KR101061482B1 - Gloeobacter rhodopsin with reconstituted carotenoid - Google Patents

Gloeobacter rhodopsin with reconstituted carotenoid Download PDF

Info

Publication number
KR101061482B1
KR101061482B1 KR1020100036536A KR20100036536A KR101061482B1 KR 101061482 B1 KR101061482 B1 KR 101061482B1 KR 1020100036536 A KR1020100036536 A KR 1020100036536A KR 20100036536 A KR20100036536 A KR 20100036536A KR 101061482 B1 KR101061482 B1 KR 101061482B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
rhodopsin
gleobacter
salinixanthin
salinixanthine
complex
Prior art date
Application number
KR1020100036536A
Other languages
Korean (ko)
Inventor
정광환
최아름
발라쇼브 세르게이
라니 야노스
이마셰바 엘레오노라
Original Assignee
서강대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서강대학교산학협력단 filed Critical 서강대학교산학협력단
Priority to KR1020100036536A priority Critical patent/KR101061482B1/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101061482B1 publication Critical patent/KR101061482B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light

Abstract

본 발명은 살리니잔틴과 특이적인 결합을 통해 재구성되는 글레오박터 로돕신에 관한 것으로, 광-수확 안테나(light-harvesting antenna) 역할을 하는 카로티노이드(carotenoid)인 살리니잔틴 및 글레오박터 로돕신이 특이적으로 결합하여, 살리니잔틴으로 흡수된 광 에너지가 글레오박터 로돕신의 레티날 단백질로 전달함으로써, 상기 글레오박터 로돕신-살리니잔틴 복합체를 광-수확률이 증가되어 빛에너지를 이용한 로돕신의 활성화 및 이를 이용한 센서에 유용하게 이용될 수 있다. The present invention relates to a glycobacter rhodopsin that is reconstituted through specific binding with salinixanthin, and that the carotenoids serving as a light-harvesting antenna are salinixanthin and glaobacter rhodopsin. Combined, the light energy absorbed by salinixanthin is transferred to the retinal protein of Gleobacter rhodopsin, thereby increasing the light-probability of the Gleobacter rhodopsin-salinixanthine complex to activate Rhodopsin using light energy and using the same. It can be usefully used for the sensor.

Description

카로테노이드가 재구성된 글레오박터 로돕신{Gloeobacter rhodopsin with reconstituted carotenoid}Gloeobacter rhodopsin with reconstituted carotenoid}

본 발명은 카로테노이드가 재구성되는 글레오박터 로돕신 단백질 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a glycobacter rhodopsin protein in which carotenoids are reconstituted and a method for preparing the same.

