KR101075030B1

KR101075030B1 - 바이오 칩

Info

Publication number: KR101075030B1
Application number: KR1020090050108A
Authority: KR
Inventors: 김동현; 심은지; 김규정; 최종률
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2009-06-05
Filing date: 2009-06-05
Publication date: 2011-10-21
Also published as: KR20100131291A

Abstract

본 발명의 일 측면에 따른 바이오칩은, 유리 기판; 유리 기판 상에 형성되어 형광 분자를 포함하는 시료를 지지하며, 상부가 나노격자 구조로 된 금속 격자/박막층; 금속 격자/박막층 상에 배치되고, 적어도 하나의 세포 배양 챔버가 형성된 세포 배양용 판 부재; 및 세포 배양용 판 부재 상에 배치되고, 세포 배양 챔버와 연통된 관통 개구가 형성되어 있고, 세포 배양 챔버로 유동체를 공급하기 위해 관통 개구로 연결된 미세 유로가 형성된 미세 유로용 판부재를 포함하며, 금속 격자/박막층은, 금속 박막; 및 금속 박막 상에 형성되어 입사광의 파장보다 작은 일정한 격자 두께(d_g) 및 일정한 격자 주기(A)를 갖는 나노격자 구조로 되어 상기 입사광에 대한 국소 표면 플라즈몬 공명을 발생시키는 금속 격자를 포함할 수 있다.

전반사 형광 현미경

Description

바이오 칩{biochip}

본 발명은 세포 등 생물 샘플(시료)에 대한 광학적 측정 장치로 사용되는 전반사 형광 현미경과 이에 적용될 수 있는 바이오 칩에 관한 것으로, 세포와 같은 생물 샘플에서 세포막 등의 국소 영역에서의 형광 정보를 추출할 수 있는 전반사 형광 현미경의 감도 향상을 위해 표면 플라즈몬 공명의 원리를 이용하여 전반사 형상에서 발생하는 소실파를 국소적으로 최적화 또는 극대화시킬 수 있는 전반사 형광 현미경과, 이러한 소실파의 극대화를 위한 광학적 배치구조를 갖고 전반사 형광 현미경에 적용될 수 있는 바이오 칩에 관한 것이다.

광학적 측정 방법의 하나인 전반사 형광 현미경(total internal reflection fluorescence microscope: TIRF 현미경)은 형광 표지로 표시된 생물 샘플에 대해 전반사각으로 입사시켜 전반사로부터 나오는 소실파로 생물 샘플의 국소 깊이에 대해서 형광 정보를 얻을 수 있다. 이러한 전반사 형광 현미경은 주로 세포 생물학, 의학, 제약 혹은 생화학 분야에서 생체 분자의 형광 관찰의 목적으로 사용되며, 자주 단일 분자 혹은 세포 등 생물 샘플로부터 형광 이미지를 관찰하기 위해 사용된다.

기존의 전반사 형광 현미경은, 샘플로부터 형광을 발생시키는 광학적 배치 구조에 있어서, 시료층과 유리(기판) 사이의 계면에서 입사광을 전반사시키는 것에 의해서 시료층 내의 형광 분자로부터 형광을 발생시키는 기본적인 구성을 갖고 있다. 그러나, 분자 수준 입자 혹은 생물 샘플의 국소 영역의 형광을 관찰하기 위해서는 높은 검출 감도가 요구된다. 따라서, 전반사 형광 현미경에 사용되는 광원으로는, 비교적 높은 강도의 광원이 필요하고, 형광 검출부는 고감도의 CCD 카메라 등이 필요하다. 이러한 고감도 고가의 장비를 사용하더라도 세포 등 생물 샘플의 국소 영역에서의 형광을 정확하게 관찰하기 어려운 경우가 있으며, 이에 따라 전반사 형광 현미경의 검출 감도를 더욱 더 향상시킬 필요가 있다.

본 발명의 일 과제는 세포 등의 시료에 대한 형광 검출 감도를 향상시키고 이를 통해 더 많은 의미있는 생물학적 정보를 얻을 수 있는 전반사 형광 현미경을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 과제는 전반사 형광 현미경에 효과적으로 적용되어 전반사 형광 현미경에 의한 광학적 측정 감도를 향상시킬 수 있는 바이오 칩을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 측면에 따른 전반사 형광 현미경은, 프리즘; 상기 프리즘 상에 형성되어 형광 분자를 포함하는 시료를 지지하며, 상부가 나노격자 구조로 된 금속 격자/박막층; 상기 금속 격자/박막층과 시료와의 계면에서 전반사가 일어나는 입사광을 제공하는 광원부; 및 상기 계면 부근에서 상기 전반사에 의해 나오는 소실파에 의해 발생되는 형광을 검출하는 형광 검출부를 포함한다. 상기 금속 격자/박막층(metal grating/film layer)은, 금속 박막(metal film)과 금속 격자(metal grating)을 갖는다. 상기 금속 격자는 상기 금속 박막 상에 형성되며, 상기 입사광의 파장보다 작은 일정한 격자 두께(d_g) 및 일정한 격자 주기(A)를 갖는 나노격자 구조로 되어 상기 입사광에 대한 국소 표면 플라즈몬 공명을 발생시킨다.

