KR101080955B1 - 인슐린 분비를 증가시키고 혈당을 감소시키는 표피성장인자 - Google Patents

Abstract

본 발명자들은 단시간에 표피성장인자를 처리한 경우 Ca2+ 유입과 PLD2-의존적 기작을 통해 인슐린 분비를 글루코오스-비의존적으로 촉진할 수 있음을 밝혔다. 게다가 본 발명자들은 표피성장인자가 정상 및 당뇨병 있는 마우스에서 혈장 글루코오스 수치를 낮출 수 있는 신규한 분비촉진제임을 밝혔다

.

Description

인슐린 분비를 증가시키고 혈당을 감소시키는 표피성장인자{EPIDERMAL GROWTH FACTOR INCREASES INSULIN SECRETION AND LOWERS BLOOD GLUCOSE}

본 발명은 당뇨병의 예방 또는 치료제 및 당뇨병의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 혈당 수치를 조절제 및 혈당 수치를 조절하는 방법, 포유동물에서 글루코오스-비의존적인 인슐린 분비를 유도하는 제제를 확인하는 방법 및 당뇨병 또는 저혈당 수치를 진단하는 방법에 관한 것이다.

본 출원은 2006년 7월 14일자로 출원된 미국특허출원 제60/807,374호의 전문을 우선권 주장하고, 참조로서 포함한다.

췌장 베타-세포(pancreatic β-cells)의 주된 기능은 혈당변동을 제한하기 위하여 적절한 비율로 인슐린을 합성하고 분비하는 것이다. 인슐린이 과도하게 분비되면 저혈당증(hypoglycemia)이 발생하며, 불충분하게 분비되면 당뇨병이 발생한다. 따라서 체내에서 글루코오스-항상성을 확보하기 위해, 인슐린 분비가 매우 엄격히 통제되는 것은 당연하다. 인슐린은 췌장 베타-세포의 분비 과립(secretory granules)에서 저장되며 분비촉진제(secretagogues)의 자극을 받아 세포외로 분 비(exocytosis)된다. 베타 세포의 활성 정도는 글루코오스, 아미노산, 지방산, 신경전달물질 및 호르몬을 포함한 여러 다른 자극제에 의해 결정된다. 면밀한 연구에도 불구하고 상기 자극-분비의 관계와 관련된, 그리고 인슐린 분비의 절묘한 조절을 유지하는 과정은 아직도 완전히 밝혀지지 않고 있다.

당뇨병은 모든 세대와 집단에 걸쳐서 가장 일반적인 내분비 질환 중 하나이다. 당뇨병에는 2가지 주요 형태가 있다: 모든 경우에서 5~10%를 차지하는 인슐린 의존성 당뇨병(제1형 당뇨병, IDDM), 및 대략 90%를 차지하는 인슐린 비의존성 당뇨병(제2형 당뇨병, NIDDM). 비록 젊은 사람들이 소위 MODY(maturity onset diabetes of the young)로 불리는 제2형 당뇨병으로 진단되는 경우가 증가하고 있는 경향이 있음에도 불구하고, 상기 제2형 당뇨병은 연령의 증가와 관련이 있다. 상기 제1형 당뇨병 및 제2형 당뇨병 모두에서, 췌장 베타-세포의 파괴나 불완전한 인슐린 생산이나 분비를 통하여 인슐린 분비가 감소한다. 제2형 당뇨병 환자는 전형적으로 적절한 식이요법, 체중감량 및 운동을 통해 치료를 시작한다.

상기 제2형 당뇨병은 인슐린 저항 및 인슐린 분비 감소가 특징이다. 상기 인슐린 분비 제어는 주로 글루코오스 그 자체로 조절되지만, 또한 일련의 물질대사, 신경, 호르몬 그리고 때로는 약리적 요인들이 관여한다. 개시인자(Initiator)는 다른 자극이 부족할 때 인슐린 분비를 증가시킬 수 있지만, 증강제(potentiator)는 개시인자, 대게는 글루코오스가 존재하여야 한다(Hedeskov CJ et al., Physiol Rev 60:442-509, 1980). 당뇨병 치료로 야기된 저혈당증은 심각한 문제를 초래한다고 많이 보고되고 있다.

표피성장인자(epidermal growth factor)는 다양한 형태의 세포들, 특히 섬유모세포 및 상피세포의 증식을 위한 중요한 성장인자이다. 상기 표피성장인자는 또한 첨단체 세포외분비(acrosomal exocytosis) 및 여러 호르몬의 분비와 같은 분비 사건을 유도할 수 있다. 상기 일부 표피성장인자는 췌장의 발달에 소정의 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 체외에서 표피성장인자 및 백혈병 억제인자(leukemia inhibitory factor)를 처리하면 인슐린을 생산하는 베타-세포군이 발생한다(Baeyens L et al., Diabetologia 48:49-57, 2005). 표피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor)는 인간 태아 췌장에서 발현되며, 표피성장인자 수용체가 결핍된 마우스는 비정상적인 췌장섬(pancreatic islets)을 보여준다(Miettinen PJ, et al., Development 127:2617-2627, 2000). 상기 표피성장인자는 또한 쥐의 췌장 베타-세포의 인슐린 양과 재생에 관련이 있는 것으로 보여진다(Li L, et al., Diabetes 53:608-615, 2004; Brand SJ, et al., Pharmacol Toxicol 91:414-420, 2002; Suarez-Pinzon WL et al., Diabetes 54:2596-2601, 2005). 또한 상기 표피성장인자는 췌장에서 생산되며, 당뇨병이 있는 동물에서는 표피성장인자의 순환 수준 및 표피성장인자 수용체가 감소된다(Burgess AW, Br Med Bull 45:401-424, 1989; Kasayama S, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 86:7644-7648, 1989; Kashimata M, et al., Biochim Biophys Acta 923:496-500, 1987). 그러나 인슐린 분비와 같은 췌장 기능의 조정에 의한 글루코오스 조절과 관련된 표피성장인자의 역할은 아직 연구된 바가 없다.

인슐린 분비는 주로 세포내 Ca2+의 상승에 의해 유도되지만, 여러 단백질 키 나아제(protein kinases) 및 포스포리파아제(phospholipases)와 같은 세포내 신호에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 포유류의 PLD(phospholipase D)는 성장인자를 포함한 다양한 신호에 대응해 다기능성 지질(multifunctional lipid), 포스파티드산(phosphatidic acid)을 생산하기 위하여 포스파티딜콜린을 가수분해하는 세포막 결합형 효소(membrane bound enzyme)이다(Exton JH, Biochim Biophys Acta 1439:121-133, 1999). 상기 포스파티드산은 다양한 생리적 사건에 관여하는 세포내 지질 이차전령(second messenger)이다. 이러한 발견은 작용제(agonist)로 유도된 PLD(phospholipase D) 활성이 다양한 신호 사건에서 어떤 역할을 담당할 수도 있음을 시사한다(Jones D, et al., Biochim Biophys Acta 1439:229-244, 1999; Honda A, et al., Cell 99:521-532, 1999). 지금까지, 두 가지 형태의 포유류 PLD(PLD1 및 PLD2)가 복제되었다. 상기 PLD1 및 PLD2는 약 50%의 서열 상동성을 가지고 있으며 유사한 조절성 도메인을 포함하고 있지만 국소화 및 조절 단백질 상호작용에서 차이를 보여준다(Frohman MA, et al., Biochim Biophys Acta 1439:175-186, 1999). PLD 활성은 다양한 트래픽킹 과정(trafficking processes), 특히 세포외분비의 조절에 관여할 수 있다(Jones D, et al., Biochim Biophys Acta 1439:229-244, 1999). 상기 PLD1 및 PLD2는 2단계 과정에 의해 비만세포에서 다른 양상의 세포외분비를 조절한다(Choi WS, et al., J Immunol 168:5682-5689, 2002). 또한 포스파티드산은 인슐린 세포외분비의 중요한 매개체이다(Metz SA, Biochem J 270:427-435, 1990).

(기술적 과제)

그러나 인슐린 분비와 같은 췌장 기능의 조정에 의한 글루코오스 조절과 관련된 표피성장인자의 역할은 아직 연구된 바가 없으며, 분비촉진제(secretagogues)에 의한 PLD(phospholipase D)의 특이적 조절은 여전히 불확실하다.

