KR101091041B1

KR101091041B1 - Novel recombinant glucose-dependent insulinotropic polypeptide agonists and use thereof

Info

Publication number: KR101091041B1
Application number: KR1020100073143A
Authority: KR
Inventors: 성재영; 문미진; 황종익
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2010-07-29
Filing date: 2010-07-29
Publication date: 2011-12-09

Abstract

PURPOSE: A novel recombinant glucose-dependent insulinotropic peptide agonist is provided to activate GLP-1 and GIP receptor and to treat type 1 and 2 diabetes. CONSTITUTION: A recombinant GIP compound contains an amino acid sequence of chemical formula I, Xaa1-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Xaa7-Ser-Asp-Tyr-Thr-Ile-Ala-Met-Xaa15-Lys-Ile-Xaa18-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-R. In chemical formula I, Xaa1 is His or Tyr; and Xaa7 is Thr or Ile. A pharmaceutical composition for preventing and treating type 1 and 2 diabetes contains the recombinant GIP compound as an active ingredient. A pharmaceutical composition for treating osteoporosis and obesity contains the recombinant GIP compound as an active ingredient.

Description

Novel recombinant glucose-dependent insulinotropic polypeptide agonists and use

본 발명은 새로운 재조합 글루코스 의존성 인슐린분비 펩타이드 작용제의 개발과 그 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 글루카곤 유사펩타이드-1 수용체(GLP-1R) 및 글루코스 의존성 인슐린분비 펩타이드 수용체(GIPR)에 동시에 작용하는 화학식 Ⅰ의 아미노산 서열을 포함하는 GIP 화합물 및 그의 의학적 용도에 관한 것이다.
The present invention relates to the development and use of a novel recombinant glucose-dependent insulin secreting peptide agonist, and more specifically to the glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R) and glucose-dependent insulin secreting peptide receptor (GIPR). A GIP compound comprising the amino acid sequence of and a medical use thereof.

장에서 분비되는 어떤 효소가 췌장의 내분비 기능을 조절할 수 있다는 발견 이후 [Moore and Abram, Biochem J 1:28-38, 1906], 장에서 유래한 인슐린을 분비하는 물질(incretin, 인크레틴)이라는 개념이 성립되었다 [Fehmann et al., Endocr Rev 16:390-410, 1995]. 인크레틴은 장에서 분비되는 호르몬으로, 장내 영양분 흡수에 반응하여, 글루코스 농도에 의존적으로 췌장에서 인슐린의 분비를 조절한다. 글루카곤 유사펩타이드-1(glucagon-like peptide-1; GLP-1)과 글루코스 의존적 인슐린분비 펩타이드(glucose-dependent insulinotropic polypeptide; GIP)는 대표적인 인크레틴이다 [Fehmann et al., Endocr Rev 16:390-410, 1995]. GLP-1은 30 개의 아미노산으로 구성된 펩타이드이며 소장의 L 세포에서 분비되는 반면, GIP는 42 개의 아미노산으로 구성되며 소장의 K 세포에서 분비된다 [Orskov et al., Endocrinology 119:1467-1475, 1986; Orskov et al., Diabetologia 30:874-881, 1987]]. GLP-1과 GIP는 췌장 베타세포에 존재하는 GLP-1 수용체와 GIP 수용체를 통해서 인슐린 분비를 조절한다.After the discovery that an enzyme secreted by the intestines can regulate the endocrine function of the pancreas [Moore and Abram, Biochem J 1: 28-38, 1906], the concept of intestinal-derived insulin secreting substance (incretin) Was established (Fehmann et al., Endocr Rev 16: 390-410, 1995). Incretin is a hormone secreted by the intestine, which responds to the absorption of nutrients in the intestine and regulates the secretion of insulin in the pancreas, depending on the glucose concentration. Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) and glucose-dependent insulinotropic polypeptides (GIP) are representative incretins [Fehmann et al., Endocr Rev 16: 390-410 , 1995]. GLP-1 is a peptide consisting of 30 amino acids and secreted in L cells of the small intestine, while GIP is composed of 42 amino acids and secreted in K cells of the small intestine [Orskov et al., Endocrinology 119: 1467-1475, 1986; Orskov et al., Diabetologia 30: 874-881, 1987]. GLP-1 and GIP regulate insulin secretion through the GLP-1 and GIP receptors present in pancreatic beta cells.

GLP-1의 인슐린 분비효과는 여러 당뇨병 동물모델에서 증명되었으며 [Shen et al., Metabolism 47:1042-1047, 1998; Drucker, Endocrinology 142:521-527, 2001; MacDonald et al., Diabetes 51 Suppl 3:S434-442, 2002], GLP-1은 베타세포에서 인슐린의 분비뿐만 아니라, 인슐린의 합성, 베타세포의 성장을 촉진하고, 베타세포 사멸에는 억제효과가 있음이 밝혀졌다 [Fehmann et al., Endocrinology 130:159-166, 1992; Perfetti et al., Eur J Endocrinol 143:717-725, 2000; Xu et al., Diabetes 48:2270-2276, 1999; Stoffers et al., Diabetes 49:741-748, 2000; List et al., Am J Physiol Endocrinol Metab 286:E875-881, 2004; Perfetti et al., Endocrinology 141:4600-4605, 2000; Drucker, Mol Endocrinol 17:161-171, 2003]. 또한 GLP-1은 췌장 알파세포에서 글루카곤의 분비를 글루코스 농도 의존적으로 억제한다 [Nauck et al., J Clin Endocrinol Metab 87:1239-1246, 2002]. GLP-1은 이러한 인슐린 분비 효과뿐만 아니라, 내장기관과 중추신경계에서도 당뇨병과 관련된 중요한 역할을 한다. GLP-1은 내장기관에서 영양분이 소실되는 것을 억제하고 글루코스 수준을 조절하며 [Nauck et al., Am J Physiol 273:E981-988, 1997], 중추신경계에서는 식욕을 억제하는 작용을 하여 궁극적으로 체중을 감소시키는 기능이 있다 [Zander et al., Lancet 359:824-830, 2002]. GLP-1의 이러한 다양한 기능은 궁극적으로 체내에서 올라간 혈당을 정상화하는데 기여하게 된다. 실제로 GLP-1을 2형 당뇨환자의 피하에 주사하면, 인슐린 분비를 촉진하고, 혈당을 낮추는 효과를 보인다 [Gutniak et al., N Engl J Med 326:1316-1322, 1992 Nauck et al., Diabetologia 36:741-744, 1993]. GLP-1이 다른 저혈당 유도 치료제보다 좋은 점은, GLP-1이 혈당에 의존적으로 활성을 가지기 때문에 저혈당을 유도하지 않는 다는 것이다. 또한 설포닐우레아(sulphonylurea) 약물에 더 이상 반응하지 않는 환자에서 인슐린을 분비시킬 수 있는 장점을 가진다 [Nauck et al., Diabetes Care 21:1925-1931, 1998].Insulin secretion effects of GLP-1 have been demonstrated in several diabetic animal models [Shen et al., Metabolism 47: 1042-1047, 1998; Drucker, Endocrinology 142: 521-527, 2001; MacDonald et al., Diabetes 51 Suppl 3: S434-442, 2002], GLP-1 not only secretes insulin from beta cells, but also promotes insulin synthesis, beta cell growth, and inhibits beta cell death. This has been found [Fehmann et al., Endocrinology 130: 159-166, 1992; Perfetti et al., Eur J Endocrinol 143: 717-725, 2000; Xu et al., Diabetes 48: 2270-2276, 1999; Stoffers et al., Diabetes 49: 741-748, 2000; List et al., Am J Physiol Endocrinol Metab 286: E875-881, 2004; Perfetti et al., Endocrinology 141: 4600-4605, 2000; Drucker, Mol Endocrinol 17: 161-171, 2003]. GLP-1 also inhibits glucagon secretion in pancreatic alpha cells in a glucose concentration dependent manner (Nauck et al., J Clin Endocrinol Metab 87: 1239-1246, 2002). In addition to these insulin secreting effects, GLP-1 plays an important role related to diabetes in the internal organs and central nervous system. GLP-1 inhibits the loss of nutrients in the internal organs, regulates glucose levels [Nauck et al., Am J Physiol 273: E981-988, 1997], and inhibits appetite in the central nervous system, ultimately losing weight Has a function of reducing the activity of the virus (Zander et al., Lancet 359: 824-830, 2002). These diverse functions of GLP-1 ultimately contribute to normalizing blood glucose levels in the body. Indeed, subcutaneous injection of GLP-1 has been shown to promote insulin secretion and lower blood sugar levels [Gutniak et al., N Engl J Med 326: 1316-1322, 1992 Nauck et al., Diabetologia 36: 741-744, 1993. The advantage of GLP-1 over other hypoglycemic-derived therapeutics is that GLP-1 does not induce hypoglycemia because GLP-1 is dependent on blood glucose. It also has the advantage of releasing insulin in patients who no longer respond to sulphonylurea drugs (Nauck et al., Diabetes Care 21: 1925-1931, 1998).

