KR101075399B1 - Production method of heterograft - Google Patents
Production method of heterograft Download PDFInfo
- Publication number
- KR101075399B1 KR101075399B1 KR1020080138505A KR20080138505A KR101075399B1 KR 101075399 B1 KR101075399 B1 KR 101075399B1 KR 1020080138505 A KR1020080138505 A KR 1020080138505A KR 20080138505 A KR20080138505 A KR 20080138505A KR 101075399 B1 KR101075399 B1 KR 101075399B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- pericardium
- ethanol
- fixation
- hours
- solution
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
- A61L27/3843—Connective tissue
- A61L27/386—Ligaments, tendons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
- A61L27/3873—Muscle tissue, e.g. sphincter
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/507—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials for artificial blood vessels
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Botany (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
본 발명은 이종이식 보철편의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명의 방법은 이종 생체조직을 무세포화한 후, 그 조직을 무-경판막압력상태에서 에타놀계용매가 함유된 글루탈알데히드 용액에 고정 처리하고 그 독성을 제거하는 항독소화 과정을 포함하여 이루어지며, 이에 의하여 제조된 이종이식 보철편은 심장판막이식술 또는 심장혈관수술시 유용하게 사용될 수 있다. The present invention relates to a method for producing a xenograft prosthesis, and more specifically, the method of the present invention after acellularizing a heterologous biological tissue, the tissue is glutaraldehyde solution containing ���olol solvent in the state of non-membrane pressure It is made to include the anti-toxin process to fix and remove the toxicity, xenograft prosthesis prepared thereby can be useful in heart valve transplantation or cardiovascular surgery.
심장판막, 심낭, 혈관대체물, 무세포화, 글루탈알데히드용액, 항독소화, 이종이식, 무-경판막압력고정 Heart valve, pericardium, vascular substitute, acellularization, glutaraldehyde solution, antitoxin, xenograft, fixation free platelet pressure
Description
본 발명은 심장판막이식술 및 심장혈관수술시 사용할 수 있는 이종이식 보철편의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a xenograft prosthesis which can be used in heart valve transplantation and cardiovascular surgery.
심장 수술의 발전과 함께 선천성 복잡 심장 기형, 심장 판막 질환 및 대소 혈관 질환 등을 교정하기 위해 자기 조직이 아닌 다른 인공조직 보철편의 필요가 늘어나 그에 따른 다양한 대체제가 연구 개발, 이용되고 있으며, 특히 이종 장기로부터의 대체재는 오래 전부터 개발 사용 되고 있다. 이종조직의 판막 및 심낭의 인체내 사용을 위해서 고정용액으로 과거부터 글루탈알데히드(glutaraldehyde, GA)가 많이 사용되고 있다.With advances in cardiac surgery, the need for artificial prosthetic tissues other than self tissues to correct congenital complex cardiac anomalies, heart valve disease, and macrovascular disease has increased, and various alternatives have been researched and developed. Alternatives from have been developed and used for a long time. Glutalaldehyde (GA) has been widely used as a fixative solution for use in the human body of heterologous tissues and pericardium.
인체에 삽입된 인공조직판막이나 인공 조직 보철편 등의 부전은 생체와의 화학적, 물리적, 면역학적 반응 등에 의하여, 변성, 퇴행되고 결국 기능상실, 소멸 등의 절차를 밟게 되는데 흔히 그 대표적인 결과로 나타나는 것이 체내에서 완전 석회화되는 것이다. 과거부터 지금까지 그러한 조직의 변성이나 퇴행을 줄이기 위한 연구 는 많이 진행되어 왔지만 , 아직까지 만족할 만한 결과를 얻지 못하고 있는 실정이다.Insufficiency of artificial tissue valves or prosthetic tissue prostheses inserted into the human body is denatured, degenerated, and eventually leads to functional loss and disappearance due to chemical, physical, and immunological reactions with the living body. It is the complete calcification in the body. Many studies have been conducted to reduce the degeneration and degeneration of such tissues from the past until now, but the results are still not satisfactory.
특히 무세포화가 안된 소나 돼지의 심낭이나 판막에서 석회화의 원천적 자리를 제공하는 죽은 조직세포의 존재와 이종면역의 계속적인 함유나, 또한 이러한 돼지의 판막이나 소나 돼지 심낭 등의 조직 고정시 결합하는 글루탈알데히드의 알데히드(aldehyde)기 (-CHO)가 체내의 칼슘과 반응하여 석회화가 일어나는 원인으로 되고 있으나 이를 적절히 처리하지 않으므로 심장내 이식후 조기 석회화로서 판막부전을 초래하고 있다. In particular, the presence of dead tissue cells that provide a source of calcification in the pericardium or valves of non-cellularized cows or pigs, and the continuous inclusion of heterologous immunity; The aldehyde group (-CHO) of the aldehyde reacts with calcium in the body to cause calcification, but since it is not properly treated, it causes valve failure as early calcification after implantation in the heart.
또한, 이러한 심장판막이나 심장혈관대체물은 국내에서 생산 판매되지 않고, 고가로 외국에서 전량 수입에 의존하고 있으며, 또한 국내의 연구 기술도 전무한 상태에 있다. 그리하여 인공조직판막이나 판막도관, 심장혈관대체물의 제작에 필수적이고 기초적인 조직의 고정처리법을 개발하는 것이며, 특히 면역학적으로 우수한 공법을 동시에 시도하였고, 또한 글루탈알데히드의 단독 고정방법의 단점을 극복하기 위한 것입니다. 글루탈알데히드 고정방법의 발명으로 이종이식 판막 또는 심낭편의 보관이나 취급이 쉬워진 면이 있으나, 면역 반응 및 내구성 등에서 많은 해결과제들이 남아 있어 완벽하다고 할 수 없고, 이에 여러 가지 새로운 처리기법의 필요성이 대두되고 있다.In addition, these heart valves and cardiovascular substitutes are not produced and sold in Korea, but are expensive and rely on imports from abroad, and there is no domestic research technology. Therefore, it is to develop a method of fixation of tissues essential and essential for the production of artificial tissue valves, valve conduits, and cardiovascular substitutes, and in particular, attempted an immunologically superior method, and also overcomes the disadvantages of the fixation method of glutaraldehyde alone. It is to. Although the invention of the glutaraldehyde fixation method makes it easier to store or handle xenograft valves or pericardium fragments, many challenges remain in immune response and durability, and thus it is not perfect. It is emerging.
이에, 본 발명자는 이러한 문제점들을 해결하고자 새로운 무세포화 및 용매 등을 이용한 고정처리방식 및 항독소화 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다. Accordingly, the present inventors have completed the present invention by developing a fixed treatment method and an antitoxin method using a new cell-free and solvent, etc. to solve these problems.
본 발명의 목적은 심장판막이식술 및 심장혈관수술시 사용할 수 있는 이종이식 보철편의 제조방법 및 이에 의해 제조된 이종이식 보철편을 제공하고자 하는데 있다. It is an object of the present invention to provide a method for producing a xenograft prosthesis which can be used in heart valve transplantation and cardiovascular surgery, and a xenograft prosthesis produced thereby.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 인간을 제외한 동물의 생체 조직을 무세포화하고, 상기 무세포화된 조직을 에탄올계 용매가 함유된 고농도의 글루탈알데히드 용액에 고정한 후, 상기 조직의 독성을 제거하는 단계를 포함하여 이루어지는 이종이식 보철편의 제조방법을 제공한다. 이러한 본 발명은 종래의 일반적으로 인공조직판막이나 판막도관, 심장혈관대체물등의 제작시 사용되었던 글루탈알데히드 단독 고정법과 비교하여 볼 때, 글루탈알데히드 고정시에 무수 용매를 혼합하여 사용함으로써 특히 판막의 탄력섬유(elastin)의 교차 결합을 유도하고, 조직에 생화학적 반응을 가하여, 판막이나 신선 심낭편의 고정 후 기계적 특성을 개선하고 장기적인 석회화를 감소시킬 수 있다. 또한 본 발명은, 일부 고정과정에서 고농도 글루탈알데히드를 이용한 고정 방법으로 이종이식 심낭 또는 판막을 처리함으로써 항석회화에도 기여할 수 있도록 하고, 글루탈알데히드에서 비롯될 수 있는 잔존 글루탈알데히드의 독성을 제거하는 과정을 포함시키도록 하고 있다. In order to solve the above problems, the present invention acellularize the biological tissues of animals other than humans, and fix the acellularized tissues in a high concentration of glutaraldehyde solution containing ethanol solvent, the toxicity of the tissues It provides a method for producing a xenograft prosthesis comprising the step of removing. The present invention, in particular, by using a mixture of anhydrous solvent at the time of glutaraldehyde fixation in comparison with the glutaraldehyde alone fixation method used in the conventional manufacturing of artificial tissue valve, valve conduit, cardiovascular substitute, etc. Induce cross-linking of elastic fibers (elastin) and apply biochemical reactions to tissues to improve mechanical properties and reduce long-term calcification after fixation of valves or fresh pericardial fragments. In another aspect, the present invention, by using a high concentration of glutaraldehyde in the fixation process by treating xenograft pericardium or valves to contribute to anticalcification, eliminating the toxicity of residual glutaraldehyde that may be derived from glutaraldehyde To include the process of doing so.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된 이종이식 보철편을 제공한다.The present invention also provides a xenograft prosthesis produced by the above method.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 제 1 견지에 의하면, 본 발명은 인간을 제외한 동물의 생체 조직을 무세포화하고, 상기 무세포화된 조직을 에탄올계 용매가 함유된 고농도의 글루탈알데히드 용액에 고정한 후, 상기 조직의 독성을 제거하는 단계를 포함하여 이루어지는 이종이식 보철편의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는 상기 생체조직은 심낭, 심장판막, 심막 또는 경막 중에서 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 소 또는 돼지 등으로부터 유래한 생체조직이다. According to the first aspect of the present invention, the present invention is a cell-free tissues of animals other than humans, and after fixing the acellularized tissues to a high concentration of glutaraldehyde solution containing an ethanol solvent, toxicity of the tissues It provides a method for producing a xenograft prosthesis comprising the step of removing. Preferably, the biological tissue may be selected from pericardium, heart valve, pericardium or dura mat, more preferably biological tissue derived from a cow or a pig.
각 과정을 구체적으로 살펴본다. 먼저 도살장에서 비교적 무균 상태로 채취한 돼지의 대동맥 및 폐동맥판막도관과 소의 심낭과 돼지의 심낭(이하 ‘처리조직’이라 부른다)을 항생제가 함유한 생리식염수에 담아 냉장상태로 유지하여 빠른 시간 내 실험 제조실에서 전처리한 다음, 처리조직을 무세포화 한다. 상기 무세포화는 처리조직에 저장성 완충용액, 고장성 완충용액, 등장성 완충용액을 순차적으로 처리함으로써 이루어지고, 이 모든 무세포화과정에서 회전진탕(rotation shaking)을 하면서 무세포화를 진행하며, 바람직하게는 분당 50-200회 이상으로 회전진탕한다. 상기 완충용액의 처리에 있어 일부 반복처리에 의해 무세포화를 진행할 수도 있다. 바람직하게는 상기 무세포화는 3~8℃의 저장성 완충용액에서 20-36시간, 3~5℃의 고장성 완충용액에서 6~12시간, 3~5℃의 등장성 완충용액에서 11~13시간 처리하며, 보다 바람직하게는 상기 저장성 완충용액의 처리에 있어서 상기 생체조직을 저장성 완충용액에 6-14시간 동안 처리한 다음, 세정제가 포함된 저장성 완충용액에서 14-24시간 동안 처리하는 과정으로 이루어지도록 한다. 일례로서, 상기 무세포화는 심장판막의 경우, 4℃ 저장성 용액에서 6-14시간동안 처리하고, 3-8℃의 온도에서 저장성 용액과 0.1% - 1% SDS 용액을 혼합한 용액에 14-24시간처리하고, 다시 4℃ 고장성 용액에 6-12시간처리, 그 후 4℃ 등장성 용액에서 12시간 처리를 시행한다. 심낭의 경우는 상기의 판막무세포화 방법과 같이 저농도 SDS가 포함된 저장성용액을 사용하여 무세포화하거나, sodium deoxycholate를 사용하는 방법으로서, 4℃ 저장성 용액에 6-14시간, 0.5%-2% sodium deoxycholate가 포함된 3~8℃ 저장성 용액에 14~24시간, 고장성 용액에서 6~12시간, 4℃ 등장성 용액에서 12시간 처리하는 방법을 사용할 수도 있다. Look at each process in detail. First, the pig aorta and pulmonary valve conduit and bovine pericardium and pig pericardium (hereinafter referred to as 'treatment tissue'), which were collected as a relatively sterile state from the slaughterhouse, were kept in refrigerated saline containing antibiotics, and then refrigerated. After pretreatment in the manufacturing room, the treated tissues are acellularized. The acellularization is achieved by sequentially treating storage tissues, hypertonic buffers, and isotonic buffers in the treated tissue, and proceed to acellularization with rotation shaking during all of the acellularizations, preferably Rotate and shake more than 50-200 times per minute. In the treatment of the buffer solution, it may be possible to proceed to acellularization by some repeated treatment. Preferably, the acellularization is 20-36 hours in 3-8 ℃ storage buffer, 6-12 hours in 3-5 ℃ hypertonic buffer, 11-13 hours in isotonic buffer of 3-5 ℃ In the treatment of the storage buffer, more preferably, the biological tissue is treated with the storage buffer for 6-14 hours, followed by the treatment with the storage buffer containing the detergent for 14-24 hours. To lose. As an example, the acellularization was performed for 14-14 hours in a 4 ℃ storage solution in the case of heart valves, 14-24 in a solution mixed with a storage solution and 0.1%-1% SDS solution at a temperature of 3-8 ℃ Time-treated, followed by another 6-12 hours treatment at 4 ° C. hypertonic solution followed by 12 hours treatment at 4 ° C. isotonic solution. In the case of pericardium, it is acellularized using a storage solution containing low concentration of SDS, or using sodium deoxycholate. It is also possible to use 14 to 24 hours in 3-8 ℃ depotable solution containing deoxycholate, 6-12 hours in hypertonic solution and 12 hours in 4 ℃ isotonic solution.
이와 같이 무세포화가 완전해진 다음 무경판막압력상태(zero-pressure fixation)하에서 고정처리한다. 상기 고정 시 자연적인 형태를 유지하기 위해 형성 틀에 넣고 무경판막압력으로 고정함으로써 판막의 상방과 하방에서 동일한 수압이 가해지므로 판막 상하의 압력차가 없게 되어 최적의 상태로 고정할 수 있게 된다. 즉, 판막에 가해지는 압력이나 피로감, 충격이 제로 상태에 있을 때 고정함으로써, 판막 조직 특히 섬유소가 가장 적절한 상태를 유지하여 장기간의 운동이나 노출에도 이상적인 상태를 유지할 수 있게 된다 (도 11 참고). 특히 판막의 적절한 이완기 상태의 펴짐을 유지하기 위하여 대동맥판막은 14~20 mmHg, 폐동맥판막은 7~10 mmHg 의 부하 압력(distension pressure)을 가한 후, 판막이 뒤로 탈출되지 않음을 확인 후 무경판막압력(zero pressure)으로 고정하였다. This complete acellularization followed by fixation under zero-pressure fixation. In order to maintain the natural shape during the fixing, the same hydraulic pressure is applied from the upper side and the lower side of the valve by fixing it in the forming mold to fix the valve to prevent the pressure difference between the upper and lower sides of the valve. In other words, by fixing when the pressure, fatigue, and impact applied to the valve are in a zero state, the valve tissue, particularly fibrin, can be maintained in the most appropriate state, thereby maintaining an ideal state even for long-term exercise or exposure (see FIG. 11). In particular, in order to maintain proper diastolic expansion, the aortic valve is 14-20 mmHg and the pulmonary valve has 7-10 mmHg load pressure. pressure).
또한 상기 고정은 에탄올계 용매가 함유된 1-3%농도의 글루탈알데히드 용액 의 처리 전 또는 처리 후에 0.25-0.625% 농도의 글루탈알데히드 용액을 처리하거나, 에탄올계 용매가 함유된 1-3%농도의 글루탈알데히드 용액의 처리 전 및 처리 후에 0.25-0.625% 농도의 글루탈알데히드 용액을 처리할 수 있다. 상기 에탄올계 용매는 70-80%의 에탄올 또는 혼합에탄올을 사용할 수 있으며, 상기 혼합에탄올은 67.5-75% 에탄올과 2.5-5% 옥탄올 또는 옥탄디올로 이루어지는 것일 수 있다. 일례로서 상용 농도인 0.5%의 글루탈알데히드 용액에 3-5 일간 무경판막압력상태(zero-pressure fixation)하에서 고정처리하고, 그 후 고농도(1-3%)의 글루탈알데히드 용액과 70-80% 혼합 에타놀(67.5-75% ethanol + 2.5-5% octanol 또는 octanediol)이 함유된 용액에 1-2일 처리하고, 그 후에는 저농도(0.25%)에 5일 처리할 수 있다. In addition, the fixation may be performed before or after the treatment of the glutaraldehyde solution containing 1-3% of the ethanol solvent in the concentration of 0.25-0.625% of the glutaraldehyde solution, or 1-3% containing the ethanol solvent. The glutalaldehyde solution at a concentration of 0.25-0.625% may be treated before and after the concentration of the glutaraldehyde solution. The ethanol solvent may be 70-80% ethanol or mixed ethanol, the mixed ethanol may be composed of 67.5-75% ethanol and 2.5-5% octanol or octanediol. As an example, a 0.5% glutaraldehyde solution, commercially available, was fixed for 3-5 days under zero-pressure fixation, followed by a high concentration (1-3%) glutaraldehyde solution and 70-80. The solution containing% mixed ethanol (67.5-75% ethanol + 2.5-5% octanol or octanediol) can be treated for 1-2 days, after which it can be treated for 5 days at low concentration (0.25%).
