KR101099517B1 - 엡타머의 구아닌 염기로부터 전자전달에 의한 분자 또는 이온 검출방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 엡타머의 구아닌 염기로부터 전자전달에 의한 분자 또는 이온 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 용매 하에서 분자 또는 이온을 감지할 수 있는 엡타머의 구아닌 염기의 전기화학적 산화를 통해 산화적 전기전달 속도의 차이를 이용하여 분자 또는 이온을 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.
엡타머, 구아닌, 전기전달, 전기화학적 산화

Description

엡타머의 구아닌 염기로부터 전자전달에 의한 분자 또는 이온 검출방법{Method for detecting materials or ions based on electron transfer from guanine bases of aptamer}
본 발명은 엡타머의 구아닌 염기로부터 전자전달에 의한 분자 또는 이온 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 용매 하에서 분자 또는 이온을 감지할 수 있는 엡타머의 구아닌 염기의 전기화학적 산화를 통해 산화적 전기전달 속도의 차이를 이용하여 분자 또는 이온을 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.
엡타머(aptamer)는 활성이 있는 감지 물질로서, 특정 단백질, 작은 분자 표적 및 금속 이온에 결합하여 G-quartet 및 헤어핀 등의 특징적인 3차 구조를 형성하는 합성 올리고뉴클레오티드이다. 현재, 표적 물질로, 트롬빈, 아데노신, 코카인 및 포타슘 이온을 검출하기 위해 상응하는 엡타머 프로브를 이용하여 비색, 형광 및 전기화학법 등의 다양한 기술들이 이용되어 왔다. 엡타머에 의한 전기화학적 검출에서, 레독스 활성 화합물은 표적 분자와 결합할 경우 프로브 가닥의 구조적 변 화로 인해 전기화학적 신호에서의 전류가 변경된 엡타머-프로브 올리고뉴클레오티드에 공유적으로 결합하였다. 잘 알려진 엡타머에 의한 방법은 표적 분자와 결합 전 후에, 전극에 부착된 프로브 올리고뉴클레오티드와 혼성화된 특정 DNA 엡타머의 유리로부터 유래한 임피던스의 차이, 또는 전극 상에 고정된 엡타머의 구조적 변화를 이용한 것이다. 이들 검출 방법에서, 전극 표면 상에 올리고뉴클레오티드의 조밀한 적용 범위(compact coverage)는 표적 분자와 결합 시 전극과 레독스 매개자 간의 전자 전달을 바꾼다.
단일 및 이중 가닥의 DNA에서 Ru(bpy)3 2+에 의해 매개된 구아닌 염기의 전기화학적 산화는 구아닌 염기의 용매 접근성이 상대적으로 쉽기 때문에 단일가닥 DNA에 의해 보다 산화적인 전류 증가를 허용한다고 보고되어 있다. 그러나, 기대에 반하여 이웃하는 구아닌의 스태킹이 일어나지 않기 때문에 전류가 현저히 증가하지는 않는다.
현재까지 전극에 고정하지 않은 채 이러한 엡타머의 구조적 차이를 이용하여 표적 없이 분자 또는 이온을 전기화학적으로 검출한 예는 보고된 바 없다.
본 발명의 목적은 단일가닥 DNA로 된 엡타머와 표적 분자 또는 이온의 구조적 변화에 따른 전기화학적 신호의 차이를 이용하여 분자 또는 이온을 검출하는 바이오센서 및 이를 이용한 검출방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
표적 분자 또는 이온과 3차 구조를 형성하는 단일가닥 엡타머; 및
전이금속 착물을 포함하는 분자 또는 이온의 전기화학적 검출용 바이오센서를 제공한다.
본 발명은 또한
i) 표적 분자 또는 이온을 포함하는 시료를 본 발명의 바이오센서와 반응시키는 단계;
ii) 상기 반응의 속도를 측정하는 단계; 및
iii) 엡타머의 전기신호와, 엡타머-표적 분자 또는 이온의 복합체의 전기신호를 비교하는 단계를 포함하는 엡타머를 이용한 분자 또는 이온의 전기화학적 검출방법을 제공한다.
