KR101079314B1

KR101079314B1 - 면역 활성을 갖는 항원 특이 세포독성 ｔ 세포(ｃｔｌ)의 시험관내 효율적 생성방법 및 이를 유효성분으로 하는 항종양 치료제

Info

Publication number: KR101079314B1
Application number: KR1020080122920A
Authority: KR
Inventors: 김태규
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2008-12-05
Filing date: 2008-12-05
Publication date: 2011-11-04
Also published as: KR20100064474A

Abstract

본 발명은 세포독성 T 세포를 활용한 면역치료에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 시험관내에서 항원 특이적인 세포독성 T 세포를 생성하는 방법에 있어서, 도움 T 세포 증강용 항원 사용 및 Th1 편극화를 포함하는 CD4+ T 세포의 정량적, 정성적 조절을 통하여 세포독성 T 세포를 효율적으로 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 동량의 말초혈액단핵세포에서 종양 항원 특이 세포독성 T 세포 생성 효율을 극대화 할 수 있으며, 적절한 도움 T 세포 증강용 항원의 사용으로 종양항원뿐만 아니라 도움 T 세포 증강용 항원에 대하여도 세포독성 반응을 일으킬 수 있어 하나의 배양을 통하여 두 항원에 동시에 특이적인 세포독성 T 세포를 획득하게 되어 항종양 면역치료제를 효율적으로 생성할 수 있게 된다.

CD4+, CTL, 면역치료, 수지상세포, SURVIVIN, pp65

Description

면역 활성을 갖는 항원 특이 세포독성 Ｔ 세포(ＣＴＬ)의 시험관내 효율적 생성방법 및 이를 유효성분으로 하는 항종양 치료제{method for efficient generation of antigen-specific cytotoxic T lymphocytes with immuno activity in vitro and antitumor agent comprising the CTL}

본 발명은 세포독성 T 세포를 활용한 면역치료에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 시험관내에서 항원 특이적인 세포독성 T 세포를 생성하는 방법에 있어서, CD4+:CD8+ T 세포의 비율을 조절하고, 도움 T 세포 증강용 항원 사용 및 Th1 편극화를 통하여 세포독성 T 세포를 효율적으로 생성하는 방법에 관한 것이다.

현재의 암 치료법으로는 암세포화한 조직을 외과적으로 가능한 한 많이 제거하고 난 후, 잔존하는 암세포를 파괴하기 위한 방사선 요법과 화학요법을 행하는 것이 주종을 이루고 있다. 그러나, 외과적 수술의 경우에는 절제범위가 광범위하고, 미세전이 등에 의한 재발 위험성이 있으며, 방사선 요법과 화학요법의 경우에도 많은 부작용이 있고, 또한 각 항암제가 모든 암에 효능이 있는 것도 아니며, 많은 경우 항암제에 노출된 잔존 암세포들이 내성을 획득하고는 성장을 계속하고 급기야 다른 장기로 전이되어 치료 불가능한 상태로 빠지게 된다는 등의 여러 문제점 이 있었다.

따라서, 이들 요법만으로 암을 정복하기에는 한계가 있다는 사실을 현실적으로 인정하지 않을 수 없으며, 이에 새로운 암 치료법으로 기대를 모으고 있는 치료방법이 우리 몸 자체의 면역기능을 이용한 면역요법이다.

면역요법은 타 요법에 비해 부작용이 적고 타 요법과 병용시 우수한 효과를 발휘해, 최근에 중요성이 더욱 부각되고 있는 요법이다. 암 치료법 중 수술요법, 화학요법(항암제), 방사선요법은 암세포를 직접 공격하는 것인 반면 면역요법은 환자 자신이 가지고 있는 면역력에 작용해 이를 활성화시킴으로써 자신의 면역력으로 암을 치료하는 간접적인 치료방법이다.

인체의 면역기능에는 체액성 면역과 세포성 면역이 있다. 체액성 면역은 세균, 바이러스 등 항원이 체내에 들어왔을 때 그 항원을 용해 제거하기 위한 항체를 만들어 내는 것이다. 한편 세포성 면역은 어느 항원(암세포)에 반응하는 세포(림프구)를 만들어 내는 것으로 면역 감시기구를 작용시키는 것이다. 암에 관한 면역에서는 체액성 면역보다 림프구를 중심으로 한 세포성 면역이 더 중요한 역할을 한다. 이처럼, 항종양 면역반응에는 일반적으로 세포성 면역반응이 관여하고, 이러한 반응은 CD8+ 세포독성 T세포(CD8+ cytotoxic T lymphocyte, CTL)의 역할이 중요한 것으로 알려졌다. 이들 항종양 T세포를 유도하기 위해 종양-연관 항원(tumor-associated antigen; TAA)에 대한 연구가 지속되어 왔으며, 재조합 DNA 기술의 발달로 종양에 대한 T 세포 면역치료법의 개발을 위한 연구가 최근 계속되고 있다.

수지상세포는 종양백신에 사용되는 강력한 세포성 아쥬번트로 많은 연구가 되고 있다. 수지상 세포를 사용하는 이유는 종양세포에 특이적으로 작용하는 항원-특이적인 세포독성 T세포를 유도하기 위해서는 MHC class I 분자에 항원이 제시되는 과정이 필수적인데, 수지상 세포는 강력한 항원제시세포로서 기능을 할 수 있기 때문이다. 항원-특이적인 세포 독성 T 세포 유도에 사용되는 항원제시세포 중 수지상 세포는 골수에서 기원하여 말초 부위(peripheral site)에서 미성숙 상태로 존재한 후 항원을 인지하여 증식이 억제된 T세포를 자극하여 항원에 대해 활성을 갖는 T세포의 면역반응을 개시하거나 조절하는 것으로 알려져 있다. 또한 수지상 세포는 세포 독성 T 세포 이외에도 면역반응에 관여하는 MHC, CD80, CD86, LFA(lymphocyte function-associated antigen) 1 및 3, I CAM(intracellular adhesion molecule) 1 및 3 등의 분자를 높은 수준으로 발현하므로 항종양 면역 반응을 유도하기 위하여 사용되는 항원제시세포로서 바람직하다.

종양에 반응하는 CD8+ 세포독성 T세포 클론은 항원 존재 종양세포를 제거하고, 개별적인 전이를 억제함으로써 항원 특이적인 면역반응을 중개한다. 암환자에서 종양 항원에 특이적인 세포독성 T세포를 생성하는 생체 내(in vivo) 방법이 연구되었으나, 암환자가 종양 특이적 항원에 대하여 골수세포 또는 조절 T 세포 등 숙주 항원 제시세포에 의해 유발된 T세포 면역성 결여로 인하여 T 세포 내성 또는 억제를 보유하고 있는 경우가 존재한다. 또한 암환자들은 비정상적으로 분화되고 활성화된 수지상세포를 가지고 있어 이는 성숙되고 기능을 발휘하는 수지상세포의 생성을 감소시키고, MHC class II, 병용 자극 분자 및 적절한 사이토카인을 저해조절하기 때문에, 종양을 가지고 있는 숙주의 수지상세포는 적절하게 면역시스템을 자극할 수 없다.

즉, 암환자들의 경우 비정상적으로 분화된 수지상세포를 가지고 있으며, T-세포 내성을 가지는 면역시스템의 정상적 기능이 수행되지 않기 때문에, 암환자 체내에서 항원 특이적 세포독성 T 세포를 생성하기 어려워 시험관 내에서 항원 특이적 세포독성 T 세포를 생성하는 방법이 연구되고 있다.