GLP-1과 마찬가지로 GIP도 베타세포에서 글루코스 의존적으로 인슐린 분비를 자극시킬 뿐만 아니라 인슐린의 합성을 촉진하고, 베타세포 증식을 유도하며, 사멸에는 억제적인 효과를 가지고 있다 [Trumper et al., Mol Endocrinol 15:1559-1570, 2001]. 최근 GIP가 과발현 되도록 만든 유전자 도입 생쥐에서 골밀도와 골내 무기질이 증가되었다는 사실이 보고되었다 [Xie et al., Bone 40:1352-1360, 2007]]. 이는 GIP가 인슐린 분비를 유도하는 기능 외에도 골밀도를 증가시킬 수 있으며, 이에 따라 골다공증 예방 및 치료제로 사용할 수 있는 가능성을 보여주는 결과이다.Like GLP-1, GIP not only stimulates insulin secretion in beta cells but also stimulates insulin synthesis, induces beta cell proliferation, and has an inhibitory effect on death [Trumper et al., Mol Endocrinol 15: 1559-1570, 2001. Recently, transgenic mice that overexpress GIP have been reported to increase bone mineral density and bone minerals [Xie et al., Bone 40: 1352-1360, 2007]. This is in addition to the ability to induce insulin secretion GIP can increase the bone density, which is a result showing the possibility that can be used as a prevention and treatment of osteoporosis.

그러나, GLP-1과 GIP 그 자체를 당뇨병 치료에 사용하는 데에는 제한이 있다. GLP-1과 GIP 모두 혈액에 존재하는 이펩타이드 분해효소-Ⅳ(dipeptidyl peptidase-Ⅳ; DPP-Ⅳ)에 의해 분해되어, in vivo 및 in vitro에 매우 짧은 반감기를 가지고 있다 [Mentlein et al., Eur J Biochem 214:829-835, 1993 Kieffer, et al., Endocrinology 136:3585-3596, 1995]. DPP-Ⅳ는 펩타이드 N-말단(N-terminal)의 두 번째 아미노산이 프롤린(proline) 이거나, 알라닌(alanine)일 경우 이 자리를 분해한다.However, there are limitations to using GLP-1 and GIP itself to treat diabetes. Both GLP-1 and GIP are degraded by dipeptidyl peptidase-IV (DPP-IV) in the blood and have very short half-lives in vivo and in vitro [Mentlein et al., Eur J Biochem 214: 829-835, 1993 Kieffer, et al., Endocrinology 136: 3585-3596, 1995]. DPP-IV degrades this site when the second amino acid of the peptide N-terminal is proline or alanine.

한편, 최근에 독도마뱀의 침샘에서 발견된 익센딘-4(exendin-4)가 GLP-1 수용체에 높은 활성을 가지는 작용제임이 밝혀졌고, 임상시험에 적용되고 있다 [Buse et al., Diabetes Care 27:2628-2635, 2004]. 익센딘-4(exendin-4)는 39 개의 아미노산으로 구성되며, GLP-1과 약 50% 정도 유사도를 보이며, GLP-1 보다 C-말단에 9 개 아미노산이 추가된 형태의 펩타이드이다. C-말단에 추가된 9 개 아미노산이 GLP-1 수용체와의 결합력을 높여주는 것으로 알려지고 있다. 또한 익센딘-4는 N-말단의 두 번째 아미노산이 글리신(glycine)으로 되어 있어 DPP-Ⅳ에 상대적으로 저항성이 높아, 혈중에서 생체유래 GLP-1보다 긴 반감기를 가지는 장점이 있다 [Edwards et al., Am J Physiol Endocrinol Metab 281:E155-161, 2001]. 하지만, 익센틴-4는 인간유래 GLP-1과 아미노산 서열이 차이를 보여 인간에 주사했을 때, 항체가 형성될 가능성이 높은 단점이 있다 [Baggio et al., Diabetes. 55:1562-1570, 2006]. 따라서 DPP-Ⅳ에 저항성이 있으면서 GLP-1 수용체뿐만 아니라, GIP 수용체의 활성을 유도한다면 인슐린분비 조절에서 상승효과를 가져올 수 있을 것으로 사료된다. GLP-1과 익센딘-4(exendin-4) 및 GIP의 아미노 말단 부분은 비교적 높은 아미노산 상동성을 보이며, 가운데 위치한 알파-헬릭스 모양을 이루는 부위와, 카르복시 말단은 아미노산 서열에서 많은 차이를 보인다. 아미노 말단에서, GIP의 1, 7번째 아미노산이 같은 위치의 GLP-1 및 익센딘-4와 차이를 보인다. 중앙의 알파-헬릭스 부위의 11, 22, 25번째 아미노산은 세 종류의 펩타이드에서 모두 동일하지만, 15, 18번째 GLP-1과 익센딘-4에서는 동일한 반면 GIP에서는 차이를 보인다. 상기 언급한 5 개의 아미노산은 펩타이드의 알파-헬릭스 구조에서 같은 면에 존재하며, 리간드-수용체의 결합에 중요하다고 알려져 있다 [Adelhorst et al., J Biol Chem 269:6275-6278, 1994; Gallwitz et al., Eur J Biochem 225:1151-1156, 1994]. GIP와 GLP-1의 아미노산의 차이는, 이러한 아미노산들이 각각의 수용체와의 결합에서 리간드 선택성에 관여할 것이라는 것을 시사한다. 또한 익센딘-4(exendin-4)의 꼬리는 익센딘-4와 GLP-1 수용체의 세포외(extracellular) 부분과의 친화력을 높인다고 알려져 있다 [Al-Sabah and Donnelly, Br J Pharmacol 140:339-346, 2003].On the other hand, recently discovered that exendin-4 (exendin-4) found in the salivary glands of islets is a high activity of the GLP-1 receptor and has been applied to clinical trials [Buse et al., Diabetes Care 27: 2628-2635, 2004]. Exendin-4 is composed of 39 amino acids and is about 50% similar to GLP-1, and is a peptide in which 9 amino acids are added at the C-terminus of GLP-1. N amino acids added to the C-terminus is known to enhance the binding to the GLP-1 receptor. In addition, Ixendin-4 is relatively resistant to DPP-IV because the second amino acid at the N-terminus is glycine (glycine), and has the advantage of having a half-life longer than that of GLP-1 in the blood [Edwards et al. , Am J Physiol Endocrinol Metab 281: E155-161, 2001. However, exentin-4 has a disadvantage in that an antibody is formed when injected into humans due to a difference in amino acid sequence from human-derived GLP-1 [Baggio et al., Diabetes. 55: 1562-1570, 2006. Therefore, if the resistance to DPP-IV and induction of the GLP-1 receptor as well as the GLP-1 receptor may be synergistic in the regulation of insulin secretion. The amino terminal portions of GLP-1, exendin-4, and GIP show relatively high amino acid homology, and the alpha-helix-shaped region in the center and the carboxy terminus show a large difference in amino acid sequence. At the amino terminus, the first and seventh amino acids of GIP differ from GLP-1 and exendin-4 at the same position. The 11th, 22nd and 25th amino acids in the central alpha-helix region are identical in all three peptides, but the same in the 15th and 18th GLP-1 and Ixendin-4, while in GIP. The five amino acids mentioned above are on the same side in the alpha-helix structure of the peptide and are known to be important for the binding of ligand-receptors [Adelhorst et al., J Biol Chem 269: 6275-6278, 1994; Gallwitz et al., Eur J Biochem 225: 1151-1156, 1994]. The difference in amino acids of GIP and GLP-1 suggests that these amino acids will be involved in ligand selectivity in binding to each receptor. The tail of exendin-4 is also known to enhance the affinity of exendin-4 with the extracellular portion of the GLP-1 receptor [Al-Sabah and Donnelly, Br J Pharmacol 140: 339-]. 346, 2003].

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, GIP에 GLP-1의 아미노산인 1, 7, 15 및 18번째 아미노산과 익센딘-4(exendin-4)의 꼬리 부분을 도입하여 재조합 GIP(rcGIP)를 제조하는 경우, 상기 재조합 GIP는 GLP-1 수용체와 GIP 수용체 모두에 작용 할뿐만 아니라, 펩타이드 분해효소에 저항성을 가짐을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
Accordingly, the present inventors have diligently researched to overcome the problems of the prior art, and as a result, GIP-1 amino acids 1, 7, 15, and 18th amino acid and exendin-4 tail portion When introduced to produce a recombinant GIP (rcGIP), it was confirmed that the recombinant GIP not only acts on both the GLP-1 receptor and the GIP receptor, but also has resistance to peptide degrading enzymes, thereby completing the present invention.

따라서 본 발명의 주된 목적은 생체에서 펩타이드 분해효소에 저항성을 가져 생체내 분해시간을 늦추면서, GLP-1 및 GIP 수용체에 동시에 작용하는 장점을 갖는 새로운 GIP 작용제를 제공하는데 있다.Accordingly, a main object of the present invention is to provide a novel GIP agent having the advantage of simultaneously acting on GLP-1 and GIP receptors while having a resistance to peptide degrading enzymes in vivo and slowing down the degradation time in vivo.

