KR101062316B1 - Signal Amplification Method of Surface Plasmon Resonance Sensor Using Carbon Nanotubes - Google Patents
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Abstract
본 발명은 탄소나노튜브를 이용한 표면 플라즈몬 공명 센서의 신호 증폭 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 탄소나노튜브를 항체와 같은 표적 단백질 감지용 생체분자와 결합시켜 표면 플라즈몬 공명 센서의 신호를 증폭시킴으로써 미량의 표적 단백질을 신속하고 정확하게 분석하는 탄소나노튜브를 이용한 표면 플라즈몬 공명 센서의 신호 증폭 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a signal amplification method of a surface plasmon resonance sensor using carbon nanotubes, and more particularly, by amplifying a signal of the surface plasmon resonance sensor by combining carbon nanotubes with a biomolecule for detecting a target protein such as an antibody. The present invention relates to a method for amplifying a surface plasmon resonance sensor using carbon nanotubes to rapidly and accurately analyze a target protein.
표면 플라즈몬 공명법, 탄소나노튜브, 단백질 칩, SPR 신호 증폭 Surface Plasmon Resonance, Carbon Nanotubes, Protein Chips, SPR Signal Amplification
Description
본 발명은 탄소나노튜브를 이용한 표면 플라즈몬 공명 센서의 신호 증폭 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 탄소나노튜브를 항체와 같은 표적 단백질 감지용 생체분자와 결합시켜 표면 플라즈몬 공명 센서의 신호를 증폭시킴으로써 미량의 표적 단백질을 신속하고 정확하게 분석하는 탄소나노튜브를 이용한 표면 플라즈몬 공명 센서의 신호 증폭 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a signal amplification method of a surface plasmon resonance sensor using carbon nanotubes, and more particularly, by amplifying a signal of the surface plasmon resonance sensor by combining carbon nanotubes with a biomolecule for detecting a target protein such as an antibody. The present invention relates to a method for amplifying a surface plasmon resonance sensor using carbon nanotubes to rapidly and accurately analyze a target protein.
특정한 단백질을 정량 분석하는 방법은 효소면역 측정법(enzyme immunoassay), 효소결합면역흡수법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 및 방사면역 측정법(radioimmunoassay) 등이 있다. 이 중에서도 ELISA 법은 항체에 효소를 결합시켜 항원-항체 반응을 확인하는 방법으로, 그 방법이 간단하고 비용이 많이 들지 않으며 다량 분석이 가능하여 현재 가장 널리 쓰이고 있는 항원-항체 분 석법의 하나가 되고 있다. ELISA 방법은 매우 민감한 반응이면서도 방사능면역측정법에서처럼 방사능을 사용하지 않는다는 이점이 있어서 많이 이용되고 있다. 방사능면역측정법은 민감도(sensitivity)가 높지만 방사능 물질을 이용한다는 점에서 안전성(safety)이 문제가 된다. Methods for quantitative analysis of specific proteins include enzyme immunoassay, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and radioimmunoassay. Among these, ELISA is a method of binding an enzyme to an antibody to confirm an antigen-antibody reaction. The method is simple, inexpensive, and can be analyzed in large quantities, making it one of the most widely used antigen-antibody assays. have. The ELISA method is widely used because it is very sensitive and does not use radioactivity as in radioimmunoassay. Radioimmunoassays have high sensitivity but safety is a problem in that they use radioactive materials.
따라서, 상기에서 기술하고 있는 종래 기술들의 단점을 극복할 수 있는 대안으로 부각되는 분석기술로 굴절률의 변화를 측정하여 생체물질의 상호작용을 인지할 수 있는 표면 플라즈몬 공명법(Surface Plasmon Resonance, SPR법)이 있다. SPR법은 형광물질과 같은 별도의 표지물질 없이 광학적 원리를 이용하여 분자들 간의 상호작용을 계측할 수 있고, 반응의 진행상황을 실시간으로 측정할 수 있다. SPR기술은 단백질과 같은 생체물질이 센서 표면에 결합될 경우 신호 변화를 일으키는 현상을 이용하여 바이오센서 및 바이오칩 측정방법으로 많이 이용되고 있다(Nice, E.C. and Catimel, B., Bioassays, 1999, 21, 339-352). 표면 플라즈몬(surface plasmon)이란 금속 표면과 같은 도체 표면을 따라서 전파하는 자유전자의 양자화 된 진동이다. 이와 같은 표면 플라즈몬은 프리즘과 같은 유전매체를 지나 유전매체의 임계각 이상의 각도로 금속박막에 입사하는 입사광에 의해 여기 되며 일정한 각도에서 공명을 일으킨다. 이러한 SPR이 일어나는 입사각, 즉 공명각은 금속박막에 근접한 물질의 굴절률 변화에 민감하다. SPR센서는 이러한 성질을 이용하여 금속박막에 근접한 물질, 즉 시료의 굴절률 변화로부터 시료의 정량 분석, 정성 분석 및 박막인 시료의 두께를 측정하는데 이용된다. 그러나 기존의 SPR센서는 낮은 농도의 생체물질을 분석하기에는 그 감도가 떨어지는 문제점이 있다(Homola, J., Yee, S.S. and Gauglitz, G., Sens. Actuators B, 1999, 54, 3-15). Therefore, Surface Plasmon Resonance (SPR) method that can recognize the interaction of biological materials by measuring the change of refractive index by an analytical technique, which is highlighted as an alternative to overcome the disadvantages of the prior art described above. There is. The SPR method can measure interactions between molecules using optical principles without a separate label such as a fluorescent material, and can measure the progress of a reaction in real time. SPR technology is widely used as a method for measuring biosensors and biochips by using a phenomenon that changes a signal when a biomaterial such as a protein is bound to a sensor surface (Nice, EC and Catimel, B., Bioassays , 1999, 21, 339-352). Surface plasmons are quantized vibrations of free electrons that propagate along a conductor surface, such as a metal surface. The surface plasmon is excited by incident light incident on the metal thin film at an angle greater than or equal to the critical angle of the dielectric medium through a dielectric medium such as a prism and causes resonance at a constant angle. The angle of incidence, ie the resonance angle, at which this SPR occurs is sensitive to the change in refractive index of the material in proximity to the metal thin film. SPR sensor is used to measure the thickness of a sample which is close to the metal thin film, that is, the quantitative analysis, qualitative analysis and thin film of the sample from the refractive index change of the sample. However, the conventional SPR sensor has a problem that the sensitivity is low to analyze a low concentration of biomaterials (Homola, J., Yee, SS and Gauglitz, G., Sens. Actuators B , 1999, 54, 3-15).