본 발명의 실시형태에 따르면, 상기 금속 격자는 상기 금속 박막 상에서 서로 평행하게 배열된 복수의 스트라이프 형상의 격자 구조를 가질 수 있다. 상기 금속 박막과 금속 격자는 동일한 금속 물질로 형성될 수 있다. 상기 금속 격자/박막층은 은(silver) 또는 금(gold)으로 형성될 수 있다. 상기 광원부는 헬륨-카드뮴 레이저 광원을 사용할 수 있다. 상기 전반사 형광 현미경은 상기 프리즘과 금속 격자/박막층 사이에 배치된 유리 기판을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 실시형태에 따르면, 상기 금속 격자의 격자 두께(d_g)는 10 내지 20 nm이고, 상기 금속 박막의 두께(d_f)는 10 내지 20 nm이고, 상기 금속 격자의 격자 주기(A)는 100 내지 300 nm일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따른 바이오 칩은, 유리 기판; 및 상기 유리 기판 상에 형성되어 형광 분자를 포함하는 시료를 지지하며, 상부가 나노격자 구조로 된 금속 격자/박막층을 포함한다. 상기 금속 격자/박막층은 금속 박막과, 금속 격자를 갖는다. 상기 금속 격자는 상기 금속 박막 상에 형성되며, 상기 입사광의 파장보다 작은 일정한 격자 두께(d_g) 및 일정한 격자 주기(A)를 갖는 나노격자 구조로 되어 상기 입사광에 대한 국소 표면 플라즈몬 공명을 발생시킨다.

본 발명의 실시형태에 따르면, 상기 바이오 칩은, 상기 금속 격자/박막층 상에 배치되고 적어도 하나의 세포 배양 챔버(cell culture chamber)가 형성된 세포 배양용 판 부재; 및 상기 세포 배양용 판 부재 상에 배치되고, 상기 세포 배양 챔버와 연통된 관통 개구가 형성되어 있고, 상기 세포 배양 챔버로 유동체를 공급하기 위해 상기 관통 개구로 연결된 미세 유로(micro-fluidic channel)가 형성된 미세 유로용 판부재를 더 포함할 수 있다.

또한, 상기 바이오 칩은, 상기 유리 기판 아래에 배치된 하부 유리 커버판; 및 상기 미세 유로용 판부재 상에 배치된 상부 유리 커버판을 더 포함할 수 있다. 상기 상부 유리 커버판에는 상기 미세 유로와 연통되어 상기 세포 배양 챔버에 유동체를 공급하기 위한 입구 구멍이 형성되어 있고, 상기 미세 유로와 연통되어 상기 세포 배양 챔버를 통과한 유동체를 배출하기 위한 배출구 구멍이 형성되어 있을 수 있다.

또한, 상기 바이오 칩은, 상기 상부 유리 커버판과 미세 유로용 판부재 사이에 배치된 밀착용 판부재를 더 포함할 수 있다. 상기 밀착용 판부재는 상기 상부 유리 커버판과 미세 유로용 판부재를 서로 밀착시키는 역할을 한다. 상기 밀착용 판부재는 상기 입구 구멍 및 상기 미세 유로와 연통된 구멍과, 상기 배출구 구멍 및 미세 유로와 연통된 구멍을 갖는다.

본 발명에 따르면, 기존 전반사 형광 현미경 시스템에 비하여 높은 형광 검출 감도를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 기존 전반사 형광 현미경의 광원, CCD 카메라 등의 검출부를 변경하지 않고서도 더욱 더 높은 감도의 형광 정보를 얻을 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 실시예들에 따른 전반사 현미경과 바이오 칩은 생물, 생화학, 의학 관련 연구에 효과적으로 사용될 수 있다. 또한 나노격자가 집적된 바이오 칩을 사용하여 높은 측정 감도로써 살아있는 세포 등의 생물 시료에 대한 인-시츄(in-situ) 실험이 실행될 수 있으므로, 랩 온 어 칩(lap-on-a-chip)으로의 효율적인 응용이 가능하다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시형태는 여러 가지의 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로만 한정되는 것은 아니다. 도면에서의 요소들의 형상 및 크기 등은 보다 명확한 설명을 위해 과장될 수 있으며, 도면상의 동일한 부호로 표시되는 요소는 동일한 요소이다.