본 발명의 다른 목적은 상기 새로운 GIP 작용제를 포함하는 당뇨병 치료제, 골다공증 및 비만 치료제를 제공하는데 있다.
Another object of the present invention to provide a therapeutic agent for diabetes, osteoporosis and obesity, comprising the new GIP agent.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 Ⅰ의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 GIP(rcGIP) 화합물을 제공한다.According to one aspect of the invention, the invention provides a recombinant GIP (rcGIP) compound comprising the amino acid sequence of formula (I)

[화학식 Ⅰ](I)

Xaa1-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Xaa7-Ser-Asp-Tyr-Thr-Ile-Ala-Met-Xaa15-Lys-Ile-Xaa18-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-RXaa1-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Xaa7-Ser-Asp-Tyr-Thr-Ile-Ala-Met-Xaa15-Lys-Ile-Xaa18-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp- Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-R

상기 식에서, Xaa1은 His 또는 Tyr이고, Xaa7은 Thr 혹은 Ile이고, Xaa15는 Glu 또는 Asp이고, Xaa18은 Ala 혹은 His이고, R은 Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 또는 NH2이다.Wherein Xaa1 is His or Tyr, Xaa7 is Thr or Ile, Xaa15 is Glu or Asp, Xaa18 is Ala or His, and R is Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro -Ser-NH2 or NH2.

본 발명의 상기 rcGIP 화합물의 아미노산 서열은 당 업계 관례에 따라, GIP의 아미노 말단의 잔기를 1번으로 지정하고, 다른 아미노산을 연속적으로 번호를 매겼다.The amino acid sequence of the rcGIP compound of the present invention designated the residue at the amino terminus of GIP as No. 1 according to the practice of the art, and consecutively numbered other amino acids.

본 발명에서는 GIP의 아미노산 서열에서 펩타이드 분해효소에 저항성을 가지는 아미노산을 도입하여 생체내 분해가 잘 일어나지 않게 하였으며, GLP-1의 아미노산과 익센딘-4(exendin-4)에서 유래한 C-말단 아미노산을 추가하여 GLP-1 수용체 및 GIP 수용체에 공동으로 작용하는 작용제를 개발하였다.In the present invention, amino acids having resistance to peptide degrading enzymes are introduced in the amino acid sequence of GIP to prevent degradation in vivo, and C-terminal amino acids derived from amino acids of GLP-1 and exendin-4 (exendin-4). Was added to develop agents that co-operate with the GLP-1 receptor and the GIP receptor.

본 발명의 상기 rcGIP 화합물은 서열번호 1(표 1의 rcGIP)의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 GIP 화합물은 DPP-Ⅳ에 대한 저항성을 주기 위해 2번째 아미노산을 세린(Serine)으로 치환하고, GLP-1 수용체에 대한 활성도를 높이기 위해 1번째 아미노산을 히스티틴(Histidine)으로 치환하고, 7번째 아미노산을 트레오닌(Threonine)으로 치환하고, 15번째 아미노산을 글루탐산(Glutamic acid)로 치환하고, 18번째 아미노산을 알라닌(Alanine)으로 치환하였으며, 30번째 아미노산 이후부터 C-말단의 12개 아미노산을 제거하였다.The rcGIP compound of the present invention is characterized in that it comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (rcGIP of Table 1). The GIP compound substitutes serine for the second amino acid to give resistance to DPP-IV, and replaces the first amino acid with histidine to increase the activity on the GLP-1 receptor, and the seventh amino acid. The amino acid was replaced with threonine, the 15th amino acid was replaced with glutamic acid, the 18th amino acid was substituted with alanine, and the 12 amino acids at the C-terminal were removed after the 30th amino acid. .

본 발명에 따른 상기 rcGIP 화합물은 서열번호 2(표 1의 [Y¹]rcGIP)의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 GIP 화합물은 DPP-Ⅳ에 대한 저항성을 주기 위해 2번째 아미노산을 세린(Serine)으로 치환하고, GLP-1 수용체에 대한 활성도를 높이기 위해 7번째 아미노산을 트레오닌(Threonine)으로 치환하고, 15번째 아미노산을 글루탐산(Glutamic acid)로 치환하고, 18번째 아미노산을 알라닌(Alanine)으로 치환하였으며, 30번째 아미노산 이후부터 C-말단의 12개 아미노산을 제거하였다.The rcGIP compound according to the present invention is characterized in that it comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 ([Y ¹ ] rcGIP of Table 1). The GIP compound substitutes serine for the second amino acid to give resistance to DPP-IV, and replaces the seventh amino acid with threonine to increase the activity on the GLP-1 receptor, and the fifteenth amino acid. Was substituted with glutamic acid, the 18th amino acid was substituted with alanine, and 12 amino acids at the C-terminus were removed after the 30th amino acid.

본 발명의 상기 rcGIP 화합물은 서열번호 3(표 1의 [I⁷]rcGIP)의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 GIP 화합물은 DPP-Ⅳ에 대한 저항성을 주기 위해 2번째 아미노산을 세린(Serine)으로 치환하고, GLP-1 수용체에 대한 활성도를 높이기 위해 1번째 아미노산을 히스티틴(Histidine)으로 치환하고, 15번째 아미노산을 글루탐산(Glutamic acid)로 치환하고, 18번째 아미노산을 알라닌(Alanine)으로 치환하였으며, 30번째 아미노산 이후부터 C-말단의 12개 아미노산을 제거하였다.The rcGIP compound of the present invention is characterized in that it comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 ([I ⁷ ] rcGIP of Table 1). The GIP compound substitutes serine for the second amino acid to give resistance to DPP-IV, and replaces the first amino acid with histidine to increase the activity on the GLP-1 receptor. The amino acid was replaced with glutamic acid, the 18th amino acid was replaced with alanine, and 12 amino acids at the C-terminus were removed after the 30th amino acid.

본 발명의 rcGIP 화합물에 있어서, 상기 GIP 화합물은 서열번호 4(표 1의 [Y¹I⁷]rcGIP)의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 GIP 화합물은 DPP-Ⅳ에 대한 저항성을 주기 위해 2번째 아미노산을 세린(Serine)으로 치환하고, GLP-1 수용체에 대한 활성도를 높이기 위해 15번째 아미노산을 글루탐산(Glutamic acid)로 치환하고, 18번째 아미노산을 알라닌(Alanine)으로 치환하였으며, 30번째 아미노산 이후부터 C-말단의 12개 아미노산을 제거하였다.In the rcGIP compound of the present invention, the GIP compound is characterized in that it comprises the amino acid of SEQ ID NO: 4 ([Y ¹ I ⁷ ] rcGIP of Table 1). The GIP compound substitutes serine for the second amino acid to give resistance to DPP-IV, replaces the 15th amino acid with glutamic acid, and increases the activity for the GLP-1 receptor. The amino acid was substituted with alanine, and 12 amino acids at the C-terminus were removed after the 30th amino acid.

본 발명의 rcGIP 화합물에 있어서, 상기 GIP 화합물은 서열번호 5(표 1의 [D¹⁵H¹⁸]rcGIP)의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 GIP 화합물은 DPP-Ⅳ에 대한 저항성을 주기 위해 2번째 아미노산을 세린(Serine)으로 치환하고, GLP-1 수용체에 대한 활성도를 높이기 위해 1번째 아미노산을 히스티틴(Histidine)으로 치환하고, 7번째 아미노산을 트레오닌(Threonine)으로 치환하였으며, 30번째 아미노산 이후부터 C-말단의 12개 아미노산을 제거하였다.In the rcGIP compound of the present invention, the GIP compound is characterized by comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 ([D ¹⁵ H ¹⁸ ] rcGIP of Table 1). The GIP compound substitutes serine for the second amino acid to give resistance to DPP-IV, and replaces the first amino acid with histidine to increase the activity on the GLP-1 receptor, and the seventh amino acid. The amino acid was substituted with threonine and 12 amino acids at the C-terminus were removed after the 30th amino acid.

본 발명에 따른 상기 rcGIP 화합물은 서열번호 6(표 1의 [Y¹]rcGIP-E4)의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 GIP 화합물은 DPP-Ⅳ에 대한 저항성을 주기 위해 2번째 아미노산을 세린(Serine)으로 치환하고, GLP-1 수용체에 대한 활성도를 높이기 위해 7번째 아미노산을 트레오닌(Threonine)으로 치환하고, 15번째 아미노산을 글루탐산(Glutamic acid)로 치환하고, 18번째 아미노산을 알라닌(Alanine)으로 치환하였으며, 30번째 아미노산 이후부터 익센딘-4(exendin-4) C-말단의 G-P-S-S-G-A-P-P-P-S의 10개 아미노산을 추가하였다.The rcGIP compound according to the present invention is characterized in that it comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 ([Y ¹ ] rcGIP-E4 in Table 1). The GIP compound substitutes serine for the second amino acid to give resistance to DPP-IV, and replaces the seventh amino acid with threonine to increase the activity on the GLP-1 receptor, and the fifteenth amino acid. Was substituted with glutamic acid, the 18th amino acid was substituted with alanine, and 10 amino acids of GPSSGAPPPS at the exendin-4 C-terminus were added after the 30th amino acid.