본 발명자들은 표피성장인자를 짧게 처리하면 Ca2+ 유입과 PLD2(phospholipase D-2) 의존성 기작을 통해 글루코오스-비의존적인 인슐린 분비가 촉진됨을 밝혔다. 또한 본 발명은 표피성장인자(epidermal growth factor) 가 정상적인 또는 당뇨병이 있는 마우스에서 혈장 글루코오스 수치를 감소시키는 신규한 분비촉진제(secretagogues)임을 밝히고, 당뇨병에서 표피성장인자에 의한 치료 가능성을 제시한다.

본 발명의 일구체예에서, 표피성장인자(epidermal growth factor)를 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 표피성장인자를 함유하는 인슐린-분비 제제를 제공하며, 보다 바람직하게는 표피성장인자를 함유하는 글루코오스-비의존적인 인슐린-분비 제제를 제공한다. 상기 표피성장인자는 글루코오스-비의존적으로 췌장 베타-세포의 인슐린 분비를 촉진한다. 또한 본 발명은 개체에 표피성장인자를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 당뇨병의 치료 방법을 제공한다. 상기 표피성장인자의 유효량은 인슐린 분비를 개시할 수 있는 양이다.

본 발명의 또 다른 일구체예에서, 본 발명은 표피성장인자를 함유하는 혈당 수치를 조절하는 제제 및 표피성장인자를 혈당 수치 조절을 필요로 하는 포유류 개체에 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 혈당 수치를 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일구체예에서, 본 발명은 표피성장인자를 함유하는 당뇨병의 진단 키트 및 표피성장인자를 이용한 포유동물의 당뇨병의 진단방법을 제공한다. 보다 구체적으로 상기 당뇨병의 진단방법은 개체의 혈액 샘플을 준비하고 항원-항체 반응으로 상기 혈액 샘플 내의 표피성장인자의 농도를 측정함으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일구체예에서, 본 발명은 포유동물에서 글루코오스-비의존적인 인슐린 분비를 유도하는 제제를 확인하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 표피성장인자를 사용하는 것을 포함한다.

(기술적 해결방법)

하기 본 발명의 상세한 설명과 첨부된 도면을 참조하면 본 발명을 더 잘 이해할 수 있으며 동시에 본 발명의 보다 완전한 이해와 그것의 수반된 많은 이점이 쉽게 분명해 질 것이다.

표피성장인자(epidermal growth factor, EGF)는 췌장에서 합성되며 당뇨병이 있는 동물은 낮은 수준의 표피성장인자를 가지고 있다. 그럼에도 불구하고, 글루코오스 항상성과 같은 췌장의 주된 기능을 조절하는데 있어서, 표피성장인자의 역할은 아직 연구된 바가 없다. 이에 본 발명은 표피성장인자가 췌장 베타 세포주뿐만 아니라 마우스 췌장섬에서도 인슐린 분비를 빨리 증가시킬 수 있음을 보여준다. 이러한 사실은 Ca^{2 +} 유입과 PLD(phospholipase D) 활성, 특히 PLD2에 따른 것이다. 이는 siRNA와 PLD 아이소자임(isozymes)의 과발현과 같은 분자적 조치(molecular manipulations)와 약리적 차단제를 사용하여 결정되었다. 또한 표피성장인자는 혈장 인슐린 수치를 증가시키고 정상 또는 당뇨병이 있는 마우스에서 글루코오스 강하를 매개하였다. 이에 우선 본 발명은 표피성장인자가 혈장 글루코오스 수치를 조절하는 신규한 분비촉진제(secretagogue)이며 당뇨병의 예방 또는 치료용 제제라는 단서를 제공한다.

본 발명의 일구체예에서, 본 발명은 표피성장인자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 보다 구체적으로 상기 표피성장인자는 인간 표피성장인자(human epidermal growth factor)일 수 있다. 상기 표피성장인자는 글루코오스-비의존적으로 췌장 베타-세포로부터 인슐린 분비를 촉진한다. 상기 표피성장인자는 췌장 베타-세포 또는 췌장섬에서 Ca2+ 유입과 PLP2 활성을 통하여 인슐린 분비를 촉진한다.

상기 표피성장인자는 개체의 중량에 대하여 5㎍/kg 내지 100㎍/kg의 양으로 투여되며 보다 바람직하게는 개체의 중량에 대하여 10㎍/kg 내지 60㎍/kg의 양으로 투여된다.

본 발명의 또 다른 일구체예에서, 본 발명은 표피성장인자(epidermal growth factor)를 혈당 수치 조절을 필요로 하는 개체에 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 혈당 수치를 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일구체예에서, 본 발명은 표피성장인자(epidermal growth factor)를 혈중 인슐린 수치 조절을 필요로 하는 개체에 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 혈중 인슐린 수치를 조절하는 방법을 제공한다.

상기 개체에 혈당 수치를 조절하거나 혈중 인슐린 수치를 조절하는 방법에 있어서, 상기 혈당 수치를 조절하는 것은 글루코오스-비의존적으로 혈중 인슐린 수치를 조절함으로써 수행된다. 상기 표피성장인자는 인간 표피성장인자(human epidermal growth factor)일 수 있다. 상기 유효량은 개체의 중량에 대하여 5㎍/kg 내지 100㎍/kg이며 보다 바람직하게는 개체의 중량에 대하여 10㎍/kg 내지 60㎍/kg이다. 상기 표피성장인자는 경구, 피하, 정맥내, 또는 근육내로 투여된다. 상기 개체는 당뇨병 환자이거나 정상적인 개체이다.

본 발명의 약학적 조성물 또는 그 각각의 활성 성분의 복용 형태는 정제, 캡슐(연질 캡슐, 마이크로캡슐), 파우더, 과립, 시럽 등과 같은 경구 투여 형태; 및 주사(피하주사, 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사 등), 외부 도포 형태(비강 분무제제, 경피제제, 연고 등), 좌약(직장 좌약, 질내 좌약), 펠렛, 점적 주입등과 같은 비경구 투여 형태를 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 각각의 약물에 제안된 투여량을 참조하여 적절히 결정될 수 있으며 개체, 연령, 개체의 체중, 현재의 임상 상태, 투여시간, 투여형태, 투여방법, 약물의 조합 등에 따라 적절히 선택될 수 있다. 인슐린 증감제(sensitizer) 및 억제제(anorectic)의 복용량은 임상적으로 사용되는 투여량에 기초하여 적절히 선택될 수 있다. 예를 들어, 성인 당뇨병 환자(체중: 50 kg)의 인슐린 증감제 투여를 위해 하루 투여량은 보통 0.01 내지 1000 mg, 바람직하게는 0.1 내지 500 mg 이다. 상기 투여량은 하루에 한번 내지 여러 번 투여될 수 있다.

상기 표피성장인자의 순간적인 투여(1 분)로 인슐린 분비를 촉진할 수 있고(도 1A), 투여된 군에서만 Ca^{2 +} 수치를 증가시킬 수 있으며(도 2A) 이는 표피성장인자가 개시인자로써 기능할 수 있음을 나타낸다. 또한 표피성장인자는 글루코오스-의존적인 인슐린 분비를 촉진하며(도 1C), 이는 표피성장인자의 효과가 글루코오스-비의존적임을 의미한다. 글루코오스에 의한 인슐린 분비는 5분 정도에 최고점에 이르고 10분 정도에 최하점에 이르며 이후 시간이 경과하면서 천천히 증가하는 이중적인 양상을 가지고 있다. 상기 최초 양상이 글루코오스 항상성을 확보하는 인슐린-의존성 과정에서 중요하다(Caumo A, et al., Am J Physiol Endocrinol Metab 287:E371-385, 2004). 표피성장인자 수용체로 매개되는 인슐린 분비의 시간 추이는 신경세포에서 신경전달물질의 분비와 유사하며 췌장 베타 세포로부터의 글루코오스-의존적 인슐린 분비의 최초 양상에 비하여 훨씬 신속하다. 표피성장인자로 유도된 인슐린 분비는 글루코오스와 비교하면 신속한 Ca^{2 +} 유입이 필요하였고, 즉 글루코오스 대사 시간으로 인한 Ca^{2 +} 유입을 위해 주로 3~4분이 필요하였으며, ATP/ADP 비율 변화가 지연되었다(데이터 미기재). 인슐린 분비는 때로는 세포막 수용체(transmembrane receptors), heterotrimeric G-단백질 및 이차전령물질(second messenger)을 포함한 종래 신호전달 기작(signaling cascades)을 통하여 조절될 수 있다(Rosenbaum T, et al., Diabetes 50:1755-1762, 2001; Itoh Y, et al., Nature 422:173-176, 2003;Mears D , J Membr Biol 200:57-66, 2004). 그러므로 표피성장인자 수용체로 매개되는 인슐린 분비 조절이 합리적이지 않는 것이 아니다. 이에 표피성장인자의 새로운 역할이 체내 및 체외에서 인슐린 분비의 개시인자로써 정의되며, 이는 당뇨병에서 표피성장인자의 치료 가능성을 시사한다.

