KR101064415B1

KR101064415B1 - Method for treatment of spermatozoa in external fertilization of domestic animal

Info

Publication number: KR101064415B1
Application number: KR1020110018668A
Authority: KR
Inventors: 김은영; 박세필
Original assignee: (주)미래생명공학연구소; 제주특별자치도; 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2010-04-30
Filing date: 2011-03-02
Publication date: 2011-09-14

Abstract

2단계 스윔업 과정을 통해 가축의 냉동 정자를 활성시켜 정자의 활력이 오랫동안 유지되면서 다수의 정자를 회수할 수 있고, 가축의 체외 수정률, 발달율, 세포수 조사, 전핵 형성률에서 기존에 주로 사용하고 있는 가축의 체외 수정방법에 비해 유의하게 증가시킬 수 있는 가축의 체외 수정용 정자 처리방법을 제공한다.Through the two-stage swim-up process, the frozen sperm of the livestock is activated, and the vitality of the sperm is maintained for a long time, and a large number of sperm can be recovered, and it is mainly used in the in vitro fertilization rate, development rate, cell count, and pronuclear formation rate of the livestock. Provided is a method for treating sperm for in vitro fertilization of livestock, which can be significantly increased as compared to in vitro fertilization of livestock.

Description

Sperm treatment method for in vitro fertilization of cattle {METHOD FOR TREATMENT OF SPERMATOZOA IN EXTERNAL FERTILIZATION OF DOMESTIC ANIMAL}

본 발명은 가축의 체외 수정용 정자 처리방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 정자의 활력이 오랫동안 유지되면서 다수의 정자를 회수할 수 있고, 가축의 체외 수정률, 발달율, 세포수 조사, 전핵 형성률에서 기존에 주로 사용하고 있는 가축의 체외 수정방법에 비해 유의하게 증가시킬 수 있는 가축의 체외 수정용 정자 처리방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for treating sperm for in vitro fertilization of livestock, and more particularly, it is possible to recover a large number of sperm while maintaining the vitality of sperm for a long time, existing in the in vitro fertilization rate, development rate, number of cells, pronucleation rate of livestock The present invention relates to a method for treating sperm for in vitro fertilization of livestock, which can be significantly increased as compared to the in vitro fertilization method for livestock mainly used in fish farming.

가축의 체외 수정 시 사용되는 기존의 정자 처리방법에는 i) 정자처리용 배양액(Bracket Oliphant; BO)을 이용한 스윔업(swim-up) 방법 및 ii) 퍼콜(percoll)의 농도 구배를 이용한 원심분리 방법 등이 있다.
Conventional sperm treatment methods used for in vitro fertilization of livestock include: i) swim-up using sperm broth (BO), and ii) centrifugation using a concentration gradient of percoll. Etc.

배양액을 이용한 스윔업 방법에 의한 정자처리는 활력이 좋은 정자의 운동성을 이용하여 펠렛화된 정자군집에 정자처리용 배양액을 넣은 후 30분 이상 정체된 상태로 배양하였을 때 부유되어 나온 정자를 회수하는 원리로서, 이때의 결과는 원래의 정액의 질에 따라서 회수된 정자의 질에 차이가 나타나게 된다.
Sperm treatment by the scoop-up method using the culture medium is to recover the sperm that has been suspended when incubated for 30 minutes or more after putting the sperm treatment medium into the pelletized sperm population using the motility of the sperm In principle, the result of this time is a difference in the quality of recovered sperm according to the quality of the original semen.

또한, 스윔업 방법에 의한 정자처리는 정자의 부유시간이 길어질수록 사멸정자의 수가 늘어나는 단점이 있다. 따라서 질 좋은 정자가 많이 들어 있는 정액의 경우 부유할 수 있는 정자 수가 많아서 많은 양이 회수되지만 질이 나쁜 정자가 많이 섞여 있는 샘플의 경우 회수량이 현저히 떨어진다. 그러나 정자의 상태가 좋지 않은 샘플의 경우라도 아주 적은 양이라도 정자를 회수할 수 있는 가장 고전적인 정자처리 방법이다. 이때, 배양되는 과정 중 배양액의 성분이 정자의 질 개선에 영향을 미칠 수 있다.
In addition, the sperm treatment by the swim-up method has the disadvantage that the number of dead sperm increases as the sperm suspension time increases. Therefore, in the case of semen that contains a lot of quality sperm, the number of sperm that can be suspended is a large amount is recovered, but in the case of a sample containing a lot of poor quality sperm recovery is significantly reduced. However, even in samples with poor sperm status, it is the most classic method of sperm recovery that can recover sperm in very small amounts. At this time, the components of the culture solution during the culture process may affect the improvement of sperm quality.

퍼콜(percoll)을 이용한 정자처리는 콜로이드 성질을 가진 농도 구배의 밀도 차이를 이용하여 정자를 분리하는 방법이다. 정액을 퍼콜로 분리하면 정액 내에 존재하는 사멸정자의 제거와 세포 파편 및 세균을 분리 하는데 장점이 있어 사람의 정액뿐만 아니라 가축 산업에도 많이 이용되고 있다.
Sperm treatment using percoll is a method of separating sperm by using density differences of concentration gradients having colloidal properties. Separation of semen into percol has the advantage of removing the dead sperm present in the semen and to separate cell debris and bacteria is used in the livestock industry as well as human semen.

퍼콜을 이용한 정자처리의 예로서, 사람의 정자를 불연속 퍼콜 원심분리하여 활동성 정자와 X 정자를 94% 이상 회수하였다는 보고(Iizuka 등, 1987)와 분리된 정자를 체외수정하였을 경우 성숙율이 높았다는 보고가 있다(Grant 등, 1994). As an example of sperm treatment using percol, the rate of maturity was high when in vitro fertilization of sperm separated from human sperm was carried out by discontinuous percol centrifugation to recover 94% or more of active sperm and X sperm (Iizuka et al., 1987). Is reported (Grant et al., 1994).

돼지 정액을 퍼콜로 분리하면 정액 내에 존재하는 정액 성분, 사멸정자, 체세포, 세포단면 및 백혈구 등의 이물질이 제거되며, 정자의 운동성이 증가하고 체외수정 시 수정율이 증가한다는 보고가 있다(Shim 등, 2001). 또한, Park 등(2008)은 퍼콜이 돼지 정액 내의 세균 분리에 효과적이라고 보고한 바 있고, 미니돼지 정액을 분리할 때 65% 이상의 퍼콜에서는 세균이 완전히 제거된다고 보고하였다.
Separation of porcine semen by percol removes foreign substances such as semen components, sperm, somatic cells, cell sections and leukocytes in semen, and it is reported that sperm motility increases and fertilization rate during in vitro fertilization (Shim et al. 2001). In addition, Park et al. (2008) reported that percol was effective for the isolation of bacteria in pig semen, and that when more than 65% of the percol were separated when mini pigs were semen, bacteria were completely removed.