본 발명에 따른 상기 rcGIP 화합물은 서열번호 7([Y¹I⁷]rcGIP-E4)의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 GIP 화합물은 DPP-Ⅳ에 대한 저항성을 주기 위해 2번째 아미노산을 세린(Serine)으로 치환하고, GLP-1 수용체에 대한 활성도를 높이기 위해 15번째 아미노산을 글루탐산(Glutamic acid)로 치환하고, 18번째 아미노산을 알라닌(Alanine)으로 치환하였으며, 30번째 아미노산 이후부터 익센딘-4(exendin-4) C-말단의 G-P-S-S-G-A-P-P-P-S의 10개 아미노산을 추가하였다.The rcGIP compound according to the present invention is characterized in that it comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 ([Y ¹ I ⁷ ] rcGIP-E4). The GIP compound substitutes serine for the second amino acid to give resistance to DPP-IV, replaces the 15th amino acid with glutamic acid, and increases the activity for the GLP-1 receptor. The amino acid was substituted with alanine and 10 amino acids of GPSSGAPPPS at the exendin-4 C-terminus were added after the 30th amino acid.

본 발명의 상기 rcGIP 화합물은 DPP-Ⅳ와 같은 펩타이드 분해효소에 대해 저항성을 갖으며, GLP-1 수용체 및 GIP 수용체를 동시에 활성화(즉, 작용제로 기능)시키는 것을 특징으로 한다.The rcGIP compound of the present invention is resistant to peptide degrading enzymes such as DPP-IV, and is characterized in that it simultaneously activates (ie, functions as an agent) the GLP-1 receptor and the GIP receptor.

구체적으로 본 발명의 실시예에서 확인한 바와 같이, GIP의 1번째 Tyr, 7번째 Ile, 15번째 Asp 및 18번째 His가 GLP-1의 His, Thr, Glu 및 Ala로 치환시킨 재조합 GIP(rcGIP)의 펩타이드 효능을 측정하는 경우, GLP-1 수용체 및 GIP 수용체를 활성화시켰다. 따라서 본 발명의 rcGIP는 GLP-1 수용체에 대한 결합력을 높일 뿐만 아니라, GIP 수용체 또한 여전히 활성화 시킨다.
Specifically, as confirmed in the embodiment of the present invention, the recombinant TIP (rcGIP) of the first Tyr, seventh Ile, 15th Asp and 18th His of GIP substituted with His, Thr, Glu and Ala of GLP-1 When measuring peptide efficacy, the GLP-1 receptor and GIP receptor were activated. Therefore, rcGIP of the present invention not only enhances the binding capacity to the GLP-1 receptor, but also activates the GIP receptor.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 GIP 화합물을 유효성분으로 함유하는 1형 및 2형 당뇨병 치료용 약제 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition for treating type 1 and type 2 diabetes containing the recombinant GIP compound as an active ingredient.

GLP-1 수용체, GIP 수용체의 활성화 및 1형 및 2형 당뇨병 치료와의 연관성이 알려져 있다 [Drucker & Nauck et al., Lancet 368:1696-1705, 2006; Meier & Nauck et al., Horm Metab Res 36:859-866, 2004]. 따라서 본 발명에 따른 재조합 GIP 화합물은 GLP-1 수용체 및 GIP 수용체 모두에 결합력이 높을 뿐만 아니라, 효과적으로 인슐린을 분비시킴으로 1형 및 2형 당뇨병을 예방 및 치료할 수 있다.GLP-1 receptors, activation of GIP receptors and their association with the treatment of type 1 and type 2 diabetes are known [Drucker & Nauck et al., Lancet 368: 1696-1705, 2006; Meier & Nauck et al., Horm Metab Res 36: 859-866, 2004]. Therefore, the recombinant GIP compound according to the present invention not only has high binding capacity to both the GLP-1 receptor and the GIP receptor, but also effectively prevents and treats type 1 and type 2 diabetes by secreting insulin.

구체적으로 본 발명의 실시예에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 재조합 GIP를 췌장의 베타 세포에 처리하는 경우 인슐린 분비를 효과적으로 촉진시켰다.Specifically, as confirmed in the embodiment of the present invention, when the recombinant GIP of the present invention to beta cells of the pancreas effectively promoted insulin secretion.

본 발명의 상기 새로운 재조합 GIP는 GIP, GLP-1 및 익센딘-4(exendin-4) 아미노산 서열에 기초하여 DPP-Ⅳ에 저항성이 있도록 설계 되었으며, GLP-1과 GIP 수용체에 공통으로 작용하여 인슐린 분비에 상승효과를 유도하도록 설계되었다. 또한 본 발명의 새로운 작용제에 DPP-Ⅳ에 대한 저항성을 주기 위해 2번째 아미노산을 모두 세린(Serine)으로 치환하였다. 인간 GLP-1과 익센딘-4(exendin-4) 및 인간 GIP의 아미노산 서열을 비교해 보았을 때, 아미노 말단 부위에서 GIP의 1번째 타이로신(Tyrosine), 7번째 아이소루신(Isoleucine)이 각각 GLP-1과 익센딘-4의 1번째 히스티틴(Histidine), 7번째 트레오닌(Threonine)과 차이를 보이는 것을 볼 수 있다. 또한 펩타이드의 중앙 부위에 있는 알파-헬릭스의 표면에 존재하고, 리간드-수용체의 결합에 중요하다고 알려진 다섯 개의 아미노산 중에서 11번째 세린(Serine), 22번째 페닐알라닌(Phenylalanine) 및 25번째 트립토판(Tryptophan)은 GLP-1, 익센딘-4(exendin-4) 및 GIP에서 공통으로 존재하지만, 15번째 글루탐산(Glutamic acid), 18번째 알라닌(Alanine)은 GLP-1과 익센딘-4에서는 동일하고, 15번째 아스파라긴산(Aspartic acid)와 18번째 히스티틴(Histidine)인 GIP와는 다르다. 이에, GLP-1과 GIP 수용체에 공통으로 작용하게 하기 위해, 1번째 아미노산은 GLP-1에서 유래한 히스티틴(Histidine) 또는 GIP에서 유래한 타이로신(Tyrosine)으로 하였으며, 7번째 아미노산은 GLP-1에서 기원한 트레오닌(Threonine) 또는 GIP의 아이소루신(Isoleucine)으로 하였다. 그리고 15번째 아미노산은 GLP-1에서 유래한 글루탐산(Glutamic acid) 또는 GIP에서 기원한 아스파라긴산(Aspartic acid)로 하였으며, 18번째 아미노산은 GLP-1의 알라닌(Alanine) 또는 GIP에서 유래한 히스티틴(Histidine)으로 하였다. 30번째 아미노산 이후부터 C-말단의 12개 아미노산을 제거하고, 익센딘-4(exendin-4) C-말단의 G-P-S-S-G-A-P-P-P-S의 10개 아미노산을 추가하거나 이들 C-말단을 추가하지 않았다. 그리고 모든 C-말단은 NH₂를 추가하여 아미데이션 하였다.The new recombinant GIP of the present invention is designed to be resistant to DPP-IV based on the GIP, GLP-1 and exendin-4 amino acid sequences, and acts in common to the GLP-1 and GIP receptors in insulin. Designed to induce synergistic effects on secretion. In addition, in order to give DPP-IV resistance to the new agent of the present invention, all of the second amino acids were substituted with Serine. Comparing the amino acid sequences of human GLP-1, exendin-4 and human GIP, the first tyrosine and seventh isoleucine of GIP at the amino terminus, respectively, GLP-1 And Ixendin-4's first histitin (Histidine), seventh threonine (Dreonine) and the difference can be seen. The 11th Serine, 22nd Phenylalanine and 25th Tryptophan are among the five amino acids that are present on the surface of the alpha-helix at the central site of the peptide and are known to be important for ligand-receptor binding. Common in GLP-1, exendin-4 and GIP, but the 15th glutamic acid and the 18th alanine are the same for GLP-1 and exendin-4, and the 15th It is different from Aspartic acid and GIP, the 18th histidine. Thus, in order to act in common to the GLP-1 and GIP receptors, the first amino acid was histitin derived from GLP-1 or tyrosine derived from GIP, and the seventh amino acid was GLP-1. Threonine (Threonine) or GIP isoleucine (Isoleucine) derived from. The 15th amino acid was glutamic acid derived from GLP-1 or aspartic acid derived from GIP. The 18th amino acid was alanine of GLP-1 or histidine derived from GIP. ). After the 30th amino acid, the 12 amino acids of the C-terminus were removed and 10 amino acids of GPSSGAPPPS of the exendin-4 C-terminus were added or these C-terminus were not added. And all C-terminals were amidated by adding NH ₂ .