PLD는 표피성장인자의 자극에 의해 활성화되며, 상기 활성화는 글루코오스 등과 같은 다른 PLD-조절 분자들에 의한 것보다 매우 신속한 과정이다. 상기 표피성장인자로 매개되는 PLD 활성의 근본적인 기작은 논쟁의 여지가 있다. 그 가운데, 표피성장인자-의존적인 Ca^{2 +} 증가는 protein kinase C(PKC)를 활성화 시키고, PLD 활성을 유도한다(Yeo EJ, et al., J Biol Chem 270:3980-3988, 1995). 또 다른 연구는 Ca^{2 +} 유입이 PLD 활성과 관련이 있고 PKC는 이러한 과정에 관여한다고 시사하였다(Sun SH, et al., J Neurochem 73:334-343, 1999). 그러나 특정 아이소자임의 Ca²⁺로 매개된 PLD 활성에 대해서는 한정된 연구만 있을 뿐이다. 본 연구에서 본 발명자들은 표피성장인자를 처리하여 췌장 베타 세포에서 Ca^{2 +}-의존적 아이소자임으로써 PLD2를 확인하였다(도 3C 및 3D). 비록 PLD1 및 PLD2가 약 50%의 서열 상동성을 가지고 있으며 유사한 조절성 도메인을 포함하고 있지만(Frohman MA, et al., Biochim Biophys Acta 1439:175-186, 1999), 국소화 및 조절 단백질 상호작용에서 차이를 보여준다(Min DS, et al., Mol Cells 11:369-378, 2001; Hiroyama M, et al., J Cell Biochem 95:149-164, 2005). 종래 연구에서는 PLD1 및 PLD2가 2단계 과정에 의해 비만세포에서 다른 양상의 세포외분비를 조절한다는 것을 시사한다(Choi WS, et al., J Immunol 168:5682-5689, 2002): 미립자와 연관된 PLD1에 의해 조절되는 세포 주변으로의 미립자 전위 및 형질막(plasma membrane)과 연관된 PLD2에 의해 조절되는 형질막과 미립자의 Ca²⁺ 의존성 융합. PLD1이 글루코오스로 촉진되는 인슐린 분비의 매개체라고 시사하는 종래 연구와는 달리(Hughes WE, et al., J Biol Chem 279:27534-27541, 2004), 본 연구에서는 표피성장인자 자극이 PLD2 활성에 필요하였다. 글루코오스에 의한 PLD1과 표피성장인자에 의한 PLD2의 특이적인 활성은 다른 반응 속도를 가지며, 그 기작을 위해서 더 많은 설명을 필요로 한다. 본 발명자들은 PLD2-특이 항체를 이용한 웨스턴 블랏(도 3C 및 3D)과 RT-PCR(데이터 미기재)를 통해 MIN6 세포에서 PLD2를 검출하였다. 나아가 본 발명자들은 PLD1이 아닌 PLD2가 표피성장인자-의존적 인슐린 분비를 매개한다는 것을 결정하기 위하여 과발현 및 침묵(silencing) 전략을 사용하였다(도 3C 및 3D). 이러한 결과는 글루코오스가 비교적 지체된 시간 추이로 PLD1을 통해 인슐린 분비를 촉진하는 반면, 표피성장인자는 형질막에 위치한 PLD2를 활성화시켜 형질막에 인슐린 미립자를 끼워 넣는(predock) 신속한 융합을 유도한다는 것을 가정한다. 본 연구는 PLD1 및 PLD2가 인슐린 분비를 조절하기 위해 다른 경로로 매개함을 뒷받침한다. PLDs가 세포외 분비과정에서 중요한 분자이므로, PLDs를 연구하면 인슐린 분비의 조절 기작에 관한 중요한 견해를 제공할 수 있을 것이다. 인슐린 분비에서 PLD1 및 PLD2의 다른 조절 기작에 대해서는 더 많은 연구가 필요하다.

글루코오스 대사는 ATP-sensitive K⁺ 채널의 패쇄를 초래하고, 이후 형질막의 탈분극으로 voltage-sensitive Ca²⁺ 채널을 개방한다(Henquin JC, Diabetes 49:1751-1760, 2000). 그 결과로 세포질에 유리된 Ca²⁺ 농도 상승이 초기 인슐린 분비를 촉진하기 위해 필요하고 충분해진다. 상기 초기 인슐린 분비는 형질막에 인슐린 미립자를 끼워 넣는(predock) 융합에 의하여 매개된다(Mears D, J Membr Biol 200:57-66, 2004). 본 결과는 표피성장인자로 자극된 Ca^{2 +} 유입이 인슐린 분비를 매개함을 나타낸다(도 2B). 본 발명에서 본 발명자들은 표피성장인자로 촉진된 인슐린 분비를 위해서 Ca^{2 +} 유입과 PLD 활성이 모두 필요함을 확인하였다(도 2B 및 3B). 본 발견은 Ca^{2 +} 유입이 PLD 활성을 위한 상위 신호(upstream signal)임을 시사한다(도 4). 본 발명은 췌장 베타-세포에 의한 인슐린 분비에 있어서 촉진제로 유도된 Ca²⁺ 유입과 PLD 활성 사이의 밀접한 관계를 나타낸다.

표피성장인자는 췌장 기능을 조절하고, 췌장 및 췌액에서 생산된다(Huotari MA, et al., Endocrinology 139:1494-1499, 1998). 표피성장인자 수용체(EGFR)은 인간 태아 췌장(human fetal pancreas)을 걸쳐서 발현되며, 표피성장인자 수용체가 결핍된 마우스는 비정상적인 췌장섬(pancreatic islet)의 형성을 보여준다. 표피성장인자에 속하는 일부는 췌장 발달에 어떤 역할을 한다. 표피성장인자는 쥐의 췌장 베타-세포의 재생뿐만 아니라 인슐린 양을 조절한다. 더욱이, 표피성장인자의 결핍은 당뇨병과 관련이 있다: 당뇨병이 있는 동물에서는 표피성장인자 또는 표피성장인자 수용체의 수치가 간, 턱밑샘, 혈장, 밀크와 같은 다양한 기관 또는 액에서 감소된다(Thulesen J, et al., Endocr Regul 27:139-144, 1993). 흥미롭게도, 상기 단백질의 수치가 종종 인슐린 치료제를 처리한 후 회복하며, 당뇨병 치료 중에 표피성장인자 및 인슐린이 더욱 크게 작용한다(Hennessey PJ, et al., Arch Surg 125:926-929, 1990). 비록 표피성장인자가 인슐린 분비를 유도하는 GLP-1-의존적 신호전달과 혼선을 나타내지만(MacDonald PE, et al., J Biol Chem 278:52446-52453, 2003), 표피성장인자가 정확히 인슐린 분비를 조절한다는 것을 보여주는 연구는 없다. MIN6 세포주(도 1) RINm5F 세포주(데이터 미기재) 및 마우스 췌장섬(도 5)으로부터 표피성장인자가 인슐린 분비를 촉진한다는 연구결과와 일치하게, 본 발명자들은 표피성장인자가 정상, 심지어 당뇨병이 있는 마우스에서 혈장 인슐린 수치를 증가시키고 혈장 글루코오스 수치를 감소시켰음을 밝혔다(도 6). 더욱이 본 발명자들은 글루코오스를 주입하면 생리적인 표피성장인자 수치가 상승함을 알아내었다. 이러한 결과로부터 본 발명자들은 생리적인 표피성장인자가 신속하게 인슐린 분비를 상승시키고 상기 과정이 혈장 글루코오스 수치를 단기간에 조절하는데 중요할 수 있다고 생각한다. 표피성장인자-의존적 인슐린 분비는 체내 글루코오스 항상성에서의 글루코오스와 유사한 기능을 하는 것 같다. 녹다운(knock down), 항체 또는 압타머(aptamer)를 이용한 표피성장인자의 내부(endogenous) 수치를 감소시키는 것은 글루코오스 및 인슐린 항상성에 관한 표피성장인자의 생리적인 기능을 지시하게 된다. 베타-세포 재생뿐만 아니라, 인슐린 분비에 관한 표피성장인자의 역할을 종합하면, 본 연구결과는 혈청 표피성장인자 수치가 감소되는 당뇨병의 병태생리(pathophysiology)를 더 잘 이해하는데 기여할 수 있다. 더욱이 당뇨병이 있는 마우스에서 표피성장인자가 보여준 효과를 통해 표피성장인자가 가능한 당뇨병 치료제로서 이용될 수 있음을 알 수 있다.

