KR101071449B1

KR101071449B1 - 병원균 검침을 위한 디엔에이 추출용 바이오칩 및 그것을 이용한 디엔에이 추출방법

Info

Publication number: KR101071449B1
Application number: KR1020080110685A
Authority: KR
Inventors: 정효일; 이창근; 윤두학; 정일정
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2008-11-07
Filing date: 2008-11-07
Publication date: 2011-10-10
Also published as: KR20100051497A

Abstract

본 발명은 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 바이오칩 및 그것을 이용한 DNA 추출방법에 관한 것으로, 미세 유로 형태의 마이크로칩 PCR 과의 연계성을 높이고 구조의 단순화 및 제작을 용이하게 하기 위한 것이다.

이를 위하여 본 발명은 시료와 혼합물 사이의 혼합을 유도하는 미세채널이 형성된 바이오칩에 있어서, 상기 미세채널로 구성되며, 시료 용해용 버퍼와 DNA 검출용 비드가 혼합된 제1 혼합물과 시료와의 혼합을 유도하여 비드-DNA 결합체와 폐기물로 이루어진 제2 혼합물을 생성하는 마이크로 믹서부; 상기 미세채널의 후단부에 연설되며, 상기 마이크로 믹서부를 통해 생성된 제2 혼합물로부터 비드-DNA 결합체와 폐기물을 분리하는 마이크로 분리부;를 구비한, 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 바이오 칩을 제공하여, μ-TAS를 용이하게 구축할 수 있도록 하고, 순수한 DNA의 쉽고 빠른 획득을 필요로 하는 기업체 또는 기관의 실험실에서 효율적으로 사용할 수 있게 한다.

DNA 추출, 마이크로 믹서, 마이크로 분리, 자기비드, 자기포레시스

Description

병원균 검침을 위한 디엔에이 추출용 바이오칩 및 그것을 이용한 디엔에이 추출방법{DNA extraction biochip for pathogen detection}

본 발명은 DNA 추출용 바이오칩에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 박테리아시료와 그 시료용해용 버퍼들을 효과적으로 혼합하여 용해하고, 그 용해된 혼합물로부터 박테리아 시료의 DNA를 효율적으로 분리하고 추출할 수 있는 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 바이오칩 및 그것을 이용한 DNA 추출방법에 관한 것이다.

일반적으로 DNA의 추출, 증폭과 동정은 질병의 진단이나 유전병의 조기 진단, 범죄자의 확인, 한우의 판별, 혹은 친자 확인 등에서 널리 쓰이는 기술이다. 하지만 DNA를 다루는 일은 그 절차가 어렵고 복잡하여 전문 인력이 필요하고, 많은 시간이 소요된다. 이러한 어려움을 해결하기 위한 마이크로 PCR칩에 대한 연구는 오래 전부터 수행되어 왔고 기술이 날로 향상되어 가고 있다.

하지만 유전자(Polymerase Chain Reaction) 증폭기와 연계되는 DNA 추출용 마이크로 칩의 연구는 아직 미미한 실정이다.