본 발명의 재조합 GIP 화합물은 종래 알려진 통상의 고상 펩티드 합성 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 펩티드 합성기는 예컨대, 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystem, 캘리포니아주 포스터시티)으로부터 상업적으로 시판된다. 고상 합성을 위한 시약은 예컨대, 미드웨스트 바이오텍(Midwest Biotech, 인디애나주 피셔)으로부터 상업적으로 시판된다. 고상 펩티드 합성기는 간섭기를 차단, 반응에 대해 아미노산을 보호, 커플링(coupling), 디커플링 및 반응하지 않는 아미노산을 캡핑(capping)하기 위해 제조사의 지시에 따라 사용할 수 있다. 통상적으로, α-N-카바모일 보호된 아미노산 및 수지 상에서 성장하는 펩티드 쇄의 N-말단 아미노산은 실온의 불활성 용매, 예컨대 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈 또는 염화 메틸렌 중에서 디시클로헥실카르보디이미드 및 1-히드록시벤조트리아졸과 같은 커플링제 및 디이소프로필에틸아민과 같은 염기 존재 하에 커플링된다. α-N-카바모일 보호기를 트리플루오로아세트산 또는 피페리딘과 같은 시약을 사용하여 생성된 펩티드 수지로부터 제거하고, 커플링 반응을 그 다음의 원하는 N-보호된 아미노산을 사용하여 반복하여 펩티드 쇄에 첨가한다. 적합한 아민 보호기는 당업계에 공지되어 있고, 예컨대 전체 교시가 참고로 인용된 그린(Green) 및 웃츠(Wuts)의 Protecting Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, 1991에 기재되었다. 예로는 t-부틸옥시카르보닐(tBOC) 및 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)이 있다.The recombinant GIP compounds of the present invention can be prepared using conventional solid phase peptide synthesis methods known in the art. Peptide synthesizers are commercially available, for example, from Applied Biosystem, Foster City, CA. Reagents for solid phase synthesis are commercially available, for example, from Midwest Biotech, Fisher, Indiana. Solid phase peptide synthesizers can be used according to the manufacturer's instructions for blocking interferers, protecting, coupling, decoupling, and capturing amino acids that do not react. Typically, the N-terminal amino acids of peptide chains growing on α-N-carbamoyl protected amino acids and resins are dicyclohexylcarbodies in an inert solvent at room temperature such as dimethylformamide, N-methylpyrrolidone or methylene chloride. Coupling in the presence of a base such as diisopropylethylamine and a coupling agent such as mid and 1-hydroxybenzotriazole. The α-N-carbamoyl protecting group is removed from the resulting peptide resin using a reagent such as trifluoroacetic acid or piperidine, and the coupling reaction is repeated using the next desired N-protected amino acid to repeat the peptide chain. Add to Suitable amine protecting groups are known in the art and described, for example, in Protecting Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, 1991, Green and Wuts, which is incorporated by reference in its entirety. Examples are t-butyloxycarbonyl (tBOC) and fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc).

GLP-1은 베타 세포의 조절을 통하여 인슐린 분비를 촉진하고, 글루카곤의 분비를 억제하기 때문에 2형 당뇨병 치료제로서 새롭게 주목 받고 있다 [Gutniak et al., N Engl J Med 326:1316-1322, 1992; Nauck et al., J Clin Endocrinol Metab 76:912-917, 1993]. 그러나, 혈액 내에서 매우 짧은 반감기 때문에 치료제로서의 사용이 제한적이다 [Deacon et al., Diabetes 44:1126-1131, 1995; Ritzel et al., Diabetologia 38:720-725, 1995]. 이에, 당뇨병 치료제로서 DPP-Ⅳ 억제제 또는 DPP-Ⅳ에 저항성을 가지는 GLP-1 유사체를 개발하는 연구가 수행되었으며 [Gallwitz et al., Regul Pept 86:103-111, 2000; Deacon et al., Diabetologia 41:271-278, 1998], 이중 DPP-Ⅳ 억제제는 GLP-1의 혈중 분해를 막아 정상 혹은 당뇨병 모델 동물에서 인슐린 분비를 촉진하고 혈중 글루코스 농도를 낮추는 효과가 있다 [Ahren et al., Diabetes Care 25:869-875, 2002; Pauly et al., Metabolism 48:385-389, 1999; Holst et al., Diabetes 47:1663-1670, 1998; Deacon et al., Diabetes 47:764-769, 1998]. 하지만, DPP-Ⅳ가 GLP-1 뿐만 아니라 다양한 조절 펩타이드를 분해하는 효과가 있기 때문에, DPP-Ⅳ의 사용은 여러 조절 펩타이드의 분해를 억제하게 되어, 결과적으로 여러 부작용을 초래할 가능성이 높다. 반면, GLP-1 유사체는 다른 조절 펩타이드 분해에 영향을 미치지 않으며, GLP-1 수용체에 특이적으로 반응하므로, 당뇨병 치료제로써 DPP-Ⅳ을 사용하는 것보다 장점이 있다.GLP-1 attracts new attention as a treatment for type 2 diabetes because it promotes insulin secretion through regulation of beta cells and inhibits glucagon secretion [Gutniak et al., N Engl J Med 326: 1316-1322, 1992; Nauck et al., J Clin Endocrinol Metab 76: 912-917, 1993]. However, their very short half-life in the blood limits their use as therapeutic agents [Deacon et al., Diabetes 44: 1126-1131, 1995; Ritzel et al., Diabetologia 38: 720-725, 1995]. Accordingly, studies have been conducted to develop DPP-IV inhibitors or GLP-1 analogs resistant to DPP-IV as a diabetes treatment agent [Gallwitz et al., Regul Pept 86: 103-111, 2000; Deacon et al., Diabetologia 41: 271-278, 1998], of which DPP-IV inhibitors prevent the breakdown of GLP-1 in blood and promote insulin secretion and lower blood glucose levels in normal or diabetic model animals [Ahren et al., Diabetes Care 25: 869-875, 2002; Pauly et al., Metabolism 48: 385-389, 1999; Holst et al., Diabetes 47: 1663-1670, 1998; Deacon et al., Diabetes 47: 764-769, 1998]. However, since DPP-IV has the effect of degrading not only GLP-1 but also various regulatory peptides, the use of DPP-IV inhibits the degradation of various regulatory peptides, which is likely to result in various side effects. On the other hand, GLP-1 analogs do not affect the degradation of other regulatory peptides, and because they specifically respond to the GLP-1 receptor, there is an advantage over using DPP-IV as a therapeutic agent for diabetes.

GIP는 GLP-1과는 별도로, 또 다른 인크레틴으로 알려져 있으며, 베타 세포에 존재하는 GIP 수용체를 통하여 작용한다. 본 발명에서 확인한 바와 같이, GIP 및 GLP-1은 그들 고유의 수용체에 대해서만 활성을 유도하는 것을 확인하였다. 그러나, GLP-1과 GIP는 인슐린 분비에 있어서 상승효과를 유도하므로, GLP-1과 GIP 수용체에 동시에 작용할 수 있는 작용제는 효과적인 당뇨병 치료제로 사용될 가능성이 있다. 이에 따라, 본 발명에서는 상기와 같은 rcGIP를 제조하였으며, 이러한 rcGIP는 농도 의존적으로 GLP-1 및 GIP 수용체의 활성을 유도하였다. 또한, 이들 펩타이드들은 인슐린을 분비하는 insulinoma INS-1 세포에서 인슐린을 효과적으로 분비시킬 수 있음을 보였다. 따라서 본 발명의 rcGIP는 효과적인 당뇨병 치료제로써 사용가능할 것으로 사료된다.GIP, apart from GLP-1, is known as another incretin and acts through GIP receptors present in beta cells. As confirmed by the present invention, it was confirmed that GIP and GLP-1 induce activity only for their own receptors. However, since GLP-1 and GIP induce synergistic effects on insulin secretion, agents that can simultaneously act on GLP-1 and GIP receptors may be used as effective diabetes treatments. Accordingly, in the present invention, the above-described rcGIP was prepared, and this rcGIP induced the activity of GLP-1 and GIP receptors in a concentration-dependent manner. In addition, these peptides have been shown to be able to secrete insulin effectively in insulinoma INS-1 cells that secrete insulin. Therefore, rcGIP of the present invention is expected to be used as an effective diabetes treatment.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명에 따른 재조합 GIP 화합물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 및 비만 치료용 약제 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for treating osteoporosis and obesity, comprising the recombinant GIP compound according to the present invention as an active ingredient.

GIP는 골밀도를 증가시키며 [Xie et al., Bone 40:1352-1360, 2007], GLP-1은 중추신경계에서 식욕을 억제시키는 작용을 하는 것이 알려져 있으므로 [Zander et al., Lancet 359:824-830, 2002], 따라서 본 발명에 따른 GLP-1 수용체 및 GIP 수용체를 동시에 활성화시키는 재조합 GIP 화합물은 골다공증 및 비만을 예방 및 치료할 수 있다.GIP increases bone mineral density [Xie et al., Bone 40: 1352-1360, 2007], and GLP-1 is known to inhibit appetite in the central nervous system [Zander et al., Lancet 359: 824- 830, 2002], thus, recombinant GIP compounds which simultaneously activate the GLP-1 receptor and GIP receptor according to the present invention can prevent and treat osteoporosis and obesity.