본 발명의 실시형태에 따르면, 전반사 형광 현미경의 형광 검출 감도를 향상시키기 위해, 표면 플라즈몬 공명의 원리를 이용한 광학 배치 구조에 있어서 전반 사 현상에서 발생하는 소실파를 국소적으로 극대화, 최적화할 수 있는 금속 나노 격자를 샘플(시료)과 프리즘 사이에 배치시킨다. 금속 종류에 따라 광학적인 모델링 및 최적화된 격자 주기와 격자 두께가 RCWA(rigorous coupled wave analysis) 또는 FDTD(finite difference time domain) 시뮬레이션을 통해 계산될 수 있으며, 이를 실험적으로 적용하였을 때에도 형광 검출 감도가 향상됨을 확인하였다. 나노 단위의 격자 주기 및 격자 두께를 형성하기 위해 전자빔 리소그래피 등의 반도체 공정에 이용되는 패터닝 방법이 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시형태에 따른 전반사 형광 현미경을 개략적으로 나타낸 도면이다. 도 1을 참조하면, 전반사 형광 현미경은 광원부(60)로부터 나온 빛(예컨대, 레이저광)이 입사되어 전반사가 이루어지는 광학 배치 구조(50)를 갖는다. 이 광학 배치 구조(50) 상에 세포 등의 생물 샘플과 같은 시료(55)가 실린다. 예를 들어, 442nm 파장의 헬륨-카드뮴 레이저광이 광원부(60)로부터 방출되고 조준 렌즈(collimating lens)와 빔 확장기(beam expander)(62)를 거쳐, 편광기(64)에 의해 p-모드(TM 모드)로 편광된다. 전반사에 필요한 일정한 입사각을 얻기 위해 반사 거울(66)이 사용될 수 있다. 광학 배치 구조(50)의 프리즘(20)으로 입사된 TM 편광된(TM polarized) 레이저광은 유리기판(40)을 거쳐 금속 나노격자(nanograting)(33) 구조가 위에 형성된 금속 박막(31)에서(또는 시료 용액과 유리기판(40) 사이의 계면에서) 전반사되고, 그 계면 부근에서의 근접장(소실파)에 의해 여기되는 형광 입자(시료 중의 형광 입자)로부터 형광이 발생한다. 발생된 형 광은 대물 렌즈(objective lens)(70)와 밴드패스 필터(도시 안함)를 통해 예컨대, CCD 카메라 등을 구비한 형광 검출부(80)에 의해 2차원 이미지 형태로 검출될 수 있다.

프리즘(20)을 통해 금속 박막(31)으로 입사되는 특정 입사각의 입사광을 통해 금속 격자/박막층(33, 31)에서는 표면 플라즈몬 공명이 일어날 수 있다. 특히 광원 파장보다 작은 크기(격자 주기와 격자 두께)를 갖는 금속 나노격자(33) 구조에 의해서, 전반사에서 비롯되는 소실파 혹은 소실 필드(evanescent wave or evanescent field)를 국소적으로 극대화시키고 평균적으로 소실 필드의 증대 효과를 얻을 수 있다. 이로써, 형광의 발생 효율은 극대화되고 세포 등의 생물 샘플 또는 그외 다른 샘플의 검출 감도가 크게 향상될 수 있다.

도 1의 전반사 형광 현미경(10)에 있어서, 프리즘(20)과 유리 기판(40)으로 SF10 기판을 사용할 수 있다. 금속 격자/박막층(33, 31)으로는 은(silver) 또는 금(gold)을 사용할 수 있고, 바람직하게는 은 격자/박막층이 사용될 수 있다. 금속 박막과 금속 격자는 동일 금속 물질로 만들어지는 것이 제조 공정 및 소실 필드 강화 측면에서 유리할 수 있다.

프리즘(20)과 유리 기판(40) 사이에 굴절율 정합 액체 혹은 젤(index matching liquid or gel)을 더 배치함으로써, 프리즘(20과 유리 기판(40) 간의 굴 절율 미스매칭을 정합시키거나 프리즘(20)과 유리 기판(40) 사이에 존재할 수 있는 공기 갭(air gap)에 의한 굴절율 미스매칭을 방지할 수 있다. 상술한 광학 배치 구조(50)에서, 유리 기판(40)을 생략하고, 프리즘(20) 위에 금속 격자/박막층(33, 31)을 직접 증착시킬 수도 있다.

도 2는 본 발명의 실시예에 따라 형광 측정의 감도 향상을 위해 금속 나노 격자를 적용한 광학 배치 구조를 나타낸 단면도이다. 이 광학 배치 구조(50)는 도 1을 참조하여 이미 설명한 바와 같이 그 위에 샘플을 싣고 대물 렌즈(70) 아래 배치되어 레이저광과 같은 조명광의 조사를 받을 수 있으며, 샘플과의 계면에서 임계각 이상의 특정 입사각(θ)으로 입사된 광의 전반사에 의해 표면 플라즈몬 공명을 발생시킬 수 있다. 특히, 전파되는 플라즈몬에 의해 형광 방출이 증대되고, 금속 격자 구조에 의해 형광 방출이 더욱 더 증강된다.