종래의 SPR 신호 증폭을 위한 연구들을 살펴보면, 대한민국 등록특허 제0511055호에는 분석하고자 하는 단백질을 일차 항체로 포획하고 이를 이차 항체에 결합시킨 뒤 서양고추냉이의 과산화효소(Horseradish Peroxidase; 이하 "HRP"로 표기함)를 결합시키고 효소에 반응하는 물질을 첨가하여 칩 표면에 침전물을 형성시켜 SPR 신호를 증폭시키는 기술이 공개되어 있다. 국제공개특허 제01/09388호에는 단백질 등의 분석물질을 일차 항체로 포획하고 이차 항체가 접합된 콜로이드 금속 나노 입자(Colloidal metal nanoparticle)를 이용하는 기술이 공개되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허 제0737689호에는 표적 단백질을 금 나노입자와 효소침전반응을 통한 이차 증폭방법을 이용하여 SPR 신호의 민감도를 증가시키는 기술이 공개되어 있다. Looking at the conventional studies for amplification of the SPR signal, Korean Patent No. 0511055 captures the protein to be analyzed with a primary antibody and binds it to a secondary antibody and then horseradish peroxidase (Horseradish Peroxidase; "HRP") A technique for amplifying the SPR signal by forming a precipitate on the surface of the chip by binding to and adding a substance that reacts with the enzyme is disclosed. International Patent Publication No. 01/09388 discloses a technique using colloidal metal nanoparticles that capture analytes such as proteins as primary antibodies and conjugated secondary antibodies. In addition, the Republic of Korea Patent No. 0737689 discloses a technique for increasing the sensitivity of the SPR signal by using a secondary amplification method through the target protein, gold nanoparticles and enzyme precipitation reaction.
종래의 SPR법은 별도의 표지 없이 생체 물질의 결합을 직접적으로 측정할 수 있는 장점이 있으나, 미량의 생체 물질을 측정하고자 할 때는 별도의 신호 증폭 기술이 요구된다.Conventional SPR method has the advantage that can directly measure the binding of the biological material without a separate label, but separate signal amplification technology is required to measure the trace amount of the biological material.
본 발명의 목적은 표면이 개질된 탄소나노튜브와 표적 단백질에 특이적인 생체분자의 복합체를 이용하여 SPR 센서 칩의 신호를 증폭시키는 방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a method for amplifying a signal of an SPR sensor chip using a complex of surface-modified carbon nanotubes and a biomolecule specific for a target protein.
본 발명의 다른 목적은 상기 단백질 정량을 위한 SPR 센서 시스템을 이용하여 다양한 농도, 특히 미량으로 존재하는 단백질을 신속하고 효과적으로 정량할 수 있는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for quickly and effectively quantifying proteins present in various concentrations, especially trace amounts, using the SPR sensor system for quantifying proteins.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 In order to achieve the above object, the present invention
탄소나노튜브 및 표적 단백질에 특이적인 생체분자로 이루어진 복합체를 제조하는 단계; 및Preparing a complex consisting of carbon nanotubes and biomolecules specific for the target protein; And
표적 단백질을 포함하는 시료와 상기 복합체를 반응시키는 단계를 포함하는 SPR 센서 칩의 신호를 증폭시키는 방법을 제공한다. It provides a method for amplifying a signal of the SPR sensor chip comprising the step of reacting the sample containing the target protein and the complex.
본 발명은 또한The invention also
i) SPR (Surface Plasmon Resonance) 칩의 금박막 표면에 자기조립단분자층 (self assembled monolayer)을 형성하는 단계;i) forming a self assembled monolayer on the surface of the gold thin film of the Surface Plasmon Resonance (SPR) chip;
ii) 자기조립단분자층에 표적 단백질에 대한 생체분자를 고정화시키는 단계;ii) immobilizing the biomolecule for the target protein on the self-assembled monolayer;
iii) 탄소나노튜브 및 표적 단백질에 특이적인 생체분자로 이루어진 복합체를 제조하는 단계;iii) preparing a complex consisting of carbon nanotubes and biomolecules specific for the target protein;
iv) 표적 단백질을 포함하는 시료와 탄소나노튜브-생체분자 복합체를 반응시켜 SPR 신호를 증폭시키는 단계, 또는iv) amplifying the SPR signal by reacting the sample containing the target protein with the carbon nanotube-biomolecule complex, or
표적 단백질을 포함하는 시료를 SPR칩과 1차 반응시키고, 탄소나노튜브-생체분자 복합체와 2차 반응시키는 단계; 및First reacting the sample containing the target protein with the SPR chip and secondly reacting the carbon nanotube-biomolecule complex; And
v) SPR 칩의 금박막 표면에 고정화된 물질에 대한 굴절지수변화 관계를 이용하여 표적 단백질의 양을 측정하는 단계를 포함하는 단백질 정량방법에 관한 것이다.and v) measuring the amount of the target protein using the refractive index change relationship for the material immobilized on the gold thin film surface of the SPR chip.
본 발명은 표면이 개질된 탄소나노튜브를 이용하여 SPR 센서의 신호를 효과적으로 증폭시킬 수 있는 SPR 센서 시스템을 이용하여 미량의 단백질을 신속하고 효과적으로 정량할 수 있어 다양한 농도의 단백질 분석 연구 등이 가능하다.The present invention can quickly and effectively quantify trace proteins using the SPR sensor system that can effectively amplify the signal of the SPR sensor using the modified carbon nanotubes, so that various concentrations of protein analysis can be conducted. .
이하, 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.EMBODIMENT OF THE INVENTION Hereinafter, the structure of this invention is demonstrated concretely.
본 발명은 The present invention
탄소나노튜브 및 표적 단백질에 특이적인 생체분자로 이루어진 복합체를 제 조하는 단계; 및Preparing a complex consisting of carbon nanotubes and biomolecules specific for the target protein; And
표적 단백질을 포함하는 시료와 상기 복합체를 반응시키는 단계를 포함하는 SPR 센서 칩의 신호를 증폭시키는 방법에 관한 것이다. A method for amplifying a signal of an SPR sensor chip comprising reacting a sample containing a target protein with the complex.
상기 탄소나노튜브는 특별히 제한하지는 않으나, 높은 소수성의 다층 탄소나노튜브(multi-wall carbon nanotube)를 사용하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 분산성을 높이기 위해 카르복실기, 하이드록실기, 알데히드기, 아민기, 티올기, 또는 카르보닐기 등과 같은 다양한 기능기 중 적어도 하나로 표면이 개질된 것을 사용하는 것이 좋다.The carbon nanotubes are not particularly limited, but it is preferable to use high hydrophobic multi-wall carbon nanotubes, and more preferably, to increase dispersibility, a carboxyl group, a hydroxyl group, an aldehyde group, and an amine group. It is preferable to use a surface modified with at least one of various functional groups such as a thiol group, a carbonyl group and the like.