최근의 파월 등은(Powell Jr DJ et al., Journal of Immunology 177:6527-39, 2006)에서는 전이피부암 환자에서, 림프구 고갈 후 백신화 된 말초혈액단핵세포(PBMC)의 도입은 다량의 종양반응성의 CD8+ 세포독성 T세포를 유지함을 밝혀내는 등, 종양세포에 대하여 특이적인 활성을 가진 세포독성 T세포의 세포 밖 생성은 암환자에게 있어서, 효율적인 세포치료 접근법 중의 하나이다.

많은 연구들은 시험관내에서 미경험 항원으로부터 종양 반응성의 세포독성 T세포의 유도를 위하여 수지상세포 같은 강력한 항원제시세포가 필요함을 보여준다.

공개특허 제2007-64578호에서 본 발명자들은 재조합 아데노바이러스로 전이된 수지상 세포를 이용하여 CEA-특이적인 세포독성 T세포를 시험관 내 조건에서(in vitro) 유도함으로써, 인간의 면역체계를 이용해 질병을 안전하고 효율적으로 치료할 수 있는 면역치료법 을 제시하였다.

서비빈(Survivin)은 세포사멸을 억제하는 IAPs(inhibitor of apoptosis) 단백질 족의 한 요소로서, 세포사멸을 억제하고, 세포분열을 조정하는 효과를 가지며, 보통의 태아 발달(fetal development)과정 중에 존재하나, 완전하게 분화된 성인의 조직에서는 발견할 수 없다. 서비빈(Survivin)은 대부분의 상피, 조혈모 관련 암과 뇌종양에서 변종적으로 발현된다. 서비빈(Survivin)의 과잉발현은 종양 진행과 연관되어 있으며, 많은 종양의 진단 및 치료에 있어서 중요한 타겟이 되고 있다. 어떤 암환자의 경우는 서비빈(Survivin)에 대하여 체액성 면역 및 세포성 면역을 나타내고 있다고 보고되었으며, 또는 MHC(major histocompatibility complex) class I 제한된 세포 독성 T세포를 자극하는 서비빈의 펩타이드 에피토프가 유방암, 백혈병, 직장암 및 흑색종 환자에서 동정되었다.

그러나, 시험관내에서 미경험 항원으로부터 최초의 면역반응을 개시하고 증폭 시키는 것은 미경험 항원이 스트린전트 활성 및 병용자극성의 요구사항을 가지기 때문에 어려우며, 이전 연구들에서는 말초혈액단핵세포에서 종양항원특이 세포독성 T 세포 생성을 위해 주로 CD8+T 세포 또는 말초혈액림프구(peripheral blood lymphocytes)를 반응세포로 이용하였으나, 결과물의 생성효율이 임상적으로 적용할 만큼 충분량을 얻지 못하는 어려움이 있었다.

따라서 소량의 말초혈액단핵세포를 이용하여 시험관내에서 세포독성 T 세포의 생성을 극대화하여 효율적으로 항종양 면역치료제를 생성하는 방법을 연구하던 중, CD4+ 세포의 수, 도움 T 세포 증강용 항원 및 Th1 편극화를 포함하는 CD4+ T 세포의 정량적, 정성적 조절을 통하여 세포독성 T 세포를 고효율로 생성할 수 있으며, 종양항원뿐만 아니라 도움 T 세포 증강용 항원에 대하여도 세포독성 반응을 일으킬 수 있어 하나의 배양을 통하여 두 항원에 동시에 특이적인 세포독성 T 세포를 획득할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 시험관내 항원 특이적 세포독성 T 세포의 고효율 생성방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 고효율 항원 특이적 세포독성 T 세포를 포함하는 면역치료제, 항종양 백신을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 도움 T 세포 증강용 항원 사용 및 Th1 편극화를 포함하는 CD4+ T 세포의 정량적, 정성적 조절을 통하여 세포독성 T 세포를 효율적으로 생성하는 방법을 제공한다.

시험관 내에서 세포독성 T 세포를 생성하기 위하여, 수지상세포에서 MHC(major histocompatibility complex) class I PATHWAY를 통하여 항원을 제시하는 survivin 발현 재조합 아데노바이러스(Adv-survivin)를 사용하였으며, 서열번호 1의 Full-length의 서비빈 단백질은 대부분의 정상 성인 조직에서는 발현정도가 낮지만, 상피, 조혈모 관련 암과 뇌종양과 같은 종양에서 전반적인 과발현 양상을 나타내기 때문에 면역반응을 일으키는 항원으로 사용하였다.

Full-length의 서비빈 단백질 사용은 다수의 에피토프 특이적 세포독성 T 세포 반응을 유도하고, CD4+ 및 CD8+ T 세포들이 둘다 관여하며, MHC class I에 기반한 환자 선택(patient selection)을 피하게 할 수 있어 항암 면역치료에 효과적이 다. 또한 CD4+ T 세포의 활성도를 높이기 위해 도움 T 세포 증강용 항원을 사용하였다.

"도움 T 세포 증강용 항원"은 강한 방어적 면역반응을 가지는 잠복바이러스성 감염상태에서 naive 한 종양 항원에 대한 면역반응을 증강시키는 물질을 의미하고, 본 발명의 도움 T 세포 증강용 항원은 사람에서 잠복감염을 일으키는 EBV antigen(LMP1,EBNA3c 등), CMV antigen(IE1, pp65 등) 에서 하나 이상 선택할 수 있으며, 본 발명의 구체적 실시에서는 Human cytomegalovirus (HCMV, 사람거대세포바이러스) 재조합 pp65를 사용하였고, 상기 재조합 pp65는 HIV(Tat) 분자가 융합된 pp65 단백질로서 pp65 mini gene으로서 N-terminal protein, 과 C-terminal protein으로 구성된다.(서열번호 2). CD4+T 세포의 활성을 강화시키기 위해 도움 T 세포 증강용 항원으로 사용되는 재조합 pp65는 CD4+ T 세포를 T helper 1으로 편극화 시킬 수 있어 종양항원특이 세포독성 T 세포생성의 촉매제로써의 역할을 수행할 수 있다.

항원제시세포로써 수지상세포의 이용은 반응 T 세포에 항원 특이적인 강력한 자극을 유도할 수 있다. 또한 재조합아데노바이러스의 이용은 그 자체로써 수지상세포의 활성을 유도할 수 있기 때문에 항원전달매개체로써 유용하다. 아데노바이러스 시스템은 수지상세포로 유전자 전달하는 효율적 방법이며 수지상세포의 성숙을 유도하는데, 이는 잠재적인 면역 반응의 자극에 매우 중요하다. 이전 연구결과에서 재조합 아데노바이러스로 전이된 수지상세포가 시험관내에서 CEA 특이적인 세포 독성 T세포를 유도함을 증명하였다. 재조합 아데노바이러스로 전이된 수지상세포는 쥐 종양 모델에서 펩타이드에 비하여 항종양 면역을 보다 효율적으로 유도할 수 있다.

본 발명은 CD4+ T 세포의 정량적, 정성적 조절에 따른 시험관내에서 항원 특이적인 세포독성 T 세포의 고효율 생성방법을 제공한다.

