KR101063792B1

KR101063792B1 - Ｌ-ｄｏｐａ의 전기효소적 제조방법

Info

Publication number: KR101063792B1
Application number: KR1020090029165A
Authority: KR
Inventors: 유영제; 민경선
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2009-04-04
Filing date: 2009-04-04
Publication date: 2011-09-08
Also published as: KR20100110691A

Abstract

본 발명은 파킨슨씨병의 치료물질인 L-DOPA의 전기효소적 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 타이로시네이즈(tyrosinase)를 효소 촉매로 하여 기질인 타이로신(tyrosine)을 L-DOPA로 변환하고, 상기 L-DOPA에서 부반응으로 생성되는 DOPA퀴논(DOPAquinone)을 환원전위 하에서 다시 L-DOPA로 환원시키는 것을 특징으로 하는 L-DOPA의 전기효소적 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 전기화학적 제조방법은 종래 화학적 방법이나, 생물학적 방법, 그리고 유리된 효소적 방법에 비해, 전환율 및 생산성은 현저히 증가되고, 반응시간은 획기적으로 단축됨을 확인할 수 있어, L-DOPA의 생산비용을 낮추고 및 L-DOPA 자체의 가격 또한 저렴하게 공급하는 것이 가능하다.

L-DOPA, DOPA퀴논, 환원전위, 작동전극, 고정화 효소

Description

Ｌ-ＤＯＰＡ의 전기효소적 제조방법 {Electroenzymatic Process for Manufacturing L-DOPA}

본 발명은 파킨슨씨병의 치료물질인 L-DOPA의 전기효소적 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 타이로시네이즈(tyrosinase)를 효소 촉매로 하여 기질인 타이로신(tyrosine)을 L-DOPA로 변환하고, 상기 L-DOPA에서 부반응으로 생성되는 DOPA퀴논(DOPAquinone)을 환원전위 하에서 다시 L-DOPA로 환원시키는 것을 특징으로 하는 L-DOPA의 전기효소적 제조방법에 관한 것이다.

파킨슨씨병은 뇌 속 신경전달 물질인 도파민(dopamine)이 부족할 때 발생하는 질환으로서, 상기 도파민의 전구체이며 혈액뇌장벽 (blood brain barrier)을 통과할 수 있는 L-DOPA가 상기 파킨슨씨병의 치료물질로 널리 사용되고 있다.

현재 상업적으로 생산되는 L-DOPA는 몬산토사 등에서 비대칭 수소첨가 (asymmetric hydrogenation) 반응을 이용한 화학적 방법으로 생산되고 있으나, 이러한 화학적 방법은 키랄 풀 (chiral pool)을 이용하고, 거울상이성질선택성 균질 수소첨가 (enantioselective homogeneous hydrogenation) 내지 비대칭 수소첨가 반응을 필연적으로 거쳐야 하므로, 합성공정이 복잡하고 고가의 금속촉매를 필요로 하며, 여러 단계의 합성과정을 거침에 따라 전체 수율이 아주 낮은 문제점이 있다. 이 때문에 L-DOPA의 가격이 높게 형성되어 파킨슨씨병 환자들에게 큰 부담으로 작용하고 있는 실정이다.

상기 화학적 방법을 대체하기 위해 전 세포 (whole cell)를 이용한 생물학적 방법과 유리 효소 (isolate enzyme)를 이용하는 효소적 방법이 연구되고 있다.

Erwinia herbicola 또는 Stizolobium hassjoo로 대표되는, Tpl 활성을 가진 전 세포를 배양하고, 상기 세포로부터 생산되는 L-DOPA를 수득하는 생물학적 방법은 상기 화학적 방법의 단점을 어느 정도 극복할 수 있으나, 세포 배양에 따른 탄소원 공급이 필요하고, 무엇보다 세포가 생산하는 다른 호르몬이나 단백질 등이 섞여 있는 배양배지로부터 저농도의 L-DOPA를 분리, 정제하는 복잡한 하부공정을 필요로 하게 된다. 이는 필연적으로 생산비용을 급격히 증가시키는 결과를 초래한다. 나아가, 이러한 생물학적 공정은 세포 배양을 포함하여 반응시간이 매우 길고, 그럼에도 불구하고 전환율은 그다지 높지 않은 한계를 가지고 있다.