그러나, 퍼콜을 정자 분리에 사용할 경우, 독소에 의한 오염이나 정자 형태 변화를 유발하기 때문에 수정에 좋지 못한 영향을 미칠 수 있다는 보고들이 발표되고 있다(Andersen과 Grinsted, 1997; De Vos등, 1997; Scott와 Smith, 1997; Strehler 등, 1998).
However, there have been reports that percol can be used for sperm separation and adversely affect fertilization because it causes toxin contamination or changes in sperm morphology (Andersen and Grinsted, 1997; De Vos et al., 1997; Scott; And Smith, 1997; Strehler et al., 1998).

한편, 퍼콜방법에 의한 정자 처리는 생존 정자 수가 많을 때 유리하다. 사멸정자수가 많으면 퍼콜 층에 모두 걸리게 되고, 살아있는 정자의 이동 진로가 막히게 되므로, 원심분리를 하더라도 다수의 정자가 회수되지 못하는 단점이 있고 처리 과정 중에는 활력이 떨어지지 않으나, 처리 후 사멸정자 수가 급격하게 증가되는 양상을 나타내므로 정자의 질이 나쁜 경우에는 권장되지 않는 방법이다.
On the other hand, sperm treatment by the percol method is advantageous when the number of viable sperm is large. If the number of sperm is large, the percol layer is caught, and the migration path of living sperm is blocked, so that sperm cannot be recovered even by centrifugation, and vitality is not decreased during the process, but the number of sperm after treatment is rapidly increased. This is not recommended if the quality of sperm is bad.

또한 퍼콜의 양이나, 농도, 처리시간을 조절하여 정자 처리에 이용할 수 있으나, 퍼콜의 잔존물이 완벽히 제거되지 않으므로 여전히 독성 요소는 배제할 수 없는 문제점이 있다.
In addition, the amount of percol, concentration, and treatment time can be used for sperm treatment by adjusting, but the residue of the percol is not completely removed, there is still a problem that can not be excluded toxic elements.

따라서, 본 발명의 목적은 종래의 i) 정자처리용 배양액(Bracket Oliphant; BO)을 이용한 스윔업(swim-up) 방법 및 ii) 퍼콜(percoll)의 농도 구배를 이용한 원심분리 방법 등과 같은 가축의 체외 수정 시 사용되는 정자 처리방법에서 나타나는 문제점을 최소화 하면서, 활력을 유지하는 다수의 정자를 회수할 수 있고, 체외 수정률, 발달율, 세포수 조사, 전핵 형성률 등에서 우수한 효과를 나타낼 수 있는 가축의 체외 수정용 정자 처리방법을 제공하는 것이다.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a livestock, such as i) a swim-up method using a sperm broth (Bracket Oliphant; BO) and ii) a centrifugation method using a concentration gradient of percoll. In vitro fertilization of livestock which can recover a large number of vitality sperm while minimizing problems in sperm treatment method used in vitro fertilization, and can show excellent effects in in vitro fertilization rate, development rate, cell count, pronuclear formation rate, etc. It is to provide a method for treating the sperm.

상기와 같은 과제를 해결하기 위해 본 발명은 가축의 체외 수정 시 사용되는 정자의 처리방법으로서, 정자동결용 용액을 포함하여 동결된 가축의 동결 정액을 제1 정자처리 용액으로 융해하여 정자융해액을 준비하는 단계; 상기 정자융해액을 1차 원심 분리하여 정자를 포함하는 제1 침전층을 형성하는 단계; 상기 제1 침전층 상에 상기 제1 정자처리 용액을 공급하여 상기 정자를 활성화 시키는 제1 스윔업(swim-up) 단계; 제 1 스윔업이 이루어진 용액에, 제2 정자처리 용액을 상기 제1 스윔업이 이루어진 용액과 동일한 양으로 첨가하여 배양하는 단계; 상기 배양된 용액을 2차 원심 분리하여 정자를 포함하는 제2 침전층을 형성하는 단계; 상기 제2 침전층 상에 제2 정차처리 용액을 공급하여 상기 정자를 활성화 시키는 제2 스윔업 단계; 및 제2 스윔업이 이루어진 정자 배양층을 분리 회수하는 단계를 포함하는 가축의 체외 수정용 정자 처리방법을 제공한다.
In order to solve the above problems, the present invention is a method of treating sperm used in vitro fertilization of livestock, melting frozen sperm of the frozen livestock, including the solution for automatic fixation with a first sperm treatment solution Preparing; Centrifuging the sperm lysate first to form a first precipitate layer comprising sperm; A first swim-up step of activating the sperm by supplying the first sperm solution on the first precipitation layer; Culturing by adding a second sperm solution to the solution in which the first swim-up was made in the same amount as the solution in which the first swim-up was made; Centrifuging the cultured solution to form a second precipitate layer including sperm; A second swim-up step of activating the sperm by supplying a second process solution on the second precipitation layer; And separating and recovering the sperm culture layer in which the second swim-up is made.

본 발명에 따르면, 가축의 체외수정 시 사용되는 정자 처리방법에 있어서, 활력을 유지하는 다수의 정자를 회수할 수 있고, 체외 수정률, 발달율, 세포수 조사, 전핵 형성률 등에서 우수한 효과를 나타내는 가축의 정자를 얻을 수 있다.
According to the present invention, in the sperm treatment method used for in vitro fertilization of livestock, a large number of sperm maintaining vitality can be recovered, and the sperm of the livestock exhibiting excellent effects in vitro fertilization rate, development rate, cell count irradiation, pronuclear formation rate, and the like. Can be obtained.