CD8+ T 세포, 2:1 및 1:1 비율의 CD4+:CD8+ T 세포, 및 2:1 비율의 CD25-CD4+:CD8+ T 세포를 포함하는 몇몇 반응자 T 세포 집단을 Adv-survivin으로 전이된 수지상세포로 3주간 자극하는 경우, 도 1A에서 나타나는 바 처럼, 1:1 비율의 CD4+:CD8+ T 세포의 증식은 21일째의 정제된 CD8+ T 세포보다 적어도 3배에서 4배 이상 높은 반면에, CD25-CD4+ T세포의 사용에도 불구하고, 2:1의 CD4+:CD8+ T 세포에서 T 세포는 증식하지 않는다. 또한 다양한 CD4+:CD8+ T 세포의 비율에 따른 T세포의 증식을 실험한 결과 그 비율이 2:1에서 1:２로 변경됨에 따라 Treg과 같은 저해 T세포를 포함한 CD4+ T세포가 정량적으로 감소되었을 경우 항원 특이적인 T세포의 증식이 증가하였다.(도 1B)

세포독성 T세포 반응의 감소는 Treg세포에 의하여 유도된 CD4+CD25+세포들의 확대와 연관되어 있다. 상기 실험결과는 CD4+ T세포의 정량적인 변화가 정상 건강인에서 CD4+CD25+ Treg세포들의 결여(제거)보다 세포독성 T세포를 생성하는데 영향을 끼침을 나타내며, 적절한 비율의 CD4+:CD8+ T 세포가 시험관내에서 항원 특이적 T 세포 반응을 생성하는데 있어서 중요함을 나타낸다.

본 발명에서 항원으로 사용된 서열번호 1의 서비빈에 대하여 서비빈 특이적 세포독성 T 림프구 면역반응을 조사한 결과 서열번호 3의 SVV-1 peptide 로 로딩된 자가 LCL(LCL/SVV-1)에서 특이적 IFN-γ 분비 세포들이 높은 빈도로 나타났으며, 세포독성반응을 측정한 결과 서비빈 특이적 T 세포들은 SVV-1 peptide 로 로딩된 LCL(LCL/SVV-1)에 대하여 특정한 세포독성을 보임을 확인하였다.(도 2A,2B)

또한 CD4+ T세포의 정략적인 변화에 의한 세포 독성 T세포의 증가에 부가하여, 특정 항원에 의한 CD4+ T세포의 활성화가 세포 독성 T세포 생성에 미치는 영향에 대하여 실험하였다.

본 발명에서, CD4+ T세포를 유도하기 위하여 HLA class II분자들을 통하여 제시되는 사람거대세포바이러스(human cytomegalovirus, HCMV) 재조합 pp65 단백질을 사용하였다. 실험결과, 도 3B에서 나타나듯이, TNF-α-및 IFN-γ를 포함하는 Th1 유형 사이토카인의 분비가 서열번호 2의 재조합 pp65 단백질에 의하여 증가되었으며, IL-4와 같은 Th2 유형 사이토카인(cytokines)의 양이 감소하였다. 재조합 pp65 단백질의 도움 T 세포 증강용 항원으로서의 사용은 몇몇 이점을 가지고 있다. 사람거대세포바이러스(human cytomegalovirus, HCMV)는 성인 인구의 50에서 100%에서 잠복되어 있어, CD4+ T세포들을 쉽게 재활성화 활 수 있는 헤르페스 바이러스다. 도 4에서 나타나는 바 처럼, 사람거대세포바이러스(human cytomegalovirus, HCMV)는 교차제시를 통하여 CD4+ T 세포 뿐만 아니라, CD8+ T세포를 활성화하기 때문에, 하나의 배양을 통하여 두 항원(도움 T 세포 증강용 항원으로서의 재조합 pp65 및 종양 항원)에 대하여 특이적인 세포독성 T세포를 획득할 수 있다. 두 항원 특이적 세포독성 T세포는 암 및 allogeneic stem cell transplantation (SCT)이후의 사망률의 주된 원인인 사람거대세포바이러스(human cytomegalovirus, HCMV) 감염에 대하여 보호할 수 있다.

도 3 및 도 4에서 나타나듯이, 재조합 pp65단백질로 자극된 CD4+ T세포들은 Th1 유형 사이토카인( TNF-α 및 IFN-γ)을 분비하고, 이는 시험관 내에서 종양 특이적인 세포독성 T세포의 효율적인 유도를 돕는다.

본 발명자들은 IL-12 및 anti-IL-4 mA를 가지고 편극화 조건하에서 4일 동안 the anti-CD3 mAb (OKT3) 및 anti-CD28 mAb로 처리한, Th1 conditioning CD4+ 세포들을 사용하였다. 도 5A에서 보여지 듯이, Th1 conditioning CD4+ T 세포들은 고수준의 TNF-α 및 IFN-γ를 분비하고, IL-4의 분비는 감소한다. 이런 세포들은 CD8+ 세포독성 T세포의 증식을 증가시킬 수 있으며, 전구체로부터 세포독성 T세포 반응의 유도를 개시할 수 있다. (도 6). 게다가. CD40L 발현은 또한 Th1 conditioning CD4+ T세포 표면에서 현저하게 증가한다(도 5). CD40-CD40L 상호작용에 의한 수지상세포-CD4+ T 세포의 교차 토크(talk)는 수지상세포에서 고수준의 IL-12를 유도하고, CD4+ T 세포를 T helper 1(Th1) 유형 쪽으로 편극화 하며, CD8+ T 세포 증식을 증가시킨다.

세포독성 T세포의 주된 subset 은 말초조직으로 이동하여 즉각적인 효과를 중재하는 효과 기억 T세포를 나타내는 CD62L- 및 CD45RA 네거티브 표현형을 나타낸다.(도 6E)

시험관내에서 생성된 바이러스 항원에 대하여 특이적인 세포독성 T세포의 대부분은 CCR7- 및 CD45RA 네거티브 표현형을 나타낸다.

본 발명은 시험관내에서 항원 특이적인 세포독성 T 세포를 생성하는 방법에 있어서, CD4+:CD8+ T 세포의 비율을 변화시켜, 항원 특이적 세포독성 T 세포의 증식을 최적화하는 CD4+:CD8+ T 세포의 비율 조성을 나타내며, 수지상세포에 사람거대세포바이러스의 주요 항원인 pp65 단백질을 감작시 Th1 사이토카인을 분비하는 CD4+ T 세포를 활성화할 수 있음을 확인하였고 면역보강제로 pp65 단백질의 사용은 survivin 특이 세포독성 T 세포수와 빈도를 증가시킴을 실험적으로 입증하였다. 또한 시험관내에서 Th1으로 편극화(polarization)된 CD4+ T 세포는 이러한 세포독성 T 세포 생성을 더욱 증대시켰다. 상기 설명된 바와 같이 CD4+ T 세포의 정량적, 정성적 조절을 통하여 시험관 내에서 세포독성 T 세포를 고효율로 생성함으로써 종양 면역치료 분야에 적용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 동량의 말초혈액단핵세포에서 종양 항원 특이 세포독성 T 세포 생성 효율을 극대화 할 수 있으며, 적절한 도움 T 세포 증강용 항원의 사용으로 종양항원뿐만 아니라 도움 T 세포 증강용 항원에 대하여도 세포독성 반응을 일으킬 수 있어 하나의 배양을 통하여 두 항원에 동시에 특이적인 세포독성 T 세포를 획득하게 되어 항종양 면역치료제를 효율적으로 생성할 수 있게 된다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 재료 및 방법

1-1. MACS system에 의한 세포 분리

인간 말초혈액은 HLA-A2 6명의 건강한 공여자로부터 획득되어지며, 단핵세포는 Ficoll-Hypaque (Amersham Pharmacia Biotech, 미국) 밀도 구배 원심분리를 사용하여 분리된다. 공여자의 인간 백혈구 항원(HLA)-A 서브타입(subtypes) 은 HLA 실험실에서 서열 기반의 타이핑으로 결정된다. 본 연구를 위한 동의서 및 승인서는 공여자들 및 한국 가톨릭 대학교 의과대학의 연구위원회로부터 획득하였다.