상기 글루탈알데히드에 고정처리한 후 리신, 그라이신, 보로하이드라이드, 글루타믹산, 아르기닌 중에서 선택된 1종 이상의 아미노산을 첨가하는 것에 의하여 글루탈알데히드의 자유 알데히드기 (-CHO)를 제거함으로써 잔존 글루탈알데히드의 독성을 제거한다. 이 때 상기 첨가되는 아미노산의 농도는 0.05~0.2 M 이고, 34~42 ℃에서 24~48 시간 동안 처리하는 것이 바람직하다. 뿐만 아니라 상기 리신 또는 그라이신에 의한 diamine bridge로 인하여 항석회화 효과가 있을 뿐만 아니라, Cross-link를 증가시켜 이종이식 보철편의 두께와 장력을 증가시킬 수 있다. 일례로 상기 고정처리 후 리신(0.05-0.2M L- lysine solution (acetic acid buffer, 또는 PBS), pH 4.5~7.6)에 담가 37℃에서 24-48시간동안 처리하거나, 그라이신(0.05-0.2M Glysine with PBS solution)을 실온에서 24-48시간동안 담가 처리하거나, Sodium borohydride 용액(Sodium borohydride 0.08M in buffered glycine(0.2% HEPES, 0.2M glycine, 0.1M NAOH, pH 10.3) 또는 buffered carbonate(0.1M NaHCO3, 0.1M Na2CO3, pH; 10.3)에 반응하지 않은 조직내 시약(알데하이드기)을 제거하기 위하여 실온에서 24-48시간 배양처리하거나, 완전 포화된 그루타믹 산 용액(saturated aqueous solution of L-glutamic acid, 또는 0.05-0.1M L-glutamic acid, ph 3, room temperature)이나, 2% 아르기닌(또는 0.12M, L-arginine, in PBS phosphate buffered saline (PBS) at pH 11 )등을 실온에서 24-48시간 배양처리한다. 이와 같이 여러 가지의 항독소처리법중에서 한가지 방법을 택하여 항독소처리를 시행한 후, 다합성 소독용액에 최종 소독후 2% 벤질알콜(benzyl alcohol)용액이나 1% 벤질코니움(benzylkonium)용액에 보관한다.After fixing to glutaraldehyde, residual glutaraldehyde is removed by removing one or more amino acids selected from lysine, glycine, borohydride, glutamic acid and arginine to remove free aldehyde group (-CHO) of glutaraldehyde. Eliminates the toxicity of aldehydes. At this time, the concentration of the added amino acid is 0.05 ~ 0.2 M, it is preferable to treat at 34 ~ 42 ℃ for 24 to 48 hours. In addition, due to the diamine bridge by lysine or glycine, not only has an anticalcification effect, but also the cross-link can be increased to increase the thickness and tension of the xenograft prosthesis. For example, after the fixation, immersed in lysine (0.05-0.2M L-lysine solution (acetic acid buffer, or PBS), pH 4.5 ~ 7.6), treated at 37 ° C. for 24-48 hours, or glycine (0.05-0.2M Soak Glysine with PBS solution for 24-48 hours at room temperature, or use Sodium borohydride solution (Sodium borohydride 0.08M in buffered glycine (0.2% HEPES, 0.2M glycine, 0.1M NAOH, pH 10.3) or buffered carbonate (0.1M) Incubate 24-48 hours at room temperature to remove reagents (aldehyde groups) that did not react to NaHCO 3 , 0.1M Na 2 CO 3 , pH; 10.3) or completely saturated glutamic acid solution (saturated aqueous solution). solution of L-glutamic acid, or 0.05-0.1M L-glutamic acid,
또한, 본 발명의 제 2견지에 의하면, 본 발명은 상기의 방법에 의하여 제조된 이종이식 보철편을 제공한다. 특히 돼지 또는 소의 심낭으로부터 상기의 방법에 의하여 제조된 이종이식 보철편은 결손심낭의 보충, 심장혈관계 결손부위의 폐쇄, 보강 등, 복잡심기형 교정 수술 등에 필요한 보철편으로서의 활용 등 심혈관계 수술에 적용가능하다. 주로 혈관 내지 심장의 일부로서 혈액이 누출없이 원하는 방향으로 흐르도록 하는 재료로서의 역할을 하게 되는데, 본 발명에 따라 제조된 이종이식 보철편은 무세포화에 의하여 면역원성이 제거되고, 그 조직의 처리에 의하여 석회화 등이 일어나지 않고, 내구성, 운동성이 개선되어 이식되는 조직 고유의 기 능이 오랫동안 유지되는 특징을 갖는다. In addition, according to a second aspect of the present invention, the present invention provides a xenograft prosthesis produced by the above method. In particular, xenograft prostheses produced by the above method from pig or bovine pericardium can be applied to cardiovascular surgery, such as replenishment of defective pericardium, closure and reinforcement of cardiovascular defects, and use as a prosthesis for complex cardiovascular surgery. Do. As a part of blood vessels or heart, it serves as a material to allow blood to flow in a desired direction without leakage. The xenograft prosthesis prepared according to the present invention is immunogenicity is removed by acellularization, and the tissue is processed. As a result, calcification does not occur, and durability and mobility are improved, and thus the function of the tissue to be transplanted is maintained for a long time.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하여 인간을 제외한 동물의 생체 조직을 무세포화하고, 상기 무세포화된 조직을 에탄올계 용매가 함유된 고농도의 글루탈알데히드 용액에 고정한 후, 상기 조직의 독성을 제거하는 단계를 포함하여 이루어지는 이종이식 보철편의 제조방법 및 이에 의하여 제조되는 항석회화 및 항독소화된 무세포성 이종이식 보철편이 제공된다.As described above, according to the present invention, the acellularized tissues of animals other than humans are acellularized, and the acellularized tissues are fixed in a high concentration of glutaraldehyde solution containing an ethanol solvent, and then the toxicity of the tissues is removed. Provided are a method for producing a xenograft prosthesis comprising a step and an anticalcified and antitoxinized acellular xenograft prosthesis produced thereby.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.
<실시예 1: 장력-두께 간의 구조적 특성 검사>Example 1 Examining Structural Properties Between Tension and Thickness
본 실시예에서는, 돼지의 대동맥 판막, 폐동맥 판막, 심낭 과 소의 심낭을 0.25-0.3%, 0.5-0.625%, 혹은 1, 2%, 3%의 각기 다른 글루탈알데히드 용액에 고정하여 각각의 장력과 두께를 측정하였으며, 상기 고정은 도 12에 나타낸 장치 및 원리를 이용하여 무-경판막압력 상태에서 수행하였다. In this example, pig aortic valves, pulmonary artery valves, pericardium and bovine pericardium are fixed in 0.25-0.3%, 0.5-0.625%, or 1, 2%, 3% of different glutalaldehyde solutions, and the respective tension and The thickness was measured and the fixation was performed in the state of no-membrane pressure using the apparatus and principle shown in FIG.
1-1 재료의 준비1-1 Preparation of Materials
도살장에서 수의사의 협조 하에 건강한 도살된 돼지에서 심장 및 심낭을 적출하고, 차가운 phosphate buffered solution (PBS, 0.1 M, pH 7.4)에 넣어 ice box에 담아 실험실로 운반하여, 냉장상태에서 대동맥 판막, 폐동맥 판막, 심낭 등을 분리 적출하여 실험에 사용하게끔 보관한다. 또한 건강한 도살된 소의 심낭을 적출하여 같은 방법으로 운반한다.In a slaughterhouse, under the cooperation of a veterinarian, the heart and pericardium are extracted from healthy slaughtered pigs, placed in a cold phosphate buffered solution (PBS, 0.1 M, pH 7.4) and transported in an ice box to a laboratory. Separate the pericardium, and store it for use in the experiment. The pericardium of a healthy slaughtered cow is also removed and carried in the same way.
1-2 이종 판막, 심낭의 고정1-2 hetero valves, fixation of the pericardium
도살장에서 냉장상태(4℃)로 실험실로 운반한 돼지의 대동맥 판막, 폐동맥 판막, 심낭, 소의 심낭을, 도살 후 최소 12시간 내에 즉시 고정한다. Aortic valves, pulmonary valves, pericardium, and bovine pericardium of pigs transported to the laboratory refrigerated (4 ° C.) in the slaughterhouse are fixed immediately within at least 12 hours after slaughter.
① 글루탈알데히드로(GA)만으로 고정한 그룹은 0.5%-0.625% 혹은 1.5%, 3% 의 완충 글루탈알데히드에 담가 4C 에서 2-3일 고정 후 상온에서 0.3%-0.25% 의 완충 글루탈알데히드에서 7일 간 고정하였다. ① The group fixed with glutaraldehyde (GA) alone was immersed in 0.5% -0.625% or 1.5%, 3% buffered glutaraldehyde and fixed at 4C for 2-3 days, then 0.3% -0.25% buffered glutaraldehyde at room temperature. Fixed for 7 days at.
② 글루탈알데히드의 고정과 함께 항석회화를 위한 용매를 이용한 그룹은 0.25%-0.3%, 0.5%-0.625% 혹은 1-3% 글루탈알데히드 고정전과 고정후의 방법으로 처리하였다. ② The group using the solvent for anticalcification together with the fixation of glutaraldehyde was treated with 0.25% -0.3%, 0.5% -0.625% or 1-3% glutaraldehyde before and after fixing.
- 80% 에탄올이나, 80% 혼합에탄올 (75% ethanol + 5% octanol 또는 75% ethanol + 5% octanediol), 4℃에서 고정 후 상온에서 0.25%- 0.3% 글루탈알데히드에 12일간 상온에서 고정하거나, -80% ethanol, 80% mixed ethanol (75% ethanol + 5% octanol or 75% ethanol + 5% octanediol), fixed at 4 ° C and then fixed at 0.25% -0.3% glutalaldehyde at room temperature for 12 days or ,
- 상온에서 0.5%-0.625% 글루탈알데히드 에 5일 동안 고정 후 80% ethanol 이나 75% ethanol + 5% octanol 혹은 75% ethanol + 5% octanediol (PBS buffer, Ph 7.4) 이 담긴 shaker bath 에 넣어 2-3일간 처리 후 다시 상온에서 0.25%-0.3% 글루탈알데히드에 담가 7일간 고정 하였다. -After fixation in 0.5% -0.625% glutaraldehyde for 5 days, put in shaker bath containing 80% ethanol or 75% ethanol + 5% octanol or 75% ethanol + 5% octanediol (PBS buffer, Ph 7.4) 2 After treatment for 3 days, soaked in 0.25% -0.3% glutaraldehyde at room temperature again and fixed for 7 days.
이때 이종이식 대동맥 판막과, 폐동맥 판막의 고정 시에는 자연적인 형태를 유지하기 위해 형성 틀에 넣고, 판막의 적절한 이완기 상태의 펴짐을 유지하기 위하여 대동맥판막은 14~20 mmHg, 폐동맥판막은 7~10 mmHg 의 부하 압력(distension pressure)을 가한 후, 판막이 뒤로 탈출되지 않음을 확인 후 무경판막압력(zero pressure)으로 고정하였다. 이와 같이 무경판막압력으로 고정하게 되면 판막의 상방과 하방에서 동일한 수압이 가해지므로 판막 상하의 압력차가 없게 되어 최적의 상태로 고정할 수 있게 된다. 즉, 판막에 가해지는 압력이나 피로감, 충격이 제로 상태에 있을 때 고정함으로써, 판막 조직 특히 섬유소가 가장 적절한 상태를 유지하여 장기간의 운동이나 노출에도 이상적인 상태를 유지할 수 있게 된다 (도 12참고). 고정된 심낭편들은 PBS solution으로 상온에서 여러 차례 세척한 후 4℃의 PBS solution에 보관한 후에 각종 물리적 검사를 시행하였다.At this time, when the xenograft aortic valve and pulmonary valve are fixed, they are placed in the formation frame to maintain their natural shape, and the aortic valve is 14-20 mmHg and the pulmonary valve is 7-10 mmHg to maintain the proper diastolic spread. After applying the pressure (distension pressure), after confirming that the valve does not escape to the back was fixed to zero pressure (zero pressure). In this way, when the fixed valve pressure is fixed, the same hydraulic pressure is applied to the upper and lower sides of the valve, so that there is no pressure difference between the upper and lower valves, and thus the optimal valve can be fixed. In other words, by fixing when the pressure, fatigue, and impact applied to the valve are in a zero state, the valve tissue, in particular, the fibrin, can be maintained in the most appropriate state, thereby maintaining an ideal state even for long-term exercise or exposure (see FIG. 12). The fixed pericardial fragments were washed several times at room temperature with PBS solution, and then stored in PBS solution at 4 ° C.
1-3 구조적 특성 검사1-3 Structural Characteristic Inspection
(1) 물리적 활성도 검사(1) physical activity test
처리된 이식편들을 검사자의 손으로 직접 촉진, 봉합, 신장시켜 보았다. 검사의 일관성을 위하여 한 사람의 흉부외과의사의 기준으로 평가하였다. 촉진은 손 으로 만져보아 조직의 부드러운 정도를 측정하고, 봉합은 5-0 prolene (Ethicon, Johnson & Johnson)을 이용하여 조직을 뚫을 때의 느낌을 기술하고, 신장도는 조직을 당겨보아 늘어나는 정도를 측정 기술 하였다. Treated grafts were palpated, sutured and stretched directly with the examiner's hand. For the consistency of the examination, the criteria were evaluated by a single thoracic surgeon. The palpation measures the softness of the tissue by touching it, the suture describes the feeling of penetrating the tissue using 5-0 prolene (Ethicon, Johnson & Johnson), and the elongation measures the extent of stretching through the tissue. Measurement technology.
아무것도 처리하지 않은 이식편을 0 으로 기준하여 그 다음 단계별로 촉진(부드러움=1, 약간만 부드러움=2, 보통임=3, 부드럽지 않음=4, 약간 딱딱한 느낌=5), 봉합(잘들어감=1, 약간만 잘 들어감=2, 보통임=3, 약간 저항감 느낌=4, 저항이 있음=5), 신장도(잘늘어남=1, 약간 늘어남=2, 보통임=3, 잘 늘어나지않음=4, 거의 늘어나지 않음=5) 에 따라 점수를 매겨 각각 이식편의 점수를 평균내어 저농도 GA , 고농도 GA, GA + Solvent 고정방법 별로 비교하였다. Promote the graft with no treatment to the next level based on 0 (soft = 1, slightly soft = 2, normal = 3, not soft = 4, slightly hard feeling = 5), suture (sleeping = 1, Slightly Entered = 2, Moderate = 3, Slightly Resistant = 4, Resistant = 5), Elongation (Slant = 1, Slightly Stretched = 2, Moderate = 3, Not Stretched = 4, Almost Stretched) None = 5), scores of the grafts were averaged and compared by low GA, high GA, and GA + Solvent fixation.