도 1은 실시예 1의 정자 처리방법 및 비교예 1의 정자 처리방법에 의한 정자 처리 후, 정자의 운동성을 나타낸 그래프이다;
도 2는 비교예 1의 정자로 체외수정된 소 난자의 체외발달 8일째 배아(A.) 의 위상차 현미경 사진과 이중염색된 배반포기 배(B.)의 형광 사진이다;
도 3은 실시예 1의 정자로 체외수정된 소 난자의 체외발달 8일째 배아(A.) 의 위상차 현미경 사진과 이중염색된 배반포기 배(B.)의 형광 사진이다;
도 4는 실시예 1의 정자로 수정 후, 18시간 째에 염색된 수정란의 전핵 형성 상태 (자성 전핵과 웅성 전핵이 형성된 후 모이는 형태)를 나타낸 형광 사진이다.1 is a graph showing the motility of sperm after sperm treatment by the sperm treatment method of Example 1 and sperm treatment method of Comparative Example 1;
Figure 2 is a phase contrast micrograph of the embryo (A.) 8 days of in vitro fertilization of bovine eggs fertilized in vitro with sperm of Comparative Example 1 and a fluorescence picture of the double-stained blastocyst embryo (B.);
Figure 3 is a phase contrast micrograph of the embryo (A.) 8 days in vitro development of bovine egg fertilized in vitro with sperm of Example 1 and a fluorescence picture of the double-stained blastocyst embryo (B.);
Figure 4 is a fluorescence photograph showing the pronuclear formation state (form gathered after the formation of the magnetic and male pronucleus of the fertilized egg 18 hours after fertilization with sperm of Example 1).

이하 본 발명을 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명에 따른 가축의 체외 수정 시 사용되는 정자 처리방법은 Sperm treatment method used in vitro fertilization of livestock according to the present invention

정자동결용 용액을 포함하여 동결된 가축의 동결 정액을 제1 정자처리 용액으로 융해하여 정자융해액을 준비하는 단계;Preparing a sperm fusion solution by melting frozen frozen semen of the frozen livestock, including a solution for automatic fixation, into a first sperm treatment solution;

상기 정자융해액을 1차 원심 분리하여 정자를 포함하는 제1 침전층을 형성하는 단계;Centrifuging the sperm lysate first to form a first precipitate layer comprising sperm;

상기 제1 침전층 상에 상기 제1 정자처리 용액을 공급하여 상기 정자를 활성화 시키는 제1 스윔업(swim-up) 단계;A first swim-up step of activating the sperm by supplying the first sperm solution on the first precipitation layer;

제 1 스윔업이 이루어진 용액에, 제2 정자처리 용액을 상기 제1 스윔업이 이루어진 용액과 동일한 양으로 첨가하여 배양하는 단계;Culturing by adding a second sperm solution to the solution in which the first swim-up was made in the same amount as the solution in which the first swim-up was made;

상기 배양된 용액을 2차 원심 분리하여 정자를 포함하는 제2 침전층을 형성하는 단계;Centrifuging the cultured solution to form a second precipitate layer including sperm;

상기 제2 침전층 상에 제2 정차처리 용액을 공급하여 상기 정자를 활성화 시키는 제2 스윔업 단계; 및A second swim-up step of activating the sperm by supplying a second process solution on the second precipitation layer; And

제2 스윔업이 이루어진 정자 배양층을 분리 회수하는 단계를 포함하는 것으로 구성되어 있다.
And separating and recovering the sperm culture layer in which the second swim-up has been made.

즉, 본 발명에 따른 정자 처리방법은 제1 정자처리 용액으로 정자를 융해하는 단계, 융해된 정자를 활성화시키는 제1 스윔업 단계, 및 제2 정자처리 용액으로 정자를 활성화 시키는 제2 스윔업 단계에 의해 각각 정자를 활성화 시켜, 활력을 유지하는 다수의 정자를 회수함으로써, 가축의 체외수정 시 사용되는 정자의 체외 수정률, 발달율, 세포수 조사, 전핵 형성률을 유의하게 향상시킬 수 있는 특징이 있다.
That is, the sperm treatment method according to the present invention comprises the steps of: melting sperm with a first sperm treatment solution, a first swim-up step of activating the molten sperm, and a second swim-up step of activating sperm with a second sperm treatment solution. By activating the sperm, respectively, and recovering a large number of sperm to maintain vitality, there is a feature that can significantly improve the in vitro fertilization rate, development rate, cell count irradiation, pronuclear formation rate of sperm used in in vitro fertilization of livestock.

상기 제1 스윔업 단계 및 제2 스윔업 단계는 생존능과 운동성을 유지하는 정자 및 활력을 상실하였거나 사멸된 정자가 섞여 있는 동결 상태 또는 침전된 상태의 가축의 정액에서 생존능과 운동성을 유지하는 건강한 정자들이 각각 상기 제1 정자처리 용액상으로 스윔(swim)에 의해 올라오도록 하는 단계 및 상기 제2 정자처리 용액 상으로 스윔(swim)에 의해 올라오도록 단계로서, 이러한 2단계 스윔업 과정에 의해, 생존능과 운동성을 유지하는 건강한 정자들이 활력을 상실하였거나 사멸된 정자와 분리되도록 하는 효과를 극대화할 수 있다.
The first swim-up step and the second swim-up step include healthy sperm maintaining viability and motility in semen of frozen or sedimented domestic animals in which sperm and viability or dying sperm are mixed. Causing each to rise by a swim onto the first sperm solution and by a swim onto the second sperm solution, by virtue of this two-step swim-up process, viability Healthy sperm that maintains excess and motility can be maximized to separate them from lost or dying sperm.

상기 정자융해액을 준비하는 단계는 사멸 정자의 수를 최소화하고, 정자의 활력을 유지시킬 수 있도록, 예를 들어, 15℃ 내지 25℃ 사이의 상온에서의 융해단계 및 35℃ 내지 39℃ 사이의 고온에서의 융해단계를 거치는 것으로 수행될 수 있다.
The step of preparing the sperm fusion solution, for example, to minimize the number of dead sperm and to maintain the vitality of the sperm, for example, the melting step at room temperature between 15 ℃ 25 ℃ and between 35 ℃ 39 ℃ It may be carried out by going through a melting step at a high temperature.

상기 1차 원심 분리는 상기 정자동결용 용액에 포함된 난황을 제거하기 위해 수행되며, 상기 2차 원심 분리는 상기 제1 정자처리 용액 및 제2 정자처리 용액의 혼합액에서 정자 이외 물질을 제거하여 활성화된 정자의 밀도를 높이기 위해 수행된다. 여기서, 상기 1차 원심 분리 및 2차 원심 분리는 예를 들어, 각각 1800 rpm 내지 2300 rpm으로 수행될 수 있다.
The first centrifugal separation is performed to remove egg yolk contained in the solution for automatic crystallization, and the second centrifugal separation is activated by removing substances other than sperm from the mixed solution of the first sperm treatment solution and the second sperm treatment solution. Is carried out to increase the density of sperm. Here, the first centrifugation and the second centrifugation may be performed at, for example, 1800 rpm to 2300 rpm, respectively.