상기 생물학적 방법의 한계를 극복하기 위해, 전 세포 대신 유리 타이로시네이즈(tyrosinase. E.C. 1.14.18.1)이용하여 L-DOPA를 생산하는 효소적 방법이 새로운 대안으로서 연구되고 있다.

상기 타이로시네이즈는 크레졸레이즈(cresolase) 활성과 카테콜레이즈(catecholase) 활성 두가지를 가지고 있다. 즉, 도 1에 도시된 바와 같이 타이로시네이즈는 크레졸레이즈 활성에 의해 기질인 L-타이로신을 L-DOPA로 전환하고, 전환된 L-DOPA는 카테콜레이즈 활성에 의해 DOPA퀴논으로 전환된다.

따라서, L-DOPA의 수율을 높이기 위해 DOPA퀴논으로의 연속적 산화를 방지해야 하는 바, 이를 위해 아스코빅산 (ascorbic acid), NADH, NH₂OH와 같은 환원제를 이용해야 한다.

그러나, 이러한 효소적 방법 역시 전환율 및 생산성이 낮아 상기 화학적 방법의 대안으로서 활용하기 곤란하며, 때문에 L-DOPA의 효율적 생산을 위한 방법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 기존의 효소적 방법에서 사용되는 환원제를 전기적 환원력으로 대체하여 전환율과 생산성을 향상시킨 새로운 L-DOPA의 전기효소적 제조방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명 L-DOPA의 전기효소적 제조방법은 상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여, DOPA퀴논의 환원전위 하에서, 타이로시네이즈(tyrosinase)를 촉매로 하여, 타이로신(tyrosine)으로부터 L-DOPA를 생산하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 DOPA퀴논의 환원전위는 -0.1 내지 -0.9 V, 바람직하게는 -0.2 내지 -0.8 V일 수 있다.

또한, 상기 L-DOPA는 전지에서 생산되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 DOPA퀴논의 환원전위는 전지로부터 제공되고, 상기 전지의 작동전극 (working electrode) 또는 환원전극은 다공성 전극인 것이 바람직하다.

또한, 상기 DOPA퀴논의 환원전위는 전지로부터 제공되고, 상기 전지의 작동전극 (working electrode) 또는 환원전극은 카본펠트 (carbon felt) 전극인 것이 바람직하다.

또한, 상기 작동전극 또는 환원전극은 상기 타이로시네이즈가 고정화된 카본펠트 전극인 것이 바람직하다.

또한, 상기 타이로시네이즈가 고정화된 카본펠트 전극은,

상기 카본펠트에 상기 타이로시네이즈를 흡착시키는 단계, 및

상기 카본펠트를 양성자 통과막 (proton exchange membrane)으로 코팅하는 단계

를 포함하여 제조할 수 있다.

또한, 상기 양성자 통과막은 상기 카본펠트에 Nafion^® 용액을 도포하고 건조시켜 제조할 수 있다.

또한, 상기 작동전극 또는 환원전극은 상기 타이로시네이즈가 흡착된 탄소 나노입자를 포함하는 전도성 중합체 전극인 것이 바람직하다.

또한, 상기 타이로시네이즈가 흡착된 탄소 나노입자를 포함하는 전도성 중합체 전극은,

카르복시기(-COOH)를 말단에 갖는 소수성 탄화수소를 탄소 나노입자에 흡착시키는 단계,

상기 카르복시기를 말단에 갖는 소수성 탄화수소가 흡착된 탄소 나노입자와 타이로시네이즈를 혼합하여, 상기 타이로시네이즈의 아민기를 상기 소수성 탄화수소의 카르복시기와 결합시키는 단계, 및

상기 타이로시네이즈가 결합된 탄소 나노입자를 전도성 중합체와 혼합하고, 산화제를 첨가하여 중합시키는 단계

를 포함하여 제조할 수 있다.