밀도 구배 후, MACS System (Miltenyi Biotec,독일)을 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라, 마그네틱 마이크로비드(Miltenyi Biotec,독일)에 결합된 anti-CD14, anti-CD4 및 anti-CD8 antibody를 사용하여 CD14+ 단핵세포, CD4+ T 및 CD8+ T 세포들을 분리하였다. 분리된 세포의 순도는 flow cytometric analysis에 의할 경우 95% 이상이다. CD4+CD25+ Treg-depleted CD4+ (CD25-D4+) T cells를 수득하기 위하여, CD25+ T세포는 미리 분리된 CD4+ T 세포로부터 마그네틱 마이크로비드(Miltenyi Biotec,독일)에 결합된 anti-CD25 antibody를 사용하여 고갈되었다.

1-2. 서비빈(서열번호 1)을 코딩하는 재조합 아데노 바이러스(Adv-survivin)의 제작

pShuttle vector (Clontech, 미국)에 기반한 인간 서비빈 발현 벡터는 센스프라이머 5-CGAACTCGAGATGGGTGCCCCGACGTTG-3, (서열번호 5) 및 안티센스프라이머 5- GCAAGGATCCTCAATCCATGGCAGCCAG-3 (서열번호 6)을 사용하여 RT-PCR법으로 제조되었다. 그 후, 서비빈 발현 카세트를 pAdeno-XTM 바이러스 벡터 (Clontech, 미국)로 삽입하였다. 아데노 바이러스 벡터 컨스트럭트는 PacI으로 절단되고, Lipofectamine(Life Technologies Inc. 미국) 을 가지고 HEK 293세포에 트랜스 펙션된다.

재조합 아데노 바이러스의 DNA를 패키징 한 후, 서비빈 유전자를 포함하는 아데노 바이러스를 증폭하였고, CsCl 밀도 구배 원심분리를 이용하여 2회 원심분리하여 세포 용해물로부터 정제하였다.

바이러스 산물은 탈염하여 10％ 글리세롤(v/v)을 포함하는 PBS (phosphate-buffered saline)에서 -80℃로 저장하였다. TCID50(50％ tissue culture infectious dose) 방법으로 바이러스 역가를 측정하였다.

1-3. 수지상 세포의 배양 및 항원 펄싱

미성숙한 수지상세포는 humidified 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 6일 동안 매 3일10% fetal bovine serum, 100 ng/mL GM-CSF (GM-CSF; Endogen,Woburn, MA, USA), 및 50 ng/mL IL-4 (IL-4; Genzyme, Cambridge, MA, USA) 이 첨가된 RPMI 1640 미디엄에서 배양에 의하여 CD14+ 단핵세포로부터 생성되었다.

미성숙한 수지상세포를 수확하여 37℃에서 3시간 동안 2μL/10⁶수지상 세포의 재조합 pp65단백질(Miltenyi Biotec), MOI 500의 Adv-survivin, 및 pp65-1(서열 번호 4) 으로 감염시켰다. 항원 로딩 후에, 수지상세포는 24시간동안 100 ng/mL TNF-α 및 100 ng/mL LPS로 성숙되었다.

실시예 2 : 시험관 내 Th1 편극화

T helper 1 (Th1) 세포를 획득하기 위하여, CD4+ T 세포들을 편극화 조건하에서 4일 동안 플레이트에 연결된 anti-CD3 mAb (OKT3, 2 ug/mL) 및 anti-CD28(2 ug/mL)로 자극하였다. Th1조건은 IL-12 (5 ng/mL) 및 anti-IL-4 mAb (5 ug/mL)를 포함한다. 4일 후, 세포들을 24시간 동안 플레이트에 연결된anti-CD3 mAb로 재자극한 후, 상층액을 수집하여 IFN-γ, TNF-α 및 IL-4농도를 측정하였다.

실시예 3 : 시험관 내 서비빈 특이적 인간 T림프구의 자극

항원 펄싱 후, 성숙된 수지상 세포를 40 Gy로 방사능 조사하였다. 본 절차는 기준(control) 배양에서 수지상세포의 성장을 방지한다. 말초혈액단핵세포의 CD14 미포함 분획은 CD8+ 및 CD4+ T세포들의 생성을 위한 원료로 사용된다. CD4+:CD8+ T 세포들, 정제된 CD8+, 또는 CD25-CD4+ 를 가지는 CD8+ T세포들의 몇몇 비율은 10% fetal bovine serum (Gibco-BRL),2mM l-glutamine, 및 1% penicillin-treptomycin (Cambrex)가 첨가된 RPMI 1640 미디엄에서 24-웰 플레이트에서, 각각 2.0×10⁶/웰 및 1.0×10⁵/웰의 최종농도로 수지상 세포와 함께 배양되었다. 배양 7일 째에 세포들을 수확되어 재자극된다. 수지상세포는 1.0×10⁵ cells/웰의 밀도로 플레이트에 놓여지고 T세포들은 1.0×10⁶ cells/웰의 밀도로 첨가된다. 8일 째부터 매3일 마다 20 U/mL IL-2 (Endogen)를 부가한다. 3번의 재자극 후에, 서비빈 특이적 면역반응을 측정하였다.

공여자-HB의 말초혈액(PBMCs)을 사용하여 시험관내에서 항원 특이적 T 세포를 유도하는 반응자로서 사용되는 적절한 T 세포들의 조건을 연구하였다. (Fig. 1A). CD4+:CD8+ T 세포 비율은 보통의 건강한 성인에서 2:1 및 1:1의 범위를 유지하기 때문에, 2:1 및 1:1 비율의 CD4+:CD8+ T 세포가 배양되었다.

말초혈액에서 자연적인 조절 T 세포를 제거하기 위하여 CD25+ cell depleted CD4+(CD25-D4+) T 세포들이 말초혈액과 유사하게 2:1 비율로 사용되었다. 정제된 CD8+ T 세포, 2:1 및 1:1 비율의 CD4+:CD8+ T 세포, 및 2:1 비율의 CD25-D4+:CD8+ T 세포를 포함하는 몇몇 반응자 T 세포 집단은 Adv-survivin으로 전이된 수지상세포로 3주간 자극된다.

CD4+:CD8+ T 세포 비율 및 시험관내 T 세포 증식결과를 살펴보면, 도 1A에서 나타나는 바 처럼, 1:1 비율의 CD4+:CD8+ T 세포의 증식은 21일째의 정제된 CD8+ T 세포보다 적어도 3배에서 4배 이상 높은 반면에, CD25-D4+ T세포의 사용에도 불구하고, 2:1의 CD4+:CD8+ T 세포에서 T 세포는 증식하지 않는다.