하기 도면과 함께 본 발명의 상세한 설명을 참조하면 본 발명을 더 잘 이해할 수 있으며 동시에 본 발명의 보다 완전한 이해와 그것의 수반된 많은 이점이 쉽게 분명해 질 것이다.

도 1A 내지 도 1C는 표피성장인자가 빠르고 글루코오스-비의존적으로 MIN6 세포에서 인슐린 분비를 촉진하는 것을 나타낸다. 상기 표피성장인자는 글루코오스보다 더 빠른 반응속도로 시간 및 투여량에 따라 MIN6 세포로부터 인슐린 분비를 촉진함을 보여주었다(도 1A 및 1B). 또한 상기 표피성장인자는 기본적인 글루코오스 농도(2.7 mM)에서 인슐린 수치를 증가시키고 뿐만 아니라 높은 글루코오스 농도(11 mM)에서도 글루코오스로 유도된 인슐린 분비를 증가시켰다(도 1C).

도 2A 및 도 2B는 MIN6 세포에서 Ca^{2 +} 유입이 표피성장인자로 유도된 인슐린 분비를 매개한다는 것을 나타낸다. 도 2A는 표피성장인자가 세포외의 Ca^{2 +} 유입을 촉진하였음을 보여주며, 상기 세포외의 Ca^{2 +} 유입은 EGTA(ethylene glycol tetraacetic acid)를 처리하면 감소할 수 있다. 또한 도 2B는 MIN6 세포에서 표피 성장인자로 유도된 인슐린 분비가 Ca²⁺ 킬레이트제로 인해 감소되었음을 보여준다.

도 3C 내지 3D는 PLD2가 특히 표피성장인자-의존성 인슐린 분비에 관여함을 나타낸다. PLD는 표피성장인자의 자극에 의해 빨리(2분 내) 활성화 된다(도 3A). 표피성장인자-의존성 인슐린 분비는 1-부탄올, PLD 저해제를 처리한 경우 억제되지만, 대조군인 t-부탄올을 처리한 경우 억제되지 않았다(도 3B). 또한 PLD2는 배타적으로 표피성장인자-의존성 인슐린 분비를 매개하고 PLD1의 과발현은 제한된 효과를 보여주었다(도 3C의 상위 부분). 또한 PLD2의 침묵(silencing)은 표피성장인자로 유도된 인슐린 분비를 사라지게 하였으며(도 3D의 상위 부분), PBt 형성으로 측정된 표피성장인자-의존성 PLD 활성이 PLD2 과발현 또는 침묵에 의해 배타적으로 조절된다(도 3C, 도 3D의 하위 부분).

도 4A 및 도 4B는 Ca^{2 +} 유입이 표피성장인자로 유도된 PLD 활성에 중요함을 나타낸다. 도 4는 EGTA 또는 BAPTA/AM를 사용하여 Ca^{2 +} 유입을 차단함으로써 대부분의 PLD 활성이 억제됨을 나타낸다. 또한 도 4B는 PLD 아이소자임(isozymes)을 침묵시킴으로써 PLD 활성을 억제하는 것이 표피성장인자-의존성 Ca^{2 +} 유입에 거의 효과가 없었음을 나타낸다. 이때 PLDs의 침묵여부는 웨스턴 불럿을 통하여 확인하였다.

도 5A 내지 도 5C는 인슐린 분비가 마우스 췌장섬(pancreatic islets)에서 Ca²⁺ 유입과 PLD 활성을 통하여 표피성장인자에 의해 증가됨을 나타낸다. 도 5A는 표피성장인자가 인슐린 분비를 빠르게 증가시켰음을 나타낸다. 도 5B 및 5C는 Ca²⁺ 유입 또는 PLD 활성을 억제하면 표피성장인자로 유도된 인슐린 분비가 완전히 차단됨을 나타낸다.

도 6A 내지 도 6E는 표피성장인자가 혈장 글루코오스 수치를 낮추고 혈장 인슐린 수치를 증가시킴을 나타낸다. 도 6A는 표피성장인자(50 g/kg)의 글루코오스-강하 효과가 인슐린에도 유사한 효능이 있고, 투여량에 의존적임을 나타낸다. 또한 도 6B는 표피성장인자와 글루코오스(0.5 g/kg) 모두 혈장 인슐린 수치를 증가시킴을 나타낸다. 도 6C는 글루코오스를 경구 투입한 경우 식염수를 처리한 경우에 비하여 혈장 표피성장인자 수치가 상승됨을 나타낸다. 또한 도 6D 및 6E는 표피성장인자가 또한 비만의 db/db형 마우스에서 혈장 글루코오스를 감소시키고 혈장 인슐린 수치를 증가시킬 수 있음을 나타낸다.

본 발명을 하기 실시예를 참고로 하여 더욱더 상세하게 설명한다. 그러나 상기 실시예는 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

실험재료

ECL(enhanced chemiluminescence) 키트를 Amersham Pharmacia Biotech사(Buckinghamshire, 영국)에서 구입하였다; Dupont NEN(Boston, MA)에서 [³H]myristic acid; MERCK(Darmstadt, 독일)에서 Silica Gel 60 thin-layer chromatography plates; Invitrogen(Carlsbad, CA)사에서 Dulbecco's modified Eagle's 배지(DMEM), RPMI 1640 및 LipofectAMINE; HyClone(Logan, UT)사에서 Fetal calf serum; 대웅제약(서울, 한국)사에서 표피성장인자; Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.(Gaithersburg, MD)에서 HRP(horseradish peroxidase)-결합된 염소유래 항토끼 IgG(goat anti-rabbit IgG) 및 항-마우스 IgA, IgG, 및 IgM; 및 Molecular Probes(Eugene, OR)사에서 Fluo-3 AM을 구입하였다. PLD1 및 PLD2 모두를 식별할 수 있는 다클론 항체(mSTP4)는 종래 방법에 따라 제조하였다(Lee et al., Biochim Biophys Acta 1347:199-204, 1997). PLD2-특이적 항체는 종래 방법에 따라 제조하였다(Kim et al., J Neurochem 85:1228-1236, 2003). 이외 모든 다른 화합물들은 Sigma(St. Louis, MO)사에서 구입하였다.

< 실시예 1>

MIN6 세포에서 인슐린 분비를 촉진하는 표피성장인자

표피성장인자는 췌장에서 생산되며, 췌장에 효능이 있으며 이의 순환 수준이 당뇨병이 있는 경우 변경된다(Burgess AW, Br Med Bull 45:401-424, 1989; Kasayama S et al., Proc Natl Acad Sci U S A 86:7644-7648, 1989). 본 실시예는 표피성장인자가 인슐린 분비를 촉진할 수 있는지 여부 및 표피성장인자에 의한 인슐린 분비가 글루코오스 처리에 의하여 증가되는지 여부를 확인하기 위하여 수행되 었다.

1.1 실험방법

세포배양: 인슐린을 생산하는 마우스 세포 MIN6m9를 Susumu Seino 박사(Division of Cellular and Molecular Medicine, Kobe University Graduate School of Medicine, Kobe, Japan)로부터 제공받아, 19에서 25 계대를 사용하여 37 ℃ 세포배양기(humidified CO₂를 5%로 조절)에서 DMEM(25 mM 글루코오스, 10 mM HEPES, 10% (v/v) fetal calf serum, 50 IU/ml 페니실린, 및 50 ㎍/ml 스트렙토마이신 함유) 배지로 배양하였다. MIN6 세포를 종래 공지된 방법에 따라 LipofectAMINE을 사용하여 형질감염(transfect)시켰다. LipofectAMINE을 사용함으로써 형질감염의 효율은 약 30-40%이다.