특히 기존의 마이크로칩으로 개발된 증폭기, 검침기와 통합되어 μ-TAS (micro total analysis system)를 구축할 수 있는 DNA 추출용 마이크로칩의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는, PDMS 칩의 내부에 미세 유로 형태로 채널을 구성함으로써 미세 유로 형태의 마이크로칩 PCR 과의 연계성을 높일 수 있도록 하여, μ-TAS를 용이하게 구축할 수 있는, 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 바이오칩 및 그것을 이용한 DNA 추출방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 기술적 과제는, 구조의 단순화 및 제작의 용이성을 통해 가격 경쟁력을 높일 수 있으며, 따라서 순수한 DNA의 쉽고 빠른 획득을 필요로 하는 기업체 또는 기관의 실험실에서 효율적으로 사용할 수 있는, 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 바이오칩 및 그것을 이용한 DNA 추출방법을 제공하고자 하는 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시 형태에 따르면, 시료와 혼합물 사이의 혼합을 유도하는 미세채널이 형성된 바이오칩에 있어서, 상기 미세채널로 구성되며, 시료 용해용 버퍼와 DNA 검출용 비드가 혼합된 제1 혼합물과 시료와의 혼합을 유도하여 비드-DNA 결합체와 폐기물로 이루어진 제2 혼합물을 생성하는 마이크로 믹서부; 상기 미세채널의 후단부에 연설되며, 상기 마이크로 믹서부를 통해 생성된 제2 혼합물로부터 비드-DNA 결합체와 폐기물을 분리하는 마이크로 분리부;를 구비한, 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 바이오 칩이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 실시 형태에 따르면, 시료와 혼합물 사이의 혼합을 유도하는 미세채널이 형성된 바이오칩에 있어서, 제1 미세채널로 형성되며, 시료와 시료 용해용 버퍼와의 혼합을 유도하여 DNA와 폐기물로 이루어지는 제3 혼합물을 생성하는 제1 마이크로 믹서부; 상기 제1 미세채널의 후단부에 연설되는 제2 미세채널로 형성되며, DNA 검출용 비드 주입을 위한 주입구가 상기 제2 미세채널의 전단부로 관입되어 형성되고, 상기 제3혼합물과 DNA 검출용 비드와의 혼합을 유도하여 비드-DNA 결합체와 폐기물로 이루어지는 제4 혼합물을 생성하는 제2 마이크로 믹서부; 상기 제2 미세채널의 후단부에 연설되며, 상기 제2 마이크로 믹서부를 통해 생성된 제4 혼합물로부터 비드-DNA 결합체와 폐기물을 분리하는 마이크로 분리부;를 구비한, 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 바이오 칩이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 실시 형태에 따르면, 시료와 혼합물 사이의 혼합을 유도하는 미세채널이 형성된 바이오칩을 이용한 DNA 추출방법에 있어서, (a1) 시료 용해용 버퍼와 DNA 검출용 비드가 혼합된 제1 혼합물과 시료를 상기 미세채널에 주입하고, 상기 미세채널의 유로를 통한 제1 혼합물과 시료와의 혼합을 유도하여, 비드-DNA 결합체와 폐기물로 이루어진 제2 혼합물을 생성하는 단계; (a2) 상기 제2 혼합물로부터 비드-DNA 결합체와 폐기물을 각각 분리하는 단계;로 이루어지는, 바이오칩을 이용한 DNA 추출방법이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 실시 형태에 따르면, 시료와 혼합물 사이의 혼합을 유도하는 제1 미세채널과 제2 미세채널이 연설된 바이오 칩을 이용한 DNA 추출방법에 있어서, (b1) 상기 제1 미세채널에 시료와 시료 용해용 버퍼를 주입하고, 제1 미세채널의 유로를 통한 시료와 시료 용해용 버퍼와의 혼합을 유도하여, DNA와 폐기물로 이루어진 제3 혼합물을 생성하는 단계; (b2) 상기 제2 미세채널의 전단부에 DNA 검출용 비드를 주입하고, 상기 제2 미세채널의 유로를 통한 제3 혼합물과 DNA 검출용 비드와의 혼합을 유도하여, 비드-DNA 결합체와 폐기물로 이루어지는 제4 혼합물을 생성하는 단계; (b3) 상기 제4 혼합물로부터 비드-DNA 결합체와 폐기물을 각각 분리하는 단계;로 이루어지는, 바이오칩을 이용한 DNA 추출방법이다.

본 발명에 의하면, 미세 유로 형태를 구성하고 있기 때문에 미세 유로 형태의 마이크로칩 PCR 과의 연계성이 우수하여μ-TAS를 용이하게 구축할 수 있는 이점이 있다.

또한 본 발명에 의하면, 구조가 단순하고, 제작이 용이하게 되므로 생산성과 제작비용의 절감 면에서 우수한 이점이 있으며, 따라서 본 발명에 의한 바이오칩은 순수한 DNA의 쉽고 빠른 획득을 필요로 하는 기업체 또는 기관의 실험실에서 중요한 역할을 할 것으로 기대된다.

이하, 본 발명에 의한 바람직한 실시예를 첨부 도면을 참조하면서 상세히 설명한다. 또한, 본 실시예는 본 발명의 권리범위를 한정하는 것은 아니고 단지 예시로 제시된 것이며, 그 기술적 요지를 이탈하지 않는 범위 내에서 다양한 변경이 가 능하다.

도 1은 본 발명의 일 실시 형태에 따른 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 바이오 칩의 사시도로서, 본 발명에 의한 바이오칩은 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane)(이하, 'PDMS'라 함) 칩(100)으로 구성된다.

PDMS 칩(100)은 투명 판재로 이루어지며, 그 판재의 내부에 미세채널(111)이 형성되는 마이크로 믹서부(110)와, 상기 미세채널의 후단부에 연설되는 마이크로 분리부(120)로 구분된다.

마이크로 믹서부(110)는 시료 용해용 버퍼와 DNA 검출용 비드가 혼합된 제1 혼합물과 시료와의 혼합을 유도하여 비드-DNA 결합체와 폐기물로 이루어진 제2 혼합물을 생성하는 부분으로서, 이 마이크로 믹서부(110)에는 상기 미세 채널(111)에 시료 용해용 버퍼와 DNA 검출용 비드가 혼합된 제1 혼합물과 시료를 각각 주입할 수 있는 다수의 주입구(111a,111b)가 형성된다. 이때 상기 각각의 주입구(111a,111b)는 상기 미세 채널(111)의 전단부에서 연통되게 형성한다.

상기 미세 채널에 주입되는 DNA 검출용 비드는, 자기 비드(magnetic bead)에 실리카(silica)를 코팅하여 형성한, 실리카 코팅된 자기비드인 것을 사용한다.