CD4+:CD8+ T 세포의 적절한 비율을 결정하기 위하여, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 및 1:8 등의 다양한 비율의 반응자 T 세포를 3인 이상의 공여자의 PBMC를 사용하여 실험하였다.

타 실험군 보다 1:1 및 1:2 비율의 CD4+:CD8+ T 세포에서 증식이 지속적으로 증가되었다.(도 1B). 21일째 CD8+ T 세포의 비율이 1:1 비율의 CD4+:CD8+ T 세포에서 보다 1:2 비율의 CD4+:CD8+ T 세포에서 더 높았기 때문에(도 1C), 1:2 비율의 CD4+:CD8+ T 세포를 대상으로 추가실험을 실시하였다. 이런 실험결과는 적절한 비율의 CD4+:CD8+ T 세포가 시험관내에서 항원 특이적 T 세포 반응을 생성하는데 CD4+CD25+ Treg세포의 제거보다도 중요함을 나타낸다.

1:2 비율의 CD4+:CD8+ T 세포가 보통의 건강한 공여자에서 시험관내 T 세포 자극에 효율적인지를 확인하기 위하여 6인의 건강한 공여자는 Adv-survivin으로 전이된 수지상세포를 사용하여 자극되었다. 도 1D에서 볼 수 있듯이, 3면의 공여자의 세포들은 6배 이상의 강력한 증식을 보이나, 2면의 공여자는 2에서 3배 정도의 중간 증식을 보인다.

한 명의 공여자는 배양동안 증식을 유지할 수 없었다. 이런 결과들은 증식 가능성이 개개인 및 그들의 상황에 따라 다양할 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 4 : ELISPOT assay

인터페론-γ(IFN-γ)분비세포를 탐색하기 위하여, BD Elispot 어세이 키트를 가지고 제조자의 지시에 따라 Elispot 어세이를 수행하였다. Any-Gen Co. Ltd. (Kwangju, 한국)가 HLA-A0201 제한된(restricted) 서비빈 유래 펩타이드, SVV-1 (ELTLGEFLKL, 서열번호 3) 및 pp65 항원 유래 펩타이드인 서열번호 4의 PP65-1(NLVPMVATV)을 합성하였다. 간략하게, T세포들은 10:1의 비율로 3번 SVV-1(서열번 호 3) 또는 PP65-1 펩타이드(서열번호 4)로 감작된 또는 감작되지 않은 LCL로 배양되었다.

인터페론-(IFN-γ-)분비세포에 대응하는 스폿의 수는 AID-ELISPOT-Reader (AID)로 측정하였다.

감작되지 않은 자가 LCL(LCL/Mock) 또는 HLA-A0201-restiricted survivin-derived peptide (SVV-1, 서열번호 3)으로 감작된 자가 LCL(LCL/SVV-1)이 ELISPOT assay의 항원 제시세포로 사용되었다. HLA class I restriction을 결정하기 위하여 세포들은 W6/32, anti-HLA class I mAb로 30분 동안 미리 배양되었다. 도 2A에서는 SVV-1(서열번호 3) 특이적 IFN-γ분비 세포들이 높은 빈도로 나타난다.(1466± 152 IFN-γ-secreting cells/105) SVV-1 특이적 IFN-γ-분비 세포들은 anti-HLA class I mAb (W6/32)로 미리 배양된 경우 현저하게 감소하며, 이는 MHC Class I restriction에 의한 제시를 의미한다.

실시예 5 : 51Cr-release assay

각 항원이 감작된 수지상세포로 3차례 자극된 후, specific lysis was determined by 표적세포로서 펩타이드 펄스된 자가 lymphoblastoid cell lines (LCLs)을 사용하여 표준 51Cr-release assay로 특정 용해를 측정하였다.

서비빈 발현 glioma cell lines (T98G 및 A172) 역시 표적세포로 사용되었다. 인간 악성신경교종 T98G cell line (human leukocyte antigen [HLA]-A2) 및 A172(HLA-A1, A3)은 American Type Culture Collection (ATCC; 미국)에서 구입하였 다. 이 세포주는 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS), 0.5mM sodium pyruvate, 2mM l-glutamine, 0.1mM 비필수아미노산, 및 항생제 (Invitrogen)을 포함하는 DMEM (Invitrogen, 미국)에서 배양되었다.

glioma cell lines을 MHC class I 분자의 발현을 강화하기 위해 2일 동안 인터페론-γ(IFN-γ;Endogen) 100U/ml의 존재하에서 배양하였다.

SVV-1 및 PP65-1로 로ELD된 LCL 및 glioma cell line을 37 ℃에서 1시간 동안 10⁶ 세포당 100μCi Na₂[⁵¹Cr]O₄과 함께 배양하고, 4회 세척한 후에, 96-웰 라운드 bottom 플레이트에 효과세포(5.0×10³ cells/well)를 위한 표적세포로 사용되었다. 37 ℃에서 4시간 동안 배양 후, 각 웰에서 150L 상층액을 회수하고, 방사능을 감마카운터(Wallac Oy, 핀란드)에서 측정하였다. 최대 Maximum release 는 2% Triton X-100(Sigma, 독일)을 부가하여 측정한다.

자발적인 release는 라벨된 표적과 함께 웰에서 결정한다. Specific lysis는 하기 수학식 1에 의하여 계산된다.

specific 51Cr release = [(experimental counts-spontaneous counts)/(maximal counts-spontaneous counts)×100%.

서비빈 특이적 T 세포들은 SVV-1 (LCL/SVV-1)로 로딩된 자가(LCL)에 대항하 여 특정한 세포독성을 보인다. (도 2B).

실시예 6 : FACs analysis

세포들을 수화하여, 세척하고, PBS 에 재현탁한 후, 다양한 fluorochrome-conjugated antibodies와 암실에서 30분간 얼음에서 배양하였다. 세포들은 다시 세척하고, FACS Calibur 기구(Becton-Dickinson,미국)및 BD CellQuest software를 사용하여 분석하였다. 다음의 mAbs가 세포독성 T세포(CTL)의 표현형을 결정하기 위하여 사용되었다.: FITC-labeled anti-CD4 및 anti-CD62L, PE-labeled anti-CD8 및 anti-IFN-γ, PE-cy5 labeled anti-CD45RA. 모든 항원은 Becton-Dickinson에서 구입하였다.

항원 감작된 또는 감작되지 않은 LCL로 재자극된 후에 직접적으로 세포내부 염색(staining)에 의하여 IFN-γ생성을 위하여 CD8+ T 세포를 분석하였다. 제작자의 추천에 따른 염색 후 proprietary solution (Cytofix/CytopermTM, Becton Dickinson)을 사용하여 세포들의 투과성을 수행하였다.

실시예 7 : Cytometric bead array (CBA) multiplex assays

공여자 KS의 시험관내 세포독성T세포 생성을 증가시키기 위하여, Th1 조건으로 조절된 CD4+ T 세포 (Th1)를 CD4+ T 세포를 대신하여 사용하였다. Th1 조건으로 조절 CD4+ T 세포 (Th1)는 고수준의 IFN-γ-(p = 0.0306) 및 TNF-α-(p = 0.0194)를 분비하나, 배양 상층액의 IL-4양은 상당히 낮다. (p = 0.0075) (도 5A).