인슐린 분비 측정: 10~15의 분리된 췌장섬 배치(batches) 또는 웰-플레이트(12 또는 24)에서 배양된 1×10⁶ cells/well를 0.2%의 소혈청알부민이 추가된 KRB로 2번 수세하였다. 그리고 나서 KRB 용액에서 37 ℃, 60분 동안 배양하였다. 본 발명자들은 동일한 실험 세트에서 동일한 수의 췌장섬을 사용하였다. 배양이 끝날 때, 상기 용액을 테스트 시약이 함유된 새로운 KRB로 교체하고 상기 지시된 시간 동안 배양하였다. 상기 배양 배지를 샘플링하고 세포를 제거하기 위해 원심 분리한 다음 상층액을 RIA(radioimmunoassay) 키트(Linco, St. Louis, MO)를 이용하여 인슐린 분석에 사용하였다.

통계적 분석: 실험결과를 평균±S.E. 또는 평균±S.D.로 나타내었다(PLD 활성 분석 및 인슐린 분비 분석). 평균 차이의 통계적 유의성은 Student's t-test로 평가하였다. P <0.05는 통계적으로 유의함을 나타낸다.

1-2. 마우스 MIN6 인슐린종 세포에서 표피성장인자의 인슐린 분비 테스트

표피성장인자가 인슐린 분비를 촉진하는지 여부를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 마우스 MIN6 인슐린종(insulinoma) 세포에 표피성장인자를 처리하였다. 표피성장인자를 1분 처리한 경우 유의적으로 인슐린 분비가 증가되었다. 표피성장인자는 글루코오스보다 더 빠른 속도로 MIN6 세포로부터 시간 및 투여량에 따른 인슐린 분비를 촉진하였다(도 1A 및 도 1B). 특히 표피성장인자를 1~2 분, 1.5~15 nM로 처리한 경우 효과적이었다(도 1A 및 도 1B).

상기 MIN6 세포를 24-웰 플레이트에 옮기고 24시간 동안 배양하였다. 상기 세포를 0.2%의 소혈청알부민이 추가된 KRB로 2번 수세하였다. 그리고 나서 KRB 용액에서 37 ℃, 60분 동안 배양하였다.

상기 배양이 끝날 때, 상기 용액을 무첨가(NT), 15 nM 표피성장인자(인간 EGF, genbank accession no. CAA34902), 또는 11 mM 글로코오스가 함유된 새로운 KRB로 교체하였다. 그리고 0, 1, 2, 5, 또는 10 분 동안 배양하였다. 상기 배양배지를 샘플링하고 세포를 제거하기 위해 원심 분리한 다음, 상층액을 인슐린 수치 분석에 사용하였다. 이중으로 2번 각각 분석한 데이터를 평균±S.D.로 나타내었다(도 1A). *: 무처리된 세포와 비교할 때 P < 0.05인 경우

상기 배양이 끝날 때, 상기 용액을 표피성장인자가 0, 1.5, 15, 또는 150 nM 함유된 새로운 KRB로 바꾸고 1분 동안 추가 배양하였다. 상기 배양배지를 샘플링하고 세포를 제거하기 위하여 원심 분리한 다음, 상층액을 인슐린 수치 분석에 사용하였다. 이중으로 2번 각각 분석한 데이터를 평균±S.D.로 나타내었다(도 1B). *: 무처리된 세포와 비교할 때 P < 0.05인 경우

1-3. 표피성장인자로 유도된 인슐린 분비 세포에 대한 글루코오스 처리

표피성장인자에 의한 인슐린 분비가 글루코오스 처리에 따른 부가적인 것인지 여부를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 표피성장인자에 의해 유도된 인슐린 분비에 미치는 고농도(11 mM)의 글루코오스 효과를 실험하였다.

표피성장인자는 기본농도(2.7 mM)의 글루코오스에서 인슐린 수치를 증가시켰을 뿐만 아니라, 또한 고농도(11 mM)의 글루코오스에서도 글루코오스에 의해 유도된 인슐린 분비를 증가시켰다(도 1C).

종합하면, 상기 데이터를 통해 글루코오스와 마찬가지로 표피성장인자는 췌장 베타-세포에서의 인슐린 분비 개시인자이며, 인슐린 분비에 미치는 표피성장인장의 효과는 글루코오스-비의존적임을 알 수 있었다.

상기 배양이 끝날 때, 상기 용액을 2.7 또는 11 mM의 글루코오스를 함유하고 0, 15, 또는 30 nM의 표피성장인자가 함유된 새로운 KRB로 바꾸고 5분 동안 추가 배양하였다. 상기 배양배지를 샘플링하고 세포를 제거하기 위하여 원심 분리한 다음, 상층액을 인슐린 수치 분석에 사용하였다. 이중으로 2번 각각 분석한 데이터를 평균±S.D.로 나타내었다(도 1C). * 또는 **: 2.7 또는 11 mM의 글루코오스를 처리 한 세포와 비교할 때 P < 0.05인 경우

< 실시예 2>

MIN6 세포에서 표피성장인자로 유도된 인슐린 분비의 Ca ^{2 +} 유입 의존성

인슐린 분비를 위해서는 세포내 Ca2+의 농도([Ca2+]i)의 증가를 필요로 한다(Barg S et al., Diabetes 51 (Suppl 1):S74-82, 2002). 본 실시예는 표피성장인자에 의해 유도된 인슐린 분비에 대한 Ca2+ 유입의 효과를 확인하기 위해 수행되었다.

2.1 [ Ca ^{2 +} ] _i 측정방법

세포내 Ca2+ 수치 변화를 공초점 현미경(confocal microscope)을 통해 Ca2+-민감성 염료(sensitive dye)를 이용하여 측정하였다. 세포를 40분 동안 상온에서 2 ㎕ Fluo-3 AM으로 로드하였다. 크렙스-링거 중탄산염 완충용액(Krebs-Ringer bicarbonate; KRB; 129 mM NaCl, 5 mM NaHCO3, 4.8 mM KCl, 1.2 mM KH2PO4, 1.0 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO4, 2.7 mM glucose, 및 10 mM HEPES, pH 7.4)으로 수세한 후, 세포를 15분 동안 Fluo-3 AM 이 없는 상태에서 추가 배양하여, 염료를 탈에스테르화(de-esterify) 하였다. 염료 로딩에 의한 가능한 영향을 배제하기 위해, 본 발명자들은 실험의 마지막에 사포닌으로 수치를 표준화하였다. 표준화하기 위해 본 발명자들은 실험이 마무리되면 잔류 형광(Fo) 수치를 측정하고, 실험조건의 형광 수 치(F)로부터 이를 감산하였다. 아르곤레이저를 사용하여 Fluo-3 AM의 여기(Excitation) 파장을 488-nm로 하고 방출(emission) 파장을 515-nm로 하였다. 이미지를 20X 대물렌즈가 구비된 도립 공초점 현미경(inverted confocal microscope; Zeiss LSM 510 Meta, Oberkochen, 독일)으로 캡쳐하였다.

2.2. 표피성장인자로 유도된 인슐린 분비에서 Ca ^{2 +} 유입 효과

상기 MIN6 세포를 유리판(glass dishes) 또는 24-웰 플레이트에 24시간 동안 평판 배양하였다. 상기 세포를 KRB(0.2% BSA가 첨가됨)로 2번 수세하고, KRB 용액에서 37℃, 60분 동안 배양하였다.

상기 배양이 끝날 때, 상기 용액을 DMSO에 녹인 Fluo-3 AM(1mg/ml)이 함유된새로운 KRB로 바꾸고 1시간 동안 추가 배양하였다. 상기 배양이 끝나면, 상기 세포를 무처리하거나 30분 동안 EGTA를 처리하고 15 nM 표피성장인자를 처리하여 배양하였다. 이미지를 20X 대물렌즈가 구비된 도립 공초점 현미경(inverted confocal microscope; Zeiss LSM 510 Meta, Oberkochen, 독일)으로 캡쳐하였다. 표준화하기 위해 본 발명자들은 실험이 마무리되면 잔류 형광(Fo) 수치를 측정하고, 실험조건의 형광 수치(F)로부터 이를 감산하였다. 상기 데이터를 평균±S.E.로 나타내고 이때 n=7로 하였다(도 2A).