상기 정자 처리방법은 예를 들어, 전체적으로 1시간 정도 수행될 수 있으며, 정자가 상기 제1 정자처리 용액에 최소 25분 내지 35분 간 노출될 수 있도록, 상기 각 단계가 수행되는 시간을 조절하는 것이 바람직하다.
The sperm treatment method may be performed, for example, for about 1 hour as a whole, and adjusting the time for each step is performed so that the sperm may be exposed to the first sperm treatment solution for at least 25 to 35 minutes. desirable.

상기 제1 정자처리 용액 및 제2 정자처리 용액의 혼합액의 혼합 비율은 예를 들어 1 : 1로 이루어질 수 있다.
The mixing ratio of the mixed solution of the first sperm treatment solution and the second sperm treatment solution may be, for example, 1: 1.

상기 제2 정자처리 용액은 예를 들어, Bracket Oliphant (BO) 및 Sperm-TL (SP-TL) 정자 처리용 배양액을 사용할 수 있다.
As the second sperm solution, for example, Bracket Oliphant (BO) and Sperm-TL (SP-TL) sperm treatment culture solution may be used.

제2 정자처리 용액의 조성은 예컨대, 다음과 같다:The composition of the second sperm solution is, for example:

CaCl₂2H₂O, 31 mg/100mL; KCl, 23 mg/100mL; MgCl₂6H₂O, 8 mg/100mL; NaCl, 584 mg/100mL; NaH₂PO₄H₂O, 4.0 mg/100mL; Lactic Acid(60% syrup), 0.368 mL/100mL; Hepes(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), 238 mg/100mL; NaHCO₃ _,210 mg/100mL; Phenol Red, 1 mg/100mL.
CaCl ₂ 2H ₂ O, 31 mg / 100 mL; KCl, 23 mg / 100 mL; MgCl ₂ 6H ₂ O, 8 mg / 100 mL; NaCl, 584 mg / 100 mL; NaH ₂ PO ₄ H ₂ O, 4.0 mg / 100 mL; Lactic Acid (60% syrup), 0.368 mL / 100 mL; Hepes (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid), 238 mg / 100 mL; NaHCO ₃ _, 210 mg / 100 mL; Phenol Red, 1 mg / 100 mL.

예를 들어, 상기 BO 배양액은 하기와 같은 조성 및 구성요소들로 제조될 수 있다:For example, the BO culture may be prepared from the following compositions and components:

NaCl, 112 mM; KCl, 4.02 mM; CaCl₂ㆍ2H₂O, 2.25mM; MgCl₂ㆍ6H₂O, 0.52 mM; NaH₂PO₄ㆍH₂O, 0.83 mM; NaHCO₃ _,37mM; Glucose, 13.9 mM; Na-pyruvate, 1.25 mM; Penicillin, 100 IU/ml; Bovine serum albumin (BSA), 3 mg/ml; ~300 mOsm/L.
NaCl, 112 mM; KCl, 4.02 mM; CaCl ₂ .2H ₂ O, 2.25 mM; MgCl ₂ .6H ₂ O, 0.52 mM; NaH ₂ PO ₄ H ₂ O, 0.83 mM; NaHCO ₃ _, 37 mM; Glucose, 13.9 mM; Na-pyruvate, 1.25 mM; Penicillin, 100 IU / ml; Bovine serum albumin (BSA), 3 mg / ml; ~ 300 mOsm / L.

또한, 상기 SP-TL 배양액은 하기와 같은 조성 및 구성요소들로 제조될 수 있다:In addition, the SP-TL culture may be prepared with the following composition and components:

NaCl, 100 mM; KCl, 3.1 mM; CaCl₂ㆍ2H₂O, 2.10mM; MgCl₂ㆍ6H₂O, 0.4 mM; NaH₂PO₄ㆍH₂O, 0.29 mM; NaHCO₃ _,25mM; Lactic acid, 21.6 mM; Hepes, 10 mM; Na-pyruvate, 1.0 mM Gentamycin, 25 ug/ml; BSA, 6 mg/ml; 290 ~ 300 mOSM/L.
NaCl, 100 mM; KCl, 3.1 mM; CaCl ₂ .2H ₂ O, 2.10 mM; MgCl ₂ .6H ₂ O, 0.4 mM; NaH ₂ PO ₄ H ₂ O, 0.29 mM; NaHCO ₃ _, 25 mM; Lactic acid, 21.6 mM; Hepes, 10 mM; Na-pyruvate, 1.0 mM Gentamycin, 25 ug / ml; BSA, 6 mg / ml; 290 to 300 mOSM / L.

상기 정자 동결용 용액은 예를 들어 정자를 스트로우(straw) 형태로 냉동시켜 보관하기 위해 사용되는 용액으로서, 정자의 보존 및 재생을 위하여 물, 난황 및 정자 동결용 희석액이 각각 2.7 내지 3.3 : 0.8 내지 1.2 : 0.8 내지 1.2 부피비로 포함된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 상기 정자 동결용 용액은 정자 동결용 희석액 10 내지 30 v/v%; 난황 10 내지 30 v/v%; 및 물 40 내지 80 v/v%를 포함한다.
The sperm freezing solution is a solution used for freezing and storing sperm in the form of a straw, for example, water, egg yolk and sperm freezing diluents are respectively 2.7 to 3.3: 0.8 to sperm for preservation and regeneration of sperm. Preference is given to using those contained in a volume ratio of 1.2: 0.8 to 1.2. That is, the sperm freezing solution is 10 to 30 v / v% diluent for sperm freezing; Egg yolk 10 to 30 v / v%; And 40 to 80 v / v% of water.

상기 제1 정자처리 용액은 상기 정자 처리방법에서 제1 스윔업 단계에서 정자의 활성화를 촉진시키는 용액으로서, 물 및 정자 동결용 희석액이 3.7 내지 4.3 : 0.8 내지 1.2 비율로 포함된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 상기 제1 정자처리 용액은 정자 동결용 희석액 10 내지 30 v/v%; 및 물 70 내지 90 v/v%를 포함한다.
The first sperm treatment solution is a solution for promoting the activation of sperm in the first scoop-up step in the sperm treatment method, it is preferable to use a diluent for freezing water and sperm in a ratio of 3.7 to 4.3: 0.8 to 1.2 Do. That is, the first sperm solution is 10 to 30 v / v% diluent for freezing sperm; And 70 to 90 v / v% of water.