본 발명은 단일가닥의 엡타머와 표적 분자 또는 이온의 결합에 따른 3차 구조의 구조적 차이를 이용하여 선택적이고, 표지 없이 분자 또는 이온을 전기화학적으로 분석할 수 있다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은
표적 분자 또는 이온과 3차 구조를 형성하는 단일가닥 엡타머; 및
전이금속 착물을 포함하는 분자 또는 이온의 전기화학적 검출용 바이오센서에 관한 것이다.
본 발명의 바이오센서는 고유의 산화전위를 갖는 염기를 포함하는 엡타머가 분자 또는 이온과 접촉하여 3차 구조를 형성하는 구조적 변화를 통해 산화-환원반응에서 금속 착물로의 전자전달 속도의 차이를 이용하여 표지 없이 분자 또는 이온을 전기화학적으로 검출하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 사용된 "바이오센서"란 용어는 산화 또는 환원 반응에서 생성된 전자들의 이동에 의해 생성된 신호를 검출 또는 측정하는데 필수적인 성분들을 포함하는 장치 또는 시스템을 나타냄을 의미한다. "바이오센서"란 용어는 생물학적 시스템이 직접 사용되지 않는 경우에도 물질의 농도 및 생물학적 관심을 갖는 다른 매개변수들을 측정하기 위한 장치를 포함한다.
상기 엡타머는 분자 또는 이온과 3차 구조를 형성할 수 있으며, 산화제에 의해 산화될 수 있는 고유의 산화전위를 갖는 염기를 적어도 하나 포함하는 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
상기 고유의 산화전위를 갖는 염기로는 아데닌, 시토신, 구아닌, 우라실 및 티민과 같은 천연 뉴클레오티드; 8-옥소-구아닌, 6-메르캅토구아닌, 4-아세틸시티딘, 5-(카르복시히드록시에틸)우리딘, 2'-O-메틸시티딘, 5-카르복시메틸아미노-메틸-2-티오리딘, 5-카르복시메틸아미노우리딘, 디히드로우리딘, 2'-O-메틸슈도우리딘, , D-갈락토실퀴오진, 2'-O-메틸구아노신, 이노신 N6-이소펜틸아데노신, 1-메틸아데노신, 1-메틸슈도우리딘, 1-메틸구아노신, 1-메틸이노신, 2,2'-디메틸구아노신, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, 3-메틸시티딘, 5-틸시티딘, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, D-만노실퀴오진, 5-메톡시카르보닐메틸우리딘, 5-메톡시우리딘, 2-메틸티오-N6-이소펜틸아데노신, N-((9- -D-리보푸라노실-2-메틸티오퓨린-6-일)카르바모일)트레오닌, N-((9- -D-리보푸라노실-6-일)N-메틸-카르바모일)트레오닌, 우리딘-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 우리딘-5-옥시아세트산, 위부톡신, 슈도우리딘, 퀴오진, 2-티오시티딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-티오우리딘, 5-메우리딘, N-((9- -D-리보푸라노실-6-일)N-메틸-카르바모일)트레오닌, 2'-O-메틸-5-우리딘, 2'-O-메틸우리딘, 위부토신, 및 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우리딘과 같은 비천연 또는 합성 뉴클레오티드 염기를 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 염기는 구아닌일 수 있다.
상기 구아닌의 개수는 본 발명 바이오센서의 검출 민감도(sensitivity)에 영 향을 줄 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 바이오센서는 분자 또는 이온을 검출하기 위한 구아닌 염기를 엡타머 내에 하나 이상 포함하고 있으며, 구아닌의 개수가 많을수록 전류신호가 커져 민감도가 증가할 수 있다.
상기 엡타머의 염기서열은 표적물질의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 상기 엡타머의 길이 역시 당업자 수준에서 변형 가능하여 특별히 제한하지는 않는다.일 구체예에 따르면, 표적물질이 아데노신인 경우 서열목록 서열번호 1에 기재된 서열을 사용할 수 있다.
전기화학적 발광물질인 상기 전이금속 착물은 금속 착물의 환원 형태가 생성되어 촉매적 순환을 완료하도록 엡타머의 고유한 산화전위를 갖는 염기와 금속-DNA 전자전달을 할 수 있다.
상기 전이금속 착물로 Ru(bpy)3 2+, Ru(Me2-bpy)3 2+, Ru(Me2-phen)3 2+, Fe(bpy)3 2+, Fe(5-Cl-phen)3 2+, Os(5-Cl-phen)3 2+, 또는 ReO2(py)4 1+로 등을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하지는 않는다.