광학 배치 구조(50)는 프리즘(20)과 그 위에 형성된 금속 격자/박막층(30)을 포함한다. 금속 격자/박막층(30)은 일정 두께(d_f)를 갖는 금속 박막(31)과, 금속 격자(33)를 포함한다. 금속 격자(33)는 일정한 격자 두께(d_g) 및 일정한 격자 주기(A)를 갖는 나노격자 구조로 되어 있다. 격자 두께(d_g) 및 격자 주기(A)는 광원부의 광파장 보다 작다. 금속 격자(33)는 금속 박막(31)과 동일한 금속 재료로 형성될 수 있으며, 바람직하게는 은(silver) 또는 금(gold)로 형성되고, 더 바람직하게는 은 으로 형성된다. 이 실시예에서, 금속 격자(33)는 서로 평행하게 배열된 복수의 스트라이프 형상(평면 형상)의 격자 구조를 가지며(도 6 참조), 도 2의 단면도에 나타난 바와 같이 금속 박막(31) 상에서 주기적인 돌출부를 이룬다.

이러한 나노격자 구조를 갖는 금속 격자/박막층(30)을 사용함으로써, 입사광에 대한 국소적인 표면 플라즈몬 공명을 발생시킬 수 있는데, 특히 금속 격자의 엣지 부근에서 플라즈몬이 국부적으로 강하게 국소화되어(localized) 그 부분에서 소실파의 강도(또는 소실 필드의 강도)가 국소적으로 극대화된다. 이는 플라즈몬 여기 효율을 높이고, 주기적으로 배치된 격자의 엣지 부근 위치들에서 소실 필드를 극대화시켜 샘플의 형광 방출 효율을 높이는 역할을 한다.

유리 기판(도 1의 도면부호 40 참조)과 같은 유전체층이 금속 박막(31) 아래에 더 배치될 수 있으나, 이러한 유전체층은 전체 특성에 중요한 영향을 끼치지 않는 것으로 발견된다. 따라서, 도 2에 도시된 바와 같이, 광학 배치 구조(50)에 있어서 부가적인 유리 기판은 생략될 수 있다.

구체적으로 적용되는 재질의 금속 격자/박막층(30)에 대해, 국소 표면 플라즈몬 공명을 위한(또는 전반사 형광 현미경의 검출 감도를 최대로 향상하기 위한) 최적 격자 주기(A), 격자 두께(d_g) 및 금속 박막의 두께(d_f)는 RCWA(Rigorous Coupled Wave Analysis) 또는 FDTD(Finite Difference Time Domain) 시뮬레이션 분석을 통해 계산될 수 있다. 특히, 최적의 금속 박막 두께(d_f)는 FDTD 방법에 의해 계산된 나노격자 구조의 근접장 프로파일로부터 결정될 수 있다. 또한 최적의 격자 두께(dg)와 격자 주기(A)는 RCWA 또는 FDTD에 의해 계산될 수 있다. 실시형태에 따르면, 금속 격자(31)의 격자 두께(d_g)는 10 내지 20 nm이고, 격자 주기(A)는 100 내지 300 nm이며, 금속 박막(33)의 두께(d_f)는 10 내지 20 nm일 수 있다.

도 3은 본 발명의 실시예들에 있어서 광학 배치 구조에 입사되는 광(레이저광)의 입사각에 따른 반사율을 나타내는 그래프이다. 도 3의 그래프는 금 또는 은 격자(33)가 서로 다른 격자 주기(A) 및 격자 두께(d_g)의 나노 격자 구조를 가질 때 전반사에 의한 표면 플라즈몬 여기가 가장 크게 일어나는 입사각을 RCWA 시뮬레이션에 의해 계산할 수 있음을 보여준다. 도 3에 도시된 각각의 반사율 곡선에 있어서, 극소점에서 가장 큰 강도의 소실파가 발생하며 가장 강한 표면 플라즈몬 여기가 발생된다. 도 3의 실시예들에서는, 금속 박막(금속 격자와 동일 금속 물질로 됨)의 두께(d_f)는 모두 10nm이고, 금속 격자의 필 팩터(fill factor)는 67%로 고정되어 있다. 도 3을 참조하면, 20nm의 격자 두께(d_g)와 300nm의 격자 주기(A)를 갖는 은 격자는, d_g=10 이고 A=300nm 인 은 격자에 비하여 공명시 더 작은 반사율(즉, 더 높은 플라즈몬 여기 효율)과 더 큰 최대 소실 필드를 나타낸다. 이와 같이 강화된 국소화에 의해, 소실 필드는 공간적으로 더 불균일하고 국소화된다.

도 4는 다양한 금속 격자/박막층(30)에 대해 FDTD에 의해 계산된 근접장(near-field)의 자기장 세기(magnetic field intensity)를 나타낸 도면으로서, 서로 다른 재질, 격자 주기 및 격자 두께 조건을 갖는 금속 격자/박막층(30)에 대해 전반사 현상에서 비롯된 소실파의 자기장 세기를 보여준다.