(2) 이종 판막, 심낭의 장력 검사와 탄력성 검사(2) examination of tension and elasticity of xenografts and pericardium;
처리된 돼지 대동맥 판막, 돼지 폐동맥 판막을 펼치고 원주방향(circumferential) 과 방사방향(radial) 으로 각각 방향을 달리하여 7.0 x 5.0 mm 의 장방향 절편을 취하여 폭 5mm 에 대한 인장강도와 탄력도를 측정함으로서 그를 평균한 값이 그 판막의 인장강도 및 탄력도를 대표한 값이 되게 하였다. 마찬가지로 처리된 돼지 심낭과 소의 심낭을 펼치고 30°씩 각도를 달리하여서 얻어낼 수 있는 모두 6가지의 방향에 대해 0.5×5 cm의 장방형 절편을 취하여서 폭 5 mm에 대한 인장강도와 탄력도를 측정함으로써 그를 평균한 값이 그 심낭의 인장강도 및 탄력도의 대표값이 되도록 시도하였다. 장력의 측정은 Japan Tech & Manufacture, Digital Force Gauge, Model 5FGN, automated materials testing system을 이용 심낭은 load speed 100 mm/min, 판막은 load speed 6mm/min로 각각 달리 측정하여 단 위는 Kgf/폭5 mm로 표기하였다.The treated porcine aortic valve and porcine pulmonary artery valve were unfolded, and the longitudinal sections of 7.0 x 5.0 mm were taken in circumferential and radial directions, respectively, and the tensile strength and elasticity of 5 mm in width were measured. The mean value was made to represent the tensile strength and elasticity of the valve. Similarly, by measuring the tensile strength and elasticity of 5 mm wide by taking a rectangular section of 0.5 × 5 cm in all six directions that can be obtained by unfolding the treated porcine pericardium and bovine pericardium and varying the angle by 30 °. His average value was attempted to be representative of the tensile strength and elasticity of the pericardium. The tension was measured using Japan Tech & Manufacture, Digital Force Gauge, Model 5FGN, and automated materials testing system.The pericardium measured the
(3) 통계 방법(3) statistical method
이종이식 판막과 심낭 장력을 Kgf/폭 5 mm , 탄력도는 처음길이에 대한 늘어난 길이의 비 % 의 평균±표준편차로 표시하였다. 열 안정성 검사시는 심낭절편의 수축시 온도를 C 로 표기하고 각 값을 평균±표준편차로 표시하였다. 각 군 간의 통계적 차이는 paired T-test 및 ANOVA test 로 검증하며, 각 실험 마다 고농도와 저농도의 글루탈알데히드 로 고정한 그룹까지의 각각의 그룹간 비교는 사후 검사 turkey b test 를 하였다. p<0.05를 의미 있는 것으로 간주한다. Xenograft valves and pericardial tension were expressed as Kgf / width 5 mm and elasticity was expressed as the mean ± standard deviation of the ratio of increased length to initial length. In the thermal stability test, the temperature at the time of contraction of the pericardial section was denoted by C and each value was expressed by the mean ± standard deviation. Statistical differences between groups were verified by paired T-test and ANOVA test. In each experiment, the comparison between each group up to the high and low glutaraldehyde-fixed groups was performed by the Turkey b test. p <0.05 is considered significant.
1-4 결과1-4 results
(1) 물리적 활성도 검사. (1) Physical activity test.
한 사람의 흉부외과의사에 의한 이종이식편에 대한 촉진, 봉합, 신장도에 대한 주관적인 평가를 시행하였다. 이식편의 종류에 상관없이 아무것도 처리하지 않은 것을 0 으로 기준하여 고정 방법마다 다시 평가 하였으므로 종류별로 구분하지 않고 판막 , 심낭 군으로 나누어 평가하고 하기 표 1에 나타내었다. 촉진시는 저농도 GA, 고농도 GA, GA+Solvent 처리군간에 유의한 차이가 없었다. 봉합검사 시 저농도GA 고농도GA 처리 군 간에 느껴지는 정도는 차이가 없었으나, 저농도와 GA + Solvent 군간에 판막(P=0.018), 심낭(P=0.009) 모두 유의하게 차이가 있었다. 신장도 검사에서도 저농도와 GA + Solvent 군간에 판막(P=0.000), 심낭(P=0.0329) 모두 유의하게 차이가 있었다. A subjective evaluation of the palpation, suture and elongation of xenografts by a thoracic surgeon was performed. Regardless of the type of graft, nothing was treated, and the evaluation was repeated for each fixation method based on 0. Therefore, the graft was divided into valves and pericardial groups, and the results are shown in Table 1 below. There was no significant difference in palpation between low concentration GA, high concentration GA, and GA + Solvent treatment. There was no difference between the low and high GA groups, but there was a significant difference in the valve (P = 0.018) and pericardial (P = 0.009) groups in the suture test. In the renal test, there was a significant difference between the low concentration and GA + Solvent groups in both valve (P = 0.000) and pericardium (P = 0.0329).
즉, 촉진소견은 통계적으로 유의한 차이가 없었고, 봉합과, 신장도면에서는 저농도 GA 에 비해 GA+ Solvent 군이 좀더 단단하게 느껴졌다. 비록 주관적이긴 하나 임상에서 외과의가 실제 수술 시 느껴지는 정도를 평가한 것으로 Solvent 첨가시 약간 단단하게 느껴짐을 확인할 수 있었다. In other words, there was no statistically significant difference in facilitation findings, and the GA + Solvent group felt more firmly in the suture and kidney drawings than in the low concentration GA. Although subjective, the surgeon evaluated the extent to which the surgeon felt during the operation.
(2) 압력-장력,압력-탄력 비교(2) Pressure-tension, pressure-elasticity comparison
방향성 압력-장력, 압력-탄력도 검사에서, 돼지의 대동맥 판막의 경우 GA 고정군 과 GA + Solvent 고정군 간에 압력-장력 및 압력-탄력도 에 통계적으로 유의하게 차이가 없었고, 돼지의 폐동맥 판막의 경우에도 GA 고정군 과 GA + Solvent 고정군 간에 압력-장력 및 압력-탄력도 에 통계적으로 유의하게 차이가 없었다. In the directional pressure-tension and pressure-elasticity test, there was no statistically significant difference in pressure-tension and pressure-elasticity between the GA fixation group and the GA + Solvent fixation group in the pig aortic valve, and in the pulmonary valve of the pig. There was no statistically significant difference in pressure-tension and pressure-elasticity between GA and Sol + GA groups.
돼지의 심낭과 소의 심낭의 경우에도 GA 고정군 과 GA + Solvent 고정군 간에 압력-장력 및 압력-탄력도 에 통계적으로 유의하게 차이가 없었다. In the case of porcine pericardium and bovine pericardium, there was no statistically significant difference in pressure-tension and pressure-elasticity between GA and Sol + GA groups.
(3) 저농도와 고농도의 글루탈알데히드 그룹 간 비교(3) Comparison between low and high glutaraldehyde groups
저농도 글루탈알데히드, 고농도 글루탈알데히드, solvent 첨가 유무 별로 검사를 하였다. Low glutaraldehyde, high glutaraldehyde, and solvent addition were examined.
① 돼지의 대동맥 판막은 원주방향, 방사방향 모두에서 solvent 첨가 상관 없이 저농도GA 고정군과 고농도 GA 고정군간에 장력비교와 탄력도 비교에서 통계적으로 유의한 차이가 없었다(P>0.05). ① There was no statistically significant difference in the tension and elasticity comparison between the low and high GA groups in both circumferential and radial directions (P> 0.05).
② 돼지의 폐동맥 판막은 원주방향 장력비교에서는 저, 고농도 GA 그룹간에 Solvent 첨가 유무 관계 없이 차이가 없었으나, 원주방향 탄력도 비교에서 solvent 를 첨가하지 않은 그룹에서와(저농도 GA 처리 vs 고농도 GA : 50.90+23.54 vs 102.50+33.75 , p=0.028), solvent를 첨가한 그룹에(저농도 GA 처리+ solvent group vs 고농도 GA + Solvent 처리 group : 62.89+39.88 vs 108.00 + 37.75 , p=0.001)서 고농도 GA 고정시 탄력도가 증가 하였다. 또한, 방사방향 장력비교에서는 저, 고농도 GA 고정 그룹간에 Solvent 첨가 유무 관계없이 차이가 없었으나, 방사방향 탄력도 비교에서는 solvent 를 첨가한 군에서 고농도 GA로 고정 한 것에서 탄력도가 증가 하였다. (저농도 GA + solvent vs 고농도 GA + solvent : 84.39 + 26.20 vs 125.44 + 42.72 , P=0.011). ② In circumferential tension comparison, the pulmonary valve of pigs was not different between low and high GA groups, regardless of the presence or absence of solvent addition.However, in the circumferential elasticity comparison, there was no difference between solvent and no solvents (low GA and high GA: 50.90+). 23.54 vs 102.50 + 33.75, p = 0.028), elasticity at high GA fixation in the solvent added group (low concentration GA treatment + solvent group vs high concentration GA + Solvent treatment group: 62.89 + 39.88 vs 108.00 + 37.75, p = 0.001) Increased. In the radial tension comparison, there was no difference between the low and high GA groups, regardless of the addition of solvent, but in the radial elasticity comparison, the elasticity was increased in the high concentration of GA in the solvent-added group. (Low GA + solvent vs high GA + solvent: 84.39 + 26.20 vs 125.44 + 42.72, P = 0.011).
③ 소의 심낭은 solvent 첨가 상관없이 저농도 GA 고정군 과 고농도 GA 고정 군간에 장력비교에서 통계적으로 유의한 차이가 없었고(P>0.05), 탄력도 비교에서 저농도 GA 고정 시 solvent를 첨가하지 않은 군이 solvent를 첨가한 군보다 탄력도가 증가하였다(저농도 GA vs 저농도 GA + solvent : 34.26+15.29 vs 21.00+8.27 , p=0.000). ③ The bovine pericardium showed no statistically significant difference in tension comparison between low and high GA group (P> 0.05), regardless of the addition of solvent (P> 0.05). The elasticity was higher than that of the added group (low concentration GA vs low concentration GA + solvent: 34.26 + 15.29 vs 21.00 + 8.27, p = 0.000).
④ 돼지 심낭의 장력비교는 저농도 GA 고정군과 고농도 GA 고정군간에 장력비교에서 통계적으로 유의한 차이가 없었다(P>0.05). 그러나 탄력도 비교에서는 solvent 를 첨가하지 않은 군(저농도 GA vs 고농도 GA : 13.19+5.89 vs 21.66+3.23, p=0.001)과 solvent 를 첨가한 군(저농도 GA + solvent vs 고농도 GA + solvent : 13.66+6.02 vs 20.86+7.43 p=0.000) 모두 고농도 GA 고정군에서 탄력도가 증가하였다. ④ There was no statistically significant difference in tension comparison between the low and high GA groups in the pig pericardium (P> 0.05). However, in the comparison of elasticity, the group without solvent (low GA vs. high GA: 13.19 + 5.89 vs 21.66 + 3.23, p = 0.001) and the group with solvent (low GA + solvent vs. high GA + solvent: 13.66 + 6.02 vs 20.86 + 7.43 p = 0.000) all had increased elasticity in high concentration GA group.
본 실시예의 결과, 심혈관조직의 물리적 활성도 검사에서 촉진소견은 통계적으로 유의한 차이가 없었고, 봉합과 신장도면에서는 저농도 GA에 비해 GA+ Solvent 군이 좀더 단단하게 느껴졌다. 비록 주관적이긴 하나 임상에서 외과의가 실제 수술 시 느껴지는 정도를 평가한 것으로 Solvent 첨가시 약간 단단하게 느껴짐을 알 수 있었다. As a result of this Example, there was no statistically significant difference in facilitation in physical activity test of cardiovascular tissue, and the GA + Solvent group felt more firmly in the suture and kidney drawings than in the low concentration GA. Although subjective, the surgeon assessed the extent to which the surgeon felt during the operation.
또한, 일방향성 압력-장력, 압력-탄력도 검사에서, 돼지의 대동맥 판막의 경우 GA 고정군 과 GA + Solvent 고정군 간에 압력-장력 및 압력-탄력도 에 통계적으로 유의하게 차이가 없었고, 돼지의 폐동맥 판막의 경우에도 GA 고정군 과 GA + Solvent 고정군 간에 압력-장력 및 압력-탄력도 에 통계적으로 유의하게 차이가 없었다. 돼지의 심낭과 소의 심낭의 경우에도 GA 고정군 과 GA + Solvent 고정군 간에 압력-장력 및 압력-탄력도 에 통계적으로 유의하게 차이가 없었다. GA 고정시 solvent 의 사용은 통계적으로 유의한 차이를 보이는 조직의 물리적 변화는 가져오지 않았다. 결론적으로, GA의 고정은 장력과 탄력을 좋게 하지만 판막의 구조적 섬유 방향을 따라서 cross link 를 다르게 함을 알 수 있다. In addition, in the unidirectional pressure-tension and pressure-elasticity test, there was no statistically significant difference in pressure-tension and pressure-elasticity between the GA fixation group and the GA + Solvent fixation group in the pig aortic valve. In addition, there was no statistically significant difference in pressure-tension and pressure-elasticity between GA and GA + Solvent anchor groups. In the case of porcine pericardium and bovine pericardium, there was no statistically significant difference in pressure-tension and pressure-elasticity between GA and Sol + GA groups. The use of solvents during GA fixation did not result in any physical changes in the tissues that showed statistically significant differences. In conclusion, GA fixation improves tension and elasticity, but cross link is different along the structural fiber direction of valve.
<실시예 2: 고정 방법에 따른 조직학적 분석>Example 2: Histological Analysis According to a Fixation Method
본 실시예에서는, 0.25% - 0.625% 글루탈알데히드 용액에 고정 전과 고정 후의 돼지 심낭과 대동맥, 폐동맥판막 및 사람의 심낭을 광학 및 전자현미경으로 비교관찰하였다. 돼지 심낭과 대동맥, 폐동맥판막을 0.25% - 0.625% 글루탈알데히드 고정 전과 고정 후에 70-80% 혼합에탄올 처리한 군과, sodium dodecylsulfate (SDS) 을 이용하여 무세포화 처리만 시행한 군, 무세포화과정 후에 0.25% - 0.625% 글루탈알데히드 고정한 군, 70%-80% 혼합에탄올 처리 후 다시 무세포화과정을 한 후 0.25% - 0.625% 글루탈알데히드 고정한 군, 무세포화한 후 다시 에탄올 처리 후 다시 0.25%- 0.625% 글루탈알데히드 고정한 군으로 나누어 각각을 광학 및 전자현미경으로 관찰하였다. 또한 상기 고정은 무-경판막압력 상태에서 수행하였다. In this example, the porcine pericardium, the aorta, the pulmonary artery valve, and the human pericardium were observed by optical and electron microscopy before and after fixation in a 0.25%-0.625% glutalaldehyde solution. Groups treated with porcine pericardium, aorta, and pulmonary artery valves 0.25%-0.625% glutaraldehyde before and after fixation with 70-80% mixed ethanol and acellularized with sodium dodecylsulfate (SDS). 0.25%-0.625% glutaraldehyde-fixed group, 70% -80% mixed ethanol-treated and then acellularized again 0.25%-0.625% glutaraldehyde-fixed group, acellularized and ethanol-treated again 0.25%- Each group was observed by optical and electron microscopy divided into groups of 0.625% glutaraldehyde fixation. In addition, the fixation was carried out in the state of no-film valve pressure.
2-1 재료의 준비 및 고정2-1 Preparation and Fixing of Material
건강한 도살된 돼지에서 즉시 심낭과 대동맥, 폐동맥판막을 적출하여 차가운 phosphate buffered solution (PBS, 0.1M, pH 7.4, 4℃)에 넣어 ice box에 담아 실험실로 운반한다. 도살장에서 냉장상태(4℃)로 실험실로 운반한 돼지 심낭과 대동맥판막, 폐동맥판막을 도살 후 최소 12시간 내에 즉시 고정한다. 도살장에서 적출한 돼지 심낭과 대동맥판막, 폐동맥판막을 0.625% 글루탈알데히드 solution (PBS buffer,pH 7.4)에 담가 4℃에서 2일간 고정한 후, 상온에서 7일간 추가로 고정한다. 고정이 끝나면 가로 세로 1.5 cm크기의 조직편들로 나누고 더 이상의 처치가 필요하지 않은 조직편들은 PBS solution으로 상온에서 24시간 동안 세척한 후 4℃의 PBS solution에 보관한다. 추가적인 항석회화 처리가 필요한 조직들은 바로 다음 단계로 진행한다.Immediately remove the pericardium, aorta and pulmonary valves from healthy slaughtered pigs and place them in cold phosphate buffered solution (PBS, 0.1M, pH 7.4, 4 ° C) in ice boxes for transport to the laboratory. Porcine pericardium, aortic valve, and pulmonary artery valve, which have been refrigerated in the slaughterhouse (4 ° C) to the laboratory, are fixed immediately within at least 12 hours after slaughter. Porcine pericardium, aortic valve, and pulmonary valve were removed from the slaughterhouse and fixed in 0.625% glutalaldehyde solution (PBS buffer, pH 7.4) for 2 days at 4 ° C, followed by an additional 7 days at room temperature. After fixing, divide the tissue into pieces of 1.5 cm in width and length. Tissue pieces that do not require further treatment are washed with PBS solution for 24 hours at room temperature and then stored in PBS solution at 4 ° C. Organizations requiring additional anticalcification should proceed to the next step.
2-2 조직학적 검사2-2 Histological Examination
(1) 광학현미경 및 전자현미경 검사(1) Optical and electron microscopy
광학 현미경적 검색은 적출된 심낭 혹은 대동맥, 폐동맥 판막을 사용하였으며 2∼3 mm 두께의 조직을 Dubosqcbrasil용액에 1시간 넣어두었다가 10% 포르말린에 후 고정한 후 파라핀포매조직을 만들어 2∼4 um 절편으로 박절하여 hematoxylin-eosin, von Kossa, phosphotungstic acid hematoxylin, Movat pentachrome, elastica-van Gieson 염색을 시행하였다. Optical microscopic examination was performed using extracted pericardium, aorta, and pulmonary valves. A 2 mm to 3 mm thick tissue was placed in Dubosqcbrasil solution for 1 hour, fixed in 10% formalin, and then paraffin-embedded. Hematoxylin-eosin, von Kossa, phosphotungstic acid hematoxylin, Movat pentachrome, and elastica-van Gieson staining were performed.