또한 이러한 마이크로 믹서부(110)는 상기 미세 채널(111)의 중앙부에 요철부(112)를 형성하여, 상기 제1 혼합물과 시료가 혼합된 제2혼합물이 통과되는 유로의 전체 길이를 연장함으로써 혼합 효율을 높인다.

마이크로 분리부(120)는 상기 미세 채널(111)의 후단부에 연설되며, 상기 마이크로 믹서부(110)를 통해 생성된 제2 혼합물로부터 비드-DNA 결합체와 폐기물을 분리한다. 이를 위해 마이크로 분리부(120)는 DNA-비드 결합체 및 폐기물을 각각 분리하여 배출하기 위한 각각의 배출구(121b,121c)를 상기 유로로부터 분기시켜 형성한다. 또한 이 마이크로 분리부(120)는 증류수 주입을 위해 시스플로(sheath flow) 주입구(121a)가 형성되며, 이 시스플로 주입구(121a)는 상기 미세 채널(111)의 후단부로 관입되어 형성된다.

또한 상기 마이크로 분리부(120)는 상기 미세 채널에서 연설된 유로의 측면에, 상기 DNA-비드 결합체의 분리를 유도하는 DNA 유도부재(122)가 설치된다. 이 DNA 유도부재(122)는 영구자석으로 구성하여, 상기 제2 혼합물이 통과되는 유로에 자기장을 형성할 수 있도록 함으로써 유로를 흐르는 DNA-비드 결합체를 일측으로 쏠릴 수 있게 한다. 특히 이 DNA 유도부재(122)는 상기 유로 상에서 상기 각 배출구(121b,121c)의 분기 지점보다 앞쪽에, 그리고 DNA-비드 결합체가 배출되는 배출구(121b)측에 위치되도록 하여, DNA-비드 결합체를 폐기물로부터 효율적으로 분리하고 배출할 수 있게 한다.

도 2는 본 발명의 일 실시 형태에 의한 바이오칩을 이용하여 DNA를 추출하는 방법을 예시한 흐름도로서, 이러한 본 발명의 일 실시 형태에 따른 DNA 추출방법은, 도 1과 같은 미세채널(111)이 형성된 PDMS 바이오칩(100)에 의해 이루어진다.

본 발명의 일 실시 형태에 의한 DNA 추출방법은, DNA 검출용 비드를 주입하기 이전에 자기 비드(magnetic bead)에 실리카 코팅을 실시하는 단계(S101)와, 시료 용해용 버퍼와 DNA 검출용 비드를 혼합하여 시료 용해용 버퍼와 DNA 검출용 비드가 혼합된 제1 혼합물을 생성하는 단계(S103)와, 적어도 1회 이상 구부러진 미세 채널(111)에 상기 제1 혼합물과 시료를 주입하여 혼합을 통해 비드-DNA 결합체와 폐기물로 이루어진 제2 혼합물을 생성하는 단계(S105)와, 상기 제2 혼합물에 시스플로를 통해 증류수를 주입하여 제2 혼합물의 농도를 희석시키는 단계(S107)와, 상기 제2 혼합물이 통과되는 유로의 측면에 자기장을 형성하여 비드-DNA 결합체를 일측으로 유도함으로써 상기 제2 혼합물로부터 분리된 비드-DNA 결합체를 폐기물과 구분하여 각각의 배출구를 통해 배출하는 단계(S109)로 이루어진다.

도 3은 본 발명의 다른 실시 형태에 따른 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 바이오 칩의 사시도로서, 이 실시예에 의한 바이오칩은 투명 판재로 이루어진 PDMS 칩의 제1 미세채널(211)과 제2 미세채널(221)이 각각 형성되는 제1마이크로 믹서부(210)와 제2 마이크로 믹서부(220), 상기 제2 미세채널의 후단부에 연설되는 마이크로 분리부(230)로 구분된다.

제1 마이크로 믹서부(210)는 시료와 시료 용해용 버퍼와의 혼합을 유도하여 DNA와 폐기물로 이루어지는 제3 혼합물을 생성하는 부분으로서, 이 마이크로 믹서부(210)에는 상기 제1 미세채널(211)에 시료와 시료 용해용 버퍼를 각각 주입할 수 있는 다수의 주입구(211a,211b)가 형성된다. 이때 상기 각각의 주입구(211a,211b)는 상기 제1 미세 채널(211)의 전단부에서 연통되게 형성한다.

제2 마이크로 믹서부(220)는 상기 제3혼합물과 DNA 검출용 비드와의 혼합을 유도하여 비드-DNA 결합체와 폐기물로 이루어지는 제4 혼합물을 생성하는 부분으로서, 상기 제1 미세채널(211)의 후단부에 연설되는 제2 미세채널(221)로 형성되며, DNA 검출용 비드 주입을 위한 주입구(221a)가 상기 제2 미세채널(221)의 전단부로 관입되어 형성된다. 이때 상기 제2 미세채널(221)에 주입되는 DNA 검출용 비드도 상술된 바와 마찬가지로 자기 비드(magnetic bead)에 실리카(silica)를 코팅하여 형성한, 실리카 코팅된 자기비드인 것을 사용한다.