도 4(a)는 종래의 TIRF에서와 같이, 금속 격자/박막층(30) 없이 프리즘만 있는 경우, 도 4(b)는 300 nm의 격자 주기(A)와 10 nm의 금속 박막 두께(d_f), 10 nm의 격자 두께(d_g)를 갖는 금 나노 격자가 있는 경우, 도 4(c)는 300 nm의 격자 주기(A)와 10 nm의 금속 박막 두께(d_f), 20 nm의 격자 두께(d_g)를 갖는 금 나노 격자가 있는 경우, 도 4(d)는 100 nm의 격자 주기(A)와 10 nm의 금속 박막 두께(d_f), 10 nm의 격자 두께(d_g)를 갖는 은 나노 격자가 있는 경우, 도 4(e)는 300 nm의 격자 주기(A)와 10 nm의 금속 박막 두께(d_f), 10 nm의 격자 두께(d_g)를 갖는 은 나노 격자가 있는 경우, 도 4(f)는 300 nm의 격자 주기(A)와 10 nm의 금속 박막 두께(d_f), 20 nm의 격자 두께(d_g)를 갖는 은 나노 격자가 있는 경우의 소실파에 의한 자기장의 세기를 나타낸다. 도 4에서, 금속 박막은 금속 격자와 동일 물질이다.

도 4에 도시된 바와 같이, d_g=20 nm, A=300 nm인 은 격자(도 4(f))는 d_g=10 nm, A=300 nm인 은 격자(도 4(e))보다 더 큰 최대 소실 필드를 보이며, 더 강하게 국소화(불균일화)되어 있다. 이는 도 3의 반사율 그래프에서 예측되는 바와 정확히 일치한다. 그러나, d_g=10 nm, A=300 nm인 은 격자(도 4(e))는 최대 필드 위치인 격자 엣지 부근(P1)에서뿐만 아니라 격자 릿지 지점(P2)(즉, 격자 돌출부의 중앙)에서도 상당한 소실 필드의 강화를 보여주고 있다. 실제로 세포 등의 생물 샘플은 실질적으로 격자 릿지부와 양호한 접촉을 이루므로, 최대 필드 위치뿐만 아니라 격자 릿지부에서의 소실 필드 강화도, 최적의 dg 및 A값 결정시 고려하는 것이 바람직하다.

도 5는 FDTD에 의해 계산된 자기장 세기(│Hy│)의 프로파일을 나타낸 그래프이다. 도 5를 참조하면, 같은 격자 주기(300 nm)와 같은 은 박막 두께(10nm), 다른 격자 두께(10 nm와 20 nm)의 은 나노 격자가 있는 경우와 없는 경우의, 소실파 발생 표면 위치(P, P1, P2)으로부터의 y축 방향 거리에 따른 자기장(Hy) 세기의 프로파일이 도시되어 있다.

도 5에서, 곡선 a는 도 4(a)에 도시된 종래의 TIRF 현미경(금속 격자/박막층 없이 프리즘만 있는 경우)에 의한 프로파일로서, 프리즘의 표면에서의 일 위치(P)에서 y축 방향으로의 거리에 따른 자기장 세기를 나타낸다. 곡선 e1은 도 4(e)에 도시된 d_g=10nm, A=300nm의 은 격자의 최대(max) 필드 지점(P1)에서 y축 방향으로의 거리에 따른 자기장 세기를 나타내고, 곡선 e2는 같은 은 격자의 릿지(ridge) 지점(P2)에서 y축 방향 거리에 따른 자기장 세기를 나타낸다. 또한, 곡선 f1 및 f2는 도 4(f)에 도시된 은 격자(d_g=20nm, A=300nm)의 최대(max) 필드 지점(P1) 및 릿지(ridge) 지점(P2)에서 y축 방향으로의 거리에 따른 자기장 세기를 각각 나타낸다.

도 5에 도시된 바와 같이, 은 나노격자가 있는 경우, 격자 릿지 지점(P2)보다 격자 엣지 부근(P1)에서 소실 필드의 자기장 세기가 크다(즉, 소실 필드가 엣지 부근에 국소화됨). 또한, 격자 두께(d_g)가 클수록 최대 필드 지점(P1)에서 더 큰 필드 강화 또는 증대 효과가 나타난다. 즉, 투과 깊이(penetration depth) 범위에서, 곡선 f1(dg=20nm인 경우)은 곡선 e1(dg=10nm인 경우)보다 더 큰 자기장 세기를 나타낸다. 그러나, 격자 두께가 더 큰 경우(dg=20nm)가 곧 최적화 조건을 의미하는 것은 아닌데, 이는 더 강한 국소화(stronger localization)은 필드가 국소화되지 않은 영역(즉, 격자 릿지 부위)에서는 필드를 약화시키기 때문이다. 따라서, 도 5에 도시된 바와 같이 곡선 f2는 곡선 a보다 아래에 위치할 수 있는 것이다. 결국, 나노 격자의 최대 필드 지점(P1)과 릿지 지점(P2)을 포함한 전체적인 고려에서 볼때, 최적의 격자 구조는 dg=10nm, A=300nm인 은 격자구조로 결정될 수 있다.

도 6은 전자 빔 리소그래피를 통해 형성된 격자 두께 10 nm, 은 박막 두께 10 nm, 격자 주기 300 nm의 은 나노 격자의 이미지를 전자주사 현미경(scanning electron microscope)으로 측정한 사진(SEM 사진)이다. 이러한 나노 격자 구조를 형성하기 위해서, 예를 들어, 유리 기판 혹은 프리즘 상에 은(보다 넓게는 금속)을 증착하여 은 박막(31)을 형성한 후, 은 박막(31) 위에 포토레지스트(PR)층을 형성하고, 그 PR층을 전자빔 리소그래피로 패터닝하여 격자 패턴을 정의한다. PR 격자 패턴이 형성된 은 박막(31) 상에 은을 증착한 후, 리프트 오프(lift)에 의해 은 박막(31) 상에 은 격자(33)를 형성할 수 있다.