일 구체예에 따르면, 상기 전이금속 착물로 Ru(bpy)3 2+의 유도체를 사용하는 경우, 산화전압을 전극에 인가하게 되면, 산화된 Ru(bpy)3 3+의 유도체가 전극 가까이에 위치하고 있는 엡타머의 고유의 산화전위를 갖는 염기와 산화-환원 반응을 일 으켜 여기상태(excited state)의 Ru(bpy)3 2+*의 유도체를 만들게 되며, 여기된 상기 유도체가 기저 상태(ground state)로 되돌아올 때 약 610nm의 빛을 발생시킨다. 이때 전이금속 착물은 다시 +2가 상태의 원래 산화상태로 되돌아오며, 이는 다시 전극에 인가된 산화 전압에 의해 +3가의 산화상태로 변하고 다시 엡타머와 반응하여 빛을 발생한다.
본 발명의 바이오센서는 일정 전압을 인가하여 주는 전기화학장치를 더 포함할 수 있다.
상기 전기화학장치는 삼전극계 또는 이전극계일 수 있다.
삼전극계를 채택하는 경우, 엡타머-전이금속 착물이 작업 전극(working electrode)으로 기능하며, Ag/AgCl 전극 또는 은 전선(silver wire)이 기준 전극(reference electrode)으로, 그리고 백금선이 대전극(counter electrode)으로 사용될 수 있으며, 기준 전극과 작업 전극 간의 인가 전압을 조절하기 위하여 포텐시오스탯(potentiostat)이 사용될 수 있다.
반면, 이전극계를 채택하는 경우에는 엡타머-전이금속 착물이 작업 전극, 그리고 지면 또는 백금선이 대전극으로 사용될 수 있다. 이때, 건전지가 전압을 걸어주는 포텐시오스탯의 역할을 대신할 수도 있다.
또한, 본 발명의 바이오센서는 화학발광 측정을 위한 광학측정장치를 더 포 함할 수 있다. 바람직하게는, 광검출기, 광카운터, A/D 변환기 및 컴퓨터를 포함할 수 있다.
화학발광을 검출하기 위한 광검출기로는 APD(avalanche photodiode)나 PMT(photomultiplier tube) 등이 사용되거나, 여러 미세 위치를 검출하기 위하여 냉각 CCD 카메라 또는 펠티어(peltier)방식의 CCD 카메라도 사용할 수 있다. 본 발명의 바이오센서는 표지 없이 분자 또는 이온을 검출하므로 형광법 등에 사용되는 별도의 레이저나 LED와 같은 광원과 필터가 필요 없다. 또한, 상기 발광은 전기화학적 반응에 의해 발생되는 빛이므로 형광물질을 여기시키기 위한 광원을 필요로 하지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 바이오센서는 광원에 의한 노이즈와 산란을 최소화시킬 수 있어 고감도의 검출이 실현 가능하며, 상기와 같이 화학발광을 측정하기 위한 광학측정장치가 매우 간단하므로 전체 분자 또는 이온 검출장치의 제조단가가 낮아지는 장점이 있다. 또한, 상기 광측정부에 APD(avalanche photodiode)를 사용하고 건전지를 전압 인가에 사용하면 휴대용 스캐너를 제작하는 것이 가능하다.
본 발명의 바이오센서로 검출할 수 있는 표적 분자 또는 이온으로는 특별히 제한하지는 않으나, 아데노신, 트롬빈, 코카인, ATP, 또는 금속이온 등일 수 있다.
본 발명은 또한
i) 표적 분자 또는 이온을 포함하는 시료를 본 발명의 바이오센서와 반응시 키는 단계;
ii) 상기 반응의 속도를 측정하는 단계; 및
iii) 엡타머의 전기신호와, 엡타머-표적 분자 또는 이온의 복합체의 전기신호를 비교하는 단계를 포함하는 엡타머를 이용한 분자 또는 이온의 전기화학적 검출방법에 관한 것이다.
본 발명의 엡타머를 이용한 분자 또는 이온의 전기화학적 검출방법을 단계별로 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
상기 i) 단계는
a) 용매 하에서 표적 분자 또는 이온과 엡타머의 복합체 형성 단계; 및
b) 상기 복합체와 전이금속 착물의 산화-환원 반응 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
랜덤-코일 구조를 나타내는 단일가닥의 엡타머(올리고뉴클레오티드)는 용매 하에서 표적 분자 또는 이온에 노출되면 복합체를 형성하는데, 상기 표적 분자 또는 이온을 포획하는 형태의 3차 구조를 선호하여 전이금속 착물로의 전자전달 속도에 영향을 줄 수 있다.
상기 용매는 특별히 제한하지는 않으나, 물, 또는 완충용액일 수 있다.
또한, 엡타머 내 고유의 산화전위를 갖는 염기, 예를 들어, 구아닌을 산화시키기 위해 엡타머-표적 분자 또는 이온의 복합체를 전이금속 착물과 접촉시켜 산화-환원 반응을 유도할 수 있다.
상기 산화-환원 반응은 엡타머의 상기 염기와 전이금속 착물의 산화-환원 반응에 유효한 조건 하에서 용해된 복합체를 포함하는 용액에 전이금속 착물을 용해시킴으로써 진행할 수 있다.
산화-환원 반응이 일어나는 용매는 복합체를 용해시키기에 적합한 용매라면 특별히 제한하지 않으며, 예를 들어, 물, 완충용액 등을 들 수 있다.
상기 ii) 단계는 산화-환원 반응이 일어나는 것을 나타내는 전기신호의 변화를 검출하여 반응 속도를 측정하는 단계이다.
산화-환원 반응은 적절한 공지 기술을 통해 검출할 수 있다. 예를 들어, 전이금속 착물과 상기 엡타머-표적 분자 또는 이온의 복합체 사이의 전자전달에 감응하는 검출전극은 반응된 복합체와 전이금속 착물을 포함하는 용액과 접촉하도록 놓여진다. 일반적으로, 기준 전극 및 보조 전극이 또한 검출 전극과 통하는 용액에 놓여지게 된다(대부분의 전류는 보조 전극을 통과한다). 적당한 검출 전극은 공지되어 있으며, 예를 들어, 유리질 탄소전극 또는 인듐주석산화물 전극이 있다. 마찬가지로, 적당한 기준 전극도 공지되어 있으며, 예를 들면, 은/염화은 전극이 있다.
또한, 산화-환원 반응과 관련된 전기신호 검출을 통해 표적 분자 또는 이온의 유무를 측정할 수 있다.
반응 속도는 적당한 수단을 통해 측정할 수 있다. 예를 들면, 스캔 속도, 프로브 농도, 타겟 농도 매질, 완충액, 온도, 및 또는 전기화학적 방법의 함수로 전 류를 비교하는 것에 의해 상대적인 반응 속도를 측정할 수 있다.
산화-환원 반응 속도는 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 적합한 수단에 따라 측정할 수 있다. 전형적으로는, 산화-환원 반응 속도를 상기 산화-환원 반응의 발생과 관련된 전기신호를 측정함으로써 측정한다. 예를 들어, 상기 산화-환원 반응과 관련된 전기신호를 검출전극과 전자적으로 연통하는 적합한 장치를 제공함으로써 측정할 수 있다. 상기 전기신호는 임의의 전기화학적 방법, 예를 들어 순환전압전류법, 정상 펄스 전압전류법, 시간대전류법, 또는 네모파 전압전류법의 특징일 수 있으며, 순환전압전류법이 바람직하다.
상기 iii) 단계는 엡타머의 전기신호와, 엡타머-표적 분자 또는 이온의 복합체의 전기신호를 측정하여 서로 비교함으로써 표적 분자 또는 이온의 유무를 판단하는 단계이다.
상기한 바와 같이, 엡타머 또는 복합체의 구조는 산화-환원 반응 속도에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 복합체는 엡타머와 다른 산화-환원 반응 속도를 나타낼 수 있다.
일 구체예에 따르면, 전이금속 착물 < 엡타머-분자 또는 이온의 복합체 + 전이금속 착물 < 엡타머 + 전이금속 착물의 순으로 전류가 증가한다.
따라서, 상기의 전기신호를 비교함으로써 분자 또는 이온을 전기화학적으로 검출할 수 있는 것이다.
본 발명의 엡타머를 이용한 분자 또는 이온의 전기화학적 검출방법을 통해 검출할 수 있는 표적 분자 또는 이온으로는 아데노신, 트롬빈, 코카인, ATP, 또는 금속이온 등이 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 올리고뉴클레오티드 및 전이금속 착물을 이용한 아데노신의 검출
본 실시예에서 사용한 물은 MilliQ purification system을 이용하여 정제하였다. [Ru(bpy)3]Cl2 은 알드리치에서 구입한 것을 사용하였다. 모든 올리고뉴클레오티드들은 JenoTec Inc. (Deajeon, Korea)에서 구입하고, HPLC를 통해 정제하였다. 아데노신 및 다른 뉴클레오시드는 알드리치에서 구입한 것을 사용하였다. ITO 전극은 Delta Technologies, Inc (USA)에서 구입한 것을 사용하였다. Ag/AgCl 기준 전극은 Cypress, Inc. 에서 구입한 것을 사용하였다. 올리고뉴클레오티드 농도는 Hewlett-Packard 8452A diode-array spectrometer에서 260 nm, ε= 6600 M-1 cm-1에서 흡광도를 모니터링하여 측정하였다. 상기 전극은 순차적으로 Alkonox에서 10분간 초음파 분해, 95% 에탄올, 물로 두 번, 마지막으로 완충용액으로 세척하였다. 전압전류는 indium tin oxide (ITO) 작업 전극(area = 0.32 cm2), 백금 와이어 대 전극, 및 Ag/AgCl 기준 전극이 구비되어 있는 단일-구획 전압전류 셀이 있는 CH 인스트루먼트 포텐시오스탯 (CHI630C)을 이용하여 수집하였다.
아데노신의 전기화학적 측정을 위해, 50μM [Ru(bpy)3]Cl2 및 40μM 올리고뉴클레오티드(서열번호 1)를 포함하는 시료를 50mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH = 6.8)에서 녹인 다음, 0.0 V 에서 1.3 V까지 25 mV/s의 스캔속도로 스캔하였다. 각 실험에는 깨끗이 세척한 ITO 전극을 사용하였으며, 각 전극에 대해 완충용액 만의 배경 스캔을 수집하고, 이후 스캔들로부터 이를 뺐다.
도 1에 나타난 바와 같이, 50mM 소듐 포스페이트 완충용액에 27-mer 아데노신 선택성 엡타머 디옥시올리고뉴클레오티드 및 Ru(bpy)3 2+ 이 포함된 용액에서 Ru(bpy)3 2+ 의 산화에 해당하는 음극 피크가 관찰되었다. Ru(bpy)3 2+ 단독일 경우와 비교하여 아데노신 엡타머 올리고뉴클레오티드(서열번호 1)에 의한 전류 상승은 엡타머 1의 구아닌 염기에서부터 이미 보고된 바와 같이, 스캐닝 시간 동안 생성된 Ru(bpy)3 3+ 로의 전자전달로 인한 것이다. 그러나, 올리고뉴클레오티드 1이 100 당량의 아데노신에 노출될 경우, 전류 상승은 아데노신 없이 제조된 상기 용액으로부터 얻은 것 보다 훨씬 작았다. 이들 전기화학적 결과에 대한 가능한 설명은 도 2에 도시하였다. 아데노신이 없는 경우, 구아닌이 풍부한 세그먼트를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 상대적으로 훨씬 용매 접근성이 있는 랜덤-코일 구조를 취하고 있다. 아데노신 용액에 노출됨으로써, 용액에서 구아닌이 Ru 매개체에 매우 근접하여 위치하는 3차 구조를 선호하여 평형을 바꾸므로 CV에서 전기신호를 감소시킨다.
아데노신 복합체를 헤어핀 구조에 부가하면 트롬빈, 코카인, 포타슘 이온 등의 작은 분자들의 존재 하에서 올리고뉴클레오티드로부터 형성된 컴팩트 G-quartet 구조에 구아닌 염기를 위한 유사한 환경을 제공할 수도 있을 것이다.
아데노신 농도 별 올리고뉴클레오티드 1의 반응은 순환전환전류법(cyclic voltammetry, CV)로 평가하였다(도 3). 아데노신을 첨가한 경우, 결합된 아데노신의 3차 구조가 증가하여, 4.0mM의 농도에서 최대가 될 때까지 점차적으로 접촉전류(catalytic current)가 감소하였다(도 3의 표 내부에 삽입된 그래프). 이는 이미 DNA 당 2개의 아데노신 분자가 1차 결합 부위 대부분을 점령한 탓인 것으로 보인다. 이 앱타센서는 40μΜ 내지 3.0mM의 범위에서 아데노신 농도가 증가함에 따라 음극 신호의 반응을 나타냈다. 결과적으로, 전기화학적 검출 방법의 민감성은 비색방법보다는 높고 형광방법과는 유사하였다.