추가적으로, 이런 CD4+ T 세포는 Th1에서 주로 발현되는 표면 분자인 CD40L 및 CXCR3를 고수준으로 발현한다. (도 5B).

항원 감작된 또는 감작되지 않은 수지상세포로 T 세포를 자극하는 동안, 상층액은 2일때체 샘플에서 수집되었고, cytometric bead array (CBA)를 사용하여 사이토카인 함량을 분석하였다.

실험은 제작자의 지식에 따라 CBA Th1/Th2 kit (BD)를 사용하여 수행하였고, 표준은 쿡 등 (Cook EB, et al.,Journal of Immunological Methods ;254:109-18, 2001)에서 기술된 절차를 따랐다.

통계적 분석은 software Graph Pad Prism 5 (GraphPad Software,미국)을 사용하여 수행하였다. 통계적 테스트는 3개의 별도의 실험에 적용되었다. 실험값의 차이는 학생들의 t-test 및 two-way ANOVAS를 보두 사용하여 결정되었다. 유의성은 p < 0.05에서 결정되었다.

실시예 8 : Th1환경을 위한 도움 T 세포 증강용 항원으로서 재조합 pp65 단백질

재조합 pp65 단백질이 CD4+ T세포를 활성화 시킬 수 있는지를 시험하기 위하여, CD4+ 및 CD8+ T세포를 pp65 단백질 또는 PP65-1 펩타이드로 감작된 수지상세포로 자극하였다. 도 3A에서 보여지는 바 처럼, pp65 단백질에 반응하는 IFN-γ 생성 CD4+ T세포의 더 높은 빈도가 발견된다. 이와 반대로, CD8+ T세포는 PP65-1 펩타이드로 감작된 수지상세포에 반응한다.

pp65 단백질로 감작된 수지상세포에 의하여 활성화된 CD4+ T세포는 T helper 1 (Th1) 또는 T helper 2(Th2) 사이토카인을 분비하는지를 시험하기 위하여 할 수 있다.Th1 (IFN-γ, TNF-α) 및 Th2 (IL-4)타입 사이토카인의 수준을 CD4+ T세포의 배양 상층액으로부터 측정하였다.

도 3B에서 나타난 바 처럼, pp65 단백질로 감작된 수지상세포로 자극된 CD4+ T세포는 더 높은 수준의 IFN-γ(p = 0.0053) 및 TNF-α(p = 0.009)를 분비하나, 탐지된 IL-4수준은 감작 되지 않은 수지상세포(p = 0.0075)보다 낮다. 상기 실험결과는pp65 단백질이 CD4+ T세포 뿐만 아니라, 도움 T 세포 증강용 항원으로서 시험관내 Th1 환경을 생성함을 나타낸다.

실시예 9 : 재조합 아데노 바이러스(Adv-survivin) 및 재조합 pp65단백질로 감작된 수지상 세포에 의한 자극

공여자 KS의 중간(ntermediate) 성장(도1D)에서 세포독성T세포의 생성을 증가시키기 위하여 Adv-survivin 및 HCMV pp65 단백질(SVV+ pp65)로 감작된 수지상세포를 1:2 비율의 공여자 KS의 CD4+:CD8+ T 세포와 함께 3주 동안 배양하였다. 도 4A에서 SVV+pp65집단의 성장능력이 Adv-survivin 집단(SVV)의 성장능력보다 현저히 높다. (*, p < 0.0038).

pp65 단백질이 주로 CD4+ T세포를 자극한다 하더라도, 세포독성T세포의 CD8+ T세포의 비율이 SVV에 비하여 SVV+pp65에서 현저히 증가된 것은 흥미로운 발견이다. (도 4B).

다음으로, 세포독성T세포의 면역반응을 조사하기 위하여 IFN-γ-ELISPOT(도 4C) 및 chromium release assay (도 4E)을 수행하였다. 모든 경우에서, SVV+ pp65의 SVV-1 펩타이드에 특이적인 IFN-γ-분비세포들은 SVV의 경우보다 높다. (*, p = 0.021).또한, SVV 는 오직 SVV-1 펩타이드 로딩된 자가 LCLs (LCL/SVV-1)에 대하여 세포독성을 나타내나, SVV+ pp65는 LCL/SVV-1뿐만 아니라 LCL/PP65-1에 대하여도 세포독성을 나타낸다.(도 4E).

게다가, 서비빈 특이적 CD8+ T세포의 총 수는 하기 수학식 2로 계산된다.

서비빈 특이적 CD8+ T세포의 총 수 = CD8+ T세포의 총 수×10⁵/10⁵당 서비빈 특이적 IFN-γ-분비 세포의 수

SVV+ pp65의 서비빈 특이적 CD8+ T세포의 총 수는 SVV의 서비빈 특이적 CD8+ T세포의 총 수보다 5배가 높다.(*, p = 0.0082, 도 4D).

상기 결과들은 Th1환경에서 자극적인 CD4+ T세포에 의한 양적 변화가 시험관 내에서 종양 항원 특이적 T세포의 효율적 생성에 필수적이라는 것을 나타낸다.

실시예 10 : Th1 conditioning CD4+ T 세포에 의한 세포독성 T 세포의 생성 증가

1:2 비율의 Th1:CD8+ T 세포는 Adv-survivin 및 pp65 단백질 (SVV+ pp65 + Th1)과 함께, 또는 pp65 단백질 없이(SVV+ Th1) 감작된 수지상세포와 함께 배양된다. SVV+ pp65 + Th1에서 CD8+ T세포의 비율 및 증식 능력은 다른 그룹보다 높다. (도 6A). SVV+ pp65 + Th1에서 IFN-γ-분비 세포의 빈도는 SVV+ pp65 및 SVV+ Th1 ( 1:2 비율의 Th1:CD8+ T 세포로부터 유도된 세포독성 T 세포)와 유사하다. (도 6C). 그러나, 도 6D에서 볼 수 있듯이, SVV+ pp65 + Th1에서 서비빈 특이적CD8+ T 세포의 최종 수득률은 증가된 증식 때문에 다른 그룹보다 높다.(*, p = 0.024, **, p = 0.042).

기억 T 세포 서브세트를 SVV-1 펩타이드로 자극된 후에 분리된 CD8+IFN-γ-+ T세포에서 분석한 결과, 모든 집합에서 CD8+ IFN-γ-+ T cells (more than 97%)의 대부분이 즉각적인 효과자 기능 및 지속적인 반응의 능력을 가지는 효과 기억 표현형[CD45RA^lowCD62L^low]을 보인다. (도 6E). 유도된 T 세포의 세포용해 활성은 HLA-A2-포지티브 or -네거티브 서비빈 발현 악성신경교종 암 세포주에 대하여 측정되었다. (도 6F). 상기 결과는 모든 집합에서 생성된 T세포가 서비빈 및 적절한 HLA allele (HLA-A2)를 발현하는 악성신경교종 암 세포주(T98G)를 용해할 수 있음을 의미한다. HLA-A2를 발현하지 않는 악성신경교종 암 세포주에 대하여는 세포독성 반응이 나타나지 않는다. 상기 결과는 T세포가 서비빈 특이적이고, HLA에 제한됨을 의미한다.