또한, 본 발명 L-DOPA의 전기효소적 제조방법은 상기 카르복시기를 말단에 갖는 소수성 탄화수소가 흡착된 탄소 나노입자와 타이로시네이즈를 혼합하는 단계에서, 상기 혼합물에 EDC (1-ethyl-3-(3-dimethyl amonopropyl)carbodiimide hydrochloride), 또는 EDC 및 NHS(N-hydroxysuccinimide)를 첨가하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 카르복시기를 말단에 갖는 소수성 탄화수소는 1-파이렌부티르산 (1-pyrenebutyric acid)인 것이 바람직하다.

또한, 상기 산화제는 (NH₄)₂S₂O₈, FeCl₃, LiClO₄, 또는 암모늄 퍼설페이트 (ammonium persulfate)인 것이 바람직하고, 특히 LiClO₄인 것이 보다 바람직하다.

또한, 상기 전도성 중합체는 아닐린(aniline) 또는 파이롤(pyrrole)인 것이 바람직하고, 특히 파이롤(pyrrole)인 것이 보다 바람직하다.

또한, 상기 반대전극은 ELAT 전극인 것이 바람직하다.

또한, 상기 기준전극은 Ag/AgCl 전극인 것이 바람직하다.

본 발명의 전기화학적 제조방법은 종래 화학적 방법이나, 생물학적 방법, 그리고 유리된 효소적 방법에 비해, 전환율 및 생산성은 현저히 증가되고, 반응시간은 획기적으로 단축됨을 확인할 수 있어, L-DOPA의 생산비용을 낮추고 및 L-DOPA 자체의 가격 또한 저렴하게 공급하는 것이 가능하다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 첨부도면을 참조하여 상세히 설명한다. 우선 각 도면의 구성요소들에 참조부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성요소들에 한해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호로 표기되었음에 유의하여야 한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명 L-DOPA의 전기효소적 제조방법은, 종래 타이로시네이즈 촉매 하에서 타이로신으로부터 L-DOPA를 생산하는 효소적 방법에 있어서, 환원제를 사용하여 부산물인 DOPA퀴논을 다시 L-DOPA로 환원시키던 것을 상기 환원제 대신 전기적 환원력으로 대체한 것을 특징으로 한다. 이를 통해, 환원제 비용을 절감하고 반응액으로부터 상기 환원제를 분리하는 과정을 생략할 수 있어, 분리/정제 과정의 단순화가 가능해진다.

이러한 전기적 방법으로 DOPA퀴논을 L-DOPA로 환원시키는 것이 가능한지 확인하기 위해, 유리탄소 (glassy carbon) 작동전극, 코일백금선 반대전극, Ag/AgCl 기준전극을 사용하여, L-DOPA의 전압전류도표(voltammogram)를 구하였다. 상기 전기적 환원력은 DOPA퀴논의 환원전위로 달성되며 상기 전위는 -0.1 내지 -0.9 V, 바 람직하게는 -0.2 내지 -0.8 V일 수 있다.

이러한 L-DOPA의 전기효소적 제조는 환원전극을 포함하는 전지에서 이루어지는 것이 바람직하고, 특히 작동전극 (working electrode), 반대전극 (counter electrode) 및 기준전극 (reference electrode)을 포함하는 전지에서 이루어지는 것이 보다 바람직하다. 상기 전지의 인산(phosphate) 버퍼 전해액에 기질인 타이로신과 촉매인 타이로시네이즈를 첨가하여 반응을 진행시킨다.

여기서, 상기 반대전극은 ELAT 전극인 것이, 그리고 상기 기준전극은 Ag/AgCl 전극인 것이 바람직하다.

그리고, 상기 작동전극 또는 환원전극은 표면적이 넓은 다공성의 카본펠트 (carbon felt) 전극인 것이 바람직하고, 특히 상기 카본펠트에 상기 타이로시네이즈를 고정화시키는 것이 더욱 바람직하다.