그러고 나서, 아데노신을 측정할 수 있는 앱타센서의 능력을 실험하였다. 전기화학적 센서 반응은 시티딘, 우리딘, 및 이노신 등의 3개의 다른 모노뉴클레오티드 염기의 농도와 같은 농도(4.0mM)로 분석 용액에 대해 평가하였다. 구아닌 유사체인 이노신은 Ru(bpy)3 3- 종에 의해 그 자체로 산화되므로 엡타머에서 유래한 산화 적 전류 신호에 영향을 미치는 구아닌 대신 사용하였다.
전극은 다른 염기에 비해 아데노신에 현저히 반응하였다(도 4). 앱타센서는 아데노신, 시티딘, 우리딘, 및 이노신 각각에 대해 -10.3, -14.5, -14.5, 및 -17.4μA의 음극 신호 값을 발생하였다(도 5a-c). 그러한 뉴클레오시드의 존재 하에서 3차 구조의 형성이 없는 것은 문헌을 통해 제안된 바 있다. 올리고뉴클레오티드 1 단독인 경우와 비교하여 전류 변화를 유도할 수 없는 올리고뉴클레오티드 1 및 4.0mM의 시티딘의 용액에 4.0mM의 아데노신을 첨가하면, 올리고뉴클레오티드 1 및 아데노신에서 얻은 것과 같은 동일한 전류 감소를 얻었다. 이는 아데노신에 대한 엡타머 모티프의 높은 선택성이 유지됨을 나타내는 것이다.
대조군 실험 시, 아데노신과 3차 구조를 형성할 수 없다고 보고되어 있는 올리고뉴클레오티드(서열번호 2)를 유사한 전기화학적 실험에 사용하였다.
흥미롭게도, 아데노신 하에서 엡타머 2 및 Ru(bpy)3 2+에 의해 생성된 전류는 아데노신 없이 얻은 것(도 5d)과 비교하여 심지어 증가하였고, 전류 변화의 절대 값은 보다 적었다(도 4). 이 결과는 올리고뉴클레오티드 1 및 아데노신에 의해 생성된 전류 감소는 올리고뉴클레오티드가 생성되는 표적물질과의 3차 복합체의 형성에 따른 것임을 입증하는 것이다.
<실시예 2> 엡타머가 고정된 전극의 제조
금 나노입자(AuNP)가 코팅된 3-아미노프로필트리에톡시실란-변형된 ITO 전극 표면에 올리고뉴클레오티드 1을 고정하여 분자 또는 이온의 전기화학적 검출을 실험하였다.
ITO 전극에 AuNP가 코팅된 AuNP-loaded ITO 전극을 제조하기 위해, ITO 전극을 초음파 처리한 후, Alconox(4g/L)으로 15분, 2-프로판올로 15분, Milli-Q water로 두 번 세척하고 나서, 50℃에서 건조하였다. 표면에 하이드록시기를 형성하기 위해 세척된 기판에 70℃에서 90분 동안 H2O/H2O2 (30%)/NH4OH (30%) 5:1:1 (v/v/v) 로 혼합한 혼합용액으로 전처리하였다. 그 후, 상기 기판은 과량의 물로 세척하고, 50℃에서 건조하였다. 전처리된 ITO 전극은 2% 3-아미노프로필트리에톡시실란(aminopropyltriethoxysilane; APTES, v/v)를 포함하는 에탄올 용액에 12시간 동안 침지시켜 아미노실란 단일층을 형성시켰다. 그 후, 에탄올(3회)로 완전히 세척하고, 실온에서 건조하였다. 아민이 형성된 ITO 전극은 1mM HAuCl4(pH 3.13)에 30분간 침지하였다. AuCl4 - 이온은 양자화된 아민기와 정전기적으로 결합되어 있다. 물로 완전히 세척한 후, 정전기적으로 결합된 AuCl4 - 이온은 0.5mM 아스코르브산을 포함하는 수용액에서 2시간 동안 감소되었다. AuNP-loaded ITO 전극은 물로 세척한 후 50℃에서 건조하였다.