카로테노이드(carotenoid)는 클로로필-기반 광생성 기구에서 스펙트럼의 청록색 부위에서의 빛-수확 및 광방호(光防護)에서 주된 역할을 담당한다(1-5). 레티날 단백질에서 빛-수확 구성요소로서의 그들의 존재는 최근에서야 확립되었는데, 살리니박터 루버(Salinibacter ruber)의 잔토로돕신은 상기 복합체의 첫 번째 예시가 되었다(비특허문헌 6). 카로테노이드 박테리오루버린(carotenoid bacterioruberin)(비특허문헌 8, 비특허문헌 9)은 상기 알케안 할로루브럼(archaeon Halorubrum)의 고대로돕신과 같은 빛-수확 기능이 없는 다른 펌프에 결합하지만(비특허문헌 9, 비특허문헌 10), 상기 고세균의 레티날-기반의 빛-을 이용한 양자 펌프인 박테리오로돕신(비특허문헌 7)은 카로테노이드를 포함하지 않는다. 광-유도 양자 펌프 잔토로돕신의 구성성분인 살리니잔틴(Salinixanthin)(비특허문헌 11)은 극호염성 박테리움 S. 루버(extremely halophilic eubacterium S. ruber)의 주요한 카로테노이드이다(비특허문헌 12). 상기 C40 카로테노이드는 한쪽 말단에 11개 이중 결합 사슬의 아실 글리코사이드를 갖고, 다른 한쪽 말단에 4-옥소(케토)기의 고리가 결합되어있다. 잔토로돕신(비특허문헌 6)에 결합하였을 때, 살리니잔틴은 빛-수확 안테나로서 제공된다(비특허문헌 6, 비특허문헌 10). 살리니잔틴은 흡수된 양자들의 40-45%를 레티날로 단명하는 카로테노이드의 S2 상태 및 레티날의 S1 상태를 포함하는(비특허문헌 13, 비특허문헌 14) 펨토 초(10-15s) 공정(비특허문헌 14)내에 빠르게 전달한다(비특허문헌 6, 비특허문헌 13). 3개 이상의 켤레 이중 결합을 갖는 카로테노이드 및 폴리엔에서, 가장 낮은 여기 상태 S1(21Ag --유사)은 대칭금지이다(비특허문헌 3, 비특허문헌 15-비특허문헌 17). 청록 범위에서의 강한 흡수 밴드는 전이 상태에서 S2 상태(11Bu +-유사)로 온 것이다. S1 상태의 카로테노이드는 S2 상태로부터 빠른 내부 전환의 결과로서 생성된다. S1 상태의 카로테노이드의 에너지 수준은 레티날의 S1 상태의 에너지 수준보다 낮아서(비특허문헌 3, 비특허문헌 13), 레티날 크로모포어(retinal chromophore)의 에너지 제공자로서 역할을 수행할 수 없다. 이는 S2 및 S1 상태가 에너지 제공자로서 역할을 하는 빛-수확 복합체에서 카로테노이드-박테리오 엽록체 쌍과 다르다(비특허문헌 3, 비특허문헌 18). 시프 염기로 양자화된 레티날 단백질에서(박테리오로돕신 및 잔토로돕신과 같은) 가장 낮은 여기 상태는 가시광선 범위에서 폭넓고 강한 흡수 밴드를 나타내는 11Bu-유사 상태인 것으로 강하게 짐작된다(비특허문헌 19). 상기 상태는 카로테노이드의 S2 상태로서 큰 진동자 세기 및 큰 전이에 의해 특징화된다(비특허문헌 19). 잔토로돕신에서 살리니잔틴 및 레티날 크로모포어 사이의 짧은 거리 및 그들의 상호간에 알맞은 방위(비특허문헌 13, 비특허문헌 20)는 크로모포어의 두 개 접합 사슬 사이의 유의한 전자기적 연결(비특허문헌 21)을 야기하고[ca. 160-210 cm-1(비특허문헌 14)], 카로테노이드에서 레티날 크로모포어로 여기 에너지를 효과적으로 전달한다(비특허문헌 13). 단순 단일-크로모포어 카로테노이드 안테나는 레티날 단백질의 빛-수확 능력을 배가시키고, 특히 레티날 크로모포어의 흡수가 낮은 청록 범위에서 추가적 광학적 횡단면을 제공한다. 카로테노이드의 결합은 그의 흡수 스펙트럼에서 진동전자 밴드의 심화 및 비대칭 형태의 4-케토 고리 및 접합 사슬의 부동화를 가리키는 광학 활성의 출현을 동반한다(비특허문헌 22). 상기 형태는 레티날에 의해 조절된다. 가수분해를 통한 후자의 제거는 결합된 카로테노이드의 특징적인 스펙트럼 특성을 제거한다(비특허문헌 6, 비특허문헌 22, 비특허문헌 23).Carotenoids play a major role in light-harvesting and photoprotection in the cyan region of the spectrum in chlorophyll-based photogeneration machinery (1-5). Their presence as a light-harvesting component in retinal proteins has only recently been established, and xanthodoxin of Salinibacter ruber has become the first example of such complexes (Non-Patent Document 6). The carotenoid bacterioruberin (Non Patent Literature 8, Non Patent Literature 9) binds to other pumps without light-harvesting functions, such as the anti-dodoxin of the alchean Halorubrum (Non-Patent Literature). 9, non-patent document 10), the bacteriododocin (non-patent document 7), which is a quantum pump using the retinal-based light of the bacterium, does not contain a carotenoid. Salinixanthin (Non-Patent Document 11), which is a component of the light-induced quantum pump xanthododocin, is a major carotenoid of the extremely halophilic eubacterium S. ruber (Non-Patent Document 12). The C 40 carotenoid has an acyl glycoside of 11 double bond chains at one end thereof, and a ring of 4-oxo (keto) group is bonded at the other end thereof. When coupled to xanthodoxin (Non-Patent Document 6), salinixanthin is provided as a light-harvesting antenna (Non-Patent Document 6, Non-Patent Document 10). Salinixanthin is a femtosecond ( 10-15 s) containing the S 2 state of carotenoids and the S 1 state of retinal, which short-lives 40-45% of the protons absorbed (Non-Patent Document 13, Non-Patent Document 14). It transfers quickly in a process (nonpatent literature 14) (nonpatent literature 6, nonpatent literature 13). In the carotenoid polyene and at least three pairs having a double bond, the lowest excited state S 1 (2 1 A g - - similar) it is symmetrical inhibited (Non-Patent Document 3, Non-Patent Document 15 Non-Patent Document 17). The strong absorption band in the cyan range comes from the transition state to the S 2 state (1 1 B u + -like). Carotenoids in the S 1 state are produced as a result of the rapid internal transition from the S 2 state. Energy levels of carotenoids in the S 1 state is lower than the energy level of the S 1 state of retinal (Non-Patent Document 3, