KR101092301B1 - 히알루로난 하이드로겔의 ｘ-선 절삭법 - Google Patents

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Abstract

히알루로난-계 하이드로겔을 절삭하기 위한 방법으로서, (a)히알루로난-계 하이드로겔을 준비하는 단계; 및 (b)상기 히알루로난-계 하이드로겔에 X-선 조사를 수행하여 상기 X-선 조사 동안의 겔에서-졸로의 전이에 의해 상기 히알루로난-계 하이드로겔의 분해를 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루로난-계 하이드로겔을 절삭하기 위한 방법 및 이를 이용한 히알루로난-계 하이드로겔의 3-차원 마이크로채널을 제조하기 위한 방법이 제공된다.
히알루로난, 하이드로겔, X-선

Description

히알루로난 하이드로겔의 Ｘ-선 절삭법{X-RAY ABLATION OF HYALURONAN HYDROGELS}
본 발명은 X-선으로 히알루로난-계 하이드로겔을 절삭하기 위한 방법 및 X-선 절삭 기법으로 히알루로난-계 하이드로겔의 3-차원 마이크로채널을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.
외부 자극에 의한 상변화는 '지능소재(intelligent materials)' 분야에서 매우 중요한 기술이며 생의학 분야는 물론 화학, 물리, 소재과학 분야에서 활발히 연구되고 있다.
하이드로겔(hydrogel)은 교차 결합된 폴리머 사슬들에 의해 삼차원 네트워크 구조를 가지고 있어 다량의 물을 함유하고 있다. 하이드로겔은 전계, 온도, pH 변화, 농도 변화, 효소, 전자빔, 음파, 그리고 빛 등의 자극에 반응하여 전이를 나타내는 것으로 알려져 있다. 유동성(fluidity), 점탄성(viscoelasticity), 용매 휘발성(solvent volatility), 광 전송(optical transmission), 이온 수송(ion transport) 및 다른 특성들을 개발하기 위한 목적으로 하이드로겔에 대해 활발히 연구가 이루어지고 있다.
히알루로난 (히알루론산의 염 형태, HA)는 중요한 세포외 및 세포-표면 결합 다당류이다. 히알루로난은 글루쿠론산 및 N-아세틸글루코사민:[-β(1,4)-GlcUA-β(1,3)-GlcNAc-]n 의 반복 이당류 단위들로 구성되는 큰, 음전하의, 선형 다당류로서 흔히 합성된다. HA는 점탄성 및 흡습성 특성 등의 주목할만한 물리화학적 특징들을 통해 조직 생체항상성 및 생체역학적 무결성(biomechanical integrity)에서 중요한 역할을 한다. HA의 이러한 특성들은 생체공학의 조직 스카폴드(scaffold)를 위한 그의 광범위한 적용에 이르게 한다. 관련된 생리학적 기능들은 세포 생물학, 병리학, 면역학 및 암연구에서의 그의 역할에 관한 관심을 높이고 있다. 또한 3-차원(3D) 세포 미소환경을 닮은 세포-적재(cell-laden) HA 구조물의 미세제조(microfabrication)는 HA에 있어서 중요한 이슈이다. HA 분자량(MW)은, 세포 활동에 주목할만한 효과를 미치기 때문에 매우 중요하다. 비록 안전한 생물 의학적 적용에 요구되는 저 MW HA는 효소 또는 비-효소 분해(degradation)에 의해 생산되지만, HA 하이드로겔의 3D 구조물을 제조하는 안전하고, 효과적인 방법에 대하여 보고된바 없다.
위에서 언급한 바처럼, 히알루로난 하이드로겔은 조직 스카폴드 또는 세포 미소환경을 위한 유망한 재료이지만, 3-차원 구조물을 제조하는 것은 여전히 큰 난관에 봉착해 있다.
본 발명은 미세하게 조정할 수 있는 X-선 절삭 기술로 히알루로난 하이드로겔의 3-차원 마이크로채널을 제조하는 프로토콜에 대해 설명한다. X-선 절삭법의 원리는 X-선 조사에 의해 폴리머 체인이 급격히 분해된다는 것이다. 이러한 프로토콜은 조정가능한 3-차원 하이드로겔 구조물을 위한 새로운 가능성을 열게 될 것이다.
그러므로, 본 발명의 제1 목적은 X-선으로 히알루로난-계 하이드로겔을 절삭하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 제2 목적은 X-선 절삭법으로 히알루로난-계 하이드로겔의 3-차원 마이크로채널을 제조하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일측면에 따른 제1 목적을 달성하기 위하여, 히알루로난-계 하이드로겔을 절삭하기 위한 방법은, (a) 히알루로난-계 하이드로겔을 준비하는 단계; 및 (b) 히알루로난-계 하이드로겔에 대해 X-선 조사를 수행하여 X-선 조사 동안의 겔에서 졸로의 전이에 의해 히알루로난-계 하이드로겔의 분해를 유도하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, X-선 조사는 경 X-선을 이용하여 수행될 수 있다.
바람직하게는, X-선 조사는 10 - 60 keV 범위의 X-선을 이용하여 수행될 수 있다.
바람직하게는, 히알루로난-계 하이드로겔의 분해 속도는 X-선 조사 동안의 전체 X-선 선량(dose)에 의해 결정될 수 있다.
바람직하게는, 전이를 개시할 전체 X-선 선량은 0.2~1 J g-1의 범위일 수 있다.
바람직하게는, 전이를 완료할 전체 X-선 선량은 2~4 J g-1의 범위일 수 있다.
제2 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 하나의 측면에 따른, X-선 절삭법으로 히알루로난-계 하이드로겔의 3-차원 마이크로채널을 제조하기 위한 방법은, (a) 히알루로난-계 하이드로겔을 준비하는 단계; 및 (b) X-선을 국소적으로 투과시키는 마스크를 통해서 상기 히알루로난-계 하이드로겔에 대해 X-선 조사를 수행하여 X-선 조사 동안의 겔에서 졸로의 전이에 의해 히알루로난-계 하이드로겔의 분해를 국부적으로 유도하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, X-선 조사는 경 X-선을 이용하여 수행될 수 있다.
바람직하게는, X-선 조사는 10 - 60 keV 범위의 X-선을 이용하여 수행될 수 있다.
바람직하게는, 마이크로채널의 깊이 및 폭은 X-선 선량 및 마스크 폭을 조정하여 조정될 수 있다.
바람직하게는, 히알루로난-계 하이드로겔의 분해 속도는 X-선 조사 동안의 전체 X-선 선량에 의해 결정될 수 있다.
바람직하게는, 전이를 개시하기 위한 전체 X-선 선량은 0.2~1 J g-1의 범위일 수 있다.
바람직하게는, 전이를 완료하기 위한 전체 X-선 선량은 2~4 J g-1의 범위일 수 있다.
본 발명에 의하면, 짧은 경 X-선 조사(X-선 절삭법)로 HA-계 하이드로겔을 미세제조하기 위한 새로운 프로토콜을 얻을 수 있다. 이 프로토콜은 3D 세포 미소환경을 위한 부피를 갖는 HA 구조물을 쪼개는데 매우 효과적일 수 있다. 레이저 절삭법 등의 다른 접근법들에 비교하여, 본 발명에서 X-선 조사는 높은 투과력, 국부적인 조사, 비-열적 특성 및 원격 제어의 이점들을 제공하며, 다양한 생물학적 및 의학적 응용을 위한 3D HA 하이드로겔 미세제조 분야에 있어서 새로운 가능성을 열 수 있게 한다.
본 발명의 바람직한 실시예들은 첨부 도면을 참조하여 이하에서 상세히 설명한다.
여기에, 본 발명자들은, 짧은 X-선 조사를 이용하여, 다음의 잘 제어된 분해 속도에 기반하여 부피를 갖는 HA 하이드로겔을 절삭하는 새로운 프로토콜을 제시한다: 약 1㎎의 HA가 30초 이내의 경 X-선 조사에 의해, 효소분해에서처럼 동일한 특정 쪼개짐을 가지고 급히 분해한다. 그러한 매우 빠른 X-선 절삭 공정을 사용하는 것에 근거하여, 도 1에 나타낸 것처럼, 본 발명자들은 3-차원 HA 하이드로겔 마이크로채널을 제조할 수 있었다. 본 발명자들은 단일 채널의 깊이 및 폭이 X-선 선량 및 마스크 폭을 조절하여 각각 조정될 수 있음을 알아냈다. HA 원 재료 및 HA-계 하이드로겔(디비닐 술폰과 가교됨)의 X-선 조사가 방사광 경 X-선(10-60kev)를 이용하여 수행되었는데, 동시에 이는 또한 실시간으로 HA 하이드로겔 분해의 이미지를 얻는데 사용되었다. 빠른 분해 속도는 HA 백본(backbone)에서 카르보닐 또는 카르복실 기의 형성과 관련된 급격한 사슬 절단에 기인한다. 일반적으로, HA-계 하이드로겔의 X-선 절삭은 3D 세포 미소환경을 위한 부피를 갖는 HA 구조물을 쪼개는데 아주 효과적일 수 있다.
도 2a는 X-선 조사 동안 디비닐 술폰(DVS)으로 가교된 HA 하이드로겔의 겔에서 졸로의 전이를 실시간으로 나타내는 대표적인 인-시츄 X-선 영상을 나타낸다. 초기에 HA 하이드로겔의 꼭대기 부분에 머물던 구상 실리카 볼(~직경 120 ㎛)은, 조사 시간에 따라 바닥으로 떨어졌고, 이는 X-선-유도 겔에서 졸로의 전이를 분명히 나타낸다. HA-DVS 하이드로겔의 조사된 질량은 모세관(직경 약 1200㎛)에서 약 1mg 이었다. 이전에 언급한 바처럼, 전이는 매우 빨랐다: 이 질량이 조사한지 30초 이내에 분해되었다.
도 2b의 졸-겔 상평형도에 예시한 바처럼, 분해 속도는 X-선 선량률(dose rate)(또는 플럭스)과 조사 시간에 의존한다(도 2a의 X-선 선량률은 약 1 kGy s-1 이었다). 하지만, 속도를 사실상 결정하는 것은 전체 X-선 선량(= X-선 선량률 곱하기 조사 시간)이다. 전이를 '개시' 하는데 요구되는 전체 선량은 대략적으로 고정되어 있고 도 2b에 나타낸 바처럼 약 0.2~1 J g-1 (= kGy)(하부 점선으로부터)이다. 또한, 전이를 '완료'하기 위한 전체 선량은 대략적으로 고정된, 약 2~4 J g-1(상부 점선으로부터)이다. 이는 전이에 요구되는 전체 에너지(전체 X-선 선량)는 선량이 변할지라도 일정하다는 사실을 시사한다. 1~2 J g-1의 전체 선량에서, 겔과 졸 상태는 공존한다. 이러한 알아낸 사실들은 분해 속도가 전체 선량을 변경하여 제어될 수 있음을 나타내기 때문에 중요하다.
본 발명자들은 X-선 절삭 공정의 원리를 설명한다. 약 1 kGy s-1에서의 HA-DVS 하이드로겔 분해는 UV 및 FT-IR 스펙트로스코프(도 3)에 의해 모니터링되었다.
UV 스펙트럼에서 260~270㎚(화살표로 나타냄)에서의 흡수 밴드는 카르보닐 또는 카르복실 기에 기인한다. 조사 시간에 따른 밴드의 강도 증가는 전체 선량의 증가에 기인한다(도 2b 참조).
도 3에 삽입되어 있는 FT-IR 스펙트럼에 나타낸 바처럼, 조사 시간에 따른 비슷한 증가가 또한 카르보닐 또는 카르복실 기에 대응하는 1700~1750 ㎝-1에서의(회색 구역으로 표시됨) 흡수 밴드에 대해 관찰되었다.
동일한 밴드 전개가 HA 원 재료(분말 또는 용액, MW = 232KDa)의 UV 및 FT-IR 스펙트럼에서 발견되었다(도 4). 두 개의 HA 및 HA-DVS 하이드로겔 샘플들의 UV 및 FT-IR 스펙트럼은 X-선 조사가 HA 백본을 쪼깬다는 사실을 시사한다. 본 발명자 들은 일분 이내의 밴드 전개가 UV 및 FT-IR 스펙트럼에 잘 표시되어 있음을 알아냈으며, 이는 조사-유도 사슬 절단이 매우 빠름을 나타낸다.
도 5에 나타낸 바처럼, 겔 투과 크로마토그래피(GPC)는 HA 및 HA DVS 하이드로겔 샘플에서 X-선 조사에 의한 현저한 분자량 감소를 검출하였다. 경 X-선에 대한 GPC 스펙트럼이 분열되는 것은 연 X-선에 의한 HA의 해중합 공정과 유사하다. 이러한 결과는 HA 백본이 X-선 조사에 의해 쪼개진다는 결론을 확증한다. 또한, HA-DVS 하이드로겔의 X-선-유도 분해는, 효소-유도 HA 분해와 비슷하게, 1700~1750 ㎝-1에서의 밴드를 제외하고 FT-IR 스펙트럼에서 현저한 변화에 대응하지 않는다는 점을 알아냈다. 이는 X-선 절삭 공정이 HA 분자에서의 특정 사슬들의 제어된 분해로부터 얻어진다는 점을 나타낸다. 카르보닐 또는 카르복실 기의 형성은 HA에서 단당류 단위들 사이의 글리코시드 연결의 절단 때문이다. 따라서, 본 발명자들은 빠른 분해 속도는 HA 백본에서 카르보닐 또는 카르복실 기의 형성과 관련된 급격한 사슬 절단에 기인한다는 결론을 얻었다.
요컨대, 본 발명자들은 짧은 경 X-선 조사(X-선 절삭법)로 HA-계 하이드로겔을 미세제조하기 위한 새로운 프로토콜을 제시하였다. 이 프로토콜은 3D 세포 미소환경을 위한 부피를 갖는 HA 구조물을 쪼개는데 매우 효과적일 수 있다. 레이저 절삭법 등의 다른 접근법들에 비교하여, X-선 조사는 높은 투과력, 국부적인 조사, 비-열적 특성 및 원격 제어의 이점들을 제공하며, 다양한 생물학적 및 의학적 응용을 위한 3D HA 하이드로겔 미세제조 분야에 있어서 새로운 가능성을 열 수 있게 한 다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 다음과 같은 실험 조건들이 사용된다:
재료: 234kDa의 분자량(MW)를 갖는, 히알루론 산(HA)의 나트륨 염인, 히알루론산 나트륨을 Lifecore Co. (Chaska, MN)으로부터 구입하였다. Suvenyl®의 상표명의, 분자량이 2백만이 넘는 HA를 Chugai Pharmaceutical Co. (Tokyo, Japan)로부터 얻었다. 디비닐 술폰 (DVS)을 Tokyo Chemical Industry Co. (Tokyo, Japan)로부터 구입하였다. 수산화나트륨(NaOH) 및 메탄올을 Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japan)로부터 얻었다. 모든 화학물질은 추가 정제없이 사용되었다.
HA-DVS 하이드로겔의 제조: HA (68 ㎎)을 1.68㎖의 0.2N NaOH (pH = 13)에 용해시켰다. 완전히 용해시킨 후, 20.02㎕의 DVS를 HA의 히드록실 기와의 가교 반응을 위해 HA 용액에 첨가하였다. DVS 대 히드록실 기의 몰비는 1:1이었다. 최종 전구체 용액을 완전히 혼합하고, 100 ㎕의 용액을 15개의 시린지(부피 = 1㎖)중 각각의 하나에 삽입하였다. HA-DVS 하이드로겔 제조를 위한 가교 반응을 완료하기 위해 37에서 1시간 동안 배양후에, 시린지를 미리세척된 투석막 관(7kDa의 MWCO)으로 밀봉하고 24시간 동안 PBS에 대해 투석한다. 이온들(Na+ 및 OH-)이 HA-DVS 하이드로겔 내부의 pH를 중화시키는 투석막을 통해 확산되어 나온다.
X-선 조사 및 실시간 위상차 X-선 현미경 영상화:
X-선 조사 및 실시간 위상차 X-선 이미징이 대한민국 포항의 포항 광원(PLS) 2.5 GeV, 150mA 스토리지 링에서 이용가능한 7B2 빔라인에서의 경 X-선(10-60 keV)를 이용하여 수행되었다. 공간-간섭성 방사광 X-선이, CdWO4 섬광 결정 및 CCD(전하-결합 소자) 카메라를 이용하여 X-선 조사 동안 자세한 겔에서 졸로의 전이를 추적하기 위해 사용되었다. 섬광결정-시료 사이 거리는 위상차 증대를 최적화하기 위해 150㎜로 설정되었다. 빔 스폿 사이즈는 1.50 × 1.13 ㎜2로 조정되었고 미세방사선투시 공간 해상도는 0.5㎛이었다. X-선 선량률은 규소 감쇠기를 추가하여 제어되었고 미리 조정된 이온 챔버로 측정되었다. 연속 미세방사선사진들이 0.5초시간 간격(0.1 초의 획득 시간 및 0.4초의 데이터 전달 시간)을 두고 촬영되었다. 동영상에서 연속 스냅샷을 Image-Pro Plus software로 처리하였다.
UV, FT-IR, GPC 측정: UV 흡수 스펙트럼들을 220-600㎚ 범위에서 SHIMADZU UV-2550 분광광도계를 이용하여 얻어졌다. FT-IR 스펙트럼들은 액체 질소-냉각 MCT 검출기가 구비된 Bomem DA8 FT-IR 분광계를 가지고 4 ㎝-1의 스펙트럼 해상도로 측정되었다. GPC 분석을 다음의 시스템을 이용하여 수행하였다: 워터스 1525 바이너리 HPLC 펌프(Waters 1525 binary HPLC pump), 워터스 2487 두얼 흡수 검출기(Waters 2487 dual absorbance detector), 워터스 717 플러스 오토샘플러(Waters 717 plus autosampler), 울트라하이드로겔 TM 1000(Ultrahydrogel TM 1000) 및 TM 250 칼럼(TM 250 columns)(7.8 ㎜ ×30 ㎝) (Milford, MA, USA). 용리제는 34 mM 포스페이트 버퍼 (pH 6.6)/메탄올 = 80:20(v/v)이었고 유량은 1 ㎖/min이었다. 검출 파장은 210 ㎚이었다.
특정한 예시적인 실시예를 참조하여 본 발명을 설명하였지만, 본 발명은 실 시예에 의해 제한되는 것이 아니라 오직 첨부 청구항들에 의해 제한된다. 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 본 발명의 범위 및 사상을 이탈함이 없이 실시예들을 변경하거나 수정할 수 있다고 인식되야 한다.
도 1은 본 발명에 따른 HA 하이드로겔에 대한 X-선 절삭의 개략적인 예시를 나타낸다. 단일 채널에서의 깊이 및 폭은 X-선 선량 및 마스크 폭을 조절하여 각각 조정가능하다. 예로서, X-선 절삭을 이용하여 제조된 100-㎛-폭 간섭성 마이크로 채널의 HA 구조물이 설명되어 있다.
도 2a는 약 1kGy S-1의 X-선 조사 동안 DVS와 가교된 약 1㎎의 HA 하이드로겔의 졸에서 겔로의 전이를 나타내는 연속적인 인-시츄 미세방사선사진들을 나타낸다. 구상의 실리카 볼(~직경 120 ㎛)은 초기에 '겔' HA 매체의 꼭대기 영역에 머물렀고, 그 다음 조사하는 동안 모세관(약, 직경 1200 ㎛)의 바닥으로 떨어졌으며, 이는 X-선에 의해 유도된 겔에서 졸로의 전이를 명백히 나타내고, 도 2b는 X-선 선량률 및 조사 시간에 대한 졸-겔 상 평형도를 나타낸다. 절삭(분해) 속도는 전체 X-선 선량에 의해 결정된다.
도 3은 약 1kGy s-1의 X-선으로 조사한 후의 HA-DVS 하이드로겔 샘플의 UV 스펙트럼(본도) 및 FT-IR 스펙트럼(삽입도)를 나타낸다. 화살표 및 회색 구역은 UV 스펙트럼의 260~270㎚에서와 FT-IR 스펙트럼에서의 1700~1750 ㎝-1에서의 흡수 밴드 전개를 나타낸다. 1분 이내의 급격한 밴드 전개는 HA에서의 급격한 X-선유도 사슬 절단을 나타낸다.
도 4는 약 1kGy s-1의 X-선으로 조사한 후의 HA 원 재료(분말 또는 용액, MW = 232 kDa)의 UV 스펙트럼(본도) 및 FT-IR 스펙트럼(삽입도)를 나타낸다. HA 원 재료와 HA-DVS 하이드로겔의 동일한 밴드 전개는 X-선 조사가 HA 백본을 쪼갠다는 사실을 나타낸다. 그리고
도 5는 60초 까지의 X-선 조사 후의 HA (MW = 232 kDa) 및 HA-DVS 하이드로겔 샘플의 GPC 분석을 나타낸다. GPC 데이터는 HA 하이드로겔 및 HA-DVS 하이드로겔의 분자량이 X-선 조사(선량률 = 1 kGy s-1)에 따라 현저히 감소되었음을 나타내며, 이는 X-선 조사에 의한 사슬 절단을 나타낸다.

Claims (13)

  1. 히알루로난-계 하이드로겔을 절삭하기 위한 방법으로서,
    (a) 히알루로난-계 하이드로겔을 준비하는 단계; 및
    (b) 상기 히알루로난-계 하이드로겔에 10-60 keV 범위의 X-선 조사를 수행하여 상기 X-선 조사 동안의 겔에서-졸로의 전이에 의해 상기 히알루로난-계 하이드로겔의 분해를 유도하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루로난-계 하이드로겔을 절삭하기 위한 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 히알루로난-계 하이드로겔의 분해 속도는 상기 X-선 조사 동안의 전체 X-선 선량에 의해 결정되는 것을 특징으로 하는 히알루로난-계 하이드로겔을 절삭하기 위한 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 전이를 개시하기 위한 상기 전체 X-선 선량은 0.2~1 J g-1의 범위인 것을 특징으로 하는 히알루로난-계 하이드로겔을 절삭하기 위한 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 전이를 완료하기 위한 전체 X-선 선량은 2~4 J g-1의 범위인 것을 특징으로 하는 히알루로난-계 하이드로겔을 절삭하기 위한 방법.
  7. X-선 절삭에 의해 히알루로난 하이드로겔의 3차원 마이크로채널을 제조하기 위한 방법으로서,
    (a) 히알루로난-계 하이드로겔을 준비하는 단계; 및
    (b) X-선을 국소적으로 투과시키는 마스크를 통해 상기 히알루로난-계 하이드로겔에 10-60 keV 범위의 X-선 조사를 수행하여 상기 X-선 조사 동안의 겔에서-졸로의 전이에 의해 상기 히알루로난-계 하이드로겔의 분해를 국부적으로 유도하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루로난 하이드로겔의 3차원 마이크로채널을 제조하기 위한 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제7항에 있어서, 상기 마이크로채널의 깊이 및 폭은 X-선 선량 및 마스크 폭을 조절하여 조정가능한 것을 특징으로 하는 히알루로난 하이드로겔의 3차원 마이크로채널을 제조하기 위한 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 히알루로난-계 하이드로겔의 분해 속도는 상기 X-선 조사 동안의 전체 X-선 선량에 의해 결정되는 것을 특징으로 하는 히알루로난 하이드로겔의 3차원 마이크로채널을 제조하기 위한 방법.
  12. 제7항에 있어서, 상기 전이를 개시하기 위한 전체 X-선 선량은 0.2~1 J g-1의 범위인 것을 특징으로 하는 히알루로난 하이드로겔의 3차원 마이크로채널을 제조하기 위한 방법.
  13. 제7항에 있어서, 상기 전이를 완료하기 위한 전체 X-선 선량은 2~4 J g-1의 범위인 것을 특징으로 하는 히알루로난 하이드로겔의 3차원 마이크로채널을 제조하기 위한 방법.
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Decreased Surface Tension of Water by Hard-X-Ray Irradiation [PRL, 100, 217403 (2008)]

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