또한 이러한 제1 마이크로 믹서부(210)와 제2 마이크로 믹서부(220)는 상기 제1 미세 채널(211) 및 제2 미세 채널(221)의 각 중앙부에 요철부(212,222)를 형성하여, 시료와 시료 용해용 버퍼가 혼합된 제3 혼합물, 또는 제3 혼합물과 실리카 코팅된 DNA 검출용 비드가 혼합된 제4 혼합물이 통과되는 유로의 전체 길이를 연장함으로써 혼합 효율을 높인다.

마이크로 분리부(230)는 상기 제2 미세채널(221)의 후단부에 연설되며, 상기 제2 마이크로 믹서부(220)를 통해 생성된 제4 혼합물로부터 비드-DNA 결합체와 폐기물을 분리한다. 상술한 바와 마찬가지로 이 마이크로 분리부(230)도 DNA-비드 결합체 및 폐기물을 각각 분리하여 배출하기 위한 각각의 배출구(231a,231b)를 상기 유로로부터 분기시켜 형성한다. 또한 상기 마이크로 분리부(230)는 상기 제2 미세채널에서 연설된 유로의 측면에, 상기 DNA-비드 결합체의 분리를 유도하는 DNA 유도부재(232)가 설치된다. 이 DNA 유도부재(232)는 영구자석으로 구성하여, 상기 제4 혼합물이 통과되는 유로에 자기장을 형성할 수 있도록 함으로써 유로를 흐르는 DNA-비드 결합체를 일측으로 쏠릴 수 있게 한다. 특히 이 DNA 유도부재(232)도 상술한 바와 마찬가지로 상기 유로 상에서 상기 각 배출구(231a,231b)의 분기 지점보다 앞쪽에, 그리고 DNA-비드 결합체가 배출되는 배출구(231a)측에 위치되도록 하여, DNA-비드 결합체를 폐기물로부터 효율적으로 분리하고 배출할 수 있게 한다.

도 4는 본 발명의 다른 실시 형태에 의한 바이오칩을 이용하여 DNA를 추출하는 방법을 예시한 흐름도로서, 이러한 본 발명의 다른 실시 형태에 따른 DNA 추출방법은, 도 3과 같은 제1 미세채널(211) 및 제2 미세채널(221)이 연설된 PDMS 바이오칩(200)에 의해 이루어진다.

본 발명의 다른 실시 형태에 의한 DNA 추출방법은, DNA 검출용 비드를 주입하기 이전에 자기 비드(magnetic bead)에 실리카 코팅을 실시하는 단계(S201)와, 적어도 1회 이상 구부러진 상기 제1 미세채널(211)에 시료와 시료 용해용 버퍼를 주입하여 제1 미세채널의 유로를 통한 시료와 시료 용해용 버퍼와의 혼합으로, DNA와 폐기물로 이루어진 제3 혼합물을 생성하는 단계(S203)와, 적어도 1회 이상 구부러진 상기 제2 미세채널(221)의 전단부에 상기 실리카 코팅된 DNA 검출용 비드를 주입하여 상기 제2 미세채널의 유로를 통한 제3 혼합물과 DNA 검출용 비드와의 혼합으로, 비드-DNA 결합체와 폐기물로 이루어지는 제4 혼합물을 생성하는 단계(S205)와, 상기 제4 혼합물이 통과되는 유로의 측면에 자기장을 형성하여 비드-DNA 결합체를 일측으로 유도함으로써 상기 제4 혼합물로부터 분리된 비드-DNA 결합체를 폐기물과 구분하여 각각의 배출구를 통해 배출하는 단계(S207)로 이루어진다.

도 5는 본 발명의 일 실시 형태에 의한 바이오칩에서 실리카 코팅된 자기비드에 DNA가 결합되는 과정을 예시한 개략도이다.

도 5에 도시된 바와 같이, DNA 검출용 자기비드에 코팅된 실리카와, 시료로부터 분리된 DNA 중추(backbone)는 그 표면에 음(-)전하를 띄고 있게 되므로, 나트 륨이온(Na⁺)이 녹아있는 용액에, DNA 검출용 자기비드에 코팅된 실리카와 DNA 중추가 첨가되는 경우 나트륨이온(Na⁺)이 브리지역할을 하여 양쪽에 DNA 검출용 자기비드에 코팅된 실리카와 DNA 중추를 붙이게 되는 과정이 예시되어 있다. 즉 나트륨 이온(Na⁺)이 포함된 혼합물 용액 내에서는 실리카가 코팅된 DNA 검출용 자기비드와 DNA가 서로 결합할 수 있게 된다.