상기 탄소나노튜브의 표면을 개질하는 방법은 특별히 제한하지는 않으나, 탄소나노튜브를 산성 용매에서 열을 가하여 반응시킨 다음 상온에서 냉각시키고, 물의 첨가 및 여과과정을 통해 중성 pH의 탄소나노튜브 용액을 제조하고, 초음파 처리하여 표면을 개질시키는 것이 바람직하다.The method of modifying the surface of the carbon nanotubes is not particularly limited, but the carbon nanotubes are reacted by applying heat in an acidic solvent, cooled at room temperature, and a carbon nanotube solution having a neutral pH is added by adding water and filtering. It is preferable to modify the surface by sonication.
상기 표적 단백질에 특이적인 생체분자는 특별히 제한하지는 않으나, 효소, 단백질, 펩타이드, 뉴클레오티드, 핵산, 다당류, 지방산, 또는 지질 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는, 표적 단백질의 단클론 또는 다클론 항체, 또는 이들 항체와 서양고추냉이 유래의 과산화효소 등이 결합된 융합단백질과 같은 표적 단백질에 특이적인 항체를 사용하는 것이 좋다.Biomolecules specific for the target protein are not particularly limited, and enzymes, proteins, peptides, nucleotides, nucleic acids, polysaccharides, fatty acids, lipids, and the like may be used alone or in combination of two or more. More preferably, an antibody specific for a target protein such as a monoclonal or polyclonal antibody of the target protein or a fusion protein in which these antibodies are combined with horseradish-derived peroxidase or the like is preferably used.
상기 표적 단백질에 특이적인 항체로는 특별히 제한하지는 않으나, 표적 단백질인 에리스로포에틴(erythropoietin), 또는 과립구-대식세포 콜로니 자극인 자(granulocyte- macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)와 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 또는 다클론 항체를 사용할 수 있다.The antibody specific for the target protein is not particularly limited, but specifically with the target protein erythropoietin, or granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). Monoclonal or polyclonal antibodies that can bind can be used.
상기 탄소나노튜브와 표적 단백질에 특이적인 생체분자로 이루어진 복합체를 제조하는 방법은 특별히 제한하지는 않으나, 표면이 개질된 탄소나노튜브와 이차 항체를 0 내지 4℃에서 10 내지 30시간 동안 반응시키는 것이 바람직하다.The method for preparing the complex consisting of the carbon nanotubes and the biomolecules specific for the target protein is not particularly limited, but the surface-modified carbon nanotubes and the secondary antibody are preferably reacted at 0 to 4 ° C. for 10 to 30 hours. Do.
또한, 본 발명의 SPR 센서칩은 표면에 자기조립단분자층이 형성될 수 있다.In addition, in the SPR sensor chip of the present invention, a self-assembled monolayer may be formed on a surface thereof.
본 발명에서 "자기조립단분자층"이란 용어는 SPR 칩 표면에 생성된 규칙적으로 잘 정렬된 유기 분자막을 뜻하는 것으로, 카르복실기(-COOH), 또는 카르복실기(-COOH) 및 하이드록시기(-OH) 중 어느 하나를 갖는 것이 바람직하다. In the present invention, the term "self-assembled monolayer" refers to a regularly ordered organic molecular film produced on the surface of the SPR chip, carboxyl group (-COOH), or carboxyl group (-COOH) and hydroxyl group (-OH) It is preferable to have either.
상기 자기조립단분자층은 머캅토 알킬 카르복실산(mercapto alkyl carboxylic acid) 용액에 SPR 칩을 담지시켜 형성될 수 있다.The self-assembled monolayer may be formed by supporting an SPR chip in a mercapto alkyl carboxylic acid solution.
상기 머캅토 알킬 카르복실산의 예로는 머캅토운데카노익산(mercaptoundecanoic acid), 머캅토헥사데카노익산(mercapto-hexadecanoic acid; MHA), 또는 3-머캅토-프로피온산(3-mercapto-propionic acid, 3-MPA) 등이 있으며, 하이드록시기를 가지는 분자막을 형성하는 화합물로는 머캅토운데카놀(mercaptoundecanol; MUOH)이 있다. 상기 화합물을 단독 또는 2종 이상 사용하여 자기조립단분자층을 형성할 수 있다. Examples of the mercapto alkyl carboxylic acid include mercaptoundecanoic acid, mercapto-hexadecanoic acid (MHA), or 3-mercapto-propionic acid, 3-MPA), and the like to form a molecular film having a hydroxyl group includes mercaptoundecanol (MUOH). The compound may be used alone or in combination of two or more to form a self-assembled monolayer.
상기 머캅토 알킬 카르복실산 용액은 머캅토 알킬 카르복실산을 수성 용매에 1:9의 비율로 녹여 제조하는 것이 바람직하다.The mercapto alkyl carboxylic acid solution is preferably prepared by dissolving mercapto alkyl carboxylic acid in an aqueous solvent at a ratio of 1: 9.
상기 수성 용매로는 특별히 제한하지는 않으나, 에탄올 등의 알코올이 바람직하다.Although it does not restrict | limit especially as said aqueous solvent, Alcohol, such as ethanol, is preferable.
또한, 상기 표면에 자기조립단분자층이 형성된 SPR 칩은 표적 단백질을 포획할 수 있는 항체와 같은 표적 단백질에 대한 생체분자가 고정될 수 있다.In addition, the SPR chip having a self-assembled monolayer on the surface may be immobilized with a biomolecule for a target protein such as an antibody capable of capturing the target protein.
상기 표적 단백질에 대한 생체분자는 효소, 단백질, 펩타이드, 뉴클레오티드, 핵산, 다당류, 지방산, 또는 지질 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는, 표적 단백질의 단클론 항체(monoclonal antibody) 또는 다클론 항체(polyclonal antibody), 또는 이들 항체와 서양고추냉이 유래의 과산화효소 등이 결합된 융합단백질 등과 같은 표적 단백질에 특이적인 항체를 사용하는 것이 좋다.As the biomolecule for the target protein, enzymes, proteins, peptides, nucleotides, nucleic acids, polysaccharides, fatty acids, lipids, etc. may be used alone or in combination of two or more. More preferably, an antibody specific for a target protein, such as a monoclonal antibody or a polyclonal antibody of the target protein, or a fusion protein in which these antibodies are combined with horseradish-derived horseradish, is used. Good to do.