상기 정자 동결용 용액 및 제1 정자처리 용액은 정자를 활성화시키는 스윔업 단계가 원활하게 수행됨으로써, 활력을 유지하는 정자의 수율을 높일 수 있도록, 삼투압이 서로 동일하게 유지되는 것이 바람직하며, 이 경우의 삼투압은 대략 800 내지 970 mOsm/L이며, 특히 940 내지 970 mOsm/L이 바람직하다. 또한, 상기 정자 동결용 용액 및 상기 제1 정자 처리용액은 pH 가 서로 동일하게 유지되는 것이 바람직하며, 이 경우의 pH 는 대략 6.5 내지 7.0이다. 제2 정자 처리용액은 상기 정자 동결용 용액 및 상기 제1 정자 처리용액 보다 pH 가 높고, 삼투압이 낮으며, 예컨대 pH 7.4 및 삼투압 290 내지 300 mOsm/L이다.
In the sperm freezing solution and the first sperm treatment solution, a scoop-up step of activating sperm is performed smoothly, so that the osmotic pressure is maintained to be the same so as to increase the yield of sperm maintaining vitality. The osmotic pressure of is approximately 800 to 970 mOsm / L, particularly 940 to 970 mOsm / L. In addition, the pH of the sperm freezing solution and the first sperm treatment solution is preferably maintained at the same pH, the pH in this case is approximately 6.5 to 7.0. The second sperm treating solution has a higher pH and lower osmotic pressure than the sperm freezing solution and the first sperm treating solution, for example, pH 7.4 and osmotic pressure of 290 to 300 mOsm / L.

상기 정자 동결용 희석액은 정액의 동결에 사용되는 희석액으로서, 예를 들어, 하이드록시메틸(hydroxymethyl), 시트르산(citric acid), 당분(sugar), 완충제(buffers), 글리세롤(glycerol) 및 항생제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 물질을 포함하는 동결액을 3 내지 5 배 부피의 물로 희석한 용액이다. 상기 하이드록시메틸은, 예컨대, 트리스-(하이드록시메틸)-아미노메탄(tris-(hydroxymethyl)-aminomethane;TRIS)일 수 있다. 상기 항생제는, 예컨대 타이로신(Tylosin), 겐타마이신(Gentamycin), 스펙티노마이신(Spectinomycin) 및 린코마이신(Lincomycin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.
The diluent for freezing sperm is a diluent used for freezing the semen, for example, consisting of hydroxymethyl, citric acid, sugar, buffers, glycerol and antibiotics. A freeze solution containing one or more substances selected from the group is a solution diluted with 3 to 5 times the volume of water. The hydroxymethyl may be, for example, tris- (hydroxymethyl) -aminomethane (TRIS). The antibiotic may be used, for example, one or more selected from the group consisting of Tylosin, Gentamycin, Gentamycin, Spectinomycin, and Lincomycin.

이러한 정자 동결용 희석액으로서 상업적으로 시판되고 있는 종류로는 예를 들어, Triladyl®(Minitub, Tiefenbach, Germany), Bioxell®(IMV, Aigle, France) Andromed®(Minitub, Tiefenbach, Germany) 등이 있으며, 이들 제품은 정자의 운동성, 전진운동, 생존성등에 약간씩 차이를 나타내나 바람직하게는 Triladyl®(Minitub, Tiefenbach, Germany)이 사용될 수 있다.
Commercially available types of such diluents for freezing sperm include Triladyl® (Minitub, Tiefenbach, Germany), Bioxell® (IMV, Aigle, France) Andromed® (Minitub, Tiefenbach, Germany), and the like. These products differ slightly in sperm motility, forward movement, viability, but preferably Triladyl® (Minitub, Tiefenbach, Germany) can be used.

상기 제 1 스윔업 단계 및 제 2 스윔업 단계는 가축의 체온과 동일한 온도에서 수행되는 것이 바람직하며, 구체적으로, 36℃ 내지 39℃ 사이의 온도에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 소의 정자 처리과정에서의 스윔업 온도는 대략 38℃가 바람직하다.
The first swim-up step and the second swim-up step are preferably performed at the same temperature as the body temperature of the livestock, specifically, may be performed at a temperature between 36 ℃ 39 ℃. For example, the scoop-up temperature in bovine sperm treatment is preferably about 38 ° C.

본 발명은 또한, 가축의 체외수정 시 사용되는 제1 정자처리 용액으로서, 하이드록시메틸(hydroxymethyl), 시트르산(citric acid), 당분(sugar), 완충제(buffers), 글리세롤(glycerol) 및 항생제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 물질을 포함하는 정자 동결용 희석액과 물이 1:3 내지 1:5의 비율로 혼합되어 있는 제1 정자처리 용액을 제공한다.
The present invention also provides a first sperm treatment solution for in vitro fertilization of livestock, comprising hydroxymethyl, citric acid, sugar, buffers, glycerol and antibiotics. Provided is a first sperm treatment solution in which a diluent for freezing sperm containing at least one substance selected from the group and water is mixed at a ratio of 1: 3 to 1: 5.

본 발명에 따른 제1 정자처리 용액은 가축의 동결 정액의 융해 후, 정자의 생존능 및 운동성을 연장시키기 용이한 혼합 용액으로서, 정자의 물에 대한 삼투 활동성을 조절하여 정자의 활력을 촉진할 수 있는 특징이 있다.
The first sperm treatment solution according to the present invention is a mixed solution that is easy to prolong the viability and motility of sperm after thawing frozen frozen semen of the livestock, and can promote the sperm's vitality by adjusting the osmotic activity of the sperm's water. There is a characteristic.

이하 실시예를 참조하여 본 발명을 더 구체적으로 설명하나, 이러한 실시예에 의해 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.
The present invention will be described in more detail with reference to the following Examples, but the scope of the present invention is not limited by these Examples.

실시예Example

실시예Example 1 One

소의 체외 수정용 정자를 제조하기 위해 다음과 같은 과정을 통해 소의 정자를 처리하였다.In order to prepare bovine sperm for in vitro fertilization, bovine sperm were processed through the following process.

1) 물, 난황 및 정자 동결용 희석액으로서 Triladyl®을 3: 1: 1 비율로 포함하는 정자 동결용 용액과 소의 정자를 혼합하여 스트로(straw) 형태로 냉각된 소 동결 정액 스트로를 대략 15 ℃ ~ 25℃ 의 실온에서 10초 동안 방치하고, 38℃ 의 온도에서 20초간 침지하는 방법으로 융해하였으며 상기 Triladyl®과 물을 1 : 4 비율로 포함하는 정자 융해액을 준비하였다.1) A bovine frozen semen straw, cooled in a straw form, by mixing sperm from bovine sperm with a 3: 1: 1 ratio of Triladyl® as a diluent for freezing water, egg yolk and sperm. The mixture was allowed to stand at room temperature of 25 ° C. for 10 seconds, and immersed at a temperature of 38 ° C. for 20 seconds to prepare a sperm melt containing Triladyl® and water in a 1: 4 ratio.