전자 현미경적 검색은 조직을 1 mm 크기로 절편하여 4% 글루탈알데히드-PBS (0.1 mol/L phosphate buffer, pH 7.4) 용액에 고정한 후 1% OsO4 (0.1 mol/L phosphate buffer, pH 7.4)에 후고정하여 Epon LX 112 fixative에 embedding을 하였다. 1 um 절편에 toluidine blue 염색을 하여 광학 현미경으로 관찰하였고 적절한 조직 표본의 위치를 결정한 후 Reichert Ultracut E-ultramicrotome (Leica, Inc., Buffalo, NY) 으로 초박절편하여 Uranyl acetate와 Lead citrate로 염색한 후 전자 현미경 JEM-100CX (Magnification; X100∼X450,000, acceleration voltage: 120 kV, JEOL USA, Inc.)으로 관찰을 하였다.Electron microscopic examination was performed by 1 mm sized tissue, fixed in 4% glutaraldehyde-PBS (0.1 mol / L phosphate buffer, pH 7.4) solution, and then in 1% OsO4 (0.1 mol / L phosphate buffer, pH 7.4). Post fixation was performed for embedding into the Epon LX 112 fixative. Toluidine blue staining was performed on 1 um sections and observed under an optical microscope. After locating the appropriate tissue specimens, ultrathin sections of Reichert Ultracut E-ultramicrotome (Leica, Inc., Buffalo, NY) were used to stain Uranyl acetate and Lead citrate. The electron microscope JEM-100CX (Magnification; X100-X450,000, acceleration voltage: 120 kV, JEOL USA, Inc.) was observed.
(2) 항석회화 및 무세포화처리(2) anticalcification and acellularization treatment
1) 80% Ethanol 처치1) 80% Ethanol Kills
80% ethanol 처치는 조직편을 0.625% 글루탈알데히드 고정전과 고정후의 다른 2가지방법으로 24시간 처리하였고, 각각의 처리 과정 중에는 생리적 용액 (PBS)로 충분히 세척(3×10 min) 한 후 다음 단계를 시행하였다.For 80% ethanol treatment, the tissue pieces were treated for 24 hours in two different ways, before and after fixation of 0.625% glutalaldehyde, and after each treatment, the physiological solution (PBS) was sufficiently washed (3 × 10 min) and the next step was performed. Was implemented.
고정된 혹은 고정되지 않은 조직편들을 4℃ 80% ethanol solution (PBS buffer, pH 7.4)이 담긴 shaker bath에 넣어 상온에서 24시간 동안 처리 후, 4℃의 PBS solution에 보관하거나, 고정하지 않은 조직편은 세척 후 0.625% 글루탈알데히드 고정하고, 4℃의 PBS solution에 보관한다.The fixed or unfixed tissue pieces were placed in a shaker bath containing 4 ° C. 80% ethanol solution (PBS buffer, pH 7.4) for 24 hours at room temperature, and then stored in 4 ° C. PBS solution or unfixed tissue pieces were washed. After fixed 0.625% glutaraldehyde, and stored in 4 ℃ PBS solution.
2) Sodium dodecyl sulfate (SDS)를 이용한 무세포화 과정 후 처리2) Treatment after acellularization with sodium dodecyl sulfate (SDS)
조직편들을 Hypotonic buffer (Tris, 10 mmol/L; EDTA, Aprotinin, PH 8, Sigma Co., U.S.A.)에서 상온 14시간, 그 후 0.1-0.5% SDS를 포함한 Hypotonic buffer에서 24시간, 그 후 Isotonic buffer (Tris, 50 mmol/L; EDTA, Aprotinin, PH 8, Sigma Co., U.S.A.)에서 24시간 처리하여 무세포화과정을 시행하고 생리수에 세척 후 보관하여 무세포화만 시행한 군과, 무세포화과정에 0.625% 글루탈알데히드 고정용액에 추가 2주간 고정한 군을 나누었고, 추후 검사를 위하여 생리수(PBS) 세척 후 4℃에 보관한다.Tissue pieces were treated for 14 hours at room temperature in Hypotonic buffer (Tris, 10 mmol / L; EDTA, Aprotinin, PH 8, Sigma Co., USA), then 24 hours in Hypotonic buffer containing 0.1-0.5% SDS, and then Isotonic buffer ( Tris, 50 mmol / L; EDTA, Aprotinin, PH 8, Sigma Co., USA), treated for 24 hours, acellularized, washed and stored in menstrual water, and acellularized. The group fixed in 0.625% glutaraldehyde fixative solution was further divided for 2 weeks, and stored at 4 ° C after washing with physiological water (PBS) for further examination.
3) Ethanol처리 및 Sodium dodecyl sulfate (SDS)를 이용한 무세포화 처리3) Ethanol treatment and acellularization treatment using sodium dodecyl sulfate (SDS)
상온에서 80% ethanol을 24시간 처리 후, 전술한 방법으로 다시 무세포화과정을 한 후 0.625% 글루탈알데히드 고정용액에 추가 2주간 고정한 군과, 먼저 무세포화한 후 24시간 ethanol 처리 후 다시 0.625% 글루탈알데히드 고정용액에 추가 2주간 고정한 군으로 실험을 진행하였다.After treatment with 80% ethanol at room temperature for 24 hours, the cells were re-cellularized by the above-described method, and then fixed in 0.625% glutaraldehyde-fixed solution for 2 more weeks. The experiment was carried out in a group fixed in glutaraldehyde fixed solution for two more weeks.
2-4 결과2-4 results
(1) 글루탈알데히드 고정, 항석회화(ethanol), 무세포화 처리(SDS) 후 돼지 심낭의 비교(1) Comparison of porcine pericardium after glutaraldehyde fixation, ethanol and acellularization treatment (SDS)
아무런 처리를 하지 않은 경우, 사람의 심낭(0.36±0.02 mm)은 돼지 심낭(0.13±0.05 mm)에 비해 세배 정도로 두꺼워 보였으며 둘다 장막층(serosal layer), 섬유층(fibrosa), 심외막 결합조직(epicardial connective tissue)로 이루어져 있었다. 장막층은 중피세포(mesothelial cell)로 이루어진 부드러운 층을 이루었다. 섬유층은 심낭의 대부분의 두께를 차지 하였고 콜라겐, 탄력섬유(elastic fibers), 신경, 혈관들, 림프관들로 이루어져 있었다. 심외막 결합조직은 느슨하게 연결된 콜라겐과 탄력섬유로 이루어져 거친 층을 이루었다(도 1).Without any treatment, the human pericardium (0.36 ± 0.02 mm) appeared to be three times thicker than porcine pericardium (0.13 ± 0.05 mm), both of which had a serous layer, fibrosa, and epicardial connective tissue ( epicardial connective tissue). The mesentery layer formed a soft layer consisting of mesothelial cells. The fibrous layer made up the bulk of the pericardium and consisted of collagen, elastic fibers, nerves, blood vessels, and lymphatic vessels. The epicardial connective tissue was composed of loosely connected collagen and elastic fibers to form a rough layer (Fig. 1).
돼지 심낭을 0.625% 글루탈알데히드 고정만 시행한 군과, 0.625% 글루탈알데히드 고정전과 고정후에 80% Ethanol 처리한 군과, sodium dodecylsulfate (SDS)를 이용한 무세포화 처리만 시행한 군, 무세포화과정에 0.625% 글루탈알데히드 고정한 군, 80% ethanol 처리 후 다시 무세포화과정을 한 후 0.625% 글루탈알데히드 고정한 군, 무세포화한 후 다시 ethanol 처리 후 다시 0.625% 글루탈알데히드 고정한 군 모두 콜라겐은 잘 유지 되고 있었다. 하지만 무세포화처리만 시행하거나 먼저 무세포화처리 후 글루탈알데히드 고정 처리한 군의 콜라겐 섬유들도 다른 군에 비해 느슨하게 연결된 양상이었다(도 2). Porcine pericardium treated with 0.625% glutaraldehyde only, 80% ethanol treated before and after 0.625% glutalaldehyde fixation, and acellularized with sodium dodecylsulfate (SDS). 0.625% glutaraldehyde-fixed group, 80% ethanol-treated group after acellularization and then 0.625% glutaraldehyde-fixed group after acellularization, 0.625% glutalaldehyde-fixed group, and collagen maintained well It was. However, collagen fibers of the group treated with acellularization alone or without glutaraldehyde fixation after acellularization treatment were also loosely connected than other groups (FIG. 2).
(2) 글루탈알데히드 고정, 항석회화, 무세포화 처리 후 돼지 대동맥 판막, 폐동맥판막의 비교 (2) Comparison of porcine aortic valve and pulmonary artery valve after glutaraldehyde fixation, anticalcification and acellularization treatment
아무런 처리를 하지 않은 경우, 돼지 대동맥 판막, 폐동맥판막은 섬유판(lamina fibrosa), 해면질판(lamina spongiosa), 심실판(lamina ventricularis) 세층으로 이루어져 있었다. 섬유판은 원주형태의 콜라겐 섬유로 되어 있었으며, 해면질판은 glycosaminoglycans (proteoglycan)이 주 성분으로 되어 있었고, 심실판은 방사상의 탄력섬유를 가진 elastin으로 이루어져 있었다.In the absence of any treatment, the porcine aortic valve and pulmonary artery valve consisted of three layers of lamina fibrosa, lamina spongiosa, and lamina ventricularis. Fibrous plate was composed of columnar collagen fibers, spongy plate was composed mainly of glycosaminoglycans (proteoglycan), and ventricular plate was composed of elastin with radial elastic fibers.
돼지 대동맥판막, 폐동맥판막을 0.625% 글루탈알데히드 고정만 시행한 군과, 0.625% 글루탈알데히드 고정전과 고정 후에 80% Ethanol 처리한 군과, sodium dodecylsulfate (SDS) 처리로 무세포화만 시행한 군, 무세포화과정에 0.625% 글루탈알데히드 고정한 군, 80% ethanol 처리 후 다시 무세포화과정을 한 후 0.625% 글루탈알데히드 고정한 군, 무세포화한 후 다시 ethanol 처리 후 다시 0.625% 글루탈알데히드 고정한 군 모두 세층과 콜라겐은 잘 유지 되고 있었다. 하지만 무세포화만 시행하거나 먼저 처리한 군은 심낭에서처럼 콜라겐구조는 다른 군에 비해 느슨하게 연결된 양상이었다 (도 3).Porcine aortic and pulmonary artery valves treated with 0.625% glutaraldehyde only, 80% ethanol treated before and after 0.625% glutalaldehyde fixation, and acellularized with sodium dodecylsulfate (SDS) treatment. In the saturation process, 0.625% glutaraldehyde-fixed group, 80% ethanol-treated and acellularized again, and then 0.625% glutaraldehyde-fixed group, acellularized and ethanol-treated again, and 0.625% glutalaldehyde-fixed group again Collagen was well maintained. However, in the acellularization-only or first-treated group, collagen structure was loosely linked compared to other groups as in the pericardium (FIG. 3).
결과적으로, 본 실시예에서 이종이식 돼지심낭과 대동맥 판막, 폐동맥판막 보철편은 여러 조건하의 고정 방법들에 따라 콜라겐 골격의 전자 현미경적 구조에서 확연한 차이를 보이지 않아, GA를 이용한 각종 조직 처리과정 중 조직손상에 의한 구조적, 기계적 손실은 없는 것으로 생각되었다. 하지만 GA 고정하기 전에 SDS로 무세포화 처리를 시행한 경우 또는 무세포화처리만 시행한 경우 콜라겐 조직의 미세한 변성이 전자현미경에서 관찰 되었다.As a result, the xenograft porcine pericardium, aortic valve, and pulmonary valve prosthetic prosthesis did not show any significant difference in the electron microscopic structure of the collagen skeleton according to the fixation method under various conditions. There was no structural or mechanical loss due to tissue damage. However, microscopic degeneration of collagen tissues was observed in the electron microscope when the cells were acellularized with SDS before GA fixation.
<실시예 3: 탈세포화 조건의 최적화>Example 3: Optimization of Decellularization Conditions
본 실시예에서는, 돼지의 대동맥 및 폐동맥판막, 대동맥 및 폐동맥벽, 돼지의 심낭을 탈세포화 세정제(detergents)에 대한 농도 및 배양시간, 온도조건, 용질에 대한 삼투압 등을 달리하고, 여러 탈세포화용액 및 그 조합을 통해 단일단계 및 여러 단계의 방법으로 배양하여 탈세포화를 시행하였다. 이렇게 탈세포화 실험을 마친 조직은 헤마톡실린-에오신 (H&E) 염색을 통해 탈세포화의 정도와 세포 외 기질의 보존 정도를 평가하였다. In this embodiment, porcine aorta and pulmonary valves, aortic and pulmonary artery walls, and porcine pericardium vary in concentration, incubation time, temperature conditions, and osmotic pressure for solutes, and various decellularization solutions. And decellularization by culturing in a single step and several steps through the combination. After decellularization experiments, hematoxylin-eosin (H & E) staining was used to evaluate the degree of decellularization and preservation of extracellular matrix.
3-1 재료의 준비3-1 Preparation of Materials
도살장에서 도살된 건강한 돼지의 심장과 심낭 및 소의 심낭을 수의사의 협조 하에 채취하여, 즉시 잔존 혈액을 세척한 후 4℃ 생리식염수에 담아 냉장상자에 보관하여 실험실로 가져온다. 실험실에서, 채취된 신선한 돼지 심장을 박리하여 대동맥판막 도관과 폐동맥판막 도관을 얻고, 이미 채취된 돼지의 심낭절편과 소의 심낭절편을 생리식염수로 여러번 세척하여 복합항균제제(1cc/L, antibiotic & antimycotic solution, Sigma)를 섞은 인산염완충 식염수 (phosphate buffered saline, PBS pH 7.4)에 약 1∼2시간동안 4℃에서 냉장 보관한 후 탈세포화 작업을 진행한다.The heart, pericardium and bovine pericardium of healthy pigs slaughtered in the slaughterhouse are collected with the help of a veterinarian, immediately washed with residual blood and stored in 4 ° C saline solution in a cold box and brought to the laboratory. In the laboratory, the collected fresh pig heart is removed to obtain aortic valve and pulmonary valve conduit, and the already collected pig pericardium section and bovine pericardium section are washed several times with physiological saline and combined antimicrobial agents (1cc / L, antibiotic & antimycotic) solution, Sigma) in a phosphate buffered saline (phosphate buffered saline, PBS pH 7.4) is refrigerated at 4 ℃ for about 1 to 2 hours and then decellularized.
3-2 탈세포화3-2 Decellularization
(1) 일반적인 원칙: (1) General Principles:
일반적으로 탈세포화처리를 시작하기 전에 복합항균제제(1 cc/L, antibiotic & antimycotic solution, Sigma, 100 U penicillin, 0.1 mg streptomycin, 0.25 g/mL amphotericin)에 의한 생체균주부담완화(Bioburden reduction) 시도를 하였고, 이후 탈세포화 과정 중에는 항생제를 사용하지 않았다. 탈세포화실험은 각각의 처리과정 중 분당 최저 200회 이상속도로 회전 진탕기(rotating shaker)에서 배양(incubation) 하였고, 다른 용액에 옮길 때에는 잔존 용매나 세정제제의 잔류를 최소화하기 위해 생리용액 (50 mL PBS)에 5∼10분간 3회 이상 세척하였다. In general, bioburden reduction is attempted by complex antimicrobial agents (1 cc / L, antibiotic & antimycotic solution, Sigma, 100 U penicillin, 0.1 mg streptomycin, 0.25 g / mL amphotericin) before starting decellularization. After that, antibiotics were not used during the decellularization process. Decellularization experiments were incubated in a rotating shaker at a speed of at least 200 times per minute during each treatment, and when transferred to other solutions, physiological solutions (50) were used to minimize residual solvents or detergents. mL PBS) was washed three more times for 5-10 minutes.
기본적으로 탈세포화를 위해 사용되는 용액은 시료조직부피(무게)의 15∼20배를 사용하는 것을 원칙으로 하였다. 일부 실험에서 이용되는 저장성 완충용액과 등장성 완충용액, 고장성 완충용액은 다음과 같은 조성 및 산도로 제작하여 사용하였다.Basically, the solution used for decellularization should be 15-20 times the sample tissue volume (weight). The hypotonic buffer, isotonic buffer and hypertonic buffer used in some experiments were prepared and used in the following compositions and pH.