본 발명의 약학 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여형태로 제형화할 수 있다. 경구 투여용 제형으로는 예를 들면, 정제, 환제, 경.연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘리시르제 (elixirs) 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예컨대, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 또는 글리신), 활택제 (예컨대, 실리카, 탈그, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리게이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알길산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.The pharmaceutical compositions of the invention can be formulated in a variety of oral or parenteral dosage forms. Formulations for oral administration include, for example, tablets, pills, light and soft capsules, solutions, suspensions, emulsifiers, syrups, granules, elixirs, and the like. Lactose, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose or glycine), glidants (e.g., silica, talc, stearic acid and its magnesium or calcium salts or polyethylene glycols). Tablets may also contain binders such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose or polyvinylpyrrolidine, optionally starch, agar, alginic acid or Disintegrating or boiling mixtures such as sodium salts or absorbents, colorants, flavoring agents, and sweetening agents.

또한 재조합 GIP(rcGIP) 펩타이드 및 그의 유사체를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사를 주입하는 방법에 의한다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 rcGIP 펩타이드 및 이의 유사체를 안정화 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제조할 수 있다.In addition, the pharmaceutical composition containing the recombinant GIP (rcGIP) peptide and its analogs as an active ingredient may be administered parenterally, and the parenteral administration may be by injection of subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, or intrathoracic injection. . At this time, the rcGIP peptide and its analogs may be prepared in solution or suspension by mixing in water with a stabilizing or buffering agent to formulate into a dosage form for parenteral administration, and may be prepared in unit dosage form of ampoules or vials.

상기 약학 조성물은 멸균되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.The pharmaceutical composition may be sterile or contain preservatives, stabilizers, hydrating or emulsifying accelerators, auxiliaries such as salts or buffers for the control of osmotic pressure, and other therapeutically useful substances and may be mixed, granulated or coated in a conventional manner. It can be formulated according to the method.

유효성분으로서 재조합 GIP 펩타이드 및 이의 유사체는 사람을 포함하는 포유동물에 대해 하루에 0.01 내지 500 mg/kg(체중), 바람직하게는 0.1 내지 50 mg/kg(체중)의 양으로 1일 1회 또는 분할하여 경구 또는 비경구적 경로를 통해 투여할 수 있다. 투여량은 환자의 연령, 성별, 질병의 경중에 따라 적절히 선택할 수 있다.
As an active ingredient, the recombinant GIP peptide and its analogs may be used once daily in an amount of 0.01 to 500 mg / kg body weight, preferably 0.1 to 50 mg / kg body weight, for mammals including humans, or Can be administered in divided oral or parenteral routes. The dosage may be appropriately selected depending on the age, sex and severity of the patient.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 재조합 GIP(rcGIP) 작용제는 펩타이드 분해효소 DPP-Ⅳ에 저항성이 있으며, GLP-1 및 GIP 수용체를 동시에 활성화시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 rcGIP 작용제는 하나의 수용체에 단독으로 작용하는 작용제와는 다르게, 췌장의 베타 세포에서 효과적으로 인슐린을 분비시킬 수 있으므로, 1형 및 2형 당뇨병 치료에 매우 효과적일 것으로 사료될 뿐만 아니라, 비만 치료 및 골다공증 치료에도 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
As described above, the recombinant GIP (rcGIP) agonist prepared according to the present invention is resistant to peptide degrading enzyme DPP-IV and can simultaneously activate GLP-1 and GIP receptors. Therefore, rcGIP agonists of the present invention, unlike agonists acting solely on one receptor, can effectively secrete insulin in the beta cells of the pancreas, and thus are not only effective for treating type 1 and type 2 diabetes. It may be useful for the treatment of obesity and osteoporosis.

도 1은 흰쥐 GLP-1 수용체(A)와 인간 GIP 수용체(B)에 대한 GLP-1 및 GIP의 활성을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 인간 GLP-1, 익센딘-4(exendin-4) 및 인간 GIP의 아미노산 서열 비교를 나타낸 도면이다.
도 3은 GLP-1 수용체(A)와 GIP 수용체(B)에 대한 재조합 GIP(rcGIP)의 활성을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 GLP-1 수용체(A)와 GIP 수용체(B)에 대한 한 개 또는 두 개의 아미노산을 치환시킨 각각의 재조합 GIP(rcGIP)의 활성을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 GLP-1 수용체(A)와 GIP 수용체(B)에 대한 [Y¹]rcGIP, [Y¹I⁷]rcGIP 및 익센딘-4(exendin-4)의 꼬리를 도입한 [Y¹]rcGIP-E4, [Y¹I⁷]rcGIP-E4의 활성을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 베타 세포에서 각각의 재조합 GIP들에 의한 인슐린 분비 측정 결과를 나타낸 도면이다.1 shows the results of measuring the activity of GLP-1 and GIP on rat GLP-1 receptor (A) and human GIP receptor (B).
2 shows a comparison of amino acid sequences of human GLP-1, exendin-4 and human GIP.
Figure 3 is a view showing the results of measuring the activity of recombinant GIP (rcGIP) to the GLP-1 receptor (A) and GIP receptor (B).
Figure 4 shows the results of measuring the activity of each recombinant GIP (rcGIP) substituted one or two amino acids for the GLP-1 receptor (A) and GIP receptor (B).
A 5 is introduced into the tail of the GLP-1 receptor (A) and the ^{GIP [Y 1] rcGIP, [} Y 1 I 7] rcGIP and ripening sendin -4 (exendin-4) to the receptor (B) [Y ^1] rcGIP-E4, shows the results obtained by measuring the [Y ¹ I ^7] activity of rcGIP-E4.
6 is a diagram showing the results of insulin secretion by each recombinant GIP in beta cells.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. Since these examples are only for illustrating the present invention, the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.

실시예Example 1. 흰쥐 White rat GLPGLP -1 수용체 및 인간 -1 receptor and human GLPGLP -1 수용체에 대한 For -1 receptor GLPGLP -1 및 -1 and GIPGIP 활성 측정 Active measurement

흰쥐 GLP-1 수용체 및 인간 GLP-1 수용체의 cDNA는 Dr. Bernard Thorens(Institute of Pharmacology and Toxicology, Lausanne, Switzerland)로부터 제공받았다. CRE-luc 벡터는 cyclic AMP-responsive element(CRE; TGACGTCA)가 4번 반복된 구조를 가진 프로모터와 루시퍼레이즈 유전자를 합성한 표지유전자로, Stratagene(La Jolla, CA)에서 구입하였다.CDNA of rat GLP-1 receptor and human GLP-1 receptor Provided by Bernard Thorens (Institute of Pharmacology and Toxicology, Lausanne, Switzerland). The CRE-luc vector is a labeling gene that synthesizes a promoter and luciferase gene that has a cyclic AMP-responsive element (CRE; TGACGTCA) four times, and was purchased from Stratagene (La Jolla, CA).

HEK 293T 세포를 37 ℃에서 10% heat-inactivated fetal bovine serum을 포함한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Life Technologies, Grand Island, NY) 배양액에서 배양하였다. 이후, 세포를 24-웰 플레이트에 배양시키고, 수용체 플라스미드(200 ng)와 CRE-luc 플라스미드(200 ng) 및 CMV-β-galactosidase 플라스미드(200 ng)를 동시에 Effectene reagent(QUIAGEN, Chatsworth, CA)를 이용하여 세포에 도입하였다. 48 시간 후, 세포에 GLP-1, GIP, rcGIP 및 유사 펩타이드를 6 시간 동안 처리하고, 세포 추출물에서 Multi-label counter(Perkin Elmer, Wellesley, MA)를 이용하여 루시퍼레이즈 활성을 측정하였다. 측정된 루시퍼레이즈 활성도를 β-galactosidase 활성도로 표준화 하였다. 상기 실험을 3회 이상 반복하였으며, 1회 실험마다 각 실험군에서 3 개의 시료로부터 얻은 평균값을 사용하여 결과를 정리하였다. 실험결과는 GraphPad PRISM4 software(GraphPad, USA) 프로그램을 이용하여 비직선회기하여 시그모이드 농도 의존적 그래프를 얻었다. 또한 동일한 프로그램을 이용하여 EC₅₀(half-maximal stimulation) 또는 Emax(maximum-fold increase) 값을 구하였다. 측정 결과는 도 1에 나타내었다.HEK 293T cells were cultured in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, Life Technologies, Grand Island, NY) culture containing 10% heat-inactivated fetal bovine serum at 37 ° C. Cells were then incubated in 24-well plates, and receptor plasmids (200 ng), CRE-luc plasmids (200 ng) and CMV-β-galactosidase plasmids (200 ng) were simultaneously applied with Effectene reagents (QUIAGEN, Chatsworth, CA). Was introduced into the cells. After 48 hours, cells were treated with GLP-1, GIP, rcGIP and similar peptides for 6 hours, and luciferase activity was measured in the cell extract using a Multi-label counter (Perkin Elmer, Wellesley, Mass.). The luciferase activity measured was normalized to β-galactosidase activity. The experiment was repeated three or more times, and the results were summarized using the average value obtained from three samples in each experimental group for each experiment. Experimental results were obtained by linear graphing using GraphPad PRISM4 software (GraphPad, USA) program to obtain sigmoid concentration-dependent graph. In addition, the same program was used to obtain half-maximal stimulation (EC ₅₀ ) or maximum-fold increase (Emax) values. The measurement result is shown in FIG.