도 6은 본 발명의 일 실시 형태에 의한 바이오칩에서 자기비드-DNA 결합체를 폐기물로부터 분리하는 과정을 예시한 개략도로서, 마이크로 믹서부(110)를 통하여 생성된 비드-DNA 결합체를 각종 폐기물(debris, lysis buffer 등)로부터 분리하기 위한 부분을 발췌하여 예시하고 있다.

도 6에 도시된 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 마이크로 분리부(120)는 자기포레시스(magnetophoresis)를 이용해 비드-DNA 결합체와 폐기물을 분리한다. 이 마이크로 분리부(120)에는 마이크로 믹서부(110)와 연결된 유로 외에 시스플로(sheath flow)를 제공하기 위한 유로와 그에 연결되는 시스플로 주입구가 하나 더 존재한다. 본 발명의 일 실시 형태에 따른 마이크로 분리부(120)에서는 이 시스플로 주입구와 유로를 통해 증류수를 주입하고, 아울러 DNA 유도부재(122)인 영구자석을 이용하여 유로에 자기장을 인가함으로써, 상기 DNA 중추와 결합된 자기비드는 그 진행 방향을 바꾸어 도면상의 아래쪽 배출구(121b) 방향으로 진행하게 되며, 반면에 그 외의 불순물들은 모두 도면상의 위쪽 배출구(121c) 방향으로 흐르게 된다. 이로 인해 아래쪽 배출구(121b)에서는 폐기물로부터 분리된, 정제된 비드-DNA 결합체를 성공적으로 얻어낼 수 있게 된다.

이하에서는 본 발명의 일 실시 형에 따른 바이오칩을 이용하여 실시한 실험예를 설명한다.

<실험예>

본 실험예에서는 먼저, 총 길이 4cm인 PDMS 칩의 내부에 폭이 200㎛, 깊이가 100㎛이고, 왕복으로 3회 구부러진 사문양의 미세 채널을 형성하고 이 채널을 연장하여 마이크로 믹서부(110)와 마이크로 분리부(120)를 연달아 구성하고, 마이크로 믹서부(110)의 주입구(111a,111b)를 통해 엘피스 바이오텍에서 제작된 지름 1㎕ 크기의 자기비드와 Bioneer에서 구입한 시료 용해용 버퍼 그리고 박테리아 샘플(24시간 동안 배양된 E. coli)을 주입하였다

마이크로 믹서부(110)에 시료를 주입하기 위해서는 1㎖ 시린지(Medi-hut international co.)와 시린지 펌프(CMA/micro dialysis co.)를 사용하였으며, 사문양(Serpentine) 형태의 유로가 발생시키는 혼탁한 흐름(chaotic flow)이 이들을 효과적으로 혼합하였다. 시료 용해용 버퍼는 박테리아 샘플과 섞이며 박테리아의 용해를 유도하였다. 용해된 박테리아는 DNA와 그 외의 부분인 부스러기로 나누어졌으며, 유로를 진행하면서 DNA, 부스러기, 시료 용해용 버퍼, 자기비드는 지속적으로 섞였다.

마이크로 분리부(120)에서는 시스플로를 통해 증류수가 유입되었고, 바로 그 후단에서 이 유로에 자기장을 걸어 주어 마이크로 믹서부(110)에서 결합된 비드-DNA 결합체의 진행 방향을 바꾸도록 하였다. 그 결과 비드-DNA 결합체는 배출 구(121b)로 진행하고, 그 외의 불순물들은 나머지 다른 배출구(121c) 방향으로 흐르게 되었다. 따라서 폐기물이 걸러진, 정제된 비드-DNA 결합체를 성공적으로 얻어낼 수 있었다.

도 7 내지 도 10은 상기 실험예에서 얻은 결과를 예시한 참고도들이다.

도 7은 미세채널의 유로를 진행함에 따라 시료 용해용 버퍼에 의해 박테리아가 파괴되는 과정을 현미경으로 촬영한 참고사진으로서, 도 7에 예시된 바와 같이, 마이크로 믹서부(110)의 효율은 유입되는 시료들의 유량에 따라 다르게 나타남을 알 수 있었다. 본 실험에서는 최적의 유량 조건을 찾기 위하여 유입되는 E. coli와 시료 용해용 버퍼(lysis buffer)의 유량을 1㎕/min 에서 4㎕/min 까지 변화시켜 보았다. E. coli는 관찰이 용이할 수 있도록 Bacterial viability kit(Molecular probes co.)로 염색하였다. 염색된 E. coli는 살아있을 때에만 형광빛을 발하므로, 유로를 진행함에 따라 lysis buffer에 의해 파괴되고 형광색을 잃게 되는 것을 알 수 있다.