- 저장성 완충용액: Tris, 10 mmol/L; ethylendiamine tetraacetic acid, 0.1%-0.05%; aprotinin, 5-10 KIU/mL, neomycin trisulfate 50-100 mg/L; pH 8Hypotonic buffer: Tris, 10 mmol / L; ethylendiamine tetraacetic acid, 0.1% -0.05%; aprotinin, 5-10 KIU / mL, neomycin trisulfate 50-100 mg / L; pH 8
- 등장성 완충용액: Tris, 50 mmol/L; NaCl, 0.15 mol/L; ethylendiamine tetraacetic acid, 0.1-0.05%; aprotinin, 5-10 KIU/mL, neomycin trisulfate 50-100 mg/L; pH 8Isotonic buffer: Tris, 50 mmol / L; NaCl, 0.15 mol / L; ethylendiamine tetraacetic acid, 0.1-0.05%; aprotinin, 5-10 KIU / mL, neomycin trisulfate 50-100 mg / L; pH 8
- 고장성 완충용액: Tris, 100 mmol/L; NaCl, 0.3-0.6 mol/L; ethylendiamine tetraacetic acid, 0.1-0.05%; aprotinin, 5-10 KIU/mL, neomycin trisulfate 50-100 mg/L; pH 8Hypertonic buffer: Tris, 100 mmol / L; NaCl, 0.3-0.6 mol / L; ethylendiamine tetraacetic acid, 0.1-0.05%; aprotinin, 5-10 KIU / mL, neomycin trisulfate 50-100 mg / L; pH 8
그 외에 사용된 용액제제들로는 사용 용매나 세정제에 따라 인산생리용액(PBS), 증류수, 생리식염수 등이 사용되었다. 탈세포화 과정 후에는 조직을 생리식염수에 세척하고 10% 포르말린에 고정하여 조직검사와 그 외 필요한 검사들을 의뢰하였다. 탈세포화와 세포 외 기질의 보존 정도는 hematoxylin-eosin (H&E)염색으로 표본을 만들고 400배율에서 관찰하였다. 탈세포화를 평가하기 위해 탈세포화 처리를 하지 않은 시료를 H&E염색하여 대조군 표본으로 사용하였다. 일부 탈세포화 된 조직에서는 이종항원면역제거 정도를 파악하는 alpha-Gal 염색과 DAPI 염색을 함께 시행할 수도 있다.Other solutions used were physiological phosphate solution (PBS), distilled water, and saline, depending on the solvent and detergent used. After the decellularization process, the tissues were washed in saline and fixed in 10% formalin for biopsy and other necessary tests. The degree of decellularization and preservation of extracellular matrix were observed at 400 magnification with specimens prepared by hematoxylin-eosin (H & E) staining. To assess decellularization, H & E stained samples without decellularization were used as control specimens. In some decellularized tissues, alpha-Gal and DAPI staining may be used to determine the extent of xenoantigen clearance.
(2) 본 실시예에서는, 여러단계의 탈세포화과정을 거치는 다단계(multi-step)방법을 이용하여 탈세포화를 수행하였다. (2) In the present embodiment, decellularization was performed by using a multi-step method that undergoes several steps of decellularization.
즉, 탈세포화의 수행을 위하여 4℃의 저장성 용액에서 6-14 시간 동안 처리하고, 0.1-1.0 % SDS 용액을 혼합한 8-10 °C의 저장성 용액에서 14-24시간 처리한 다음, 다시 고장성 용액에서 6-12 시간 처리한 후, 4℃의 등장성 용액에서 12시간 처리하였다. 모든 과정에서 200회 이상 회전진탕을 하면서 탈세포화를 진행하였다. That is, 6-14 hours in a storage solution at 4 ℃ to perform decellularization, 14-24 hours in a storage solution of 8-10 ° C mixed with 0.1-1.0% SDS solution, and then broken again After treatment for 6-12 hours in the aqueous solution, it was treated for 12 hours in an isotonic solution at 4 ℃. In all processes, decellularization was performed with rotation shaking more than 200 times.
특히 심장판막은 4℃ 저장성 용액에서 6시간동안 처리하고, 8℃에서 저장성 용액과 0.1% - 1% SDS 용액을 혼합한 용액에 14시간처리하고, 다시 4℃ 고장성 용액에 6시간처리, 그 후 4℃ 등장성 용액에서 12시간 처리를 시행하여 탈세포화를 수행하였다. In particular, the heart valves were treated for 6 hours in a 4 ° C. storage solution, and treated at 8 ° C. for 14 hours in a mixture of a storage solution and 0.1% -1% SDS solution, and then treated for 6 hours in a 4 ° C. hypertonic solution. Then, decellularization was performed by performing treatment for 12 hours in an isotonic solution at 4 ° C.
심낭의 경우에는, 심장판막의 무세포화를 SDS용액의 낮은 농도에서 같은 방법으로 시행하거나, 혹은 다른 세제 (deoxycholate 등)를 이용하여 세정액이 혼합된 저장성 용액에 6-14시간, 0.5-2% sodium deoxycholate가 포함된 3-8℃ 저장성 용액에 14-24시간, 고장성 용액에서 6-12시간, 4℃ 등장성 용액에서 12시간 처리하였다. In the case of pericardium, the acellularization of the heart valve is performed in the same manner at a low concentration of SDS solution, or in a storage solution mixed with washing solution using another detergent (deoxycholate, etc.) for 6-14 hours, 0.5-2% sodium 14-24 hours in 3-8 ° C storage solution containing deoxycholate, 6-12 hours in hypertonic solution, and 12 hours in 4 ° C isotonic solution.
3-3 결과3-3 results
상기 실시예의 결과를 도4에 나타내었다. 도 4a는 상기 탈세포화 처리를 하지 않은 돼지 대동맥판막, 폐동맥판막 및 소 심낭의 H&E 염색 결과로, 파란 점 등이 탈세포화가 되지 않은 상태를 나타낸다. 도 4b는 4℃의 저장성 용액에서 6-14 시간 동안 처리하고, 0.1-1.0 % SDS 용액을 혼합한 8-10 °C의 저장성 용액에서 14-24시간 처리한 다음, 다시 고장성 용액에서 6-12 시간 처리한 후, 4℃의 등장성 용액에서 12시간 처리한 대동맥판막, 돼지 심낭, 돼지 폐동맥판막 및 소 심낭의 H&E 염색 결과를 나타낸 것이다. 탈세포화가 이루어져 세포핵이 제거되었음을 확인할 수 있다. The results of the above example are shown in FIG. Figure 4a is a result of H & E staining of the porcine aortic valve, pulmonary valve and bovine pericardium without the decellularization, the blue dots and the like shows a state that is not decellularized. Figure 4b is treated for 6-14 hours in a stock solution at 4 ℃, 14-24 hours in a 8-10 ° C stock solution mixed with 0.1-1.0% SDS solution, and then again 6- in hypertonic solution After 12 hours of treatment, the results of H & E staining of aortic valves, porcine pericardium, porcine pulmonary artery valves and bovine pericardium were shown for 12 hours in isotonic solution at 4 ° C. Decellularization can be confirmed that the nucleus was removed.
SDS는 탈세포 효과가 매우 강력한 이온성 세정제(ionic detergent) 중 하나로서 세포의 acidic phospholipid를 제거하며, 이러한 SDS는 높은 이온성의 양측 친매성 리간드(highly ionic, amphipathic ligands)를 가지고 있고 이는 소수성 도메인(hydrophobic domain)을 통해 단백과 결합하여 친수성 도메인(hydrophilic domain)을 노출시켜 음전하(negative charge)들을 많이 만들어 단백이 친수성(hydrophilic)이 되게 하여 물과 결합함으로서 조직의 부종을 증가 시키고, 수소결합을 와해시킴으로서 콜라겐의 안전성을 감소시킨다. 또 elastin은 주로 소수성(hydrophobic)이기 때문에 SDS에 노출되면 소수성을 잃어버려 수성환경(aqueous environments)에 노출되게 된다. SDS는 다른 세정제(detergent)들과 비교하여 잔존 핵물질, vimentin 같은 세포질 단백을 거의 완전하게 제거할 수 있다고 알려져 있지만 SDS는 고유조직구조를 파괴하는 경향이 있어 glycoaminoglycan (GAG)의 감소나 콜라겐의 구조(integrity)를 약화 시킬 수 있다. SDS is one of the ionic detergents that has a very strong decellular effect, which removes acidic phospholipids from cells, and these SDSs have highly ionic, amphipathic ligands, which are hydrophobic domains. Hydrophobic domains bind to proteins to expose hydrophilic domains, creating a lot of negative charges, making the proteins hydrophilic, and binding to water to increase edema of tissues and break hydrogen bonds. By reducing the safety of collagen. In addition, elastin is primarily hydrophobic, so when exposed to SDS, elastin loses its hydrophobicity and is exposed to aqueous environments. SDS is known to be able to completely remove cellular proteins such as vimentin and remaining nuclear material compared to other detergents, but SDS tends to destroy the native tissue structure, reducing glycoaminoglycan (GAG) or collagen structure. You can weaken (integrity).
따라서 SDS 단독에 의한 탈세포화는 장기간 노출시 조직에 독성이 있고, 불완전하므로, 본 실시예에서는 상기한 바와 같이 SDS 노출 전 저장성 용액에 조직을 처치한 다음에 SDS가 혼합된 저장성 용액을 처치함으로써 저농도의 SDS와 삼투압방식을 함께 이용한 탈세포화를 최적화하였다. 저장성 용액에 조직을 전처치함으로써 삼투압을 이용하여 세포를 팽창시켜 세포막을 터트려 세포를 파괴하여 탈세포화를 일차적으로 수행한 것이다. 이 때 추가적으로 세포 지꺼기(cell debris)를 제거하기 위해 효소적 혹은 화학적 처치함으로써 탈세포화의 효율을 높일 수 있다. 가장 보편적으로 사용하는 용액은 10 mM tris buffer solution으로 여기에 chelating agent 인 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)를 섞어 세포와 세포외 기질과의 결합(binding)을 약화 시켜 세포를 잘 빠져 나오게 하고 세포 파괴시 누출되는 세포내 여러 효소의 활성을 방지하기 위해 protease inhibitor인 phenylmethylsulfonylfluoride, aprotinin, leupeptin 등을 첨가하여 사용할 수 있다. 뿐만 아니라, 이러한 저장성 용액에서의 처치를 저온(4 ℃)에서 수행할 경우 비록 여러 효소나 세정제등의 활성화나 기능을 약화시킬 수 있지만, 탈세포화과정에 비교적 장시간 노출시킴으로서 효소적, 화학적 탈세포화의 효과를 유지하고, 특히 세포외 기질의 손상을 최소화 할 수 있을 것으로 판단된다. Therefore, since decellularization by SDS alone is toxic and incomplete in long-term exposure, in the present embodiment, as described above, by treating the tissue with the storage solution before SDS exposure, the low concentration by treating the storage solution with the SDS is mixed. The decellularization using SDS and osmotic pressure was optimized. By pretreatment of tissue in a storage solution, the cells are expanded by osmotic pressure, the cell membranes are broken, and the cells are destroyed to decellularize. At this time, the efficiency of decellularization can be increased by enzymatic or chemical treatment to remove cell debris. The most commonly used solution is 10 mM tris buffer solution, which is mixed with chelating agent EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) to weaken the binding between cells and extracellular matrix, allowing them to escape well and leaks when cells are destroyed. Protease inhibitors such as phenylmethylsulfonylfluoride, aprotinin and leupeptin can be added to prevent the activity of various enzymes in cells. In addition, treatment at low temperature (4 ° C.) may impair the activation or function of various enzymes or cleaning agents, but the exposure to decellularization may cause relatively long exposure to enzymatic and chemical decellularization. It is believed that it is possible to maintain the effect and in particular to minimize damage to the extracellular matrix.
또한, 본 실시예에서는 저장성 용액 및 SDS를 혼합한 저장성 용액에서 조직을 처치한 다음, 고장성 용액에서 처리함으로써 삼투압을 이용하여 SDS를 비롯한 세포독성 물질을 제거할 수 있도록 하고, 저장성용액 처리에따른 조직의 부종을 완화할 수 있으며, 조직내의 콜라겐 배열을 재정돈하는 효과가 있으며, 다시 저온의 등장성 용액에 조직을 처치함으로써 조직의 삼투압을 정상화하고, 탈세포화과정에서 발생할 수 있는 세포외기질을 보호할 수 있도록 하였다. In this embodiment, the tissue is treated in a storage solution mixed with a storage solution and SDS, and then treated in a hypertonic solution to remove cytotoxic substances including SDS using osmotic pressure. It can relieve edema of tissues, rearrange collagen arrangement in tissues, normalize osmotic pressure of tissues by treating tissues in low temperature isotonic solution, and remove extracellular matrix that can occur during decellularization process. To protect.
결론적으로, 탈세포화가 최적의 탈세포화를 이루기 위해서는 조직마다 조금씩 차이가 있으나, SDS 농도는 상기와 같이 0.1-2% 이고, 저장성 완충용액에 배양하는 총시간은 20 ~ 36 시간은 되어야 할 것으로 판단되며, 저장성 용액과 고장성 용액 및 등장성 용액에 순서대로 처리하는 단계를 거치는 것이 탈세포화가 잘 이루어질 수 있다. 이 때, 고장성 용액에서는 6-12 시간 이상, 등장성 용액에서는 12 시간 이상 처리되어야 할 것으로 생각된다.In conclusion, decellularization is slightly different from tissue to tissue to achieve optimal decellularization, but the SDS concentration is 0.1-2% as described above, and the total time to incubate in storage buffer solution should be 20 to 36 hours. Degradation may be achieved by sequentially treating the hypotonic solution, the hypertonic solution, and the isotonic solution. At this time, it is thought to be treated for at least 6-12 hours in hypertonic solution and at least 12 hours in isotonic solution.
<실시예 4: 각종 고정 처리법에 대한 피로 내구성 검사>Example 4 Fatigue Durability Test for Various Fixing Methods
본 실시예에서는, 준비된 처리조직을 고정 또는 탈세포화한 뒤 피로 실험 전후로 조직의 투과도와 유순도를 측정하여 비교하였고 또한 광학현미경을 통한 조직검사로 조직 구조의 가시적인 변화 정도를 확인하였다.In the present embodiment, the prepared tissue was fixed or decellularized, and the tissue permeability and purity were measured before and after the fatigue test, and the degree of visible change of the tissue structure was confirmed by histological examination through an optical microscope.
4-1 재료의 준비4-1 Preparation of Materials
도살장에서 수의사의 협조 하에 건강한 소나 돼지를 도살하여 즉시 소, 돼지심낭과 돼지대동맥, 폐동맥판막을 무균법으로 적출하여 차가운 phosphate buffered solution (PBS, 0.1M, pH 7.4, 4℃)에 넣어 아이스 박스에 담아 실험실로 운반한다. In a slaughterhouse, with the help of a veterinarian, the slaughterer thrives healthy cows or pigs and immediately removes bovine, swine pericardium, porcine aorta, and pulmonary artery valves by aseptic method and put them in a cold phosphate buffered solution (PBS, 0.1M, pH 7.4, 4 ℃) in an ice box. Take it to the lab.
4-2 탈세포화 및 고정4-2 Decellularization and Fixation
신선 이종 심낭편을 저장성(hypotonic) 완충용액에 12시간 동안 담가두고, 세척후 0.25% SDS를 포함한 저장성 완충용액에 16시간 동안 담가 둔 뒤, 그 후 등장액에 8시간 동안 담가 두었다. 무세포화에 사용하는 용액에는 교질(matrix)조직의 보호를 위하여 항단백분해효소제나 항섬유분해효소제등을 첨가하였으며, 전 과정은 냉장상태인 4℃, 회전 분탕기(rotating shaker)내에서 처리하고, 이후 고정 과정을 거쳤다. 대조군으로는 아무런 처리를 하지 않은 신성 이종 심낭편을 즉시 고정 처리하였다.Fresh heterologous pericardium was soaked in hypotonic buffer for 12 hours, washed and then soaked in hypotonic buffer containing 0.25% SDS for 16 hours, and then soaked in isotonic solution for 8 hours. Anti-proteinase or anti-fibrinase was added to the solution used for acellularization, and the whole process was carried out in a rotating shaker at 4 ° C in a refrigerated state. Since then, it has been fixed. As a control, untreated neoplastic heterologous pericardium was immediately fixed.
고정에는 글루타르알데히드와 용매(solvent)를 사용하였다. 글루타르알데히드 0.2%, 0.25%, 0.5%, 0.6%,0.625%, 1%, 2%, 3% 용액 등을 사용하였고, 용매는 에탄올(ethanol) 60%, 80%, 95% 용액이거나 67.5%-75% 에탄올과 2.5-5% 옥타놀(octanol), 혹은 2.5-5%의 옥탄디올(octanediole) 혼합 용액 등을 사용하였다. 고정의 온도는 4℃, 실온(room temperature) 또는 고온 (37-45℃)이었다.Glutaraldehyde and a solvent were used for fixation. Glutaraldehyde 0.2%, 0.25%, 0.5%, 0.6%, 0.625%, 1%, 2%, 3% solution and the like were used, and the solvent was
보관을 위하여, 0.25% 또는 0.3% 글루타르알데히드를 사용하였으며, 12일간 실온에서 보관한 심낭편을 실험에 사용하였다. 실험 초기에는 0.3% 글루타르알데히드 용액을 사용하였으나 후에는 0.25%를 사용하기로 하여 방법을 통일하였다.For storage, 0.25% or 0.3% glutaraldehyde was used, and pericardium fragments stored at room temperature for 12 days were used for the experiment. Initially, 0.3% glutaraldehyde solution was used, but later, 0.25% was used to unify the method.