상기 도 2A에서 표피성장인자는 세포외 Ca2+ 유입을 자극하였고, 이는 EGTA를 처리하면 감소될 수 있었다. 표피성장인자에 의해 유도된 인슐린 분비에 대한 Ca2+ 유입을 설명하기 위해, 본 발명자들은 세포외 Ca2+ 유입을 차단하기 위해 상기 세포에 EGTA를 처리하거나, 세포외 Ca2+ 유입 및 세포내 Ca2+ 분비를 차단하기 위해 1,2-Bis (2-aminophenoxy) ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid tetrakis (acet-oxymethyl ester) (BAPTA/AM)를 처리하였다. '

상기 배양이 끝날 때, 상기 용액을 무처리, EGTA, 또는 BAPTA/AM이 함유된 새로운 KRB로 바꾸고 30분 동안 추가 배양한 다음, 0 또는 1분 동안 15 nM 표피성장인자를 처리하였다. 상기 배양배지를 샘플링하고 세포를 제거하기 위하여 원심 분리한 다음, 상층액을 인슐린 수치 분석에 사용하였다. 이중으로 2번 각각 분석한 데이터를 평균±S.D.로 나타내었다(도 2B). *: 표피성장인자를 처리한 세포와 비교할 때 P < 0.05인 경우

상기 도 2B에서 표피성장인자에 의해 유도된 인슐린 분비가 Ca2+ 킬레이트제에 의해 감소하였다. 또한 상기와 동일한 결과를 RINm5F 세포에서도 관찰할 수 있었다(데이터 미기재). 종합하면, 상기 결과들을 통해 표피성장인자에 의해 유도된 인슐린 분비를 위해서는 Ca2+ 유입이 필요함을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

MIN6 세포에서 PLD2 의 표피성장인자로 유도된 인슐린 분비 매개

종래 연구는 PLD가 다양한 세포외 분비를 매개하는 중요한 분자임을 시사하였다(Jones D et al., Biochim Biophys Acta 1439:229-244, 1999; Choi WS et al., J Immunol 168:5682-5689, 2002; Metz SA et al., . Biochem J 270:427-435, 1990).

본 발명자들은 처음에 MIN6 세포에서의 PLD 활성을 테스트하였다. 표피성장인자의 자극에 의해 PLD는 신속히(2분 내) 활성화 되었다(도 3A). 표피성장인자-의존적 인슐린 분비가 1-부탄올, PLD 저해제를 처리한 경우 억제되지만, 대조군으로서 t-부탄올을 처리한 경우에는 억제되지 않았다(도 3B). 이러한 결과를 통해 표피성장인자에 의해 유도되는 인슐린 분비를 위해서는 PLD 활성이 필요함을 알 수 있었다. 또한 상기와 동일한 결과가 RINm5F 세포에서도 관찰되었다(데이터 미기재).

PLD 구조체: 래트 PLD1 또는 인간의 PLD2의 전장(full-length) cDNAs를 세포에 형질감염시키기위해 pcDNA 3.1 벡터에 연결하였다.

SiRNA 서열: 마우스 PLD1((nucleotides 1099 to 1119, AACACGUUAGCUAAGUGGUAU, SEQ ID NO: 1) 또는 PLD2((nucleotides 2539 to 2559, AACUCCAUCCAGGCUAUUCUG, SEQ ID NO: 2)에 대응하는 21-mer siRNA를 Dharmacon Research Inc. (Lafayette, CO)에서 구입하였다. 모든 siRNA 서열의 BLAST 검색 결과를 통해 데이터베이스에서 어떤 다른 서열과 유의미한 상동성은 없었다.

세포에서 PLD 활성 분석: 6-웰 플레이트에서 배양된 세포를 KRB로 2번 수세하고 KRB 용액에서 37℃, 4시간 동안 [3H]미리스트산(myristic acid)으로 표지하였다. PBt(phosphatidylbutanol)의 형성을 측정함으로써 PLD 활성을 평가하였다 (Kim JH et al., J Immunol 163:5462-5470, 1999). 0.4% 1-부탄올이 있는 경우 PBt 반점의 크기를 측정하고 1-부탄올이 없는 경우의 PBt 반점의 크기를 감산함으로써 PLD 활성을 측정하였다.

인슐린 분비를 촉진하는 PLD 아이소자임을 확인하기 위해, 본 발명자들은 PLD 아이소자임의 과발현 및 침묵에 따른 효과를 조사하였다. 본 발명자들은 공벡터, PLD1 또는 PLD2로 MIN6 세포를 형질감염시키고, 표피성장인자로 그것을 자극하였다. PLD1은 종래 알려진 바와 같이 글루코오스-의존적 인슐린 분비를 매개하였다(데이터 미기재)(Hughes WE et al., J Biol Chem 279:27534-27541, 2004). 반대로 PLD2는 배타적으로 표피성장인자-의존적 인슐린 분비를 매개하였으며, PLD1의 과발현은 제한된 효과만을 보여주었다(도 3C의 상단부분). 나아가, PLD1이 아닌 PLD2를 침묵시킨 경우, 표피성장인자에 의해 유도되는 인슐린 분비가 일어나지 않았다(도 3D의 상단부분). 또한 RINm5F 세포에서도 동일한 결과를 관찰할 수 있었다(데이터 미기재). 마지막으로 PBt 형성에 따라 측정된 표피성장인자에 의존적인 PLD 활성은 PLD2 과발현 또는 침묵에 의해 배타적으로 조절되었다(도 3C 및 3D의 하단부분). 이러한 결과로부터, 상기 세포에서 표피성장인자에 의해 유도되는 인슐린 분비를 위해서는 PLD2가 필요하다는 것을 알 수 있었다.

도 3A에서 MIN6 세포를 6-웰 플레이트에 24시간 동안 평판 배양하였다. 상기 세포를 KRB로 2번 수세하고, [³H] 미리스트산이 함유된 KRB 용액에서 37 ℃, 4시간 동안 배양하였다. 상기 배양이 끝날 때, 지정된 시간 동안 15 nM의 표피성장인자를 처리하였다. 1-부탄올 및 표피성장인자가 함유된 경우 0, 1, 2, 5, 또는 10 분이 지나 PBt 반점의 크기를 측정하고 그 결과를 1-부탄올이 존재하지 않는 경우 수득한 반점의 크기로 감산하였다. 이중으로 2번 각각 분석한 데이터를 평균±S.D.로 나타내었다(도 3A).

도 3B에서 MIN6 세포를 24-웰 플레이트에서 24시간 동안 평판 배양하였다. 상기 세포를 0.2% BSA가 함유된 KRB로 2번 수세하고, KRB 용액에서 37 ℃, 60분 동안 배양하였다. 상기 배양이 끝날 때, 상기 용액을 0.4% t-부탄올 또는 1-부탄올이 함유된 새로운 KRB로 바꾸고 10분 동안 배양한 다음, MIN6 세포에 0 또는 1분 동안 15 nM의 표피성장인자를 처리하였다. 상기 배양배지를 샘플링하고 세포를 제거하기 위해 원심 분리한 다음 그 상층액을 인슐린 수치 분석에 사용하였다. 이중으로 2번 각각 분석한 데이터를 평균±S.D.로 나타내었다. *: 표피성장인자를 처리한 세포와 비교할 때, P < 0.05인 경우.

도 3C 및 3D에서, 상기 MIN6 세포를 24-웰 플레이트(인슐린 수치를 측정하기 위함) 또는 6-웰 플레이트(PLD 활성을 측정하기 위함)에 평판 배양하고 지정된 플라스미드(도 3C에서 벡터, PLD1 또는 PLD2), 또는 siRNAs(도 3D에서 대조군 (luciferase), 마우스 PLD1, 또는 마우스 PLD2)로 형질 감염하고 24시간 또는 72시간 동안 배양하였다. 형질감염의 효율은 약 30~40%이었다. 인슐린 분비를(상위부분)를 측정하기 위해 상기 세포를 0.2% BSA가 함유된 KRB로 2번 수세하고, KRB 용액에서 37 ℃, 60분 동안 배양하였다. 상기 배양이 끝날 때, 상기 용액을 0 또는 1분 동안 15 nM의 표피성장인자가 함유된 새로운 KRB로 바꾸었다. 상기 배양배지를 샘플링하고 세포를 제거하기 위해 원심 분리한 다음 그 상층액을 인슐린 수치 분석에 사용하였다. 이중으로 2번 각각 분석한 데이터를 평균±S.D.로 나타내었다. *: 표피성장인자를 처리한 세포와 비교할 때, P < 0.05인 경우. 한편 PLD 활성(하위부 분)을 측정하기 위해, 상기 세포를 KRB로 2번 수세하고, [³H] 미리스트산이 함유된 KRB 용액에서 37 ℃, 4시간 동안 배양하였다. 상기 배양이 끝날 때, 0 또는 1분 동안 15 nM의 표피성장인자를 처리하였다. 1-부탄올 및 표피성장인자가 함유된 경우 1분이 지나 PBt 반점의 크기를 측정하고 그 결과를 1-부탄올이 존재하지 않는 경우 수득한 반점의 크기로 감산하였다. 이중으로 2번 각각 분석한 데이터를 평균±S.D.로 나타내었다. *: 표피성장인자를 처리한 세포와 비교할 때, P < 0.05인 경우. 상기 세포를 0.1% 트리톤 X-100이 함유된 KRB로 용해시키고 SDS-PAGE로 옮긴 다음, 항- PLDs 항체(도 3C의 내부 박스 및 도 3D의 PLD1-내부 박스), PLD2-특이적 항체(도 3D의 PLD2-내부 박스) 또는 액틴 항체(도 3C 또는 도 3D의 액틴 내부 박스)를 사용하여 면역블랏하였다(도 3C의 내부 박스 및 도 3D의 PLD1-내부 박스).