도 7에 의하면, 주입구로부터 유로의 거리에 따라 형광색이 줄어드는 정도를 측정할 수 있을 것이며, 처음 유입시 염색된 E. coli solution의 너비를 a, 입구로부터 일정거리에서의 너비를 b라 하면, 마이크로 믹서부(110)의 효율(e)은 아래의 수학식 1과 같이 산출할 수 있게 된다.

e = {(a-b)/a}×100%

도 8은 E.coli(Escherichia coli)와 시료 용해용 버퍼의 유입 유량별, 주입 구로부터의 거리에 따른 용해 효율을 도식화한 그래프로서, E. coli 와 lysis buffer의 유입 유량을 1㎕/min 에서 4㎕/min 까지 변화시키며 얻어낸 용해 효율을 나타낸다. 그래프상에서 x축은 유로의 주입구에서부터의 거리를 의미하고, y축은 용해 효율을 의미한다. 도 8에 예시된 바와 같이 박테리아 샘플이 유로를 진행함에 따라 점점 용해됨을 알 수 있다. 특히 유량이 1㎕/min, 2㎕/min 일 때 유로의 끝부분에서 박테리아 샘플이 대부분 용해되는 것을 관찰할 수 있었으며, 따라서 최적의 유량을 결정할 수 있었다.

도 9a와 도 9b는 본 발명의 일 실시형태에 따른 바이오칩의 마이크로 분리부에 자기장이 작용하지 않을 때(도 9a)와 자기장이 작용할 때(도 9b)를 각각 구분하여 현미경으로 촬영한 참고사진이고, 도 10은 미세 채널과 자석과의 거리에 따른 용해 효율을 도식화한 그래프로서, 자기포레시스(Magnetophoresis)를 효과적으로 구현하기 위하여 자석과 유로의 거리에 대한 최적 조건을 얻고자 현미경으로 자기비드의 움직임을 관찰하였다. 마이크로 분리부(120)에 자석을 이용하여 자기장을 인가하지 않았을 때에는 도 9a에 도시된 바와 같이 대부분의 자기 비드가 폐기물 배출을 위한 배출구(121c)(waste) 측으로 진행함을 관찰할 수 있었다. 또한 자석을 이용하여 자기장 생성시 자기비드가 효과적으로 그 진행방향을 바꾸어 비드-DNA 결합체 배출을 위한 배출구(121b)(DNA+bead)로 진행함이 관찰되었다.

그러나 자석과 유로의 거리가 멀 때에는 자기비드 중 많은 수가 폐기물 배출을 위한 배출구(121c)로 진행하였고, 또 짧을 때에는 많은 수의 자기비드가 유로 벽면에 부착해 버리는 현상이 관찰되었다. 이러한 문제를 해결하기 위해서 자석과 유로의 거리를 적절히 조절하는 것이 중요할 것이다. 자석과 유로의 거리에 따른 자기비드의 분리(sorting) 효율을 산출해낸 결과는 도 10과 같이 그 거리가 1.5㎜ 일 때에 가장 효율이 높은 것을 알 수 있었다.

도 1은 본 발명의 일 실시 형태에 따른 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 바이오 칩의 사시도이다.

도 2는 본 발명의 일 실시 형태에 의한 바이오칩을 이용하여 DNA를 추출하는 방법을 예시한 흐름도이다.

도 3은 본 발명의 다른 실시 형태에 따른 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 바이오 칩의 사시도이다.

도 4는 본 발명의 다른 실시 형태에 의한 바이오칩을 이용하여 DNA를 추출하는 방법을 예시한 흐름도이다.

도 6은 본 발명의 일 실시 형태에 의한 바이오칩에서 자기비드-DNA 결합체를 폐기물로부터 분리하는 과정을 예시한 개략도이다.

도 7은 본 발명의 일 실시 형태에 따른 바이오칩을 이용한 실험예에서, 미세채널의 유로를 진행함에 따라 시료 용해용 버퍼에 의해 박테리아가 파괴되는 과정을 현미경으로 촬영한 참고사진이다.

도 8은 본 발명의 일 실시형태에 따른 바이오칩을 이용한 실험예에서, E.coli(Escherichia coli)와 시료 용해용 버퍼의 유입 유량별, 주입구로부터의 거리에 따른 용해 효율을 도식화한 그래프이다.

도 9a와 도 9b는 본 발명의 일 실시형태에 따른 바이오칩의 마이크로 분리부 에 자기장이 작용하지 않을 때(도 9a)와 자기장이 작용할 때(도 9b)를 각각 구분하여 현미경으로 촬영한 참고사진이다.

도 10은 미세 채널과 자석과의 거리에 따른 용해 효율을 도식화한 그래프이다.