2) 상기 정자 융해액을 2000 rpm으로 1 분간 1차 원심분리함으로써, 상층액을 제거하여 소의 정자를 포함하는 제1 침전층을 제조하였다.2) The sperm lysate was centrifuged at 2000 rpm for 1 minute to remove the supernatant, thereby preparing a first precipitated layer containing bovine sperm.

3) 상기 제 1 침전층이 형성되어 있는 용기에 상기 제1 정자처리 용액으로 대략 20 분간 배양하여 1차 스윔업하였다.3) The first scoop-up was incubated with the first sperm solution in a container in which the first precipitated layer was formed for about 20 minutes.

4) 제1 스윔업이 이루어진 제1 정자처리 용액에 동일한 양의 제2 정자처리 용액을 넣어 대략 5분간 배양하여 제2 정자처리 용액에 대해 적응시켰다. 4) An equal amount of the second sperm solution was added to the first sperm solution in which the first swim-up was made and incubated for approximately 5 minutes to adapt to the second sperm solution.

5) 혼합액을 2차 원심 분리하여 제거하고 정자를 포함하는 제2 침전층을 제조하였다.5) The mixed solution was removed by secondary centrifugation to prepare a second precipitate layer including sperm.

6) 상기 제2 침전층 상에 상기 제2 정자처리 용액으로 대략 25분간 배양하여 2차 스윔업을 유도하였다.6) Incubated for about 25 minutes with the second sperm solution on the second precipitate layer to induce a second swim-up.

7) 상기 2차 스윔업된 정자배양액층으로부터 소의 체외수정용 정자를 최종 회수하였다.
7) The bovine in vitro fertilized sperm was finally recovered from the second scooped up sperm culture layer.

비교예Comparative example

비교예Comparative example 1 One

1) 실시예 1과 같은 소 동결 정액 스트로를 15 ℃ ~ 25 ℃의 실온에서 10초 동안 방치하고, 38℃의 온도에서 20초간 침지하는 방법으로 융해하였다. 1) The same frozen frozen sesame straw as in Example 1 was allowed to stand for 10 seconds at a room temperature of 15 ° C to 25 ° C, and melted by immersion for 20 seconds at a temperature of 38 ° C.

2) 상기 융해된 소의 정액을 90%와 45% 퍼콜(percoll) 층이 각각 1 ml씩 들어있는 튜브의 상층에 주입하였다.2) The molten bovine semen was injected into the upper layer of a tube containing 1 ml of 90% and 45% percoll layers, respectively.

3) 상기 소 정액이 주입된 튜브를 2000rpm에서 15분간 원심분리하였다.3) The bovine semen injected tube was centrifuged at 2000 rpm for 15 minutes.

4) 상기 튜브의 하단에 모인 정액층을 제외한 상층액은 모두 제거하여 소의 체외수정용 정자를 최종 회수하였다.
4) The supernatant except for the semen layer gathered at the bottom of the tube was removed and the bovine sperm for IVF was finally recovered.

실험예Experimental Example

실험예Experimental Example 1 One

실시예 1 및 비교예 1에서 각각 회수된 정자를 처리 후 즉시와 5시간까지 1시간 간격으로 정자의 상태를 컴퓨터 정액분석기의 CASA Program(SAIS ALPHA version 1.2, Medicalsupply, Co, Korea)을 사용하여 분석하였다. 비교 항목은 운동성(Total motility), 곡선 운동속도 (Curvilinear Velocity, VCL), 직선 운동 속도(Straight-Line Velocity, VSL), 평균 진행 속도(Average-Path Velocity, VAP) 등 4가지를 3회 반복 측정하였다.
Sperm recovered in Example 1 and Comparative Example 1, respectively, and immediately after treatment and at a time interval of up to 5 hours, the sperm state was analyzed using the CASA Program (SAIS ALPHA version 1.2, Medicalsupply, Co, Korea) of the computer semen analyzer. It was. The comparison item measures three repetitions of total motility, curvilinear velocity (VCL), straight-line velocity (VSL) and average velocity (average-path velocity). It was.

실험예Experimental Example 2 : 2 : 체외수정In vitro fertilization

도축장에서 도축된 소의 난소에서 10 ml 주사기에 18G 주사침을 이용하여 직경 3~6 mm 난포로부터 난구세포-난자 복합체 (cumulus-oocyte complexes) 를 채취하였다. 채취된 난자는 실체현미경 하에서 난구세포가 치밀하게 부착되고 세포질이 균일한 난자만을 선별하여 체외성숙에 공시하였다. 회수된 난구세포-난자 복합체는 1 mg/ml 소혈청 알부민이 들어있는 TL-HEPES 버퍼로 3회이상 충분히 세척하고 10% 우태아혈청 (FBS, Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA) 와 0.2mM 피루브산 나트륨, 10㎍/ml 난포자극 호르몬, 1㎍/ml 에스트라디올, 25㎍/ml 젠타마이신이 들어간 TCM-199 (Gibco-BRL) 체외성숙용 배양액에 넣어 38.8℃ 온도와 5% 이산화탄소 조건의 배양기내에서 22~24시간 동안 성숙 배양하였다.
Cumulus-oocyte complexes were collected from 3-6 mm follicles in diameter using 18G needles in 10 ml syringes from bovine ovaries slaughtered at the slaughterhouse. The collected oocytes were selected for in vitro maturation by selecting only eggs that had densely adherent and homogeneous cytoplasm under the microscope. Recovered oocyte-egg complexes were washed three or more times with TL-HEPES buffer containing 1 mg / ml bovine serum albumin, followed by 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA) and 0.2 mM TCM-199 (Gibco-BRL) in vitro culture medium containing sodium pyruvate, 10 μg / ml follicle stimulating hormone, 1 μg / ml estradiol, 25 μg / ml gentamicin, incubated at 38.8 ° C and 5% carbon dioxide Mature culture was carried out for 22-24 hours.