도 1에 나타낸 바와 같이, GLP-1은 GLP-1 수용체(EC₅₀: 0.03 nM)를 발현하는 세포에서 농도 의존적으로 CRE-루시퍼레이즈 활성을 증가시켰으나, GIP 수용체를 발현하는 세포에서는 루시퍼레이즈 활성을 증가시키지 못했다. 또한, GIP는 GIP 수용체를 활성화시키는데 매우 높은 효능을 보임을 확인하였다. GIP는 매우 높은 농도(1 μM)에서 GLP-1 수용체를 활성화시킬 수 있지만, GLP-1 수용체에 대한 GIP의 효능은 GIP 수용체에 대한 효능보다 매우 낮았다. 상기의 결과로, GLP-1과 GIP는 그들 각각의 고유의 수용체에만 결합을 하고, 서로 다른 수용체에는 결합을 하지 않는 것을 확인할 수 있다.
As shown in FIG. 1, GLP-1 increased CRE-luciferase activity in a concentration-dependent manner in cells expressing the GLP-1 receptor (EC ₅₀ : 0.03 nM), but did not increase luciferase activity in cells expressing the GIP receptor. Failed to increase. In addition, GIP was found to show a very high efficacy in activating the GIP receptor. GIP could activate the GLP-1 receptor at very high concentrations (1 μM), but the efficacy of GIP on the GLP-1 receptor was much lower than that on the GIP receptor. As a result, it can be seen that GLP-1 and GIP bind only to their own receptors, but not to different receptors.

실시예 2. 인간 GLP-1, 익센딘-4(exendin-4) 및 GIP의 아미노산 서열 비교Example 2. Amino Acid Sequence Comparison of Human GLP-1, Exendin-4, and GIP

GLP-1과 GIP의 활성에 중요한 아미노산 잔기를 찾고자 GLP-1과 GIP 및 독도마뱀의 침샘에서 발견된 익센딘-4(exendin-4)의 아미노산 서열을 비교하였다. 익센딘-4(exendin-4)는 GLP-1 수용체에 높은 활성을 가지는 작용제이며, GLP-1과 약 50%의 아미노산 서열 상동성을 가진다. 이와 같이, 아미노산 서열을 비교함으로써 GLP-1과 GIP 각각의 수용체와의 결합에 중요할 것이라 생각되는 아미노산 잔기를 추측할 수 있다. 펩타이드의 아미노산 서열 비교를 쉽게 하기 위해, GLP-1의 일곱 번째 잔기인 His를 GIP와 익센딘-4와 같이 첫 번째 아미노산으로 하고, 여덟 번째인 Ala를 두 번째 아미노산으로 하고, 뒤이은 아미노산 또한 이러한 방식으로 번호를 매겼다. To find the amino acid residues important for the activity of GLP-1 and GIP, the amino acid sequences of exendin-4 found in the salivary glands of GLP-1 and GIP and lizards were compared. Exendin-4 is an agent with high activity on the GLP-1 receptor and has about 50% amino acid sequence homology with GLP-1. Thus, by comparing the amino acid sequences, it is possible to infer amino acid residues which are considered to be important for binding of the receptors of GLP-1 and GIP. To make it easier to compare amino acid sequences of peptides, His, the seventh residue of GLP-1, is the first amino acid, such as GIP and Ixendin-4, and the eighth, Ala, is the second amino acid. Numbered in the way.

도 2 및 표 1에 보이는 바와 같이, GLP-1과 익센딘-4(exendin-4) 및 GIP의 아미노 말단 부분은 높은 아미노산 상동성을 보였으며, 가운데 위치한 알파-헬릭스(α-helix) 모양을 이루는 부위와 카르복시 말단은 아미노산 서열에서 많은 차이를 보였다. 아미노 말단에서, GIP의 첫 번째(Tyr)와 일곱 번째(Ile) 아미노산이 같은 위치의 GLP-1과 익센딘-4와 차이를 보였다. 중앙의 알파-헬릭스 분위의 11번째 Ser, 22번째 Phe 및 25번째 Trp는 세 개의 펩타이드에서 모두 동일했지만, 15번째 Glu와 18번째 Ala는 GLP-1과 익센딘-4에서는 동일한 반면 GIP에서는 15번째 Asp와 18번째 His로 차이를 보였다. GIP와 GLP-1의 아미노산 비교에서, 아미노 말단의 1번째와 7번째 그리고 알파-헬릭스 부위의 15번째와 18번째 아미노산의 차이는, 이러한 아미노산들이 각각의 수용체와의 결합에서 리간드 선택성에 관여할 것이라는 것을 시사한다. 따라서 본 발명에서는 GIP에 GLP-1의 아미노산인 1번째 Tyr, 7번째 Ile, 15번째 Asp 및 18번째 His를 치환해서 재조합 GIP(rcGIP)를 제조하였다. 또한 상기 재조합 펩타이드는 DPP-IV에 대한 저항성을 주기 위하여, 2번째 아미노산을 Ser로 치환하였으며, GIP 수용체와의 결합에서 중요하지 않다고 알려진 카르복시 말단의 12 개의 아미노산을 제거하였다.
As shown in FIG. 2 and Table 1, the amino terminal portions of GLP-1, exendin-4, and GIP showed high amino acid homology, and showed a central alpha-helix shape. The constituent site and the carboxy terminus showed a lot of difference in amino acid sequence. At the amino terminus, the first (Tyr) and seventh (Ile) amino acids of GIP differed from GLP-1 and exendin-4 at the same position. The 11th Ser, 22nd Phe and 25th Trp of the central alpha-helix quartile were identical in all three peptides, but the 15th Glu and the 18th Ala were the same for GLP-1 and Ixendin-4, while the 15th for GIP The difference was as Asp and 18th His. In comparing the amino acids of GIP and GLP-1, the difference between the 1st and 7th amino acids of the amino terminus and the 15th and 18th amino acids of the alpha-helix site indicates that these amino acids will be involved in ligand selectivity in binding to each receptor. Suggests that. Therefore, in the present invention, recombinant GIP (rcGIP) was prepared by replacing GIP-1 with amino acids of GLP-1, 1st Tyr, 7th Ile, 15th Asp, and 18th His. The recombinant peptide also replaced Ser with the second amino acid in order to provide resistance to DPP-IV, and removed the 12 amino acids at the carboxy terminus that were not important for binding to the GIP receptor.

[표 1.GLP-1, GIP 및 재조합 GIP의 아미노산 서열]TABLE 1.Amino Acid Sequences of GLP-1, GIP, and Recombinant GIP

실시예Example 3. 재조합 3. Recombination GIPGIP (( rcGIPrcGIP ) ) 펩타이드의Peptide 효능 측정 Efficacy Measurement

실시예 1에서와 같이, HEK293T 세포에서의 루시퍼레이즈 활성 시스템을 이용하여, GIP 수용체와 GLP-1 수용체에 대한 rcGIP의 효능을 측정하였다. 측정 결과는 도 3에 나타내었다.As in Example 1, the luciferase activity system in HEK293T cells was used to measure the efficacy of rcGIP on GIP receptors and GLP-1 receptors. The measurement results are shown in FIG. 3.

도 3에 나타낸 바와 같이, GIP의 1번째 Tyr, 7번째 Ile, 15번째 Asp 및 18번째 His가 GLP-1의 His, Thr, Glu 및 Ala로 치환된 재조합 GIP(rcGIP)는 GIP 및 GLP-1의 결과와 비교하여 비슷한 수준으로 GLP-1 수용체 및 GIP 수용체를 활성화 시켰다. 이러한 결과는 GIP에 GLP-1의 아미노산을 치환하면, GLP-1 수용체에 대한 결합력을 높일 수 있으며, GIP 수용체 또한 여전히 활성화 시킬 수 있음을 보여준다.As shown in FIG. 3, recombinant GIP (rcGIP) in which the 1st Tyr, 7th Ile, 15th Asp, and 18th His of GIP was substituted with His, Thr, Glu, and Ala of GLP-1 was expressed as GIP and GLP-1. In comparison with the results, the GLP-1 receptor and GIP receptor were activated at a similar level. These results show that the substitution of GLP-1 amino acid in GIP can increase the binding capacity to the GLP-1 receptor and still activate the GIP receptor.

본 발명자들은 또한, GIP/GLP-1 수용체 선택성을 야기하는 아미노산 잔기를 찾기 위해, rcGIP의 하나 또는 두 개의 아미노산을 GIP의 것으로 치환하여 새로운 펩타이드를 제조한 후, 루시퍼레이즈 활성을 측정하였다 (도 4).We also replaced the one or two amino acids of rcGIP with those of GIP to find new amino acid residues that result in GIP / GLP-1 receptor selectivity, and then produced luciferase activity (FIG. 4). ).