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>

100,200 : 바이오칩 110,210,220 : 마이크로 믹서부

111,211,221 : 미세 채널 112,212,222 : 요철부

111a,111b,211a,211b,221a : 주입구 120,230 : 마이크로 분리부

122,232 : DNA 유도부재 121a : 시스플로 주입구

121b,121c,231a,231b : 배출구

Claims

시료와 혼합물 사이의 혼합을 유도하는 미세채널이 형성된 바이오칩에 있어서,

상기 미세채널로 구성되며, 시료 용해용 버퍼와 DNA 검출용 비드가 혼합된 제1 혼합물과 시료와의 혼합을 유도하여 비드-DNA 결합체와 폐기물로 이루어진 제2 혼합물을 생성하는 마이크로 믹서부;

상기 미세채널의 후단부에 연설된 유로로서, 상기 마이크로 믹서부를 통해 생성된 제2 혼합물로부터 비드-DNA 결합체와 폐기물을 분리하는 마이크로 분리부;를 구비한 것을 특징으로 하는 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 마이크로 바이오칩.
제1항에 있어서, 상기 DNA 검출용 비드는,

실리카 코팅된 자기비드인 것을 특징으로 하는 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 마이크로 바이오칩.
제1항에 있어서, 상기 마이크로 믹서부는,

시료 용해용 버퍼와 DNA 검출용 비드가 혼합된 제1 혼합물과 시료를 각각 주입하기 각각의 주입구를 상기 미세채널의 전단부에 연통되게 형성한 것을 특징으로 하는 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 마이크로 바이오칩.
제1항에 있어서, 상기 마이크로 믹서부는,

제1 혼합물과 시료가 혼합되는 유로의 전체 길이를 연장하기 위해, 상기 미세채널의 중앙부에 요철부를 형성한 것을 특징으로 하는 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 마이크로 바이오칩.
제1항에 있어서, 상기 마이크로 분리부는,

증류수 주입을 위한 시스플로 주입구가 상기 미세채널의 후단부로 관입되어 형성되며,

DNA-비드 결합체 및 폐기물을 각각 분리하여 배출하기 위한 각각의 배출구를 마이크로 분리부의 유로의 하단에서 분기시켜 형성하는 것을 특징으로 하는 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 마이크로 바이오칩.
제5항에 있어서, 상기 마이크로 분리부는,

상기 마이크로 분리부의 유로의 하단 측면에, DNA-비드 결합체의 분리를 유도하는 DNA 유도부재가 설치된 것을 특징으로 하는 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 마이크로 바이오칩.
제6항에 있어서, 상기 DNA 유도부재는,

영구자석으로 이루어진 것을 특징으로 하는 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 마이크로 바이오칩.
제6항에 있어서, 상기 DNA 유도부재는,

상기 마이크로 분리부의 유로의 하단에서 상기 각 배출구의 분기 지점보다 앞쪽에 위치되는 것을 특징으로 하는 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 마이크로 바이오칩.
시료와 혼합물 사이의 혼합을 유도하는 미세채널이 형성된 바이오칩을 이용한 DNA 추출방법에 있어서,

(a1) 시료 용해용 버퍼와 DNA 검출용 비드가 혼합된 제1 혼합물과 시료를 상기 미세채널에 주입하고, 상기 미세채널의 유로를 통한 제1 혼합물과 시료와의 혼합을 유도하여, 비드-DNA 결합체와 폐기물로 이루어진 제2 혼합물을 생성하는 단계;

(a2) 상기 제2 혼합물로부터 비드-DNA 결합체와 폐기물을 각각 분리하는 단계;로 이루어지는 것을 특징으로 하는 바이오칩을 이용한 DNA 추출방법.
제9항에 있어서, 상기 (a1) 단계는,

(a11) DNA 검출용 비드를 주입하기 이전에 자기 비드(magnetic bead)에 실리카 코팅을 실시하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오칩을 이용한 DNA 추출방법.
제9항에 있어서, 상기 (a1) 단계는,

(a12) 상기 제1 혼합물과 시료가 혼합되는 유로의 전체 통과 시간을 연장하기 위해, 적어도 1회 이상 구부러진 미세채널을 통과시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오칩을 이용한 DNA 추출방법.
제9항에 있어서, 상기 (a2) 단계는,

(a21) 상기 제2 혼합물이 통과되는 유로의 측면에 자기장을 형성하여 비드-DNA 결합체를 일측으로 유도하는 단계;

(a22) 상기 제2 혼합물로부터 분리된 비드-DNA 결합체를 폐기물과 구분하여 각각의 배출구를 통해 배출하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오칩을 이용한 DNA 추출방법.
제9항에 있어서, 상기 (a2) 단계는,

상기 (a21) 단계 이전에, 상기 제2 혼합물에 시스플로를 통해 증류수를 주입하여 제2 혼합물의 농도를 희석시키는 단계;를 먼저 실행하는 것을 특징으로 하는 바이오칩을 이용한 DNA 추출방법.
시료와 혼합물 사이의 혼합을 유도하는 미세채널이 형성된 바이오칩에 있어서,