상기 표적 단백질에 대한 항체로는 특별히 제한하지는 않으나, 표적 단백질인 에리스로포에틴(erythropoietin), 또는 과립구-대식세포 콜로니 자극인자(granulocyte- macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)와 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 또는 다클론 항체를 사용할 수 있다.The antibody to the target protein is not particularly limited, but specifically binds to a target protein, erythropoietin, or granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). Monoclonal or polyclonal antibodies can be used.
본 발명은 또한The invention also
i) SPR (Surface Plasmon Resonance) 칩의 금박막 표면에 자기조립단분자층 (self assembled monolayer)을 형성하는 단계;i) forming a self assembled monolayer on the surface of the gold thin film of the Surface Plasmon Resonance (SPR) chip;
ii) 자기조립단분자층에 표적 단백질에 대한 생체분자를 고정화시키는 단계;ii) immobilizing the biomolecule for the target protein on the self-assembled monolayer;
iii) 탄소나노튜브 및 표적 단백질에 특이적인 생체분자로 이루어진 복합체를 제조하는 단계;iii) preparing a complex consisting of carbon nanotubes and biomolecules specific for the target protein;
iv) 표적 단백질을 포함하는 시료와 탄소나노튜브-생체분자 복합체를 반응시켜 SPR 신호를 증폭시키는 단계, 또는iv) amplifying the SPR signal by reacting the sample containing the target protein with the carbon nanotube-biomolecule complex, or
표적 단백질을 포함하는 시료를 SPR칩과 1차 반응시키고, 탄소나노튜브-생체분자 복합체와 2차 반응시키는 단계; 및First reacting the sample containing the target protein with the SPR chip and secondly reacting the carbon nanotube-biomolecule complex; And
v) SPR 칩의 금박막 표면에 고정화된 물질에 대한 굴절지수변화 관계를 이용하여 표적 단백질의 양을 측정하는 단계를 포함하는 단백질 정량방법에 관한 것이다.and v) measuring the amount of the target protein using the refractive index change relationship for the material immobilized on the gold thin film surface of the SPR chip.
본 발명의 단백질의 정량방법을 도 1을 참조하여 단계별로 구체적으로 설명하면 다음과 같다.The method for quantifying the protein of the present invention will be described in detail with reference to FIG. 1 as follows.
제1단계는 SPR 칩의 금속 박막 표면에 자기조립단분자층을 형성하는 단계이다. The first step is to form a self-assembled monolayer on the surface of the metal thin film of the SPR chip.
상기 자기조립단분자층은 카르복실기(-COOH), 또는 카르복실기(-COOH) 및 하이드록시기(-OH) 중 어느 하나를 가지는 층으로, 머캅토 알킬 카르복실산(mercapto alkyl carboxylic acid) 용액에 SPR 칩을 담지시켜 형성될 수 있다.The self-assembled monolayer is a layer having any one of a carboxyl group (-COOH), or a carboxyl group (-COOH) and a hydroxyl group (-OH), and a SPR chip in a mercapto alkyl carboxylic acid solution. It can be formed by supporting.
상기 머캅토 알킬 카르복실산의 예로는 머캅토운데카노익산(mercaptoundecanoic acid), 머캅토헥사데카노익산(mercapto-hexadecanoic acid; MHA), 또는 3-머캅토-프로피온산(3-mercapto-propionic acid, 3-MPA) 등이 있으며, 하이드록시기를 가지는 분자막을 형성하는 화합물로는 머캅토운데카놀(mercaptoundecanol; MUOH)이 있다. 상기 화합물을 단독 또는 2종 이상 사용하여 자기조립단분자층을 형성할 수 있다. Examples of the mercapto alkyl carboxylic acid include mercaptoundecanoic acid, mercapto-hexadecanoic acid (MHA), or 3-mercapto-propionic acid, 3-MPA), and the like to form a molecular film having a hydroxyl group includes mercaptoundecanol (MUOH). The compound may be used alone or in combination of two or more to form a self-assembled monolayer.
상기 머캅토 알킬 카르복실산 용액은 머캅토 알킬 카르복실산을 수성 용매에 1:9의 비율로 녹여 제조하는 것이 바람직하다.The mercapto alkyl carboxylic acid solution is preferably prepared by dissolving mercapto alkyl carboxylic acid in an aqueous solvent at a ratio of 1: 9.
상기 수성 용매로는 특별히 제한하지는 않으나, 에탄올 등의 알코올이 바람직하다.Although it does not restrict | limit especially as said aqueous solvent, Alcohol, such as ethanol, is preferable.
제2단계는 SPR 칩의 자기조립단분자층 상에 일차 항체와 같은 표적 단백질에 대한 생체분자를 고정하는 단계이다.The second step is to fix biomolecules for a target protein such as a primary antibody on the self-assembled monolayer of the SPR chip.
상기 표적 단백질에 대한 생체분자는 효소, 단백질, 펩타이드, 뉴클레오티드, 핵산, 다당류, 지방산, 또는 지질 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는, 표적 단백질의 단클론 항체(monoclonal antibody) 또는 다클론 항체(polyclonal antibody), 또는 이들 항체와 서양고추냉이 유래의 과산화효소 등이 결합된 융합단백질 등과 같은 표적 단백질에 특이적인 항체를 사용하는 것이 좋다.As the biomolecule for the target protein, enzymes, proteins, peptides, nucleotides, nucleic acids, polysaccharides, fatty acids, lipids, etc. may be used alone or in combination of two or more. More preferably, an antibody specific for a target protein, such as a monoclonal antibody or a polyclonal antibody of the target protein, or a fusion protein in which these antibodies are combined with horseradish-derived horseradish, is used. Good to do.
상기 표적 단백질에 대한 항체로는 특별히 제한하지는 않으나, 표적 단백질인 에리스로포에틴(erythropoietin), 또는 과립구-대식세포 콜로니 자극인자(granulocyte- macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)와 특이적으로 결 합할 수 있는 단클론 또는 다클론 항체를 사용할 수 있다.The antibody to the target protein is not particularly limited, but specifically binds to a target protein, erythropoietin, or granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). Monoclonal or polyclonal antibodies can be used.
또한, 상기 자기조립단분자층의 카르복실기와 표적 단백질에 대한 항체의 N-말단과의 상호작용을 위하여 항체 고정 전에 SPR 칩에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride, EDC), 또는 N-하이드록시석시니마이드(N-hydroxysuccinimide, NHS) 등의 이미드 화합물을 하나 이상 처리하는 것이 바람직하다. In addition, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride was added to the SPR chip before antibody immobilization for interaction between the carboxyl group of the self-assembled monolayer and the N-terminus of the antibody to the target protein. It is preferable to treat at least one imide compound such as 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride (EDC), or N-hydroxysuccinimide (NHS).