상기 타이로시네이즈가 고정화된 카본펠트 전극은, 우선 카본펠트에 타이로시네이즈를 흡착시키고, 상기 카본펠트를 실온에서 건조시킨 후, 상기 카본펠트를 양성자 통과막 (proton exchange membrane)으로 코팅함으로써 제조된다. 여기서, 상기 양성자 통과막은 상기 카본펠트에 양성자가 통과하여 DOPA퀴논을 L-DOPA로 환원시킬 수 있는 막이면 제한이 없으며, 예컨대 Nafion^® 용액 (Sigma, 미국)을 코팅하여 형성시킬 수 있다.

또한, 상기 작동전극 또는 환원전극은 상기 카본펠트 전극 외에 타이로시네이즈가 흡착된 탄소 나노입자를 포함하는 전도성 중합체 전극인 것이 더욱 바람직 하다.

상기 타이로시네이즈가 흡착된 탄소 나노입자를 포함하는 전도성 중합체 전극은, 우선 카르복시기(-COOH)를 말단에 갖는 소수성 탄화수소를 탄소 나노입자에 흡착시키고, 상기 탄소 나노입자와 타이로시네이즈를 혼합하여, 상기 타이로시네이즈의 아민기를 상기 소수성 탄화수소의 카르복시기와 결합시킨 후, 상기 탄소 나노입자를 전도성 중합체와 혼합하고, 산화제를 첨가하여 화학적으로 중합시킴으로써 제조된다.

이때, 상기 소수성 탄화수소가 흡착된 탄소 나노입자와 타이로시네이즈를 혼합하는 단계에서, 상기 소수성 탄화수소의 카르복시기와 타이로시네이즈의 아민기의 결합을 촉진시키기 위해, 상기 혼합물에 EDC (1-ethyl-3-(3-dimethyl amonopropyl)carbodiimide hydrochloride), 또는 EDC 및 NHS(N-hydroxysuccinimide)를 첨가하는 것이 보다 바람직하다.

여기서, 상기 카르복시기를 말단에 갖는 소수성 탄화수소는 1-파이렌부티르산 (1-pyrenebutyric acid)인 것이 바람직하다. 그리고, 중합을 위한 상기 산화제는 (NH₄)₂S₂O₈, FeCl₃, LiClO₄, 또는 암모늄 퍼설페이트 (ammonium persulfate)인 것이 바람직하고, 특히 LiClO₄인 것이 보다 바람직하다.

이하, 본 발명의 실시예에 대하여 설명한다.

실시예

실시예 1: 유리 효소 (1)

도 2에 도시된 바와 같이 회분식 반응기에 작동전극으로 카본펠트, 반대전극으로 ELAT, 기준전극으로 Ag/AgCl을 설치하고, pH 6.5의 인산 버퍼 30 ㎖를 채운 후, L-타이로신 (1 mM. Sigma, 미국) 및 타이로시네이즈 (250 단위. Sigma, 미국)를 첨가하고, -0.3 V의 환원전위로 설정한 다음 반응시켰다. 시간 경과에 따른 L-DOPA 및 L-타이로신의 농도를 측정하고, 이를 도 3에 나타내었다.

상기 L-DOPA는 개량 Arnow법으로 측정하였는데, 그 과정은 인산 버퍼 (50 mM, pH 6.5) 10 ml에 소듐 나이트레이트 (sodium nitrate) 2 g 및 소듐 몰리브데이트 (sodium molybdate) 2 g을 첨가하여 혼합한 후 0.5 ml을 취하고, 이를 0.5 ml의 샘플과 혼합하여 1 시간 동안 배양한 후, UV 분광광도계 (UV spectrometer. Varian, 미국)를 이용하여 460 nm에서 흡광도를 측정하는 단계로 이루어진다.

그리고, 타이로신은 샘플을 OPH(o-phtalaldehyde)로 전처리한 후, HPLC (Agilent, 미국)로 측정하였다. HPLC의 운전조건은 다음과 같다:

컬럼 : C-18 reverse phase (Agilent zorbax eclipse. Agilent, 미국)

이동상 : borate buffer (100 mM, pH 9.0)

검출기 : Fluoremetric detector (Waters 474. Waters, 미국)

λex = 230 nm, λem = 445 nm

체류시단 : 9. 79 min

측정 결과, 초기 1 시간까지 급격하게 L-DOPA가 생성된 후 완만하게 생성량 이 증가하는 것을 확인할 수 있다.