AuNP-ITO 전극에서 전기화학적 검출을 위해, AuNP-loaded ITO 전극을 20μΜ 올리고뉴클레오티드 1과 함께 실온에서 30분간 배양한 후 소듐 포스페이트 완충용 액으로 세척하였다. 그 후, 50μM Ru(bpy)3 2+를 포함하는 50mM 소듐 포스페이트 완충용액을 AuNP-ITO 전극에 로딩하고, 0.0 V 에서 1.3 V까지 25 mV/s의 스캔속도로 스캔하였다. 각 전극에 대해 완충용액 만의 배경 스캔을 수집하고, 이후 스캔에서 이를 뺐다.
50μM Ru(bpy)3 2+로 얻은 CV는 상기에서 설명한 것과 유사한 전류 증가를 나타냈다(도 6b). AuNP 전극은 100 또는 200 당량의 아데노신과 함께 배양된 올리고뉴클레오티드 1의 용액으로부터 제조될 때, 전류는 올리고뉴클레오티드 1의 단독으로부터 얻은 것과 비교하여 현저하게 감소하였다(도 6c, d). AuNP는 엡타머를 기초로 한 검출을 위한 비색 지표로 사용하기 때문에, 단일가닥 DNA는 AuNP에 효과적으로 결합하는 것으로 알려져 있다. 아데노신과 결합 시, 올리고뉴클레오티드 1은 전극에서 AuNP에 대한 DNA 염기의 흡착을 탐탁지 않게 여기는 견고한 3차 구조로 포개진다. 결과적으로, AuNP를 감싸는 랜덤-코일 단일가닥의 올리고뉴클레오티드 1 은 AuNP 전극 제조 시 세척 과정 동안 제거된 3차 구조 보다는 전류 증가에 더 많이 기여한다. 기대했던 대로, 시티딘, 우리딘, 이노신 및 심지어 구아닌의 존재 하에서 제조된 올리고뉴클레오티드 1의 시료에 대한 전류는 엡타머 1 단독에서 얻은 것과 유사하였다.
또한, 표면에 AuNP를 갖지 않는 아민으로 기능화된 ITO 전극에 대한 올리고 뉴클레오티드 1의 비특이적 흡수 가능성을 점검하기 위한 다른 대조군 실험에서, 올리고뉴클레오티드 1이 처리되고, 완충용액으로 세척된 아민으로 기능화된 전극으로부터 얻은 Ru(bpy)3 2+의 전류는 올리고뉴클레오티드 1을 처리하지 않은 것과 유사하게 나타났다(도 7).
결론적으로, 본 발명은 단일가닥의 올리고뉴클레오티드와 상기 올리고뉴클레오티드-아데노신 복합체의 3차 구조 간의 구조적 차이를 이용하여 작은 분자 아데노신을 선택적이고, 표지 없이 분석하는 전기화학적 방법을 제공한다. 랜덤-코일 구조의 엡타머의 느린 전자전달 때문에 엡타머-아데노신 복합체의 형성은 Ru(bpy)3 2+의 CV에서 전류 증가에 영향을 주었다. 특히, 아데노신 검출에 적용할 수 있다.
또한, AuNP-변형된 전극의 고체 표면에 결합된 엡타머 DNA에서 분자 또는 이온의 검출을 실험한 결과, 전류 갭, 단일가닥 아데노신 엡타머와 아데노신 하에서 형성된 3차 구조 간의 구조적 차이로부터 유래된 전류 갭은 엡타머에서 구아닌 염기의 수에 의해 향상될 수 있는 전기 신호로서 다른 전기화학적 방법보다 더 현저할 수 있다(도 8).
이 방법은 이종 및 동종 분석 둘 다에서 선택적 DNA 검출에 유용할 것이며, 당해 DNA 엡타머에 의한 트롬빈, 코카인, ATP, 및 금속 이온 등의 다른 기질의 분석에 사용할 수 있을 것이다.
도 1은 순환전류전압도(cyclic voltammogram)를 나타낸 것으로, a)는 Ru(bpy)3 2+ 단독에 대한 것이고, b)는 아데노신 하에서 Ru(bpy)3 2+ 및 아데노신 엡타머 올리고뉴클레오티드 1를 첨가한 경우, c)는 아데노신이 없는 상태에서 Ru(bpy)3 2+ 및 아데노신 엡타머 올리고뉴클레오티드 1를 첨가한 경우이다.