또한, 상기 표적 단백질에 대한 항체의 고정화 단계는 비특이적인 단백질의 결합을 제어하기 위해, 예를 들어, 반응하지 않은 활성화기를 제거하거나, SPR 칩에 비선택적 반응이 일어날 수 있는 부분을 막기 위해, 항체 고정 후 에탄올아민, 혈청알부민, 폴리에틸렌 클리콜, 아미노덱스트란 등을 단독 또는 2종 이상 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. In addition, the step of immobilizing the antibody to the target protein may be used to control the binding of nonspecific proteins, for example, to remove unreacted activators or to block portions where non-selective reactions may occur in the SPR chip. After fixation, the method may further include treating ethanolamine, serum albumin, polyethylene glycol, aminodextran, or the like alone or two or more.
제3단계는 탄소나노튜브와 표적 단백질에 특이적인 이차 항체로 이루어진 복합체를 제조하는 단계이다.The third step is to prepare a complex consisting of a carbon nanotube and a secondary antibody specific for the target protein.
상기 탄소나노튜브는 높은 소수성의 다층 탄소나노튜브(multi-wall carbon nanotube)를 사용하는 것이 바람직하며, 분산성을 높이기 위해 카르복실기, 하이드록실기, 알데히드기, 아민기, 티올기, 또는 카르보닐기 등의 기능기 중 적어도 하 나로 표면이 개질된 것을 사용하는 것이 바람직하다. The carbon nanotubes preferably use high hydrophobic multi-wall carbon nanotubes, and have functions such as carboxyl group, hydroxyl group, aldehyde group, amine group, thiol group, or carbonyl group in order to increase dispersibility. Preference is given to using those whose surfaces have been modified with at least one of the groups.
상기 표적 단백질에 특이적인 생체분자는 특별히 제한하지는 않으나, 효소, 단백질, 펩타이드, 뉴클레오티드, 핵산, 다당류, 지방산, 또는 지질 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는, 표적 단백질의 단클론 또는 다클론 항체, 또는 이들 항체와 서양고추냉이 유래의 과산화효소 등이 결합된 융합단백질과 같은 표적 단백질에 특이적인 항체를 사용하는 것이 좋다.Biomolecules specific for the target protein are not particularly limited, and enzymes, proteins, peptides, nucleotides, nucleic acids, polysaccharides, fatty acids, lipids, and the like may be used alone or in combination of two or more. More preferably, an antibody specific for a target protein such as a monoclonal or polyclonal antibody of the target protein or a fusion protein in which these antibodies are combined with horseradish-derived peroxidase or the like is preferably used.
상기 표적 단백질에 특이적인 항체로는 특별히 제한하지는 않으나, 표적 단백질인 에리스로포에틴(erythropoietin), 또는 과립구-대식세포 콜로니 자극인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)와 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 또는 다클론 항체를 사용할 수 있다.The antibody specific for the target protein is not particularly limited, but specifically binds to a target protein, erythropoietin, or granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). Monoclonal or polyclonal antibodies can be used.
상기 탄소나노튜브 및 표적 단백질에 특이적인 생체분자로 이루어진 복합체를 제조하는 방법은 특별히 제한하지는 않으나, 표면이 개질된 탄소나노튜브와 이차 항체를 0 내지 4℃에서 10 내지 30시간 동안 반응시키는 것이 바람직하다.The method for preparing the complex consisting of biomolecules specific for the carbon nanotubes and the target protein is not particularly limited, but the surface-modified carbon nanotubes and the secondary antibody may be reacted at 0 to 4 ° C. for 10 to 30 hours. Do.
또한, 상기 탄소나노튜브와 표적 단백질에 특이적인 생체분자로 이루어진 복합체는 SPR 칩 표면과의 비특이적인 반응을 억제하기 위하여 에탄올아민, 아미노덱스트란, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 혈청알부민 등을 단독 또는 2종 이상의 물질로 추가로 처리될 수 있다. In addition, the complex consisting of biomolecules specific to the carbon nanotubes and the target protein is used alone or two or more of ethanolamine, aminodextran, polyethylene glycol, or serum albumin in order to suppress nonspecific reaction with the surface of the SPR chip. It may be further treated with the material.
제4단계는 표적 단백질을 포함하는 시료와 항체를 반응시켜 SPR 칩의 신호를 증폭시키는 단계이다.The fourth step is to amplify the signal of the SPR chip by reacting the sample containing the target protein with the antibody.
상기 표적 단백질은 특별히 제한하지는 않으나, 에리스로포에틴, 또는 과립구-대식세포 콜로니 자극인자 등과 같은 단백질, 또는 펩타이드 등을 사용할 수 있다. 또한, 표적이 되는 단백질 외에도 탄수화물, 핵산, 지방산, 또는 비타민 등을 사용할 수 있다. The target protein is not particularly limited, but may be a protein, peptide or the like, such as erythropoietin or granulocyte-macrophage colony stimulating factor. In addition to the target protein, carbohydrates, nucleic acids, fatty acids, or vitamins may be used.
상기 표적 단백질은 SPR 센서의 신호 증폭에 따른 굴절 지수의 변화의 측정이 가능하도록 시료 1㎖ 당 0.001ng 내지 500㎍ 로 포함되는 것이 바람직하다. The target protein is preferably contained in 0.001ng to 500㎛ per 1ml of the sample so that the change in the refractive index according to the signal amplification of the SPR sensor can be measured.
상기 SPR 신호는 종래의 표적 단백질과 표적 단백질에 특이적인 생체분자와의 반응을 통해 발생하는 신호와 비교하여 표적 단백질과 탄소나노튜브 및 표적단백질에 특이적인 생체분자로 이루어진 복합체의 반응을 통해 보다 증폭될 수 있다. 증폭된 신호는 SPR 굴절지수를 변화시켜 미량의 단백질의 정량도 가능케 하는 것이다.The SPR signal is further amplified by the reaction of a complex consisting of a target protein, a carbon nanotube, and a biomolecule specific to a target protein as compared with a signal generated through a reaction between a target protein and a biomolecule specific to the target protein. Can be. The amplified signal changes the SPR refractive index to allow the determination of trace proteins.
제5단계는 표적 단백질을 정량하는 단계로, SPR 칩의 금속 박막 표면에 고정화된 물질에 대한 굴절지수변화 관계를 이용하여 표적 단백질의 양을 환산하여 정량할 수 있다. The fifth step is to quantify the target protein, which can be quantified by converting the amount of the target protein by using the refractive index change relationship for the material immobilized on the metal thin film surface of the SPR chip.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시 예는 본 발명을 예시하고자 하는 것으로, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on the following examples. The following examples are intended to illustrate the invention, not to limit the invention.