도 7은 전자 빔 리소그래피를 통해 형성된 격자 두께 10 nm, 은 박막 두께 10 nm, 격자 주기 300 nm의 은 나노 격자의 이미지를 원자간력 현미경(atomic force microscope: AFM)로 측정한 사진이다. 도 7에는, 격자 표면에 흩어져 있는 폴리머 잔여물이 보여진다. 도 6 및 7을 참조하면, 금속 격자/박막층(30)의 금속 격자(33)는 서로 평행하게 배열된 복수의 스트라이프 형상(격자 와이어)의 격자 구조를 가질 수 있다. 도 8은 원자간력 현미경을 통해 측정된 도 7의 이미지 데이터에서 추출한 프로파일이다.

도 9는 종래예에 따라 금속 나노 격자를 적용하지 않은, 프리즘을 사용한 전반사 형광 현미경으로 측정하여 얻은 형광 마이크로비드(지름(φ) = 1.00 μm)의 이미지이다. 도 10은 실시예에 따라 도 9에서의 실험과 동일한 조건(나노 격자 구 조를 제외하고는 동일 조건)에서 격자 두께 10 nm, 은 박막 두께 10 nm, 격자 주기 300 nm의 은 나노 격자 구조를 적용하였을 때, 전반사 형광 현미경으로 측정한 형광 마이크로비드(지름(φ) = 1.00 μm)의 이미지이다. 도 9와 10을 비교하여 살펴보면, 실시예에 따른 금속 나노 격자를 적용한 광학 배치 구조를 이용하였을 때 형광 마이크로비드의 검출 감도가 훨씬 향상되어 있음을 알 수 있다.

도 11은 격자 두께 10 nm, 은 박막 두께 10 nm, 격자 주기 300 nm의 은 나노 격자 구조 위에 배양된 세포의 전자주사 현미경(SEM) 사진이다. 도 12는 도 11의 전자주사 현미경 배율을 확대하여 얻은 SEM 사진이다. 도 11, 12에 나타난 세포는 A431 사람 상피 암세포로서, 도시된 바와 같이 격자 표면에 잘 접촉된 상태를 유지한다. 따라서, 시료가 세포 등의 생물 샘플이더라도, 이러한 시료(세포 등)는 상술한 금속 나노 격자 구조 상에 배양되어 잘 점착될 수 있고, 여러가지 생물 시료의 분석 실험에 유용하게 적용될 수 있음을 알 수 있다.

도 13은 종래예에 따라 금속 나노 격자를 적용하지 않은, 프리즘을 사용한 전반사 형광 현미경으로 A431 세포에 적용된 퀀텀 닷(quantum dot)을 측정하여 얻은 이미지이다. 도 14는 도 13과 동일한 조건에서 본 발명의 실시예에 따라 격자 두께 10 nm, 은 박막 두께 10 nm, 격자 주기 300 nm의 은 나노격자 구조를 적용하였을 때, A431 세포에 적용된 퀀텀 닷을 전반사 형광 현미경으로 측정하여 얻은 이미지이다. 도 13 및 14에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예에 따른 금속 나노 격자 를 적용한 광학 배치 구조를 이용하였을 때 세포의 퀀텀닷 이미지 검출 감도가 훨씬 향상되어 있음을 알 수 있다.

도 15는 본 발명의 실시형태에 따라 형광 측정의 감도 향상을 위해 금속 나노 격자 구조를 적용한 바이오칩의 개략적인 분해 사시도이다. 도 15에 도시된 바와 같은 바이오 칩(100)은, 도 1에 도시된 금속 격자/박막층(33, 31) 위치에 배치되어(즉, 프리즘(20) 상에 배치되어) 전반사 형광 현미경에 적용됨으로써, 바이오 칩(100) 내에 배양된 세포 등의 생물 시료에 대한 다양한 분석과 검사 등 바이오 실험에 유용하게 이용될 수 있다. 입구 구멍(161a)에 연결된 실리콘 튜브와 같은 튜브(161)를 통해 세포 배양 챔버(112)에 배지 용액, 약물 등의 유동체를 공급, 순환시킨 후 유동체 잔여물을 배출구 구멍(162a)에 연결된 튜브(162)를 통해 외부로 배출시킬 수 있다. 이로써, 바이오 칩(100) 내의 세포 배양 챔버(112)에서 세포를 배양하거나 세포에 원하는 약물을 투입하여 여러가지 바이오 실험을 인-시츄로 실행할 수 있어, 이러한 바이어 칩(100)은 랩-온-어-칩(lab-on-a-chip)으로서 유용하게 적용될 수 있다.