통계적 분석

결과는 평균±표준편차로 나타내었다. 통계적 분석은 ANOVA 테스트를 이용하여 수행되었다. 생존 데이터는 Kaplan-Meier 테스트를 통하여 분석되었고, log-rank 테스트를 이용하여 비교되었다. 데이터는 P < 0.05.에서 통계적으로 유의미하다.

도 1은 시험관내에서 T 세포 증식 CD4+:CD8+ T 세포 비율에 관한 것이다.

도 1(a)는 Adv-survivin으로 전이된 수지상세포에 의한 다양한 반응자 T 세포의 증식능력에 관한 것으로, HLA-A2 공여자-HB로부터 정제된 CD8+ T cells, CD4+:CD8+ (2:1) T 세포, CD25-CD4+:CD8+ (2:1) T 세포, 및 CD4+:CD8+ (1:1) T 세포를 포함하는 다양한 반응자 T 세포는 Adv-survivin으로 전이된 수지상세포로 3주간 자극된다.

도 1 (b)는 다양한 비율의 CD4+:CD8+ T 세포에 의한 반응자 T 세포의 증식 능력을 나타내는 것으로, 3명의 공여자로부터 반응자 T 세포의 CD4+:CD8+ T 세포의 비율은 각각 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 및 1:8 이며, 반응자 T 세포의 각각은 Adv-survivin으로 전이된 수지상세포로 3주간 자극된다.

도 1 (c)는 3명의 공여자로부터 flow cytometric analysis를 사용하여 서비빈 특이적 T 세포에서 다양한 비율의 CD4+:CD8+ T 세포에 의한 CD4+ 및 CD8+ T 세포 빈도의 비율을 나타낸다.

도 1(d)는 6명의 건강한 HLA-A2 공여자로부터 서비빈 특이적 T 세포의 성장 능력을 보여주며, 생존세포의 수는 트립판 블루 다이 exclusion method.에 의하여 결정된다.

도 2는 시험관내에서 1:2 비율의 CD4+:CD8+ T 세포를 사용하여 서비빈 특이적 세포독성 T 세포의 유도를 나타낸다. Adv-survivin으로 전이된 수지상세포가 공여자HJ로부터의 자가 1:2 비율의 CD4+:CD8+ T 세포를 자극하는데 사용되었다.

도 2(a)는 IFN-γ-ELISPOT assay로, 감작되지 않은 자가 LCL(LCL/Mock) 또는 HLA-A0201-restiricted survivin-derived peptide (서열번호3)으로 감작된 자가 LCL( LCL/SVV-1)이 ELISPOT assay의 항원 제시세포로 사용되었다. HLA class I restriction을 결정하기 위하여 세포들은 W6/32, anti-HLA class I mAb로 30분동안 미리 배양되었다.

도 2(b)는 자가 LCC(꽉찬 원) 또는 SVV-1 로드된 LCL(빈 원)에 대한 T 세포의 세포독성을 도시한다.

도 3은 pp65 단백질로 감작된 수지상세포에 의한 CD4+ T 세포의 활성을 나태낸다.

도 3(a)는 IFN-γ ELISPOT assay로서, HLA-A2 공여자-KS의 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 24시간 동안 106 수지상세포 당 2㎕의 pp65단백질 또는 2㎍/mL의 PP65-1 펩타이드로 감작된 수지상 세포와 배양된다.

도 3(b) pp65 단백질로 자극된 CD4+ T 세포로부터 사이토카인의 분비를 도시한다. 사이토카인의 정량은 pp65 단백질로 로드되거나 로드되지 않은 수지상세포와 함께 배양된 CD4+ T 세포의 48시간 배양 상층액으로부터 CBA (cytometric bead array)assay를 사용하여 수행되었다.

도 4는 시험관 내 T 세포 생성에서 도움 T 세포 증강용 항원으로서의 pp65 단백질의 역학을 나타낸다. HLA-A2 공여자-KS로부터 1:2 비율의 CD4+:CD8+ T 세포는 Adv-survivin 또는Adv-survivin 및 pp65단백질로 전이된 수지상세포로 3주 동안 자극되며 사용된 약어는 다음과 같다.

SVV :Adv-survivin 으로 전이된 수지상세포로 자극된 1:2 비율의 CD4+:CD8+ T 세포로부터 유도된 T 세포

pp65: pp65 단백질 감작된 수지상 세포로 유도된 T 세포

SVV+ pp65: Adv-survivin 및 pp65 단백질 감작된 수지상 세포로 유도된 T 세포

도 4(a)는 Trypan blue dye exclusion method에 의한 증식능력 실험결과이다.

도 4(b)는 FACs분석을 사용하여 전체 서비빈 특이적 T 세포에서 CD4+및 CD8 T+ 세포 빈도의 비율로 대표 밀도 플롯을 표현하였다.

도 4(c)는 감작되지 않은 자가 LCLs un-pulsed (LCL/Mock), SVV-1 펩타이드로 감작된 자가 LCLs (LCL/SVV-1) 또는 PP65-1펩타이드로 감작된 자가 LCLs (LCL/PP65-1)이 IFN-γ ELISPOT assay를 위하여 항원 제시세포로 사용되었다.

도 4(d)에서 서비빈 특이적 CD8+ T세포의 최종 수율은 하기 수학식 2로 계산된다:

서비빈 특이적 CD8+ T세포의 최종 수율 = the total number of CD8+ T cells×the number of survivin-specifiic IFN-γ-secreting cells per 10⁵/10⁵.

도 4(e) 자가 LCL/Mock (원), LCL/PP65-1 (삼각형) 및 LCL/SVV-1 (사각형)에 대한 T 세포의 세포독성을 나타낸다.

도 5는 Th1 conditioning CD4+ T 세포의 유도를 나타내며, CD4+ T 세포는 편극화 또는 비편극화 조건하에서 플레이트 연결된 anti-CD3 mAb (OKT3, 2g/mL) 및 anti-CD28 mAb (2g/mL)로 4일 동안 자극된다.

도 5(a) IL-12 (5 ng/mL) plus anti-IL-4 mAb (5g/mL)를 사용하여 또는 사용하지 않고 CD4+ T세포의 배양 상층액으로부터 CBA assay를 사용하여 수행된 사이토카인의 정량을 도시한다. 그리고, 세포들은 phycoerithrin-l 라벨된 anti-CD40L 또는 anti-CXCR3 mAb로 염색된다.

생존한 CD4+ T 세포가 도 5(b)에서 보여진다.

도 6은 시험관 내 서비빈 특이적 T 세포의 가장 효율적인 생성을 위한 Th1 conditioning CD4+ T 세포의 역할을 나타낸다.

도 6(a)는 HLA-A2 공여자-KS로부터의 반응자 T 세포는 각각 Adv-survivin 또는 Adv-survivin 및 pp65 단백질로 3주 동안 전이된 수지상 세포로 자극된 1:2 비율의 CD4+:CD8+ T 세포 및 1:2 비율의 Th1:CD8+ T 세포를 가지고 변형된 결과를 도시한다. 도면에 사용된 약어는 다음과 같다.

SVV+ Th1: Adv-survivin 으로 전이된 수지상세포로 자극된Th1:CD8+ T 세포로부터 유도된 T 세포,

SVV+ pp65 + Th1: Adv-survivin 및 pp65 단백질로 전이된 수지상세포로 자극된 Th1:CD8+ T 세포로부터 유도된 T 세포.

증식 능력은 Trypan blue dye exclusion로 매주 결정된다.