<실시예 1> SPR 센서 칩에서 항원-항체반응 및 신호 증폭을 이용한 EPO 단백질의 정량Example 1 Quantification of EPO Protein Using Antigen- Antibody Response and Signal Amplification in SPR Sensor Chip
1) One) 금박막Gold foil 칩의 제조 및 칩 활성화 Chip Fabrication and Chip Activation
95% 황산과 30% 과산화수소를 부피비 3:1 로 혼합한 용액에 금박막 칩을 65℃에서 30분간 담지시킨 후 증류수, 에탄올 순으로 금박막 칩을 수 차례 세척하였다. 10mM MUA을 녹인 에탄올 용액에 상기 금박막 칩을 상온에서 20시간 정도 담지시켜 자기조립단분자층이 형성되도록 하였다. 에탄올, 증류수 순으로 상기 금박막 칩을 세척하여 금박막 칩을 완성하였다. Gold thin film chips were immersed at 65 ° C. for 30 minutes in a solution of 95% sulfuric acid and 30% hydrogen peroxide in a volume ratio of 3: 1, and then the gold thin film chips were washed several times with distilled water and ethanol. The gold thin film chip was immersed in an ethanol solution in which 10 mM MUA was dissolved at room temperature for about 20 hours to form a self-assembled monolayer. The gold thin film chip was washed with ethanol and distilled water in order to complete the gold thin film chip.
2) 2) 금박막Gold foil 칩에 일차 항체의 고정화 Immobilization of Primary Antibodies on a Chip
표면 처리가 완성된 금박막 칩을 활성화하기 위하여, 증류수에 0.2M EDC와 0.05의 NHS를 녹인 용액 50㎕를 15분 동안 칩 위에서 반응시켰다. 이어서, 상기 칩에 100㎍/㎖ 농도의 단클론 EPO 항체를 함유한 500㎕의 PBS(phosphate-buffered saline, pH 7.4)로 1시간 동안 고정화시켰다. 반응하지 않은 활성화기를 제거하기 위하여, 이후 상기 칩에 1M 에탄올아민(ethanolamine) 용액(pH 8.5)을 10분 동안 반응시키고, 또한, 상기 칩에 비선택적 반응이 일어날 수 있는 부분을 막기 위하여, 1%의 소혈청알부민(bovine serum albumin; 이하 BSA로 표기함)을 PBS에 녹인 후 1시간 동안 반응시켰다.In order to activate the gold thin film chip having the surface treatment, 50 µl of a solution of 0.2 M EDC and 0.05 NHS in distilled water was reacted on the chip for 15 minutes. The chip was then immobilized with 500 μl of PBS (phosphate-buffered saline, pH 7.4) containing 100 μg / ml monoclonal EPO antibody for 1 hour. In order to remove unreacted activator, 1M ethanolamine solution (pH 8.5) was then reacted with the chip for 10 minutes, and in order to prevent the non-selective reaction on the chip, 1% Bovine serum albumin (hereinafter referred to as BSA) was dissolved in PBS and reacted for 1 hour.
3) 3) SPRSPR 센서를 이용한 Sensor EPOEPO 항원-항체 면역반응 측정 Antigen-Antibody Immune Response Measurement
상기 과정을 거친 칩을 SPR 센서 시스템 (BiacoreX, GE Healthcare, Sweden)을 이용하여 측정하였으며, 이후 반응은 25℃, 2∼100㎕/min의 유속에서 수행하였다. The chip subjected to the above process was measured using an SPR sensor system (BiacoreX, GE Healthcare, Sweden), and then the reaction was performed at 25 ° C. at a flow rate of 2-100 μl / min.
EPO 항원 단백질(식약청, 한국)을 PBS 완충용액에 0.1∼125,000㎍/㎖ 의 농도로 녹인 용액을 주입하여 항원-항체 결합이 이루어지도록 하였다. 이 실험에서 블랭크(blank)는 PBS 완충용액으로 설정하였다. SPR 측정 후 센서 칩의 재사용을 위해 0.1M Glycine-HCl(pH 2.0)의 완충용액을 사용하였다. A solution of EPO antigen protein (KFDA, Korea) dissolved in PBS buffer at a concentration of 0.1-125,000 μg / ml was injected to allow antigen-antibody binding. Blanks were set in PBS buffer in this experiment. After the SPR measurement, a buffer solution of 0.1 M Glycine-HCl (pH 2.0) was used for reuse of the sensor chip.
4) 탄소나노튜브와 이차 항체의 복합체 형성4) Complexation of Carbon Nanotubes and Secondary Antibodies
높은 소수성을 가지는 다층탄소나노튜브(multi-wall carbon nanotube) 100mg을 황산과 질산의 부피비 3:1로 혼합한 용액에 첨가한 뒤 70℃에서 약 3 시간 반응시킨 후 상온에서 냉각시켰다. 이후, 충분한 양의 물을 첨가하고 여과과정을 통해 탄소나노튜브 용액의 pH 7.0 이 되도록 하였다. 다음으로, 약 6시간 정도 초음파 처리하였다. 상기 과정을 통해 탄소나노튜브는 길이가 짧아지고 그 표면은 증류수에 잘 분산되는 카르복실기로 개질되었다.100 mg of multi-wall carbon nanotubes having high hydrophobicity were added to a solution mixed with sulfuric acid and nitric acid in a volume ratio of 3: 1, and then reacted at 70 ° C. for about 3 hours, and then cooled at room temperature. Thereafter, a sufficient amount of water was added and filtered to make pH 7.0 of the carbon nanotube solution. Next, ultrasonication was performed for about 6 hours. Through the above process, the carbon nanotubes were shortened in length, and the surface thereof was modified with carboxyl groups that are well dispersed in distilled water.
탄소나노튜브-이차 항체 복합체를 만들기 위해, 상기 카르복실기로 개질된 탄소나노튜브 용액을 500㎕를 취하여 원심분리 하였다(12,000 rpm, 15분). 이로부터 얻은 탄소나노튜브를 PBS완충용액에 넣고 초음파 처리하여 현탁시킨 후, 원심분리 하였다(12,000 rpm, 15분). 상기 탄소나노튜브를 활성화시키기 위해, 0.4M EDC (12.5㎕)와 1㎖ 이차 항체(PBS 완충용액에서 100㎍/㎖, pH 7.4) 용액을 혼합하여 4℃에서 20시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 탄소나노튜브-이차 항체 복합체에 비특이적 반응이 일어날 수 있는 부분을 막기 위하여, 10㎎/㎖의 아미노덱스트란(amino dextran)을 PBS 완충용액에 녹인 용액을 500㎕ 넣어주어 2 시간 동안 반응시켰다. To prepare a carbon nanotube-secondary antibody complex, 500 μl of the carboxyl-modified carbon nanotube solution was centrifuged (12,000 rpm, 15 minutes). Carbon nanotubes thus obtained were placed in PBS buffer solution, sonicated and suspended, and then centrifuged (12,000 rpm, 15 minutes). In order to activate the carbon nanotubes, 0.4M EDC (12.5 μl) and 1 mL secondary antibody (100 μg / ml in PBS buffer, pH 7.4) were mixed and reacted at 4 ° C. for 20 hours. After the reaction, in order to prevent the non-specific reactions in the carbon nanotube-secondary antibody complex, 500 μl of a solution of 10 mg / ml amino dextran in PBS buffer solution was added thereto for 2 hours. Reacted for a while.