체외수정은 0.6% BSA, 2μg/ml Heparin, 4% PHE (0.372 mg/ ml penicillamine, 0.11 mg/ml hypotaurine, 0.018 mg/ml epinephrine)가 함유된 수정용 배양액 (Fertilization-TALP) 사용하였다. Mineral oil이 도포된 50μL 수정용 소적에 난구세포를 제거하지 않은 성숙된 난자 10개씩을 침적하고, 실시예 1 및 비교예 1에서 각각 회수된 정자를 각각의 수정용 배양 용기에 소적당 50,000 개씩 (전체 농도 1×0⁶/ml) 주입 후 CO2, 39 ℃배양액에 48시간 배양하여 체외수정을 유도하였다.
In vitro fertilization was performed using fertilization-TALP containing 0.6% BSA, 2μg / ml Heparin, and 4% PHE (0.372 mg / ml penicillamine, 0.11 mg / ml hypotaurine, 0.018 mg / ml epinephrine). 10 mature eggs that had not been removed from the oocytes were deposited in 50 μL fertilized droplets coated with mineral oil, and 50,000 sperm collected in each fertilization culture vessel in each fertilization culture vessel in Example 1 and Comparative Example 1 ( Total concentration of 1 × 0 ⁶ / ml) was injected and cultured in CO 2, 39 ° C. for 48 hours to induce in vitro fertilization.

수정란은 난구세포를 완전히 제거한 후 0.3% fatty acid free-BSA (Sigma)가 함유된 CR1aa 배양액 50μL 에 넣어 2일간 배양하였고, 그 후 10% FBS가 함유된 50μL 소적에 옮긴 후 다시 4일간 배양하여 배양 4일(≥8세포), 6일 (≥상실배), 8일 (≥배반포배) 째 발달율을 조사하였다.
The fertilized eggs were completely removed and cultured for 2 days in 50 μL of CR1aa medium containing 0.3% fatty acid free-BSA (Sigma), and then transferred to 50 μL droplets containing 10% FBS. The development rates were examined at 4 days (≧ 8 cells), 6 days (≧ lost embryos), and 8 days (≧ blastocysts).

실험예Experimental Example 3 : 3: 전핵형성Pronuclear formation 유무조사Presence Survey

상기 실시예 1 및 비교예 1의 각각의 정자로 체외수정 후 18 ~ 20 시간째에 전핵형성 특성을 비교하였다. 난자의 투명대에 붙어있는 난구세포와 정자를 제거하고 충분히 세척한 후에 슬라이드 그라스에 올려 놓고 커버슬립으로 덮은 다음 10㎍/ml 비스벤자마이드 (Hoechst 33258)가 포함된 글리세롤 용액을 넣어 다음날까지 반응시키고 형광 현미경의 blue 필터 (excitation field-350 nm, emission field-461 nm) 하에서 관찰하여 전핵 유무와 다정자 침입 여부를 조사하였다.
The pronucleation characteristics of the sperm of Example 1 and Comparative Example 1 were compared 18 to 20 hours after in vitro fertilization. After removing the sperm cells and sperm attached to the egg's zona pellucida, wash them thoroughly, put them on the slide glass, cover them with coverslips, add glycerol solution containing 10 µg / ml bisbenzamide (Hoechst 33258), and react until the next day. Observation was carried out under the blue filter (excitation field-350 nm, emission field-461 nm) of the microscope to investigate the presence of pronucleus and polysperm invasion.

실험예Experimental Example 4 : 4 : 배반포기배의Blastocyst 세포수Cell number 조사 Research

상기 실시예 1 및 비교예 1의 각각의 정자로 체외수정 후, 체외 배양 8일째 발달된 배반포기배의 질적인 차이를 비교하기 위해 영양배엽세포와 내부세포괴 수를 동시에 검토할 수 있는 이중 염색을 실시하였다. 이중 염색은 2단계로 실시되었다. 각 군의 배반포기배는 1% triton X-100과 100㎍/ml 프로피디움 이오다이드 화합물이 포함된 TL-HEPES 용액에서 30초간 처리하고 (1단계) 25㎍/ml 비스벤자마이드 (Hoechst 33258)가 포함된 TL-HEPES 용액에 넣어 4 ℃에서 다음날까지 반응시켰다 (2단계). 염색된 배반포기배는 글리세롤에 넣어 여분의 형광물질을 제거한 다음 슬라이드 그라스에 올려 놓고 커버슬립으로 덮어 형광 현미경의 blue 필터 (excitation field-350 nm, emission field-461 nm) 하에서 관찰하여 세포 수를 세었다. 결과는 영양배엽세포가 붉게 염색되고 내부세포괴는 푸르게 염색되어 염색된 세포수를 각각 계수하여 조사하였다.
After in vitro fertilization with each sperm of Example 1 and Comparative Example 1, double staining was performed to simultaneously examine the number of trophoderm cells and internal cell masses in order to compare the qualitative differences of blastocysts developed on the 8th day of in vitro culture. It was. Double staining was performed in two steps. Blastocysts of each group were treated with TL-HEPES solution containing 1% triton X-100 and 100 μg / ml propidium iodide compound for 30 seconds (step 1) and 25 μg / ml bisbenzamide (Hoechst 33258). ) Was added to the TL-HEPES solution containing a reaction at 4 ℃ until the next day (step 2). Stained blastocysts were placed in glycerol to remove excess fluorescent material, placed on slide glass and covered with a cover slip, and observed under a fluorescence microscope blue filter (excitation field-350 nm, emission field-461 nm). It was. The results were examined by counting the number of dyed germ cells in red and inner cell mass in blue.

상기 실험예 1 내지 실험예 4의 실험 결과를 하기 표 1 및 표 2에 각각 나타내었다. 표 1 및 표 2를 참조하면, 실시예 1의 정액에서는 처리 후 5시간 째에도 상당수의 정자가 생존능을 보유하는 것으로 확인된 반면, 비교예 1의 정액에서는 처리 후 급격하게 사멸정자가 늘어나는 양상을 나타났으며 (도 1 참조), 곡선운동속도, 직선운동속도. 평균진행속도에 뚜렷한 차이가 나타남을 알 수 있었다.Experimental results of Experimental Examples 1 to 4 are shown in Tables 1 and 2, respectively. Referring to Table 1 and Table 2, in the semen of Example 1 it was confirmed that a significant number of sperm retained the viability even after 5 hours after treatment, whereas in the semen of Comparative Example 1 there is a sharp increase in death sperm after treatment Appeared (see Fig. 1), curved speed, linear speed. It was found that there was a marked difference in the average speed.