4-3 검사4-3 Inspection
(1) 투과도(permeability) 검사(1) Permeability inspection
탈세포화, 고정, 보관 등의 처리과정을 마친 심낭편에, 생리식염수를 이용하여 100mmHg의 압력 1시간 동안 한쪽 방향에서 가한 뒤, 심낭편을 투과한 생리식염수의 양을 측정한다. 1시간 동안 동일한 면적의 심낭편을 투과한 생리식염수의 부피(cc/hrcm2)로 결과를 표시한다. 투과성의 차이는 콜라겐 섬유다발의 영구적인 늘어남과 간격(gap)의 발생의 정도와 연관이 있다고 본다.After decellularization, fixation, storage, etc., the pericardium fragments were treated in one direction using a saline solution at 100 mmHg for 1 hour, and the amount of saline penetrating the pericardial sac was measured. The results are expressed as the volume of normal saline (cc / hrcm 2) penetrating pericardial fragments of the same area for 1 hour. The difference in permeability seems to be related to the extent of permanent stretch of the collagen fiber bundle and the occurrence of gaps.
(2) 유순도(compliance) 검사(2) compliance check
탈세포화, 고정, 보관 등의 처리과정을 마친 심낭편에, 생리식염수를 이용하여 각각 100, 120, 140, 160, 180, 200mmHg의 정수압을 한쪽 면에서 가하여, 심낭편의 변형된 부피를 측정한다. 압력이 100mmHg에서 200mmHg로 증가하는 동안 변형된 부피를 유순도의 값으로 정하며, 심낭편의 면적이 다를 경우에도 비교가 가능하도록 하기 위하여 단위 면적으로 나누어, 단위는 ㎕/mmHgcm2가 된다. 유순도의 변화는 콜라겐 섬유다발의 변성과 이완, 손상 정도와 연관이 있다고 본다.After decellularization, fixation, and storage, the pericardium fragments were treated with physiological saline, and hydrostatic pressures of 100, 120, 140, 160, 180, and 200 mmHg, respectively, were applied on one side to measure the deformed volume of the pericardium. While the pressure is increased from 100 mmHg to 200 mmHg, the deformed volume is defined as the value of purity, and divided into unit areas in order to allow comparison even when the pericardium fragments are different, and the unit is μL / mmHgcm 2 . The change in purity is related to the degree of collagen fiber bundle degeneration, relaxation and damage.
(3) 피로 실험(fatigue test)(3) fatigue test
실험을 위해 장비를 고안하였다. 지름이 25mm인 원 모양의 심낭편에 박동성의 압력을 한쪽 방향에서 짧은 간격으로 반복해서 가할 수 있는 장치로, 생체 내에 심낭편을 이식하여 판막엽으로 사용하는 경우를 재현하기 위해 0~180 mmHg까지의 박동성 압력 재현이 가능하다. 초당 7회로 총 천 5백만 회의 압력 스트레스를 가하게 된다.The equipment was designed for the experiment. It is a device that can repeatedly apply pulsating pressure in one direction at short intervals to a circular pericardial flap of 25 mm in diameter, and to 0 to 180 mmHg to reproduce the case where the pericardial flap is implanted in vivo and used as a valve leaf. The pulsating pressure can be reproduced. A total of 15 million pressure stresses are applied seven times per second.
(4) 광학 현미경 검사(4) optical microscopy
각각의 실험 전후 및 보관 과정까지 끝난 심낭편은 10% 포르말린 용액에 담가진 채로 즉시 병리과로 보내졌으며, 파라핀 포매조직을 만들어 2~4㎛ 절편으로 박절하여 hematoxylin-eosin 염색을 시행하였다.The pericardium fragments before and after each experiment and stored in the 10% formalin solution were immediately sent to the pathology department, paraffin embedded tissues were cut into 2 ~ 4㎛ sections and subjected to hematoxylin-eosin staining.
4-4 결과4-4 results
(1) 신선 우심낭편의 투과도와 유순도 측정(1) Measurement of permeability and purity of fresh right pericardium
기본적인 실험결과 비교의 근거자료로서 아무런 처리를 하지 않은 신선 우심낭을 재료로 하여 투과도와 유순도를 측정하였다(표 2). 아무런 처리를 하지 않은 신선 우심낭은 고정 처리를 거친 이종 이식편에 비해 비교적 높은 투과도와 유순도를 보여 기계적 내구성이 미흡함을 보여주었다.Permeability and purity were measured using fresh right pericardium without any treatment as a basis for comparison of the basic experimental results (Table 2). The untreated fresh right pericardium showed relatively high permeability and purity compared to the fixed xenograft, indicating poor mechanical durability.
(2) 용매(solvent)의 혼합여부 또는 용매의 농도에 차이를 둔 실험군(2) Experimental group with difference in solvent mixing or solvent concentration
이 군에 속한 샘플은 여덟 개였다(표 3, 1.~8.). 현미경 관찰상 각각의 샘플에서 피로 실험 전후에 조직학적 차이는 특별히 발견할 수 없었다(도 5a). 그러나 투과성 및 유순도 검사에 있어서는 에탄올 용매를 혼합하여 고정한 경우가 용매를 혼합하지 않은 경우에 비해 좀더 좋은 특성, 즉 피로 실험 전후로 투과성과 유순도가 낮은 상태로 유지되는 특성을 보였다(표 3). 또한, 고정 시에 용매를 혼합한 경우 중에서도 그 용매의 농도가 높은 경우에 더 좋은 결과를 보였다. 결국, 가능한 높은 농도의 용매를 사용하여 고정하는 것이 더 좋은 결과물을 만들어낸다는 결과를 얻을 수 있었다. 추가 실험을 통해 에탄올의 농도가 80%정도일 때에 가장 좋은 결과를 보임을 알 수 있었는데, 용매로서 에탄올에 더하여 옥타네디올, 옥타놀 등을 추가하였을 때에는 에탄올 농도에 큰 영향을 받지 않았다. 에탄올과 부타놀을 용매로 사용한 고정은 투과성과 유순도의 유지 측면에서는 유리하지만 외과의사가 샘플을 이용하여 실험적인 외과 수술조작을 가할 때 주관적인 불편함이 심하여 곤란하였다. 최종적으로 8개의 고정방법 중 0.6% 글루타르알데히드 용액에 80%의 에탄올을 섞어 3일간 고정한 후에 0.3% 글루타르알데히드 용액에 담가 12일간 보관한 것이 투과도, 유순도 유지가 잘 되었으며, 피로 실험 전후의 조직학적인 변화도 매우 적었다(표 3).There were eight samples in this group (Table 3, 1.-8.). Microscopic observation showed no particular histological difference between each sample before and after the fatigue experiment (FIG. 5A). However, in the permeability and purity test, the mixture of ethanol solvent and fixation showed better properties than the case where no solvent was mixed, that is, the permeability and purity remained low before and after the fatigue test (Table 3). Moreover, even when the solvent was mixed at the time of fixation, when the concentration of the solvent was high, a better result was shown. In the end, we found that fixing with the highest possible concentration of solvent yielded better results. Further experiments showed that the best results were obtained when the concentration of ethanol was about 80%. When octanediol and octanol were added in addition to ethanol as a solvent, the ethanol concentration was not significantly affected. Fixation using ethanol and butanol as solvents was advantageous in terms of maintaining permeability and purity, but it was difficult due to the subjective discomfort when the surgeon performed the experimental surgical operation using the sample. Finally, 80% ethanol was mixed with 0.6% glutaraldehyde solution and fixed for 3 days, and then soaked in 0.3% glutaraldehyde solution for 12 days to maintain permeability and purity. There was also very little change (Table 3).
(3) 고농도 글루탈알데히드 사용 여부에 차이를 둔 실험군(3) Experiment group with difference in the use of high concentration glutalaldehyde
이 군에 속한 샘플은 네 개였다. 고정용 글루탈알데히드의 농도는 대체로 저농도(1% 이하)와 고농도(2~3%정도)로 분류되는데, 이에 본 발명자들은 기존의 1% 미만 농도 글루탈알데히드를 이용한 고정법 대신 2- 3% 고농도의 글루탈알데히드와 용매를 사용하여 심낭편을 고정한 뒤 피로 실험 전후에 투과도, 유순도 및 조직학적 특성 등을 확인하였다. 그 결과 2-3% 글루탈알데히드를 사용한 군이 피로 실험 전후로 투과도, 유순도, 조직학적 특성에서 0.5% 글루탈알데히드 사용 군에 비해 열등하지 않았다. 조직학적으로도 피로 실험 전후에 큰 차이를 발견할 수 없었다(도 5b)There were four samples in this group. The concentration of fixation glutaraldehyde is generally classified into low concentration (less than 1%) and high concentration (about 2 to 3%), and thus the present inventors have instead of the conventional fixation method using concentration glutaraldehyde below 1%. 2- 3% high concentration Permanent fragments were fixed using glutaraldehyde and a solvent, and then permeability, purity and histological characteristics were checked before and after the fatigue test. As a result, the group using 2-3% glutalaldehyde was not inferior to the group using 0.5% glutalaldehyde in the permeability, purity and histological characteristics before and after the fatigue test. Histologically, no significant difference was found before and after the fatigue test (FIG. 5B).
(4) 탈세포화(decellularization) 및 용매 사용 여부에 차이를 둔 실험군(4) Experiment group with difference in decellularization and solvent use
이 군에 속한 샘플은 네 개였다. 탈세포화는 전통적으로 SDS(sodium dodecylsulfate) 용액을 사용하며 최근 다른 물질을 사용하기도 한다. 본 실험에서는 주로 0.1-0.5% SDS 용액을 사용하였으며, 탈세포화여부에 따라, 그리고 용매(에탄올)를 사용했는지 혹은 사용하지 않았는지의 여부에 따라 네 가지의 경우에 대해 피로 실험 전후로 투과성, 유순도, 조직학적 특성을 확인하였다. 그 결과 탈세포화를 시행한 샘플은 피로 실험 이전부터 투과성이 훨씬 높았고, 유순도 자체도 크게 높아져 있었다 (표 3). 피로 실험 후에는 탈세포화 시행 군과 미시행 군의 차이가 더욱 커져서, 탈세포화가 심낭편의 기계적 특성을 매우 악화시킨다고 생각되었다. 뿐만 아니라, 광학 현미경 검사에서도 탈세포화 처리 심낭편은 피로 실험 이전에 이미 콜라젠 섬유다발의 치밀도가 떨어지고, 간혹 간격(gap)이 관찰되고, 피로 실험 후에는 이러한 현상이 심화되어, 콜라겐섬유다발의 분열(fracture), 손상 및 간격(gap)이 더욱 심해지는 것을 확인할 수 있었다(도 5c)There were four samples in this group. Decellularization traditionally uses a solution of sodium dodecylsulfate (SDS), and recently other substances. In this experiment, 0.1-0.5% SDS solution was mainly used, and permeability, purity, Histological characteristics were confirmed. As a result, the samples subjected to decellularization had much higher permeability and higher purity even before the fatigue test (Table 3). After the fatigue test, it was thought that the difference between the decellularized group and the unexecuted group was greater, which deteriorated the mechanical properties of the pericardium. In addition, the decellularized pericardium fragments had already lost the density of collagen fiber bundles, sometimes gaps were observed before the fatigue test, and this phenomenon was intensified after the fatigue test. It was confirmed that the fragmentation (fracture), damage and gap (gap) is more severe (Fig. 5c)
결론적으로, 본 실시예에서 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다. 첫째, 글루타르알데히드 단독으로 사용하여 고정한 경우에 비해 에탄올 등 용매를 함께 사용하여 고정한 경우에 이종 이식편이 더 좋은 기계적 내구성을 가지게 된다. 둘째, 글루타르알데히드와 에탄올을 혼합하여 고정에 사용할 때에, 에탄올의 농도를 70-80 % 정도로 했을 경우 가장 좋은 기계물리학적 내구성을 갖게 한다. 셋째, 글루타르알데히드의 독성을 줄이기 위해 현재 잘 사용되지 않는 고농도(2-3%)의 글루타르알데히드를 사용하여 고정했을 때 그 결과물은 저농도(1%미만) 글루타르알데히드를 사용했을 때와 비슷한 정도의 기계물리학적 내구성을 갖는다. 넷째, 탈세포화는 이종 이식편의 면역원성을 줄이기 위한 필수적인 과정으로 여겨지고 있으나, 탈세포화 처리를 거친 우심낭편은 투과도 및 유순도가 증가하여 기계물리학적 성질이 나빠지고, 피로 실험을 거친 후에는 투과도와 유순도가 더욱 증가하였고, 조직검사에서도 콜라젠섬유의 손상이 심하여 기계물리학적 내구성이 떨어진다.In conclusion, the following conclusions were obtained in the present embodiment. First, the xenograft has better mechanical durability when it is fixed by using a solvent such as ethanol than when it is fixed by using glutaraldehyde alone. Second, when glutaraldehyde and ethanol are mixed and used for fixing, the best mechanical and physical durability is obtained when the concentration of ethanol is about 70-80%. Third, when using high concentrations (2-3%) of glutaraldehyde, which is not currently used to reduce the toxicity of glutaraldehyde, the result is similar to that of low concentration (less than 1%) glutaraldehyde. It has a degree of mechanical and physical durability. Fourth, decellularization is considered to be an essential process for reducing the immunogenicity of xenografts. However, decellularized right pericardium shows increased permeability and purity, resulting in poor mechanical and physicochemical properties. The purity increased further, and collagen fibers were severely damaged in histological examination, resulting in poor mechanical and physical durability.
<실시예 5: 항독소화 처리>Example 5: Antitoxin Treatment
5-1 재료의 준비5-1 Preparation of Materials
도살장에서 도살된 돼지 (생후3개월- 4개월)에서 즉시 심낭을 적출하여 PBS 용액 (0.1M, pH 7.4)에 넣어 ice box에 담아 실험실로 운반한다. 실험군은 총 4군 (1군: 0.625% GA, 2군: 0.625% GA + 80% Ethanol, 3군: 0.625% GA + L-lysine, 4군: 0.625% GA + 80% Ethanol + L-lysine)으로 나누어, 각 군당 심낭 절편의 개수는 8개로 하였다. 또한, Glycine은 nonpolar neutral이고, lysine은 polar basic이지만 모두 NH3 기가 작용하므로, 상기 lysine 대신에 glycine을 사용하여 항독소화처리를 하여도 무방하다. 기타 보로하이드라이드, 글루타믹 산, 호모시스테익 산 등의 아미노산을 처리하여 항독소화할 수 있다. From the slaughterhouse pigs (3 months-4 months old), the pericardium is immediately extracted and placed in PBS solution (0.1M, pH 7.4) in an ice box and transported to the laboratory. The experimental group was a total of 4 groups (Group 1: 0.625% GA, Group 2: 0.625% GA + 80% Ethanol, Group 3: 0.625% GA + L-lysine, Group 4: 0.625% GA + 80% Ethanol + L-lysine) The number of pericardial sections in each group was eight. In addition, since glycine is nonpolar neutral and lysine is polar basic, but both NH 3 groups work, anti-toxin treatment may be performed using glycine instead of lysine. Other amino acids such as borohydride, glutamic acid, homocysteic acid can be treated to antitoxin.
5-2 고정 및 전처치5-2 Fixing and Pretreatment
(1) 고정: 돼지 심낭을 0.625% 글루탈알데히드 (PBS buffer, pH 7.4)에 담가 4℃에서 2일간 고정한 후, 상온에서 7일간 추가로 고정한다. 고정이 끝나면 심낭을 가로 세로 1.5cm 크기의 심낭편들로 나누어서 더 이상의 처치가 필요하지 않은 심낭편들은 PBS 용액으로 상온에서 24시간 동안 세척한 후, 쥐에게 이식한다. 추가적인 항석회화 처리가 필요한 심낭편들은 바로 다음 단계로 진행한다.(1) Fixation: Soak the porcine pericardium in 0.625% glutalaldehyde (PBS buffer, pH 7.4) and fix it at 4 ° C for 2 days, and then fix it further at room temperature for 7 days. After fixation, the pericardium is divided into pericardium of 1.5 cm in size. The pericardium fragments that do not require further treatment are washed with PBS solution for 24 hours at room temperature, and then transplanted into rats. Pericardial fragments requiring additional anticalcification proceed to the next step.
(2) Ethanol 전처치: 0.625% 글루탈알데히드 고정 처리를 마친 심낭편들을 80% ethanol (PBS buffer, pH 7.4)이 담긴 shaker bath에 넣어 상온에서 24시간 동안 처리한다. 더 이상의 처치가 필요하지 않은 심낭편들은 PBS 용액으로 상온에서 24시간 동안 세척한 후, 쥐에게 이식한다.(2) Pretreatment of Ethanol: The pericardium fragments treated with 0.625% glutalaldehyde fixation are treated in a shaker bath containing 80% ethanol (PBS buffer, pH 7.4) for 24 hours at room temperature. The pericardium fragments that do not require further treatment are washed with PBS solution at room temperature for 24 hours and then transplanted into rats.
(3) L-lysine 전처치: 0.625% 글루탈알데히드 고정 처리나 추가 Ethanol 처리를 마친 심낭편들을 PBS 용액으로 세척한 후, 0.1M L- lysine solution (acetic acid buffer, 0.5M, pH 7.6)에 담가 37℃에서 48시간 동안 처리한다. 이후 PBS solution으로 상온에서 24시간 동안 세척한 후, 쥐에게 이식할 때까지 4℃의 PBS 용액에 보관한다.(3) Pretreatment of L-lysine: Pericardial fragments treated with 0.625% glutaraldehyde fixation or additional ethanol treatment were washed with PBS solution, and then washed with 0.1M L-lysine solution (acetic acid buffer, 0.5M, pH 7.6). Soak is treated for 48 hours at 37 ℃. After washing for 24 hours at room temperature with PBS solution, and stored in PBS solution of 4 ℃ until transplanted to the rat.