5) 탄소나노튜브와 이차 항체의 복합체를 이용한 5) using a complex of carbon nanotubes and a secondary antibody SPRSPR 신호의 증폭 Signal amplification
농도에 따른(1∼125㎍/㎖) 항원 단백질 EPO의 항원-항체 반응, 항원 단백질과 탄소나노튜브-이차 항체 복합체의 반응에 의해 변화된 SPR 값을 측정하였다. SPR values changed by antigen-antibody reaction of antigenic protein EPO and reaction of antigenic protein and carbon nanotube-secondary antibody complex according to concentration (1 to 125 µg / ml) were measured.
도 2에 나타난 바와 같이, EPO 농도가 증가함에 따라 탄소나노튜브 복합체에 의한 SPR 신호 변화가 증폭됨을 확인하였다. As shown in Figure 2, it was confirmed that the SPR signal change by the carbon nanotube complex is amplified as the concentration of EPO increases.
<실시예 2> EPO 항원 단백질과 일차 항체-탄소나노튜브 복합체와의 결합에 의한 SPR 칩의 신호 증폭에 따른 단백질의 정량Example 2 Quantification of Proteins According to Signal Amplification of SPR Chip by Coupling EPO Antigen Protein with Primary Antibody-Carbon Nanotube Complex
1) One) 금박막Gold foil 칩에 이차 항체의 고정화 Immobilization of Secondary Antibodies on a Chip
상기 실시예 1의 1)의 방법과 동일하게 단백질 칩을 제작하고, 활성화된 칩에 100㎍/㎖ 농도의 다클론 EPO 항체를 함유한 500㎕의 PBS 로 1시간 동안 고정화시켰다. 반응하지 않은 활성화기를 제거하기 위하여, 상기 칩에 1M 에탄올아민 용액(pH 8.5)을 10분 동안 반응시키고, 상기 칩에 비선택적 반응이 일어날 수 있는 부분을 막기 위하여, 1%의 BSA를 PBS 에 녹인 용액을 1시간 동안 올려 반응시켰다.A protein chip was prepared in the same manner as in Example 1), and the immobilized chip was immobilized with 500 μl of PBS containing 100 μg / ml of polyclonal EPO antibody for 1 hour. In order to remove unreacted activator, 1M ethanolamine solution (pH 8.5) was reacted with the chip for 10 minutes, and 1% of BSA was dissolved in PBS to prevent the non-selective reaction on the chip. The solution was allowed to react for 1 hour.
2) 2) EPOEPO 항원 단백질과 일차 항체-탄소나노튜브 복합체와의 결합 Binding of Antigen Proteins to Primary Antibody-Carbon Nanotube Complexes
상기 실시예 1의 4)의 방법과 동일하게 제조된 단클론 일차 항체와 탄소나노튜브의 복합체를 이용하여 한 번의 시료 주입으로 이차 항체가 고정화된 SPR 칩 상에서 신호 증폭을 확인하였다. Signal amplification was confirmed on the SPR chip to which the secondary antibody was immobilized by a single sample injection using a complex of monoclonal primary antibody and carbon nanotube prepared in the same manner as in Example 1, 4).
이를 위해, 탄소나노튜브-일차 항체 복합체 20㎕와 EPO 항원 단백질을 PBS 완충용액에 1∼125㎍/㎖의 농도로 녹인 시료 20∼1000㎕를 각각 혼합하여, 1차적인 항원-항체 결합이 이루어지도록 하였다. 이후, 2 ㎕/min의 흐름속도로 항원-항체 결합이 이루어진 혼합 용액을 15분간 주입하여 2차 항원-항체 결합이 이루어지도록 하였다. 블랭크는 탄소나노튜브-일차 항체 복합체에 PBS 용액을 혼합한 시료를 사용하였다.To this end, 20 μl of a carbon nanotube-primary antibody complex and 20 to 1000 μl of a sample in which EPO antigen protein is dissolved in PBS buffer at a concentration of 1 to 125 μg / ml are mixed, respectively, to form a primary antigen-antibody binding. To lose. Thereafter, a mixture solution of antigen-antibody binding was injected for 15 minutes at a flow rate of 2 μl / min to enable secondary antigen-antibody binding. Blank used a sample in which a PBS solution was mixed with a carbon nanotube-primary antibody complex.
도 3에 나타난 바와 같이, 항원시료의 양에 따라 SPR의 RU값이 증가함을 알 수 있으며, 항원 시료를 넣었을 때 보이는 SPR의 RU값 보다 약 100배 이상 증폭된 값을 보이는 것을 확인할 수 있었다.As shown in Figure 3, it can be seen that the RU value of the SPR increases according to the amount of the antigen sample, it was confirmed that the amplified value about 100 times or more than the RU value of the SPR when the antigen sample is added.
면역반응 측정 후 칩의 재사용을 위해서, 센서 칩에 0.1M Glycine-HCl(pH 2.0)의 완충용액을 이용하여 5분간 흘려 칩을 다시 이용하였다. In order to reuse the chip after measuring the immune response, the chip was used for 5 minutes using a 0.1 M Glycine-HCl (pH 2.0) buffer solution on the sensor chip.
<실시예 3> SPR 센서 칩에서 항원-항체반응 및 신호 증폭을 이용한 GM-CSF 단백질의 정량Example 3 Quantification of GM-CSF Protein Using Antigen- Antibody Response and Signal Amplification in SPR Sensor Chip
항원 단백질로 GM-CSF(R&D systems, 1∼125㎍/㎖)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법에 따라 항원-항체 반응 및 상기 항원 단백질과 탄소나노튜 브-이차 항체 복합체의 반응에 의해 변화된 SPR 값을 측정하였다.The antigen-antibody reaction and the reaction of the antigen protein with the carbon nanotube-secondary antibody complex according to the same method as in Example 1, except that GM-CSF (R & D systems, 1 to 125 µg / ml) was used as the antigenic protein. The SPR value changed by was measured.