도 15를 참조하면, 바이오 칩(100)은 SF10 등으로 된 유리 기판(40)과 그 유리 기판(40) 위에 형성된 상술한 금속 격자/박막층(31, 33)을 포함한다. 금속 격자/박막층(31, 33)은 은 박막과 같은 금속 박막(31)과 금속 격자(33)를 포함하며, 전반사 현미경(10)과 관련하여 이미 설명한 바와 마찬가지이므로 이에 대한 설명은 생략한다.

또한, 바이오 칩(100)은 금속 격자/박막층(33, 31) 상에 배치된 세포 배양용 판부재(102)를 더 포함한다. 이 세포 배양용 판부재(102)는 하나 이상의 세포 배양 챔버(cell culture chamber)(112)가 형성되어 있다. 이 세포 배양 챔버(112)는 판부재(102)를 관통하는 관통홀에 의해 구성되며 세포 배양소로서의 역할을 하여 세포가 함유된 배지 용액이 이 챔버(112)에 공급된다. 챔버(112)에서 노출되는 (즉, 챔버 바로 아래의) 금속 격자 부분에 세포 등의 생물 샘플이 배양되어 점착될 수 있다.

또한, 바이오 칩(100)은 세포 배양용 판부재(102) 상에 배치된 미세 유로용 판부재(104)를 포함할 수 있다. 이 미세 유로용 판부재(104)에는 세포 배양 챔버(112)와 연통된 관통 개구(124)가 형성되어 있고, 세포 배양 챔버(112)로 배지용액 또는 약물 등의 유동체를 공급하기 위해 관통 개구(124)로 연결된 미세 유로(micro-fluidic channel)(114)가 형성되어 있다.

상술한 금속 격자/박막층(33, 31), 세포 배양용 판부재(102) 및 미세 유로용 판부재(104)는 하부 유리 커버판(101)과 상부 유리 커버판(151)에 의해 안정적으로 덮여질 수 있다. 상부 유리 커버판(151)에 결합된 나사(171)를 하부 유리 커버판(101)의 구멍(103)에 체결함으로써, 바이오 칩(100)의 전체 구조가 조립될 수 있 다. 전체 구조 조립시, 개구(124)와 챔버(112)가 서로 연통되도록 판부재들이 정렬되어야 한다.

또한, 부가적으로, 상부 유리 커버판(151)과 미세 유로용 판부재(104) 사이에 밀착용 판부재(106)가 더 배치될 수 있다. 이 밀착용 판부재(106)는 고무 등과 같이 두께방향으로 탄성 혹은 쿠션을 제공하거나 실리콘 고분자 물질과 같이 말랑말랑한 재질로 되어 상부 유리 커버판(151)과 미세 유로용 판부재(104)를 서로 밀착시키는 역할을 한다. 상부 유리 커버판(151)에 형성된 유동체(배지 용액, 약물 등) 공급용 입구 구멍(161a)이 미세 유로의 일 부위(114a)와 연통될 수 있도록, 밀착용 판부재(106)에는 구멍(116a)이 형성되어 있다. 또한, 상부 유리 커버판(151)에 형성된 유동체(순환되어 나오는 배지 용액, 약물의 잔여물 등) 배출용 배출구 구멍(162a)이 미세 유로의 일부위(114b)와 연통되도록, 밀착용 판부재(106)에는 또하나의 구멍(116b)이 형성되어 있다. 따라서, 튜브(161)를 통해 유동체가 입구 구멍(161a)으로 들어가면, 이 유동체는 밀착용 판부재(106)의 구멍(116a)을 통해 미세 유로의 일부위(114a)로 가서 미세 유로(114)를 통해 갈라지고 각각의 관통 개구(124)로 들어가서 세포 배양 챔버(112)로 공급된다. 세포 배양 챔버(112)에서 사용되고 남은 잔여 유동체는 관통 개구(124), 구멍(116b), 배출구 구멍(162a) 및 튜브(162)를 통해 외부로 빠져 나가게 된다.

상술한 바와 같이 금속 격자/박막층(33, 31)를 이용함으로써, 바이오 칩(100) 내에 배양된 세포는, 전반사 형광 현미경을 통해 보다 높은 검출감도로 검출, 관찰될 수 있다.

본 발명은 상술한 실시형태 및 첨부된 도면에 의해 한정되지 아니한다. 첨부된 청구범위에 의해 권리범위를 한정하고자 하며, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 형태의 치환, 변형 및 변경이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

도 1은 본 발명의 실시형태에 따른 전반사 형광 현미경을 개략적으로 나타낸 도면이다.

도 2는 도 1의 전반사 형광 현미경에 적용될 수 있는 금속 나노 격자 구조를 포함하는 주요 부분으로서, 표면 플라즈몬 공명을 발생시키기 위한 광학 배치 구조를 나타낸 단면도이다.

도 3은 본 발명의 실시예들에 있어서 광학 배치 구조에 입사되는 광(레이저광)의 입사각에 따른 반사율을 나타내는 그래프이다.