제1 미세채널로 형성되며, 시료와 시료 용해용 버퍼와의 혼합을 유도하여 DNA와 폐기물로 이루어지는 제3 혼합물을 생성하는 제1 마이크로 믹서부;

상기 제1 미세채널의 후단부에 연설되는 제2 미세채널로 형성되며, DNA 검출용 비드 주입을 위한 주입구가 상기 제2 미세채널의 전단부로 관입되어 형성되고, 상기 제3혼합물과 DNA 검출용 비드와의 혼합을 유도하여 비드-DNA 결합체와 폐기물로 이루어지는 제4 혼합물을 생성하는 제2 마이크로 믹서부;

상기 제2 미세채널의 후단부에 연설된 유로로서, 상기 제2 마이크로 믹서부를 통해 생성된 제4 혼합물로부터 비드-DNA 결합체와 폐기물을 분리하는 마이크로 분리부;를 구비한 것을 특징으로 하는 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 마이크로 바이오칩.
제14항에 있어서, 상기 DNA 검출용 비드는,

실리카 코팅된 자기비드인 것을 특징으로 하는 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 마이크로 바이오칩.
제14항에 있어서, 상기 제1 마이크로 믹서부는,

시료와 시료 용해용 버퍼를 각각 주입하기 위한 각각의 주입구를 상기 제1 미세채널의 전단부에 연통되게 형성한 것을 특징으로 하는 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 마이크로 바이오칩.
제14항에 있어서, 상기 제1 마이크로 믹서부 또는 제2 마이크로 믹서부는,

시료와 시료 용해용 버퍼, 또는 상기 제3 혼합물과 DNA 검출용 비드가 혼합되는 유로의 전체 길이를 연장하기 위해, 상기 각 미세채널의 중앙부에 요철부를 형성한 것을 특징으로 하는 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 마이크로 바이오칩.
제14항에 있어서, 상기 마이크로 분리부는,

DNA-비드 결합체 및 폐기물을 각각 분리하여 배출하기 위한 각각의 배출구를 마이크로 분리부의 유로의 하단에서 분기시켜 형성하는 것을 특징으로 하는 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 마이크로 바이오칩.
제18항에 있어서, 상기 마이크로 분리부는,

상기 마이크로 분리부의 유로의 하단의 측면에, DNA-비드 결합체의 분리를 유도하는 DNA 유도부재가 설치된 것을 특징으로 하는 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 마이크로 바이오칩.
제19항에 있어서, 상기 DNA 유도부재는,

영구자석으로 이루어진 것을 특징으로 하는 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 마이크로 바이오칩.
제19항에 있어서, 상기 DNA 유도부재는,

상기 마이크로 분리부의 유로의 하단에서 상기 각 배출구의 분기 지점보다 앞쪽에 위치되는 것을 특징으로 하는 병원균 검침을 위한 DNA 추출용 마이크로 바이오칩.
시료와 혼합물 사이의 혼합을 유도하는 제1 미세채널과 제2 미세채널이 연설된 바이오칩을 이용한 DNA 추출방법에 있어서,

(b1) 상기 제1 미세채널에 시료와 시료 용해용 버퍼를 주입하고, 제1 미세채널의 유로를 통한 시료와 시료 용해용 버퍼와의 혼합을 유도하여, DNA와 폐기물로 이루어진 제3 혼합물을 생성하는 단계;

(b2) 상기 제2 미세채널의 전단부에 DNA 검출용 비드를 주입하고, 상기 제2 미세채널의 유로를 통한 제3 혼합물과 DNA 검출용 비드와의 혼합을 유도하여, 비드-DNA 결합체와 폐기물로 이루어지는 제4 혼합물을 생성하는 단계;

(b3) 상기 제4 혼합물로부터 비드-DNA 결합체와 폐기물을 각각 분리하는 단계;로 이루어지는 것을 특징으로 하는 바이오칩을 이용한 DNA 추출방법.
제22항에 있어서, 상기 (b2) 단계는,

(b21) DNA 검출용 비드를 주입하기 이전에 자기 비드에 실리카 코팅을 실시하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오칩을 이용한 DNA 추출방법.
제22항에 있어서, 상기 (b1) 단계 또는 (b2) 단계는,

시료와 시료 용해용 버퍼, 또는 제3 혼합물과 DNA 검출용 비드가 혼합되는 유로의 전체 통과 시간을 연장하기 위해, 적어도 1회 이상 구부러진 미세채널을 통과시키는 단계;를 포함하는 특징으로 하는 바이오칩을 이용한 DNA 추출방법.
제22항에 있어서, 상기 (b3) 단계는,

(b31) 상기 제4 혼합물이 통과되는 유로의 측면에 자기장을 형성하여 비드-DNA 결합체를 일측으로 유도하는 단계;

(b32) 상기 제4 혼합물로부터 분리된 비드-DNA 결합체를 폐기물과 구분하여 각각의 배출구를 통해 배출하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오칩을 이용한 DNA 추출방법.