먼저, 첫 번째 His만을 Tyr로 치환한 rcGIP([Y¹]rcGIP)는 GIP 수용체의 활성을 매우 높였으며, 이는 GIP에 의한 활성과 비슷한 수준이었다. 그러나 GLP-1 수용체에 대한 활성은 rcGIP와 비교해서 약간 낮았다. 이러한 결과는 GIP의 1번째 아미노산인 Tyr이 GIP 수용체와의 결합과 활성에 매우 중요하다는 것과, GLP-1 수용체의 리간드 결합에 있어서 1번째 아미노산의 Tyr로의 치환은 크게 중요하지 않다는 것을 나타낸다. 그리고, 7번째 아미노산을 Ile로 치환한 rcGIP([I⁷]rcGIP)의 GIP 수용체에 대한 효능은 rcGIP에 비해 약 5배 증가하였으나, GLP-1 수용체를 활성화 시키는 능력은 10배 이상 감소하였다. 이는 각각 GIP와 GLP-1의 7번째 아미노산인 Ile와 Thr이 각 수용체의 리간드 선택성을 결정하는데 주우요한 역할을 할 수 있음을 시사한다.First, rcGIP ([Y ¹ ] rcGIP), in which only the first His was substituted with Tyr, significantly increased the activity of the GIP receptor, which was similar to that of GIP. However, activity against the GLP-1 receptor was slightly lower compared to rcGIP. These results indicate that Tyr, the first amino acid of GIP, is very important for binding and activity of the GIP receptor, and that substitution of the first amino acid with Tyr for ligand binding of the GLP-1 receptor is not very important. In addition, the efficacy of rcGIP ([I ⁷ ] rcGIP) substituted with the 7th amino acid with Ile was increased about 5 times compared to rcGIP, but the ability to activate GLP-1 receptor was reduced by more than 10 times. This suggests that the seventh amino acids of GIP and GLP-1, Ile and Thr, may play a major role in determining ligand selectivity of each receptor.

또한 rcGIP의 1번째 아미노산을 Tyr로, 7번째 아미노산을 Ile로 동시에 치환한 rcGIP([Y¹I⁷]rcGIP)의 경우, GIP 수용체에 대한 효능이 매우 높았으며, GLP-1 수용체를 활성화 시키는 능력은 매우 낮아 GIP와 비슷한 효능을 보였다. 그리고 15번째 아미노산을 Asp로, 18번째 아미노산을 His로 치환한 rcGIP([D¹⁵H¹⁸]rcGIP)은 rcGIP와 비교하여 GIP 수용체와 GLP-1를 활성화시키는데 근소한 차이를 보였다 (도 4a 및 4b). 상기의 결과로 GIP/GLP-1 펩타이드의 1번째 Tyr/His와 7번째 Ile/Thr가 GIP 수용체와 GLP-1 수용체의 리간드 선택성에 있어서 매우 중요한 역할을 한 것이라는 것을 제안할 수 있다.
In addition, rcGIP ([Y ¹ I ⁷ ] rcGIP), in which the first amino acid of rcGIP was replaced with Tyr and the seventh amino acid with Ile, had a high effect on the GIP receptor and the ability to activate the GLP-1 receptor. Was very low, similar to GIP. And rcGIP ([D ¹⁵ H ¹⁸ ] rcGIP), in which the ^15th amino acid was replaced with Asp and the 18th amino acid with His, showed a slight difference in activating the GIP receptor and GLP-1 compared to rcGIP (FIGS. 4A and 4B). . The above results suggest that the first Tyr / His and the seventh Ile / Thr of the GIP / GLP-1 peptide played a very important role in ligand selectivity of the GIP receptor and the GLP-1 receptor.

실시예Example 4. 4. rcGIPrcGIP 에 on 익센딘Ixendin -4(-4( exendinexendin -4)의 꼬리를 붙인 재조합 Tailed recombination 펩타이드의Peptide 효능 측정 Efficacy Measurement

익센딘-4(exendin-4)의 꼬리는 익센딘-4와 GLP-1 수용체의 세포외(extracellular) 부분과의 친화력을 높인다고 알려져 있다 [Al-Sabah and Donnelly, Br J Pharmacol 140:339-346, 2003]. 이러한 꼬리부분이 GLP-1 수용체 및 GIP 수용체에 대한 재조합 GIP의 효능에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해, [Y¹]rcGIP와 [Y¹I⁷]rcGIP에 익센딘-4의 꼬리부분의 10개 아미노산을 더하여 [Y¹]rcGIP-E4와 [Y¹I⁷]rcGIP-E4를 제조하였다. 이후 상기 제조된 펩타이드에 대한 루시퍼레이즈 활성을 측정하였다. 측정 결과는 도 5 및 표 2에 나타내었다.The tail of exendin-4 is known to enhance the affinity of the exendin-4 with the extracellular portion of the GLP-1 receptor [Al-Sabah and Donnelly, Br J Pharmacol 140: 339-346. , 2003]. To determine how these tails affect the efficacy of recombinant GIP on GLP-1 receptors and GIP receptors, 10 of the tails of exendin-4 in [Y ¹ ] rcGIP and [Y ¹ I ⁷ ] rcGIP Amino acids were added to prepare [Y ¹ ] rcGIP-E4 and [Y ¹ I ⁷ ] rcGIP-E4. Thereafter, luciferase activity of the prepared peptide was measured. The measurement results are shown in FIG. 5 and Table 2.

측정 결과, 익센딘-4(exendin-4) 꼬리를 가지고 있는 [Y¹]rcGIP-E4 및 [Y¹I⁷]rcGIP-E4의 GLP-1 수용체 및 GIP 수용체에 대한 효능은 [Y¹]rcGIP와 [Y¹I⁷]rcGIP와 비교하여 큰 차이를 보이지 않았다.
The results showed that the efficacy of [Y ¹ ] rcGIP-E4 and [Y ¹ I ⁷ ] rcGIP-E4 with exendin-4 tails on the GLP-1 receptor and GIP receptor was [Y ¹ ] rcGIP. And [Y ¹ I ⁷ ] showed no significant difference compared to rcGIP.

[표 2. GLP-1 수용체와 GIP 수용체의 리간드 선택성]Table 2. Ligand Selectivity of GLP-1 and GIP Receptors]

실시예Example 5. 췌장의 베타 세포에서 재조합 5. Recombination in the Beta Cells of the Pancreas GIPGIP 들에 의한 인슐린 분비Insulin secretion

랫트에서 유래한 췌장 베타 세포인 INS-1 세포를 2×10⁵/well 배양하면서, 16.7 mM의 글루코스를 처리하거나, 글루코스 16.7 mM이 있는 상태에서 1 μM의 GLP-1, GIP 및 재조합 GIP들을 처리한 후, 인슐린 분비를 인슐린 검출 키트(rat/mouse insulin ELISA kit, Linco Research, St Charles, Missouri, USA)를 이용하여 측정하였다. 측정 결과는 도 6에 나타내었다.INS-1 cells, which are pancreatic beta cells derived from rats, were treated with 2 × 10 ⁵ / well of 16.7 mM glucose or 1 μM of GLP-1, GIP and recombinant GIPs with 16.7 mM glucose. Afterwards, insulin secretion was measured using an insulin detection kit (rat / mouse insulin ELISA kit, Linco Research, St Charles, Missouri, USA). The measurement results are shown in FIG. 6.

측정 결과, 1.67 mM 글루코스가 있는 상태에서 GLP-1과 GIP 및 재조합 GIP 모두 효과적으로 인슐린 분비를 촉진시킴을 확인하였다.
As a result, it was confirmed that both GLP-1, GIP and recombinant GIP promote insulin secretion in the presence of 1.67 mM glucose.

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Claims

A recombinant GIP compound comprising the amino acid sequence of Formula I:
(I)
Xaa1-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Xaa7-Ser-Asp-Tyr-Thr-Ile-Ala-Met-Xaa15-Lys-Ile-Xaa18-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp- Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-R
Wherein Xaa1 is His or Tyr, Xaa7 is Thr or Ile, Xaa15 is Glu or Asp, Xaa18 is Ala or His, and R is Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro -Ser-NH ₂ or NH ₂ .

The recombinant GIP compound of claim 1, wherein the compound comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

The recombinant GIP compound according to claim 1, wherein the compound comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO.

The recombinant GIP compound according to claim 1, wherein the compound comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO. 7.

The recombinant GIP compound according to claim 1, wherein the compound has resistance to peptide degrading enzymes.

The recombinant GIP compound according to claim 1, wherein the compound simultaneously activates the GLP-1 receptor and the GIP receptor.

A pharmaceutical composition for treating type 1 and type 2 diabetes, comprising the recombinant GIP compound of any one of claims 1 to 8 as an active ingredient.

A pharmaceutical composition for treating osteoporosis and obesity, comprising the recombinant GIP compound of any one of claims 1 to 8 as an active ingredient.