< 실시예 4>

MIN6 세포에서 Ca ^{2 +} 유입에 의존적인 PLD 활성

Ca^{2 +} 유입과 PLD 활성이 표피성장인자-의존적 인슐린 분비에 필요하므로, 본 실시예는 PLD 활성에 대한 Ca^{2 +} 유입의 효과 및 Ca^{2 +} 유입에 대한 PLD 활성의 효과를 테스트하여 상기 Ca^{2 +} 유입과 PLD 활성의 관계를 분석하였다. EGTA 또는 BAPTA/AM를 사용하여 Ca^{2 +} 유입을 차단함으로써 대부분의 PLD 활성이 억제되었다(도 4A). 이는 표피성장인자-의존적 인슐린 분비와 서로 관련이 있었다(도 2B). 그러나 PLD 아이소자임을 침묵(PLDs의 침묵여부는 웨스턴 블랏을 통해 확인)시켜 PLD 활성을 억제한 경우에는 표피성장인자-의존적 Ca^{2 +} 유입에 거의 영향이 없었다(도 4B). 상기 결과로부터 표피성장인자-의존적 인슐린 분비에 있어서 Ca^{2 +} 유입이 PLD 활성에 영향을 미치는 것(upstream)을 알 수 있었다.

도 4A에서 MIN6 세포를 6-웰 플레이트에 24시간 동안 평판 배양하였다. 상기 세포를 KRB로 2번 수세한 다음, 37℃, 4시간 동안 [³H] 미리스트산이 함유된 KRB 용액에서 배양하였다. 상기 배양이 끝날 때, 상기 용액을 무처리, EGTA, 또는 BAPTA/AM이 함유된 새로운 KRB로 바꾸고 30분 동안 배양한 다음, 0 또는 1분 동안 15 nM의 표피성장인자를 처리하였다. 1-부탄올이 존재하는 상태에서 1분이 지나 PBt 반점의 크기를 측정하고 그 결과를 1-부탄올이 존재하지 않는 상태에서의 반점의 크기로 감산하였다. 이중으로 2번 각각 분석한 데이터를 평균±S.D.로 나타내었다. *: 표피성장인자를 처리한 세포와 비교할 때, P < 0.05인 경우.

도 4B에서 MIN6 세포를 유리판(glass dishes)에서 평판 배양하고 siRNAs(대조군(luciferase), 마우스 PLD1, 또는 마우스 PLD2)로 형질감염한 다음, 24시간 동안 배양하였다. 상기 세포를 0.2% BSA가 함유된 KRB로 2번 수세하고 KRB 용액에서 37℃, 60분 동안 배양하였다. 상기 배양이 끝날 때, 상기 용액을 DMSO에 녹인 Fluo-3 AM(1mg/ml)이 함유된 새로운 KRB로 바꾸고 1시간 동안 추가 배양하였다. 상기 배양이 끝나면, 상기 세포에 15 nM 표피성장인자를 처리하였다. 이미지를 20X 대물렌즈가 구비된 도립 공초점 현미경(inverted confocal microscope; Zeiss LSM 510 Meta, Oberkochen, 독일)으로 캡쳐하였다. 표준화하기 위해 본 발명자들은 실험이 마무리되면 잔류 형광(Fo) 수치를 측정하고, 실험조건의 형광 수치(F)로부터 이를 감산하였다. 상기 데이터를 피크 타임(peak time)의 평균±S.E.로 나타내고 이때 n=7로 하였다. 상기 세포를 0.1% 트리톤 X-100이 함유된 KRB로 용해시키고 SDS-PAGE로 옮겨 항-PLDs 항체(도 4B의 PLD1-내부 박스), PLD2-특이적 항체(도 4B의 PLD2-내부 박스) 또는 액틴 항체(도 4B의 액틴-내부 박스)로 면역블랏을 하였다.

면역블랏 분석: 단백질을 램나이 샘플 버퍼(Laemmli UK et al., Nature 227:680-685, 1970)에서 95℃, 5분 동안 가열하여 변성하고 SDS-PAGE로 분리하여 종래 알려진 방법(Kim JH et al., J Immunol 163:5462-5470, 1999)에 따라 면역블랏을 수행하였다.

< 실시예 5>

마우스 췌장섬에서 표피성장인자로 유도된 인슐린 분비의 Ca ^{2 +} 유입 및 PLD 활성 필요성

인슐린 분비에서 표피성장인자, Ca^{2 +}, PLD의 생리적 중요성을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 마우스 췌장섬의 일차 배양물을 제조하였다. 기대한 것과 같이, 표피성장인자는 신속하게 인슐린 분비를 증가시켰으며(도 5A), 이러한 결과는 다양 한 성장인자(데이터 미기재)를 1분 처리한 경우 성장인자들 사이에 특이적이었다. Ca²⁺ 유입 또는 PLD 활성을 완벽히 억제한 경우, 표피성장인자에 의해 유도되는 인슐린 분비가 차단되었다(도 5B 및 5C). 이는 표피성장인자에 의해 촉진되는 인슐린 분비를 위해서는 Ca²⁺ 유입 및 PLD가 필요함을 시사한다.

마우스 췌장섬을 준비하기 위하여, 종래 공지된 방법(Jonas JC, et al., Diabetes 47:1266-1273, 1998)에 따라 7에서 8주령의 수컷 BALB/c 마우스(Hyochang Science, 한국)로부터 췌장섬을 분리하였다. 분리된 췌장섬을 웰당 10~15 췌장섬이 포함되도록 12-웰 플레이트에 옮겼다. 본 발명자들은 각 실험세트상 동수의 췌장섬을 사용하였다. 췌장섬은 5 mM 글루코오스 및 10% FCS(fetal calf serum)가 함유된 RPMI1640에 2일 동안 보존하고 100 g/ml의 스트렙토마이신 및 100 U/ml의 페니실린을 보충하였다.

상기 마우스 췌장섬을 12-웰 플레이트에서 24시간 동안 평판 배양하였다. 상기 췌장섬을 0.2% BSA가 함유된 KRB로 2번 수세하고 KRB 용액에서 37℃, 60분 동안 배양하였다.

도 5A에서, 상기 배양이 끝날 때, 상기 용액을 새로운 KRB로 바꾸고 무처리, 15 nM 표피성장인자 또는 11 mM 글루코오스를 처리하여 1 또는 5분 동안 배양하였다. 상기 배양배지를 샘플링하고 췌장섬을 제거하기 위해 원심 분리한 다음, 상층액을 취하여 인슐린 수치 측정에 사용하였다. 이중으로 2번 각각 분석한 데이터를 평균±S.D.로 나타내었다. * 또는 **: 1분 또는 5분 처리한 췌장섬과 비교할 때 P < 0.05인 경우.

도 5B에서, 상기 배양이 끝날 때, 상기 용액을 무처리, EGTA 또는 BAPTA/AM이 함유된 새로운 KRB로 바꾸고 30분 동안 배양한 다음, 0 또는 1 분 동안 15 nM의 표피성장인자를 처리하였다. 상기 배양 배지를 샘플링하고 췌장섬을 제거하기 위해 원심 분리한 다음 상층액을 인슐린 수치를 측정하기 위해 사용하였다. 이중으로 2번 각각 분석한 데이터를 평균±S.D.로 나타내었다. *: 표피성장인자를 처리한 췌장섬과 비교할 때 P < 0.05인 경우.