도 6(b) FACs분석을 사용하여 전체 서비빈 특이적 T 세포에서 CD4+및 CD8 T+ 세포 빈도의 비율로 대표 밀도 플롯을 표현하였다.

도 6(c) 감작되지 않은 자가 LCLs (LCL/Mock), SVV-1 펩타이드로 감작된 자가 LCLs (LCL/SVV-1) 또는 pp65-1펩타이드로 감작된 자가 LCLs (LCL/pp65-1)이 IFN-γ ELISPOT assay를 위하여 항원 제시세포로 사용되었다.

도 6(d)의 서비빈 특이적 CD8+ T세포의 최종 수율은 하기 수학식 2로 계산된다:

도 6(e)의 밀도 플랏은 FACs분석을 사용하여 CD8+ IFN-γ+ T세포에서 중앙 기억(CD45RAlowCD62Lhigh) 및 효과 기억(CD45RAlowCD62Llow)빈도의 비율로 표현된다.

도 6(f) 표적 세포는 서비빈 발현 HLA-A2 positive T98G (black) 및 HLA-A2 negative A172 (white) glioma 세포 주이며, [⁵¹Cr]-라벨된 표적 세포는 효과세포들과 지정된 최종 효과: 표적세포 비율까지 배양되었고, 표적세포의 용해비율은 표준 [⁵¹Cr] release assay를 사용하여 측정되었다.

<110> catholic university industry academic cooperation foundation <120> method for efficient generation of antigen-specific cytotoxic T lymphocytes with immuno activity in vitro and antitumor agent comprising the CTL <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 429 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> survivin <400> 1 atgggtgccc cgacgttgcc ccctgcctgg cagccctttc tcaaggacca ccgcatctct 60 acattcaaga actggccctt cttggagggc tgcgcctgca ccccggagcg gatggccgag 120 gctggcttca tccactgccc cactgagaac gagccagact tggcccagtg tttcttctgc 180 ttcaaggagc tggaaggctg ggagccagat gacgacccca tagaggaaca taaaaagcat 240 tcgtccggtt gcgctttcct ttctgtcaag aagcagtttg aagaattaac ccttggtgaa 300 tttttgaaac tggacagaga aagagccaag aacaaaattg caaaggaaac caacaataag 360 aagaaagaat ttgaggaaac tgcgaagaaa gtgcgccgtg ccatcgagca gctggctgcc 420 atggattga 429 <210> 2 <211> 1686 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant pp65 <400> 2 atggagtcgc gcggtcgccg ttgtcccgaa atgatatccg tactgggtcc catttcgggg 60 cacgtgctga aagccgtgtt tagtcgcggc gatacgccgg tgctgccgca cgagacgcga 120 ctcctgcaga cgggtatcca cgtacgcgtg agccagccct cgctgatctt ggtatcgcag 180 tacacgcccg actcgacgcc atgccaccgc ggcgacaatc agctgcaggt gcagcacacg 240 tactttacgg gcagcgaggt ggagaacgtg tcggtcaacg tgcacaaccc cacgggccga 300 agcatctgcc ccagccagga gcccatgtcg atctatgtgt acgcgctgcc gctcaagatg 360 ctgaacatcc ccagcatcaa cgtgcaccac tacccgtcgg cggccgagcg caaacaccga 420 cacctgcccg tagctgacgc tgtgattcac gcgtcgggca agcagatgtg gcaggcgcgt 480 ctcacggtct cgggactggc ctggacgcgt cagcagaacc agtggaaaga gcccgacgtc 540 tactacacgt cagcgttcgt gtttcccacc aaggacgtgg cactgcggca cgtggtgtgc 600 gcgcacgagc tggtttgctc catggagaac acgcgcgcaa ccaagatgca ggtgataggt 660 gaccagtacg tcaaggtgta cctggagtcc ttctgcgagg acgtgccctc cggcaagctc 720 tttatgcacg tcacgctggg ctctgacgtg gaagaggacc tgacgatgac ccgcaacccg 780 caacccttca tgcgccccca cgagcgcaac ggctttacgg tgttgtgtcc caaaaatatg 840 ataatcaaac cgggcaagat ctcgcacatc atgctggatg tggcttttac ctcacacgag 900 cattttgggc tgctgtgtcc caagagcatc ccgggcctga gcatctcagg taacctgttg 960 atgaacgggc agcagatctt cctggaggta caagccatac gcgagaccgt ggaactgcgt 1020 cagtacgatc ccgtggctgc gctcttcttt ttcgatatcg acttgctgct gcagcgcggg 1080 cctcagtaca gcgagcaccc caccttcacc agccagtatc gcatccaggg caagcttgag 1140 taccgacaca cctgggaccg gcacgacgag ggtgccgccc agggcgacga cgacgtctgg 1200 accagcggat cggactccga cgaagaactc gtaaccaccg agcgcaagac gccccgcgtc 1260 accggcggcg gcgccatggc gggcgcctcc acttccgcgg gccgcaaacg caaatcagca 1320 tcctcggcga cggcgtgcac gtcgggcgtt atgacacgcg gccgccttaa ggccgagtcc 1380 accgtcgcgc ccgaagagga caccgacgag gattccgaca acgaaatcca caatccggcc 1440 gtgttcacct ggccgccctg gcaggccggc atcctggccc gcaacctggt gcccatggtg 1500 gctacggttc agggtcagaa tctgaagtac caggaattct tctgggacgc caacgacatc 1560 taccgcatct tcgccgaatt ggaaggcgta tggcagcccg ctgcgcaacc caaacgtcgc 1620 cgccaccggc aagacgcctt gcccgggcca tgcatcgcct cgacgcccaa aaagcaccga 1680 ggttga 1686 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> survivin-1 epitope <400> 3 Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pp65-1 epitope <400> 4 Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val 1 5 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cgaactcgag atgggtgccc cgacgttg 28 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gcaaggatcc tcaatccatg gcagccag 28

Claims

종양항원을 발현하는 재조합벡터가 전이된 항원제시세포를 통하여 시험관내에서 항원 특이적인 세포독성 T 세포를 생성하는 방법에 있어서, CD4+:CD8+ T 세포의 비율을 1:1 내지 1:2로 조절하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포독성 T세포 생성방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 세포독성 T세포 생성방법.
제1항에 있어서, 상기 항원제시세포는 수지상 세포인 것을 특징으로 하는 세포독성 T세포 생성방법.
제1항에 있어서, 상기 항원은 서열번호 1의 서비빈인 것을 특징으로 하는 세포독성 T세포 생성방법.
삭제
제1항에 있어서, 항기 항원제시세포는 도움 T 세포 증강용 항원으로 감작되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포독성 T세포 생성방법.
제7항에 있어서, 상기 도움 T 세포 증강용 항원은 서열번호 2의 재조합 pp65 단백질인 것을 특징으로 하는 세포독성 T세포 생성방법.
제1항에 있어서, Th1 편극화 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포독성 T세포 생성방법.
제1항, 제3항, 제4항, 제5항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 의하여 생성되는 항원 특이적인 세포독성 T세포.
제10항의 항원 특이적인 세포독성 T세포를 포함하는 면역치료제.
제10항의 항원 특이적인 세포독성 T세포를 포함하는 항종양 백신.
제10항의 항원 특이적인 세포독성 T세포를 포함하는 종양치료용 약제학적 조성물.
삭제