(4) 다른 아미노산을 처리하여 항독소화할 수 있다. Glycine(0.05-0.2M Glysine with PBS solution)을 실온에서 24-48시간동안 담가 처리하거나, Sodium borohydride 용액(Sodium borohydride 0.08M in buffered glycine(0.2% HEPES, 0.2M glycine, 0.1M NAOH, pH 10.3) 또는 buffered carbonate(0.1M NaHCO3, 0.1M Na2CO3, pH; 10.3)에 반응하지 않은 조직내 시약(알데하이드기)을 제거하기 위하여 실온에서 24-48시간 배양처리하거나, 완전 포화된 그루타믹 산 용액(saturated aqueous solution of L-glutamic acid, 또는 0.05-0.1M L-glutamic acid, ph 3, room temperature)이나, 2% 아르기닌( 0.12M, L-arginine in PBS phosphate buffered saline (PBS) at pH 11 )등을 실온에서 24-48시간 배양처리한다. 상기 항독소처리를 시행한 다음 다합성 소독용액에 최종 소독후 2% 벤질알콜(benzyl alcohol)용액이나 1% 벤질코니움(benzylkonium)용액에 보관한다.(4) Other amino acids can be treated to antitoxin. Soak glycerine (0.05-0.2M Glysine with PBS solution) for 24-48 hours at room temperature, or use Sodium borohydride solution (Sodium borohydride 0.08M in buffered glycine (0.2% HEPES, 0.2M glycine, 0.1M NAOH, pH 10.3) Or incubate at room temperature for 24-48 hours to remove reagents (aldehyde groups) that did not react with buffered carbonate (0.1
5-3 검사5-3 Inspection
(1) Purpald 검사, 두께, 장력검사(1) Purpald inspection, thickness inspection
각 군당 1개의 심낭편들은 쥐에게 이식하지 않고 광학 및 전자현미경으로 미세구조를 관찰한다. L-lysine으로 글루탈알데히드 detoxification 처리를 한 심낭편에서 detoxification이 적절히 이루어졌는지 알아보기 위해 aldehyde residue evaluation을 위한 검사를 한다. 이를 위해서 심낭편을 saline으로 세척한 후 0.171M Purpald in 1M NaOH solution에 15분간 soaking한 후 공기 중에 노출시켜 심낭편의 색이 변하는데 걸리는 시간 및 보라색의 정도를 정성적으로 분석한다. Detoxification 처리를 하지 않은 심낭편들에도 같은 검사를 해서 그 결과를 비교한다. One pericardial piece in each group was examined for microstructure by optical and electron microscopy without implantation into rats. A aldehyde residue evaluation is performed to determine whether the detoxification has been properly performed in the pericardium treated with glutalaldehyde detoxification with L-lysine. To do this, the pericardium was washed with saline, soaked in 0.171M Purpald in 1M NaOH solution for 15 minutes, and then exposed to air for qualitative analysis of the time and color of the pericardium fragments. The same test is performed on the pericardium without detoxification, and the results are compared.
처리된 돼지 심낭을 펼치고 30°씩 각도를 달리하여서 얻어낼 수 있는 모두 6가지의 방향에 대해 0.5 x 5cm 의 장방형 절편을 취하여서 폭 5mm에 대한 인장강도를 측정함으로써 그를 평균한 값이 그 심낭의 인장강도의 대표 값이 되도록 시도하였다. 장력의 측정은 Japan Tech & Manufacture, Digital Force Gauge, Model 5FGN, automated materials testing system을 이용 load speed 100mm/min 로 측정하여 단위는 Kg중/폭5mm 로 표기하였다. 또한 심낭의 두께와 장력과의 관계를 보기 위하여 캘리퍼스 Mitutoyo Thickness Gauge (Digimatic 543-122-15, Mitutoyo, Japan)로 표본들의 두께도 한 샘플에서도 세 번씩 측정하여 각각의 평균값을 사용하였다. The average value of the pericardium of the treated pericardial pericardium was determined by unfolding the treated pericardial pericardium and taking a 0.5 x 5 cm rectangular section in all six directions that can be obtained by varying the angle by 30 °. Attempts were made to be representative of tensile strength. The tension was measured at a load speed of 100 mm / min using Japan Tech & Manufacture, Digital Force Gauge, Model 5FGN, and automated materials testing system. In addition, the caliper Mitutoyo Thickness Gauge (Digimatic 543-122-15, Mitutoyo, Japan) was used to measure the thickness of the pericardium, and the average thickness was measured three times in one sample.
(2) 쥐 이식 모델(2) rat transplantation model
Zoletil(0.2cc IP), Rompun(0.1cc IP)으로 쥐를 마취한 다음 등 부위 피하조직에 4개의 pouch를 만든 후, 각각의 pouch에 위의 방법대로 처리한 심낭편들을 임의로 이식한 후 상처를 봉합한다. 심낭편 이식 후 8주가 지나면 실험을 종료하게 되며, CO2 gas를 이용하여 쥐를 마취한다. 이식 시에 만들었던 pouch를 박리하여 심낭편들을 적출해낸다. 적출해낸 각각의 심낭편들을 3등분하여 결과 분석에 사용하게 된다. 쥐의 수명은 2-3년 정도이고 생후 3주까지를 포유기로, 생후 3주에서 14주까지를 성장기로 나누고 생후 14주 이후 성체가 되며, 어린 나이 일수록 석회화가 빨리 진행되는 것으로 알려져 있으므로 본 실시예에서는 생후 3주 연령의 쥐를 사용하였다. After anesthetizing the rats with Zoletil (0.2cc IP) and Rompun (0.1cc IP), four pouches were made in the subcutaneous tissue of the dorsal area. Suture. Eight weeks after pericardial implantation, the experiment was terminated and rats were anesthetized using CO2 gas. The pouch made at the time of implantation is peeled off and the pericardial fragments are removed. Each extracted pericardial piece is divided into three and used for analyzing the results. The life span of rats is about 2-3 years, and it is divided into 3 weeks of gestation and 3 to 14 weeks of growth, and adulthood after 14 weeks of age. It is known that calcification proceeds faster at younger age. In the example, mice at 3 weeks of age were used.
(3) Vonkossa 염색(3) Vonkossa Dyeing
광학 현미경적 검색은 적출된 심낭을 2-3mm 두께의 조직으로 잘라 Dubosqc-brasil 용액에 1시간 넣어두었다가 10% 포르말린에 후고정한 후 파라핀포매조직을 만들어 2-4um 절편으로 박절하여 hematoxylin-eosin 및 vonkossa 염색하여 조직학적 소견과 칼슘 침착의 정도를 알아본다. Optical microscopic examination was performed by cutting the extracted pericardium into 2-3 mm thick tissue, placing it in Dubosqc-brasil solution for 1 hour, fixing it in 10% formalin, and then paraffin embedding tissue and cutting it into 2-4um sections to cut hematoxylin-eosin and vonkossa. Stain for histologic findings and the extent of calcium deposition.
(4) 칼슘 정량(4) calcium determination
각 군의 심낭편의 석회화 정도를 알아보기 위해 calcium 정량을 시행한다. 이를 위해서 심낭편을 saline으로 세척한 후 24시간 이상 hot dryer에서 건조시킨 후 각각 조직의 무게를 측정한다. Glass tube에 담아 1M HCl 용액 3 ml를 첨가하고 75oC dry oven (Fisher Scientific) 에서 가온하며 완전 용해될 때까지 24시간 이상 기다린다. 용액을 e-tube에 옮겨 automatic environmental speedvac system을 이용하여12시간 이상 증발시킨다. Pellet이 만들어지면, PBS(phosphate buffered solution) 1 ml에 담아 Automatic chemistry I.S.E (HITACHI) 장비를 이용하여 calcium content를 정량 한다.Calcium quantification was performed to determine the degree of calcification of the pericardium of each group. To do this, the pericardium is washed with saline, dried in a hot dryer for at least 24 hours, and then weighed. Add 3 ml of 1M HCl solution in a glass tube, warm in a 75oC dry oven (Fisher Scientific) and wait at least 24 hours for complete dissolution. The solution is transferred to an e-tube and evaporated for more than 12 hours using an automatic environmental speedvac system. Once pellets are made, calcium content is quantified using Automatic Chemistry I.S.E (HITACHI) equipment in 1 ml of PBS (phosphate buffered solution).
(5) 통계 방법(5) statistical method
통계처리는 Microsoft excel과 SPSS 14.0K를 사용하였고, 모든 통계수치는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. 각 군간의 평균치 비교는 Student T-test로 검증하였고 각 군 간의 통계적 차이는 ANOVA 및 post-hoc test (Turkey test)로 검증하였으며 p<0.05를 의미 있는 것으로 간주한다. Statistical processing was performed using Microsoft Excel and SPSS 14.0K, and all statistics were expressed as mean ± standard deviation. The mean comparison between groups was verified by Student T-test, statistical difference between each group was verified by ANOVA and post-hoc test (Turkey test) and p <0.05 is considered meaningful.
5-4 결과5-4 Results
(1) 장력 검사(1) tension inspection
각 그룹당 5개의 심낭편을 사용하여 측정하였다. 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 L-lysine 처리한 군이 1.20 ± 0.30 Kg 중/5mm로 가장 강했으며 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 80% Ethanol 과 L-lysine 모두 처리한 군 0.90 ± 0.22 Kg 중/5mm, 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 80% Ethanol 처리한 군이 0.85 ± 0.36 Kg중/5mm, 0.625% 글루탈알데히드 고정만 시행한 군이 0.53 ± 0.34 Kg 중/5mm로 가장 약했다 (도 6). 각 군들간에 통계적으로 유의한 차이가 있었다 (p=0.035). Measurements were made using five pericardium fragments in each group. The group treated with L-lysine after 0.625% glutalaldehyde fixation was the strongest at 5mm of 1.20 ± 0.30 Kg, and the group treated with both 80% Ethanol and L-lysine after fixation with 0.625% glutalaldehyde / 5mm at 0.90 ± 0.22 Kg , The group treated with 80% ethanol after 0.625% glutalaldehyde fixation was the weakest at 5mm in 0.85 ± 0.36 Kg, and the group treated with 0.625% glutalaldehyde fixation at 0.53 ± 0.34 Kg / 5mm (Fig. 6). There was a statistically significant difference between the groups (p = 0.035).
(2) 두께(2) thickness
각 그룹당 5개의 심낭편을 사용하여 측정하였다. 각각의 심낭편을 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 L-lysine 처리한 군이 0.18 ± 0.02 mm로 가장 두꺼웠으며, 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 80% Ethanol 처리한 군이 0.13 ± 0.03mm, 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 80% Ethanol과 L-lysine 모두 처리한 군이 0.12 ± 0.01mm, 0.625% 글루탈알데히드 고정만 시행한 군이 각각0.10 ± 0.02mm로 가장 얇았다. 각 군들간에 통계적으로 유의한 차이가 있었다 (p<0.01) (도 7).Measurements were made using five pericardium fragments in each group. L-lysine treated group was thickest with 0.18 ± 0.02 mm after 0.625% glutalaldehyde fixation, and 0.13 ± 0.03mm, 0.625% for 80% ethanol treated group after 0.625% glutaraldehyde fixation. The group treated with both 80% Ethanol and L-lysine after glutaraldehyde fixation was the thinnest with 0.12 ± 0.01mm and 0.625% glutalaldehyde fixation, respectively, 0.10 ± 0.02mm. There was a statistically significant difference between each group (p <0.01) (FIG. 7).
(3) Purpald 검사(3) Purpald inspection
돼지 심낭을 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 L-lysine 처리한 군과 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 80% Ethanol과 L-lysine 처리한 군에서 약한 보라색을 띠었고 0.625% 글루탈알데히드 고정만 시행한 군과 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 80% Ethanol 처리한 군에서 가장 진한 보라색을 띠었다 (도 8). L-lysine-treated group after 0.625% glutalaldehyde fixation and 80% ethanol and L-lysine-treated group after 0.625% glutaraldehyde fixation showed weak purple color and 0.625% glutalaldehyde fixation group. And dark purple in 80% Ethanol treated group after 0.625% glutaraldehyde fixation (FIG. 8).
(4) Vonkossa 염색(4) Vonkossa Dyeing
심낭은 장막층, 섬유층, 심외막 결합조직으로 이루어져 있었으며 섬유층이 심낭의 대부분의 두께를 차지 하였고 콜라겐, 탄력섬유 (elastic fibers), 신경, 혈관들, 림프관들로 이루어져 있었다. 칼슘은 주로 심외막 결합조직에 주로 침착 되어 있었고 일부는 섬유층 내로 침범하고 있었다. 0.625% 글루탈알데히드 고정만 시행한 군에서는 거의 전 층에서 칼슘이 침착 되어 있었으며 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 80% Ethanol 처리한 군, 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 L-lysine 처리한 군, 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 80% Ethanol과 L-lysine 처리한 군은 세 층이 비교적 잘 유지되면서 주로 심외막 결합조직 내에 칼슘의 침착이 관찰되었다 (도 9). The pericardium was composed of the mesenteric layer, fibrous layer, and epicardial connective tissue. The fibrous layer made up the bulk of the pericardium and consisted of collagen, elastic fibers, nerves, blood vessels, and lymphatic vessels. Calcium was mainly deposited in epicardial connective tissue, and some invaded into the fibrous layer. In the group treated with only 0.625% glutaraldehyde fixation, calcium was deposited almost all over the layer, followed by 80% Ethanol treatment after 0.625% glutaraldehyde fixation, and L-lysine treatment after 0.625% glutaraldehyde fixation, 0.625% In the group treated with 80% Ethanol and L-lysine after glutaraldehyde fixation, three layers were relatively well maintained, and calcium deposition was observed mainly in the epicardial connective tissue (FIG. 9).
(5) 칼슘 정량(5) Calcium Determination
각 그룹당 4개씩의 적출한 심낭편을 사용하였다. 돼지 심낭을 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 80% Ethanol 처리한 군이 13.6 ± 10.0 ug/mg으로 가장 작았고 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 L-lysine 처리한 군이 15.3 ± 1.0 ug/mg, 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 80% Ethanol과 L-lysine 처리한 군이 16.1 ± 11.1 ug/mg, 0.625% 글루탈알데히드 고정만 시행한 군이 51.2 ± 8.5 ug/mg로 가장 많았다. 0.625% 글루탈알데히드 고정만 시행한 군과 비교하여 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 80% Ethanol 처리한 군 (p=0.008)과, 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 L-lysine 처리한 군 (p=0.002), 그리고 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 80% Ethanol과 L-lysine 처리한 군 (p=0.012)은 통계적으로 의미 있게 칼슘의 침착량이 적었다 (도 10).Four isolated pericardial fragments were used for each group. The 80% ethanol treated group was the smallest at 13.6 ± 10.0 ug / mg after the 0.625% glutalaldehyde fixation and the 15.3 ± 1.0 ug / mg, 0.625% glue at the L-lysine treated group after the 0.625% glutalaldehyde fixation. 80% Ethanol and L-lysine treated group after dealdehyde fixation was the highest in the group treated with 16.1 ± 11.1 ug / mg and 0.625% glutalaldehyde fixation (51.2 ± 8.5 ug / mg). 80% Ethanol-treated group (p = 0.008) after 0.625% glutalaldehyde fixation, and L-lysine-treated group after 0.625% glutaraldehyde fixation (p = 0.002). ), And the group treated with 80% Ethanol and L-lysine after fixation with 0.625% glutalaldehyde (p = 0.012) showed a statistically significant decrease in calcium deposits (FIG. 10).