도 4는 서로 다른 재질, 주기 및 두께 조건을 갖는 금속 나노 격자에 대해 전반사 현상에서 비롯한 소실파의 자기장 세기를 보여주는 도면이다.

도 5는 같은 격자 주기와 같은 베이스부 두께 및 다른 격자 두께를 갖는 은 나노 격자가 구비된 경우와 구비되지 않은 경우에 있어서, 소실파 발생 표면으로부터의 거리에 따른 자기장 세기의 프로파일을 나타낸 그래프이다.

도 6은 본 발명의 실시예에 따른 나노 격자 구조의 전자주사 현미경(scanning electron microscopy) 사진이다.

도 7은 본 발명의 실시예에 따른 나노 격자 구조의 원자간력 현미경(atomic force microscopy) 사진이다.

도 8은 도 7의 원자간력 현미경 사진 데이터로부터 추출한 프로파일을 나타낸 그래프이다.

도 9는 종래예의 전반사 현미경으로 측정한 형광 마이크로비드를 나타낸 사 진이다.

도 10은 본 발명의 실시예에 따른 전반사 현미경으로 측정한 형광 마이크로비드를 나타낸 사진이다.

도 11은 본 발명의 실시예에 따라 은 나노 격자 위에 배양된 세포의 전자주사 현미경 사진이다.

도 12는 도 11의 사진의 측정 배율을 확대한 사진이다.

도 13은 A431 세포에 적용된 퀀텀 닷(quantum dot)을 종래예에 따른 전반사 형광 현미경으로 측정하여 얻은 사진이다.

도 14는 A431 세포에 적용된 퀀텀 닷을 본 발명의 실시예에 따른 전반사 형광 현미경으로 측정하여 얻은 사진이다.

도 15는 본 발명의 실시예에 따른 금속 나노 격자 구조를 적용한 바이오 칩을 나타낸 분해 사시도이다.

<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>

20: 프리즘 30: 금속 격자/박막층

31: 금속 박막 33: 금속 격자

50: 광학 배치 구조 55: 샘플(시료)

60: 광원부 62: 빔 확장기

64: 편광기 66: 반사 거울

70: 대물 렌즈(objective lens) 80: 형광 검출부

Claims

삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
유리 기판;

상기 유리 기판 상에 형성되어 형광 분자를 포함하는 시료를 지지하며, 상부가 나노격자 구조로 된 금속 격자/박막층;

상기 금속 격자/박막층 상에 배치되고, 적어도 하나의 세포 배양 챔버가 형성된 세포 배양용 판 부재; 및

상기 세포 배양용 판 부재 상에 배치되고, 상기 세포 배양 챔버와 연통된 관통 개구가 형성되어 있고, 상기 세포 배양 챔버로 유동체를 공급하기 위해 상기 관통 개구로 연결된 미세 유로가 형성된 미세 유로용 판부재를 포함하며,

상기 금속 격자/박막층은,

금속 박막; 및

상기 금속 박막 상에 형성되어 입사광의 파장보다 작은 일정한 격자 두께(d_g) 및 일정한 격자 주기(A)를 갖는 나노격자 구조로 되어 상기 입사광에 대한 국소 표면 플라즈몬 공명을 발생시키는 금속 격자를 갖는 것을 특징으로 하는 바이오 칩.
제8항에 있어서,

상기 금속 격자는 상기 금속 박막 상에서 서로 평행하게 배열된 복수의 스트라이프 형상의 격자 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 바이오 칩.
제8항에 있어서,

상기 금속 박막과 금속 격자는 동일한 금속 물질로 형성된 것을 특징으로 하는 바이오 칩.
제8항에 있어서,

상기 금속 격자/박막층은 은 또는 금으로 형성된 것을 특징으로 하는 바이오 칩.
제8항에 있어서,

상기 금속 격자의 격자 두께(d_g)는 10 내지 20 nm이고, 상기 금속 박막의 두 께(d_f)는 10 내지 20 nm이고, 상기 금속 격자의 격자 주기(A)는 100 내지 300 nm인 것을 특징으로 하는 바이오 칩.
삭제
제8항에 있어서,

상기 유리 기판 아래에 배치된 하부 유리 커버판; 및

상기 미세 유로용 판부재 상에 배치된 상부 유리 커버판을 더 포함하고,

상기 상부 유리 커버판에는 상기 미세 유로와 연통되어 상기 세포 배양 챔버에 유동체를 공급하기 위한 입구 구멍이 형성되어 있고, 상기 미세 유로와 연통되어 상기 세포 배양 챔버를 통과한 유동체를 배출하기 위한 배출구 구멍이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오 칩.
제14항에 있어서,

상기 상부 유리 커버판과 미세 유로용 판부재 사이에 배치된 밀착용 판부재를 더 포함하되, 상기 밀착용 판부재는 상기 상부 유리 커버판과 미세 유로용 판부재를 서로 밀착시키는 역할을 하며, 상기 밀착용 판부재는 상기 입구 구멍 및 상기 미세 유로와 연통된 구멍과, 상기 배출구 구멍 및 미세 유로와 연통된 구멍을 갖는 것을 특징으로 하는 바이오 칩.