도 4에 나타난 바와 같이, GM-CSF 농도가 증가함에 따라 탄소나노튜브 복합체에 의한 SPR 신호 변화가 증가함을 알 수 있었으며, 탄소나노튜브에 의해 증폭된 신호는 평균적으로 17배 증가하였다. As shown in Figure 4, it was found that the SPR signal change by the carbon nanotube complex increases as the GM-CSF concentration is increased, the signal amplified by the carbon nanotubes increased 17 times on average.
또한, GM-CSF 항원 단백질의 농도를 0.1ng/㎖로 낮추어 탄소나노튜브-이차 항체 복합체 반응에 의해 변화된 SPR 값을 측정한 결과, 탄소나노튜브 복합체에 의한 SPR신호의 RU값 변화가 80배로 증가함을 확인할 수 있었다. In addition, the concentration of GM-CSF antigen protein was reduced to 0.1 ng / ml, and the SPR value changed by the carbon nanotube-secondary antibody complex reaction was measured. Could confirm.
<실시예 4> GM-CSF 항원 단백질과 일차 항체-탄소나노튜브 복합체와의 결합에 의한 SPR 칩의 신호 증폭에 따른 단백질의 정량<Example 4> Quantification of protein according to signal amplification of SPR chip by binding GM-CSF antigen protein and primary antibody-carbon nanotube complex
실시예 1과 동일한 방법에 따라 단백질 칩을 제작하고, 실시예 2와 동일한 방법에 따라 만들어진 단클론 일차 항체와 탄소나노튜브의 복합체를 이용하여 이차 항체가 고정화된 SPR 칩 상에서 신호 증폭을 확인하였다. A protein chip was prepared according to the same method as Example 1, and signal amplification was confirmed on the SPR chip to which the secondary antibody was immobilized using a complex of monoclonal primary antibody and carbon nanotubes prepared according to the same method as Example 2.
이를 위해, 탄소나노튜브-일차 항체 복합체 20㎕와 GM-CSF 항원 단백질을 PBS 완충용액에 1∼10㎍/㎖의 농도로 녹인 시료 20∼1000㎕를 각각 혼합하여, 일차적인 항원-항체 결합이 이루어지도록 하였다. 다음으로, 2㎕/min의 흐름속도로 항원-항체 결합이 이루어진 혼합 용액을 15분간 주입하여 이차 항원-항체 결합이 이루어지도록 하였다. To this end, 20 μl of carbon nanotube-primary antibody complexes and 20 to 1000 μl of GM-CSF antigen protein dissolved in PBS buffer at a concentration of 1 to 10 μg / ml were mixed, respectively, to prevent primary antigen-antibody binding. It was done. Next, a mixture of antigen-antibody binding was injected for 15 minutes at a flow rate of 2 μl / min to allow secondary antigen-antibody binding.
도 5에 나타난 바와 같이, 항원시료의 양에 따라 SPR의 RU값이 증가함을 알 수 있으며, 항원 시료를 넣었을 때 보이는 SPR의 RU값 보다 약 40배 이상 증폭된 값을 보이는 것을 확인할 수 있었다 블랭크 시료를 넣었을 때 보이는 SPR의 RU 값 보다 항원 단백질 농도에 비례하여 약 40배 이상 높아짐을 확인할 수 있었다.As shown in Figure 5, it can be seen that the RU value of the SPR increases according to the amount of the antigen sample, it was confirmed that the amplified value about 40 times more than the RU value of the SPR when the antigen sample was added. It was confirmed that the sample was about 40 times higher in proportion to the antigenic protein concentration than the RU value of the SPR when the sample was added.
도 1은 탄소나노튜브를 이용한 SPR 신호 증폭에 따른 본 발명의 단백질의 정량방법을 개략적으로 도시한 모식도이다.1 is a schematic diagram showing a method for quantifying a protein of the present invention according to amplification of SPR signals using carbon nanotubes.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 정량방법으로, SPR 칩에 고정된 일차 항체와 EPO 항원 단백질의 1차 항원-항체 반응, 탄소나노튜브-이차 항체 복합체와 고정된 항원 단백질의 2차 항원-항체 반응에 의한 SPR 굴절지수의 변화 값을 나타내는 그래프이다.Figure 2 is a protein quantification method according to an embodiment of the present invention, the primary antigen-antibody reaction of the primary antibody and EPO antigen protein immobilized on the SPR chip, the secondary of the carbon nanotube-secondary antibody complex and the immobilized antigen protein It is a graph showing the change value of the SPR refractive index by the antigen-antibody reaction.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 정량방법으로, 탄소나노튜브-일차 항체 복합체와 EPO 항원 단백질의 1차 항원-항체 반응, SPR 칩에 고정된 이차 항체와 상기 1차 항원-항체 반응을 거친 표적 단백질의 2차 항원-항체 반응에 의한 SPR 굴절지수의 변화 값을 나타내는 그래프이다.Figure 3 is a protein quantification method according to an embodiment of the present invention, the first antigen-antibody reaction of the carbon nanotube-primary antibody complex and EPO antigen protein, the secondary antibody immobilized on the SPR chip and the primary antigen-antibody reaction It is a graph showing the change value of the SPR refractive index by the secondary antigen-antibody reaction of the target protein passed through.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 정량방법으로, SPR 칩에 고정된 일차 항체와 hGM-CSF 항원 단백질의 1차 항원-항체 반응, 탄소나노튜브-이차 항체 복합체와 고정된 항원 단백질의 2차 항원-항체 반응에 의한 SPR 굴절지수의 변화 값을 나타내는 그래프이다.Figure 4 is a protein quantification method according to an embodiment of the present invention, the primary antigen-antibody reaction of the primary antibody immobilized on the SPR chip and hGM-CSF antigen protein, the carbon nanotube-secondary antibody complex and the immobilized antigen protein It is a graph showing the change value of the SPR refractive index by the secondary antigen-antibody reaction.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 정량방법으로, 탄소나노튜브-일차 항체 복합체와 hGM-CSF 항원 단백질의 1차 항원-항체 반응, SPR 칩에 고정된 이차 항체와 상기 1차 항원-항체 반응을 거친 표적 단백질의 2차 항원-항체 반응에 의한 SPR 굴절지수의 변화 값을 나타내는 그래프이다.Figure 5 is a protein quantification method according to an embodiment of the present invention, the first antigen-antibody reaction of the carbon nanotube-primary antibody complex and hGM-CSF antigen protein, the secondary antibody immobilized on the SPR chip and the primary antigen- It is a graph showing the change value of the SPR refractive index by the secondary antigen-antibody reaction of the target protein subjected to the antibody reaction.
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