상기와 같이 본 실시예에서 0.625% 글루탈알데히드 고정한 돼지 심낭을 80% Ethanol, L-lysine, 으로 항석회화 처리를 한 후, 각각의 이종 이식 편들의 두께와 장력을 측정하였고 또한 이를 쥐의 피하조직에 이식하여 그 효과를 알아본 결과, Ethanol, L-lysine, 그리고 Ethanol과 L-lysine을 모두 처리한 군에서만 GA 고정만 시행한 군에 비해 통계적으로 유의하게 칼슘의 침착이 적었지만 세 군간에는 차이가 없었다. 또한 이식 전 시행한 두께와 장력검사에서는 L-lysine을 처리한 군이 Ethanol 처리한 군에 비해 좋은 결과를 보였다. 이는 추가적인 Diamine bridge의 효과로 Cross-link가 늘어난 것으로 해석된다. Purpald test 결과에서는 Ethanol만 처리한 군은 GA 고정만 시행한 군과 비슷한 진한 보라색을 띤 반면, L-lysine만 처리하거나 Ethanol과 L-lysine 모두를 처리한 군은 연한 보라색을 띠었다. 이는 L-lysine 처리를 통해 효과적으로 GA의 자유 알데히드기 (-CHO)를 제거하였음을 보여 준다. 결국 이종 이식편의 석회화에는 GA의 자유 알데히드기 외에 여러 가지 반응이 작용하며 이를 억제하기 위하여 작용기전이 다른 Ethanol과 L-lysine를 같이 처리하는 것이 바람직하다. 또한, 본 실시예에서 돼지심낭 보철편은 여러 조건하의 고정 방법들에 따라 콜라겐 골격의 현미경적 구조에서 확연한 차이를 보이지 않아, GA를 이용한 각종 조직 처리과정 중 조직손상에 의한 구조적, 기계적 손실은 없는 것으로 생각되었다. As described above, after anti-calcification of the porcine pericardium fixed with 0.625% glutalaldehyde with 80% Ethanol, L-lysine, the thickness and tension of each xenograft were measured and subcutaneous tissue of the rat was also measured. The effects of ethanol, L-lysine, and ethanol and L-lysine were only significantly lower in calcium deposits than in the GA-only group. There was no. In addition, the L-lysine treated group showed better results than the ethanol treated group in the thickness and tension tests before transplantation. This is interpreted as increased cross-link due to the effect of additional diamine bridge. In the Purpald test results, the ethanol-only group had a dark purple color similar to the GA fixation-only group, whereas the L-lysine-treated group or the ethanol- and L-lysine-treated group had a light purple color. This shows that L-lysine treatment effectively eliminated GA's free aldehyde group (-CHO). Eventually, in addition to GA free aldehyde groups, various reactions work on the calcification of xenografts, and it is preferable to treat Ethanol and L-lysine with different mechanisms of action in order to suppress them. In addition, the porcine pericardial prosthetic prosthesis did not show any significant difference in the microscopic structure of the collagen skeleton according to the fixation method under various conditions, so that there was no structural and mechanical loss due to tissue damage during various tissue processing using GA. Was thought to be.
심장 수술의 증가에 따르는 보철편의 수요 증가가 계속 되는 상황에서 인공 보철편들과 타 동물로부터 채취 제작한 보철편들은 정도의 차이는 있지만 심장 내 이식 후 석회화의 진행에 따르는 중장기 수술 성적의 미흡함이 계속 문제점으로 남아 있다. 이에 본 발명에 따른 이종이식 보철편 제조방법에 의하여 기존의 보철편보다 한결 우수한 석회화 방지 및 완화 효과와 세포독성이 제거된 보철편을 제작, 상품화할 수 있을 것으로 기대되며, 특히 심장판막질환이나 심장혈관수술시 사용할 수 있는 완전 이식 가능한 심장판막이나 심장판막도관, 혈관대체물들의 제작에 적용할 수 있을 것이다. As the demand for prosthetics continues to increase as cardiac surgery continues, prosthetics and prosthetic specimens from other animals differ in degree, but lack of mid- and long-term surgical outcomes following calcification after intracardiac transplantation. It remains a problem. Accordingly, the method for producing xenograft prostheses according to the present invention is expected to produce and commercialize prostheses that are more excellent in preventing and mitigating the effects of calcification and cytotoxicity than conventional prostheses, in particular, heart valve disease or heart. It may be applied to the manufacture of fully implantable heart valves, heart valve conduits, and vascular substitutes for use in vascular surgery.
특히 심장혈관계통의 인공조직이식편의 임상적 사용에는 크게 나누어 이종이식 심낭과 판막으로 볼 수 있다. 이종이식 심낭은 간단한 결손심낭의 보충에서부터 심장혈관계 결손부위의 폐쇄, 보강 등으로부터, 복잡심기형 교정 수술 등에 필요한 보철편으로서의 활용 등 여러 가지가 있다. 주로 혈관 내지 심장의 일부로서 혈액이 누출없이 원하는 방향으로 흐르도록 하는 재료로서의 역할을 하게 된다. 이때 면역원성을 개선하여 석회화 등이 일어나지 않고 오랫동안 제 역할을 하도록 하며, 물리학적 특성의 개선으로 수술 중 조작성도 개선될 것으로 기대하고 있다. 또한, 이식조직 판막은 심장혈관계 수술 중 특히 판막질환에 적용하고자 하는 것으로 특히 지금까지 내구성의 문제로 소아나 젊은 층에서 사용이 기피되던 단점을 극복하고, 장년, 노령층에서도 역시 내구성의 향상으로 재수술을 줄이고, 장기간의 혈역학적으로 개선된 모델을 제작할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 이종 이식 판막도관은 가장 많이 쓰일 것으로 생각되는 분0야는 선천성 심장 기형 중 라스텔리 수술을 받은 환자에서 우심실-폐동맥도관에 사용할 판막으로서이다. 기존의 우심실-폐동맥도관에 사용중인 판막은 그 내구성이 만족스럽지 못하고 수년 내에 판막구조가 파괴되거나 운동성이 저하되어 재수술(교체)이 필요하다. 본 발명에서 개발한 방법으로 고정한 이종이식 판막은 석회화가 적게 일어나고 판막 고유의 기능이 오랫동안 유지되어 한 번의 수술로 더 긴 기간동안 환자가 문제 없이 생활할 수 있을 것으로 기대된다.In particular, the clinical use of artificial tissue grafts in the cardiovascular system can be divided into xenografts pericardium and valves. Xenograft pericardium has many uses, such as supplementation of a simple defective pericardium, closure or reinforcement of a cardiovascular defect site, or the like as a prosthesis for complex cardiovascular surgery. As part of the blood vessel or heart, it serves as a material that allows blood to flow in a desired direction without leakage. In this case, it is expected to improve the immunogenicity so that calcification does not occur for a long time, and the operability during surgery is improved by improving the physical characteristics. In addition, graft valves are intended to be applied to valve diseases, especially during cardiovascular surgery. In particular, they overcome the drawbacks of avoiding use in children and young people because of durability problems. It is expected that a reduced, long-term hemodynamically improved model can be produced. Xenograft conduits, which are considered to be the most widely used, are the valves used for right ventricular-pulmonary artery conduits in patients with congenital heart malformations who have undergone rasterial surgery. The valves used in the existing right ventricle-pulmonary artery catheter are not satisfactory in durability and require reoperation (replacement) due to the destruction of the valve structure or the deterioration of mobility within a few years. The xenograft valve fixed by the method developed in the present invention is expected to be able to live without problems for a longer period of time with a single operation because less calcification occurs and the valve inherent function is maintained for a long time.
도 1은 아무런 처리를 하지 않은 경우의, alkaline toluidine blue로 염색한, 사람의 심낭과 돼지의 심낭의 조직학적 검사 사진이다. 단, 위: 광학현미경 사진(A-C: 돼지 심낭, D-F: 사람 심낭, 콜라겐 섬유가 잘 유지되고 있으며, 사람 심낭은 돼지 심낭의 2배 두께이다.), 아래: 전자현미경 사진 (A-C: 돼지 심낭, D-F: 사람 심낭, 콜라겐 섬유가 잘 유지되고 있으며 사람 심낭은 돼지 심낭의 3배 두꼐이다.)Figure 1 is a histological examination of human pericardium and porcine pericardium stained with alkaline toluidine blue when no treatment. However, above: optical micrograph (AC: porcine pericardium, DF: human pericardium, collagen fibers are well maintained, human pericardium is twice as thick as porcine pericardium), bottom: electron micrograph (AC: porcine pericardium, DF: Human pericardium, collagen fibers are well maintained and human pericardium is three times as thick as pig pericardium.)
도 2는 글루탈알데히드 고정, 항석회화(ethanol), 무세포화 처리(SDS) 후 돼지 심낭의 콜라겐 양상을 확인할 수 있는 사진이다. 콜라겐 섬유는 D,E,G를 제외하고 잘 유지되었다. 단, A: 0.625% GA, B: ethanol+0.625% GA 고정, C: 0.625% GA+ethanol, D: 무세포화 (0.25% SDS) 처리, E: 무세포화 (0.25% SDS) 처리+0.625% 고정, F: ethanol+무세포화 (0.25% SDS) 처리+0.625% GA, (G) 무세포화 (0.25% SDS) 처리+ethanol+0.625% GA. Figure 2 is a photograph showing the collagen pattern of porcine pericardium after glutaraldehyde fixation, anticalcification (ethanol), acellularization treatment (SDS). Collagen fibers were well maintained except for D, E, G. A: 0.625% GA, B: ethanol + 0.625% GA fixed, C: 0.625% GA + ethanol, D: acellularized (0.25% SDS) treated, E: acellularized (0.25% SDS) treated + 0.625% fixed , F: ethanol + acellularization (0.25% SDS) treatment + 0.625% GA, (G) acellularization (0.25% SDS) treatment + ethanol + 0.625% GA.
도 3은 글루탈알데히드 고정, 항석회화, 무세포화 처리 후 돼지 대동맥 판막, 폐동맥판막의 콜라겐 양상을 확인할 수 있는 사진이다. 콜라겐 섬유는 E,F,H를 제외하고 잘 유지되었다. 단, A: 아무것도 처리하지 않은 돼지 판막, B: 0.625% GA 고정, C: ethanol 처리+0.625% GA 고정, D: 0.625% GA 고정+ethanol 처리, E: 무세포화 (0.25% SDS) 처리, F: 무세포화 (0.25% SDS) 처리+0.625% GA 고정, G: ethanol 처리+무세포화 (0.25% SDS) 처리+0.625% GA 고정, H: 무세포화 (0.25% SDS) 처리+ethanol 처리+0.625% GA 고정. Figure 3 is a photograph showing the collagen pattern of porcine aortic valve, pulmonary artery valve after glutaraldehyde fixation, anticalcification, acellularization treatment. Collagen fibers were well maintained except for E, F and H. A: Porcine valve with no treatment, B: 0.625% GA fixation, C: Ethanol treatment + 0.625% GA fixation, D: 0.625% GA fixation + ethanol treatment, E: Acellularization (0.25% SDS) treatment, F : Acellularization (0.25% SDS) treatment + 0.625% GA fixation, G: ethanol treatment + acellularization (0.25% SDS) treatment + 0.625% GA fixation, H: acellularization (0.25% SDS) treatment + ethanol treatment + 0.625% GA fixed.
도 4a는 무세포화가 안된 돼지 대동맥판막(왼쪽 위), 폐동맥판막(오른쪽 위), 소 심낭(왼쪽 아래)의 조직학적 사진이다 (배율: 400배). FIG. 4A is a histological picture of porcine aortic valve (top left), pulmonary artery valve (top right), and bovine pericardium (bottom left) unmagnified (magnification: 400x).
도 4b는 탈세포화된 대동맥판막(왼쪽 위), 돼지심낭(오른쪽 위), 폐동맥판막(왼쪽 아래), 소 심낭(오른쪽 아래) 의 H&E 염색 후 조직학적 사진이다 (배율: 400배). 4B is a histological picture after H & E staining of decellularized aortic valve (top left), porcine pericardium (top right), pulmonary artery valve (bottom left), and bovine pericardium (bottom right) (magnification: 400 ×).
도 5a는 용매혼합여부(1~4) 또는 용매농도의 차이(5~8)에 따른, 피로 실험 전(BF) 후(AF)의 우심낭의 조직학적 사진이다 (배율: 100배).Figure 5a is a histological picture of the right pericardium before (BF) and after fatigue experiment (AF) according to the solvent mixing (1-4) or the difference in solvent concentration (5-8) (magnification: 100 times).
도 5b는 글루탈알데히드의 농도의 차이에 따른, 피로 실험 전 후의 우심낭의 조직학적 사진이다 (배율: 100배).Figure 5b is a histological picture of the right pericardium before and after the fatigue experiment, according to the difference in the concentration of glutaraldehyde (magnification: 100 times).
도 5c은 탈세포화 및 용매 (80% 에탄올) 사용여부의 차이에 따른,한 피로 실험 전 후의 우심낭의 조직학적 사진이다 (배율: 100배).FIG. 5C is a histological picture of the right pericardium before and after one fatigue experiment, according to the difference in decellularization and solvent use (80% ethanol) (magnification: 100-fold).
도 6은 리신, 에탄올 처리에 따른 심낭편의 장력검사 결과를 나타낸 것이다.Figure 6 shows the results of the tension test of the pericardial fragments treated with lysine, ethanol.
도 7은 리신, 에탄올 처리에 따른 심낭편의 두께검사 결과를 나타낸 것이다. Figure 7 shows the thickness test results of the pericardial piece according to lysine, ethanol treatment.
도 8는 리신, 에탄올 처리에 따른 Purpaid 검사 결과를 나타낸 것이다. Figure 8 shows the Purpaid test results according to lysine, ethanol treatment.
도 9은 리신, 에탄올 처리에 따른 심낭의 Vonkosa 염색결과를 나타낸 것이다. 9 shows the results of Vonkosa staining of the pericardium following treatment with lysine and ethanol.
도 10은 리신, 에탄올 처리에 따른 심낭의 칼슘 정량 결과를 나타낸 것이다. Figure 10 shows the results of quantification of calcium in the pericardium following treatment with lysine and ethanol.
도 11는 무-경판막압력상태 고정를 설명하는 그림 및 사진을 나타낸 것이다. 11 shows a picture and photograph illustrating the fixation of a non-dural valve pressure state.
Claims (13)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020080138505A KR101075399B1 (en) | 2008-12-31 | 2008-12-31 | Production method of heterograft |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020080138505A KR101075399B1 (en) | 2008-12-31 | 2008-12-31 | Production method of heterograft |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20100079908A KR20100079908A (en) | 2010-07-08 |
KR101075399B1 true KR101075399B1 (en) | 2011-10-25 |
Family
ID=42640946
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020080138505A KR101075399B1 (en) | 2008-12-31 | 2008-12-31 | Production method of heterograft |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR101075399B1 (en) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102411248B1 (en) * | 2019-06-21 | 2022-06-21 | 주식회사 에스앤지바이오텍 | Decellularization procedure |
CN118105544A (en) * | 2022-11-30 | 2024-05-31 | 上海微创心通医疗科技有限公司 | Biological tissue material and preparation method and application thereof |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100524082B1 (en) * | 2003-02-05 | 2005-10-27 | 박기동 | Calcification-resistant Bioprosthetic Tissue Implants Coupled Arginine and Method the Same |
KR100739422B1 (en) | 2005-04-26 | 2007-07-13 | 박기동 | Calcification-resistant heparinized acellular bioprosthetic tissue implant and preparation method thereof |
-
2008
- 2008-12-31 KR KR1020080138505A patent/KR101075399B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100524082B1 (en) * | 2003-02-05 | 2005-10-27 | 박기동 | Calcification-resistant Bioprosthetic Tissue Implants Coupled Arginine and Method the Same |
KR100739422B1 (en) | 2005-04-26 | 2007-07-13 | 박기동 | Calcification-resistant heparinized acellular bioprosthetic tissue implant and preparation method thereof |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20100079908A (en) | 2010-07-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Liao et al. | Effects of decellularization on the mechanical and structural properties of the porcine aortic valve leaflet | |
Badylak et al. | Strength over time of a resorbable bioscaffold for body wall repair in a dog model | |
Cartmell et al. | Effect of chemical treatments on tendon cellularity and mechanical properties | |
ES2404033T3 (en) | Chemical cleaning of biological material | |
KR101029887B1 (en) | Method to process porcine cornea for decellularization | |
US7989157B2 (en) | Solution for storing bioprosthetic tissue used in a biological prosthesis | |
US5558875A (en) | Method of preparing collagenous tissue | |
ES2841735T3 (en) | Composite bone implants | |
US20070123700A1 (en) | Processes for removing cells and cell debris from tissue and tissue constructs used in transplantation and tissue reconstruction | |
AU2007321018B2 (en) | Preparation of tissue for meniscal implantation | |
US20210030923A1 (en) | Biological valve material, preparation method and use thereof, and cross-linking agent and use thereof | |
AU2013200822A1 (en) | Improvements Relating to Decellularisation of Tissue Matrices for Bladder Implantation | |
JP2001520542A (en) | Tissue decellularization | |
US9211361B2 (en) | Thin collagen tissue for medical device applications | |
EP3393535B1 (en) | Methods for preparing dry cross-linked tissue | |
KR101217136B1 (en) | Tissues for xenograft and manufacturing method thereof | |
KR101075399B1 (en) | Production method of heterograft | |
JP2016530025A (en) | Method for enzyme treatment of tissue products | |
Iha et al. | Morphological, immunohistological and fibrinolytic features of patch grafts for reconstruction of the inferior vena cava | |
Sembiring et al. | Comparative Assessment of Various Concentration and Exposure Time of Sodium Dodecyl Sulfate as Decellularization Agents for Small-Vessels Vascular Tissue Engineering | |
EP2550029A1 (en) | Thin collagen tissue for medical device applications | |
Vasudev et al. | Covalently bonded heparin to alter the pericardial calcification | |
Sembiring et al. | Comparative Assessment of Various Concentration and Exposure Time of Sodium Dodecyl Sulfate as Decellularization Agents for Small-Vessels Vascular Tissue Engineering. Open Access Maced J Med Sci. 2022 Jun 28; 10 (B): 1-9 | |
Conconi et al. | Biological fate of tissue-engineered porcine valvular conduits xenotransplanted in the sheep thoracic aorta | |
WO2013060103A1 (en) | Method for treating animal-derived collagen fibre materials |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant | ||
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20140929 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20160217 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170825 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180921 Year of fee payment: 8 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20191010 Year of fee payment: 9 |