실시예 2: 유리 효소 (2)

실시예 1과 동일한 과정을 거치되, 타이로시네이즈의 양을 변화시키며, L-DOPA의 생성량을 관찰하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

관찰 결과 실시예 1과 마찬가지로 초기 1 시간까지는 급격하게 L-DOPA가 생성되다 이후 완만하게 증가하거나, 타이로시네이즈의 양이 많은 경우 (2000 단위) L-DOPA의 양이 일부 감소하는 것이 관찰되었다.

실시예 3: 고정화 효소 (1)

실시예 1과 동일한 과정을 거치되, 타이로시네이즈는 인산 버퍼에 첨가하지 않고, 카본펠트 전극에 고정화시켰다. 이러한 타이로시네이즈가 고정화된 카본펠트 전극은 우선, 카본펠트에 2000 단위 (Sigma, 미국)의 타이로시네이즈를 흡착시킨 후, 실온에서 건조하고, Nafion^® 용액 (5 중량%의 물 및 알콜 용액. Sigma, 미국)을 도포하여 코팅막을 형성하여 제조하였다. 본 전극을 작동전극으로 하여 시간 경과에 따른 L-DOPA의 생성량을 도 5에 나타내었다.

실시예 4: 고정화 효소 (2)

실시예 1과 동일한 과정을 거치되, 타이로시네이즈는 인산 버퍼에 첨가하지 않고, 탄소 나노입자 - 전도성 중합체 복합재료 전극에 고정화시켰다. 이러한 타이로시네이즈가 고정화된 탄소 나노입자 - 전도성 중합체 복합재료 전극은 우선, 탄소 나노입자를 1-파이렌부티르산 (1-pyrenebutyric acid)로 처리하여 카르복시기 를 노출시키고, EDC (1-ethyl-3-(3-dimethyl amonopropyl)carbodiimide hydrochloride) 중에서 타이로시네이즈 2000 단위 (Sigma, 미국)를 첨가 혼합하여 상기 탄소 나노입자에 타이로시네이즈를 결합시켰다. 상기 타이로시네이즈가 결합된 탄소 나노입자와 파이롤(pyrrole) 단량체를 혼합하고, LiClO₄를 첨가하여 중합시켜, 1.5 × 1.5 × 0.2 (가로×세로×두께) 규격의 전극을 제조하였다. 본 전극을 작동전극으로 하여 시간 경과에 따른 L-DOPA의 생성량을 도 5에 나타내었다.

도 5에 도시된 바와 같이, 고정화된 효소를 이용한 결과 특히 실시예 4의 복합재료 전극의 경우 전환율이 95.9 %에 이르는 현저한 개선효과를 확인할 수 있었으며, 생산성 역시 1576 mg/l-h에 이르렀다.

나아가, 실시예 3과 실시예 4의 전극을 재이용하고 활성 감소를 관찰한 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었는 바, 7 회의 재이용에도 실시예 3은 거의 활성이 감소하지 않았으며, 실시예 4에서도 80 % 이상의 활성을 유지함을 알 수 있었다.

이러한 본 발명의 전기효소적 L-DOPA 제조방법을 종래의 제조방법과 비교한 결과를 표 1에 나타내었다.

반응 유형	생산성 (mg/l-h)	전환율 (%)	장단점	비고
화학적 방법		44	여러 단계의 반응	Catalysis Communications 5: 631
고정화 효소 효소적 방법	1.7		긴 작업시간 (170 시간) 낮은 조작 안정성	Biotechnol. Bioeng. 51; 141
고정화 효소 효소적 방법	4.5	1.8	낮은 전환율	Enzyme Microb. Technol. 40; 683
Erwinia herbicola 생물학적 방법	1800	7.34	낮은 전환율 기질 혼합물	J. Biotech. 115; 303
Stizolobium hassjoo 생물학적 방법	3.13		긴 작업시간 (10 일)	Enzyme Microb. Technol. 30; 779
유리 효소 효소적 방법	268	68.3	높은 전환율 짧은 작업시간 (1 시간)	실시예 2 (2000 단위)
고정화 효소 효소적 방법	1576	95.9	높은 전환율	실시예 4