실험예Experimental Example 5 : 5: 체외 수정률 및 체외 발달률 비교In vitro fertilization rate and in vitro development rate

실시예 1 및 실시예 2에서 회수된 정자로 체외수정을 실시하였을 때, 비교예 1 정자의 수정율은 70.0%인 반면 실시예 1의 정자는 84.3%를 나타내어 유의한 차이를 알 수 있었고(p<0.05), 배양 6일째 상실배 이상 발달, 그리고 배양 8일 째 배반포기배 이상 발달에서도 유의한 차이를 나타내어 (p<0.05) 희석액을 이용한 2단계 스윔업에 의한 새로운 정자처리방법이 배발달에도 유효함을 알 수 있었다. 이러한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.In vitro fertilization with sperm recovered in Examples 1 and 2, the fertilization rate of the sperm of Comparative Example 1 was 70.0%, whereas the sperm of Example 1 was 84.3%, indicating a significant difference (p <0.05). ), The development of sperm abnormality over 6 days of culture and blastocyst development over 8 days of culture showed a significant difference (p <0.05). And it was found. These results are shown in Table 3 below.

실험예Experimental Example 6: 6: 세포수Cell number 조사에 의한 결과 비교 Comparison of results by investigation

체외수정 및 체외배양으로 생산된 실시예 1 및 비교예 1의 정자에 의해 체외수정된 배반포기배를 이중염색을 통하여 염색을 실시하고 총 세포수, 내부세포괴수, 내부세포괴 비율을 조사하였다. 그 결과 총 세포수가 비교예 1에 의한 배반포기배에서는 98.5±17.8 인 반면, 실시예 1의 배반포기배에서는 168.7±13.7로 나타나 유의한 차이를 확인하였으며, 내부세포괴수 또한 11.5±10.7, 36.1±12.7로 각각 나타나 실시예 1의 정자에 의한 세포수가 비교예 1의 정자에 의한 세포수에 비해 충실함을 알 수 있었으며, 이러한 결과를 표 4에 나타내었다(p<0.0%). 또한 이러한 차이는 도 2와 도 3에서 확인할 수 있다.The blastocyst blastocysts fertilized in vitro by sperm of Example 1 and Comparative Example 1 produced by in vitro fertilization and in vitro culture were stained by double staining, and the total cell number, internal cell mass, and internal cell mass ratio were examined. As a result, the total cell count was 98.5 ± 17.8 in blastocyst blastocyst according to Comparative Example 1, while 168.7 ± 13.7 in blastocyst blastocyst in Example 1 was confirmed, and the internal cell mass was also 11.5 ± 10.7, 36.1 ±. The number of sperm cells of Example 1 was shown to be 12.7, respectively, and the cell number of sperm of Comparative Example 1 was found to be more substantial. Table 4 shows the results (p <0.0%). This difference can also be seen in FIGS. 2 and 3.

실험예Experimental Example 7 7

또한 실시예 1 및 비교예 1의 정자처리 방법에 의해 처리된 정자로 수정을 실시했을 때 체외수정 후 전핵 형성에 미치는 영향을 조사하여 표 5에 나타내었다. 표 5에 나타낸 바와 같이 희석액을 이용한 2단계 스윔업 방법에 의한 정자처리가 대조군인 Percoll 방법과 비교하여 전핵 형성율이 (도 4 참조) 높은 것을 알 수 있다. 이는 체외 발달율의 유의한 차이를 가져올 수 있는 수정능 차이의 근거를 나타내는 결과이다.In addition, when fertilization with sperm treated by the sperm treatment method of Example 1 and Comparative Example 1, the effect on the pronucleus formation after in vitro fertilization is shown in Table 5. As shown in Table 5, it can be seen that the sperm treatment by the two-step swim-up method using the diluent is higher in the pronucleation rate (see FIG. 4) than in the Percoll method, which is a control group. This is a result showing the basis of the difference in fertility that can bring a significant difference in in vitro development rate.

도 1의 둥근 매듭선: 실시예의 정자의 운동성
도 1의 세모 매듭선: 비교예의 정자의 운동성
도 2 및 도 3의 A사진: 200㎛ 의 확대 사진
도 2 및 도 3의 B사진: 100㎛ 의 확대 사진Round knot in FIG. 1: Motility of sperm of the embodiment
Triangular knot in FIG. 1: sperm motility of the comparative example
A picture of FIGS. 2 and 3: enlarged picture of 200 μm
B picture of Figs. 2 and 3: enlarged photograph of 100 μm

Claims

As a method of treatment of sperm used in vitro fertilization of livestock,
Preparing a sperm fusion solution by melting frozen frozen semen of the frozen livestock, including a solution for automatic fixation, into a first sperm treatment solution;
Centrifuging the sperm lysate first to form a first precipitate layer comprising sperm;
A first swim-up step of activating the sperm by supplying the first sperm solution on the first precipitation layer;
Culturing by adding a second sperm solution to the solution in which the first swim-up was made in the same amount as the solution in which the first swim-up was made;
Centrifuging the cultured solution to form a second precipitate layer including sperm;
A second swim-up step of activating the sperm by supplying a second process solution on the second precipitation layer; And
A sperm treatment method for in vitro fertilization of livestock, comprising the step of separating and recovering the sperm culture layer in which the second swim-up was made.

The method of claim 1,
The sperm freezing solution,
10-30 v / v% diluent for sperm freezing;
Egg yolk 10 to 30 v / v%; And
Sperm treatment method, characterized in that containing water 40 to 80 v / v%.

The method of claim 1,
The first sperm treatment solution,
10-30 v / v% diluent for sperm freezing; And
Sperm treatment method, characterized in that containing 70 to 90 v / v% of water.

The method according to claim 2 or 3,
The diluent for freezing sperm is a freezing solution containing one or more substances selected from the group consisting of hydroxymethyl, citric acid, sugar, buffers, glycerol and antibiotics. Sperm treatment method, characterized in that the solution diluted with 3 to 5 times the volume of water.

The method of claim 4, wherein
The hydroxymethyl is tris- (hydroxymethyl) -aminomethane (tris- (hydroxymethyl) -aminomethane (TRIS), sperm treatment method.

The method of claim 4, wherein
The antibiotic is sperm treatment method, characterized in that at least one selected from the group consisting of Tylosin, Gentamycin (Gentamycin), Spectinomycin (Spectinomycin) and Lincomycin (Lincomycin).

The method of claim 1,
The sperm treatment method, characterized in that the osmotic pressure of the sperm freezing solution and the first sperm treatment solution is the same.

The method of claim 7, wherein
The osmotic pressure is 940 to 970 mOsm / L, characterized in that the sperm treatment method.

The method of claim 1,
Sperm treatment method characterized in that the pH of the sperm freezing solution and the first sperm treatment solution is 6.5 to 7.0.

The method of claim 1,
The second sperm treating solution is higher in pH and lower in osmotic pressure than the sperm freezing solution and the first sperm treating solution.

The method of claim 1,
And the first and second swim-up steps are performed at a temperature between 36 [deg.] C. and 39 [deg.] C.