도 2는 아데노신 엡타머의 구조 및 아데노신에 의한 구조적 변이에 대한 전기화학적 검출을 나타내는 도식도이다.
도 3은 아데노신을 농도별로 첨가할 경우 Ru(bpy)3 2+ 및 올리고뉴클레오티드 1의 순환전류전압도를 나타낸 것이다.
도 4는 올리고뉴클레오티드 1 및 다른 모노뉴클레오티드의 산화적 전류 차이의 신호 대 배경 비율을 나타낸 것이다.
도 5는 ITO 작업 전극에서 시티딘(a), 이노신(b), 우리딘(c)을 처리한 경우 올리고뉴클레오티드 1과 Ru(bpy)3 2+ 의 순환전류전압도를 나타낸 것으로, (d)는 아데노신을 처리한 경우(점선)와 처리하지 않은 경우(실선), Ru(bpy)3 2+ 과 올리고뉴클레오티드 2의 순환전류전압도를 나타낸 것이다.
도 6은 AuNp-ITO 전극과 Ru(bpy)3 2+ 의 순환전류전압도를 나타낸 것으로, a) 는 다른 처리가 없는 경우, b)는 20μM 올리고뉴클레오티드 1을 처리한 경우, c)는 20μM 올리고뉴클레오티드 1 및 2 mM 아데노신, d)는 20μM 올리고뉴클레오티드 1과 4 mM 아데노신을 처리한 경우이다.
도 7은 아민으로 기능화된 ITO 전극에 올리고뉴클레오티드 1을 처리한 것(점선)과 처리하지 않은 경우(실선) 얻은 Ru(bpy)3 2+의 순환전류전압도를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 APTES-변형된 ITO 전극 상에 AuNP가 형성되는 과정과 아데노신을 검출하기 위한 전기화학적 앱타센서를 도식화한 것이다.
<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> Method for detecting materials or ions based on electron transfer from quanine bases of aptamer <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for detecting adenosine <400> 1 acctggggag tattgcggag gaaggt 26 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for a control experiment <400> 2 gacaaggaaa atccttcaat gaagtgggtc 30

Claims (13)

  1. 아데노신, 트롬빈, 코카인, ATP, 또는 금속이온 중 어느 하나의 분자 또는 이온과 3차 구조를 형성하는 서열목록 서열번호 1에 기재된 단일가닥 엡타머; 및
    전이금속 착물을 포함하는 분자 또는 이온의 전기화학적 검출용 바이오센서.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    전이금속 착물은 Ru(bpy)3 2+, Ru(Me2-bpy)3 2+, Ru(Me2-phen)3 2+, Fe(bpy)3 2+, Fe(5-Cl-phen)3 2+, Os(5-Cl-phen)3 2+, 및 ReO2(py)4 1+로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 분자 또는 이온의 전기화학적 검출용 바이오센서.
  6. 삭제
  7. i) 아데노신, 트롬빈, 코카인, ATP, 또는 금속이온 중 어느 하나의 분자 또는 이온을 포함하는 시료를 제1항 기재의 바이오센서와 반응시키는 단계;
    ii) 상기 반응의 속도를 측정하는 단계; 및
    iii) 엡타머의 전기신호와, 엡타머-표적 분자 또는 이온의 복합체의 전기신호를 비교하는 단계를 포함하는 엡타머를 이용한 분자 또는 이온의 전기화학적 검출방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 i) 단계는
    a) 용매 하에서 표적 분자 또는 이온과 엡타머의 복합체 형성 단계; 및
    b) 상기 복합체와 전이금속 착물의 산화-환원 반응 단계를 포함하는 엡타머를 이용한 분자 또는 이온의 전기화학적 검출방법.
  9. 제8항에 있어서,
    용매는 물, 또는 완충용액인 엡타머를 이용한 분자 또는 이온의 전기화학적 검출방법.
  10. 제8항에 있어서,
    복합체는 3차 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 엡타머를 이용한 분자 또는 이온의 전기화학적 검출방법.
  11. 제8항에 있어서,
    산화-환원 반응은 엡타머의 구아닌 염기를 산화시키는 것인 엡타머를 이용한 분자 또는 이온의 전기화학적 검출방법.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 ii) 단계는 산화-환원 반응의 전압전류를 측정하는 것인 엡타머를 이용한 분자 또는 이온의 전기화학적 검출방법.
  13. 삭제
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