상기 표 1에서 확인할 수 있듯이 본 발명의 제조방법은 종래 화학적 방법이나, 효소적 방법, 생물학적 방법에 비해 작업시간은 현저히 단축시키면서도, 전환율이나 생산성이 획기적으로 증가된 방법이므로 실제 생산현장에 바로 적용이 가능한 기술임을 알 수 있다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대해서 도시하고 설명하였으나, 본 발명은 상술한 특정의 실시예에 한정되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형 실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 범위는 위의 실시예에 국한해서 해석되어서는 안되며, 후술하는 특허청구범위 뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 할 것이다.

도 1은 L-DOPA의 생성반응을 나타낸 도면이다.

도 2는 본 발명의 제조방법에 사용되는 전지의 일실시예를 도시한 개략도이다.

도 3은 유리 타이로시네이즈 250 단위 사용시 시간 경과에 따른 L-DOPA 생산량을 나타낸 그래프이다.

도 4는 유리 타이로시네이즈의 양을 달리하며 시간 경과에 따른 L-DOPA 생산량을 관찰한 그래프이다.

도 5는 고정화 타이로시네이즈 2000 단위 사용시 시간 경과에 따른 L-DOPA 생산량을 나타낸 그래프이다.

도 6은 본 발명의 카본펠트 전극의 재이용 횟수에 따른 상대 활성을 나타낸 그래프이다.

도 7은 본 발명의 복합재료 전극의 재이용 횟수에 따른 상대 활성을 나타낸 그래프이다.

Claims

DOPA퀴논의 환원전위 하에서, 타이로시네이즈(tyrosinase)를 촉매로 하여, 타이로신(tyrosine)으로부터 L-DOPA를 생산하고,

상기 DOPA퀴논의 환원전위는 전지로부터 제공되고,

상기 전지의 작동전극 또는 환원전극은 카본펠트 (carbon felt) 전극인 것을 특징으로 하는, L-DOPA의 전기효소적 제조방법.
청구항 1에 있어서,

상기 DOPA퀴논의 환원전위는 -0.1 내지 -0.9 V인 것을 특징으로 하는, L-DOPA의 전기효소적 제조방법.
삭제
청구항 1에 있어서,

상기 작동전극 또는 환원전극은 상기 타이로시네이즈가 고정화된 카본펠트 전극인 것을 특징으로 하는, L-DOPA의 전기효소적 제조방법.
청구항 1에 있어서,

상기 DOPA퀴논의 환원전위는 전지로부터 제공되고, 상기 전지의 작동전극 또는 환원전극은 상기 타이로시네이즈가 흡착된 탄소 나노입자를 포함하는 전도성 중합체 전극인 것을 특징으로 하는, L-DOPA의 전기효소적 제조방법.
청구항 5에 있어서,

상기 타이로시네이즈가 흡착된 탄소 나노입자를 포함하는 전도성 중합체 전극은,

카르복시기(-COOH)를 말단에 갖는 소수성 탄화수소를 탄소 나노입자에 흡착시키는 단계,

상기 카르복시기를 말단에 갖는 소수성 탄화수소가 흡착된 탄소 나노입자와 타이로시네이즈를 혼합하여, 상기 타이로시네이즈의 아민기를 상기 소수성 탄화수소의 카르복시기와 결합시키는 단계, 및

상기 타이로시네이즈가 결합된 탄소 나노입자를 전도성 중합체와 혼합하고, 산화제를 첨가하여 중합시키는 단계

를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는, L-DOPA의 전기효소적 제조방법.
청구항 6에 있어서,

상기 카르복시기를 말단에 갖는 소수성 탄화수소는 1-파이렌부티르산 (1-pyrenebutyric acid)인 것을 특징으로 하는, L-DOPA의 전기효소적 제조방법.
청구항 6에 있어서,

상기 전도성 중합체는 파이롤(pyrrole)인 것을 특징으로 하는, L-DOPA의 전기효소적 제조방법.