도 5C에서 상기 배양이 끝날 때, 상기 용액을 0.4%의 t-부탄올 및 1-부탄올이 함유된 새로운 KRB로 바꾸고, 10분 동안 배양한 다음, 0 또는 1 분 동안 15 nM의 표피성장인자를 처리하였다. 상기 배양 배지를 샘플링하고 췌장섬을 제거하기 위해 원심 분리한 다음 상층액을 인슐린 수치를 측정하기 위해 사용하였다. 이중으로 2번 각각 분석한 데이터를 평균±S.D.로 나타내었다. *: 표피성장인자를 처리한 췌장섬과 비교할 때 P < 0.05인 경우.

< 실시예 6>

표피성장인자의 혈장 글루코오스 감소 및 혈장 인슐린 수치 증가 효과

체외(in vitro)에서 표피성장인자가 인슐린 분비를 촉진할 수 있음을 확인하기 위하여, 본 실시예는 표피성장인자를 정맥주사로 주입함으로써 정상 및 비만 db/db 마우스의 혈장 글루코오스 및 인슐린 수치에 대한 표피성장인자 매개 반응 특성을 밝혀내었다.

혈장 글루코오스 및 혈장 인슐린 수치의 측정: 7 또는 8 주령의 수컷 ICR 마우스를 Hyochang Science(서울, 한국)에서 구입하였다. C57BLKSJ-db/db 마우스를 SLC(일본)에서 구입하였다. 상기 마우스를 6시간 동안 단식시킨 다음, 살린, 표피성장인자 또는 글루코오스를 꼬리 정맥에 정맥 주사하고 혈액 샘플(0.1　ml)을 수집하였다. 휴대용 글루코오스 미터(Gluco-Dr, 한국)를 사용하여 글루코오스 산화효소법을 통해 혈장 글루코오스의 농도를 측정하였다. 혈장은 원심분리를 통해 분리하고 혈장 인슐린 분석을 RIA 키트를 이용하여 수행하였다. 본 발명자들의 소속기관 지침에 따라 동물 보호(animal care)를 실시하였다.

혈장 표피성장인자 수치의 측정: 7에서 8주령의 수컷 ICR 마우스를 Hyochang Science(서울, 한국)에서 구입하였다. 상기 마우스를 6시간 동안 단식시킨 다음, 살린, 또는 글루코오스를 경구 투여하고 혈액 샘플(0.1　ml)을 EGTA로 코팅된 시험관에 수집하였다. 혈장 표피성장인자의 농도를 표피성장인자 ELISA 키트(KOMA biotech, 한국)로 측정하였다. 본 발명자들의 소속기관 지침에 따라 동물 보호(animal care)를 실시하였다.

예비실험에서, 표피성장인자 50　g/kg을 7에서 8주령의 수컷 ICR 마우스에 정맥내 주사한 후 10분이 지나 혈장 글루코오스의 감소 효과가 포화에 이르렀다(데이터 미기재). 상기 표피성장인자(50 g/kg)의 글루코오스 감소 효과는 인슐린과 비슷한 효능이었으며, 투여량에 의존적이었다(도 6A). 또한 표피성장인자 및 글루코오스(0.5 g/kg)는 모두 혈장 인슐린 수치를 증가시켰으며(도 6B), 이러한 사실로부터 상기 글루코오스 감소 효과가 혈장 인슐린 수치의 변화 때문이라는 것을 알 수 있 었다. 인슐린 분비 및 글루코오스 변화의 속도는 서로 관련이 있었다. 더욱이 글루코오스를 경구 투여한 경우 살린을 투여한 경우에 비해 혈장 표피성장인자 수치를 상승시켰다(도 6C). 상기 결과로부터, 표피성장인자의 생리적 농도는 투여 조건에 따라 변화될 수 있으며, 분비된 표피성장인자는 마침내 인슐린 분비를 조절할 수 있다. 표피성장인자는 또한 비만 db/db 마우스에서 혈장 글루코오스를 감소시키고 혈장 인슐린 수치를 증가시켰다(도 6D 및 6E). 종합하면, 본 발명자들은 정상 또는 당뇨병이 있는 마우스 모델에서 표피성장인자가 인슐린 분비를 촉진할 수 있고 혈장 글루코오스를 감소시킬 수 있다는 결론지었다.

도 6A에서 7에서 8주령의 수컷 ICR 마우스(10 마우스/그룹)에 살린(이중 희석된 물에 0.9% NaCl), 인슐린(0.06 U/kg), 또는 표피성장인자(18.5 또는 50 g/kg)를 정맥 주사하고 혈장 글루코오스 수치를 측정하였다. 상기 데이터를 평균±S.E.로 나타내었다. †(인슐린), *(표피성장인자 50 g/kg) 또는 **(표피성장인자 18.5 g/kg), 특정시간에 살린을 투여한 마우스와 비교하여 P < 0.05인 경우

도 6B에서 7에서 8주령의 수컷 ICR 마우스(10 마우스/그룹)에 살린, 글루코오스(0.5 g/kg), 또는 표피성장인자(18.5 또는 50 g/kg)을 정맥 주사하고 혈장 인슐린 수치를 측정하였다. 상기 데이터를 평균±S.E.로 나타내었다. ‡(글루코오스), * (표피성장인자 50 g/kg) 또는 ** (표피성장인자 18.5 g/kg), 특정시간에 살린을 투여한 마우스와 비교하여 P < 0.05인 경우

도 6C에서, 7에서 8주령의 수컷 ICR 마우스(10 마우스/그룹)에 살린, 글루코오스(2 g/kg)를 경구 투여하고, 혈장 표피성장인자 수치를 측정하였다. 상기 데이 터를 평균±S.E.로 나타내었다. *: 특정시간에 살린을 투여한 마우스와 비교하여 P < 0.05인 경우

도 6D에서, 비만 C57BLKSJ-db / db 마우스(6 마우스/그룹)에 살린(이중 희석된 물에 0.9% NaCl), 인슐린(0.06 U/kg) 또는 표피성장인자(50 g/kg)를 정맥 주사하고 혈장 글루코오스 수치를 측정하였다. 상기 데이터를 평균±S.E.로 나타내었다. †(인슐린) 또는 * (표피성장인자 50 g/kg), 특정시간에 살린을 투여한 마우스와 비교하여 P < 0.05인 경우

도 6E에서, 비만 C57BLKSJ-db / db 마우스(6 마우스/그룹)에 살린, 글루코오스(0.5 g/kg) 또는 표피성장인자(50 g/kg)를 정맥 주사하고 혈장 인슐린 수치를 측정하였다. 주사 전 및 주사 후 10분이 지나 혈장인슐린 수치를 비교하였다. 상기 데이터를 평균±S.E.로 나타내었다. ‡(글루코오스) 또는 *(표피성장인자 50 g/kg), 특정시간에 살린을 투여한 마우스와 비교하여 P < 0.05인 경우. 모든 동물은 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다. 본 발명자들의 소속기관 지침에 따라 동물 보호(animal care)를 실시하였다.

본 발명을 바람직한 실시예를 참조로 하여 상세히 기술하였지만, 당업자가 첨부된 청구항에 기재한 것과 같이 본 발명의 의도와 목적에 벗어나지 않고 본 발명에 다양한 수정과 대체가 가능할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> EPIDERMAL GROWTH FACTOR INCREASES INSULIN SECRETION AND LOWERS BLOOD GLUCOSE <130> DPP-2008-5138-KR <150> US 60/807,374 <151> 2006-07-14 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of 21-mers corresponding to mouse PLD1 <400> 1 aacacguuag cuaaguggua u 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of 21-mers corresponding to mouse PLD2 <400> 2 aacuccaucc aggcuauucu g 21

Claims (14)

1. 유효성분으로서 표피성장인자(epidermal growth factor)를 단독으로 포함하고 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 표피성장인자는 글루코오스-비의존적으로 췌장 베타-세포에서 인슐린 분비를 촉진하는 것인 약학적 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 표피성장인자는 췌장 베타-세포에서 Ca²⁺ 유입과 PLD2 활성을 통하여 인슐린 분비를 촉진하는 것인 약학적 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 표피성장인자는 인간 표피성장인자(human epidermal growth factor)인 약학적 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 표피성장인자는 개체의 중량에 대하여 5㎍/kg 내지 100㎍/kg의 양으로 투여되는 것인 약학적 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 표피성장인자는 개체의 중량에 대하여 10㎍/kg 내지 60㎍/kg의 양으로 투여되는 것인 약학적 조성물.
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제

Images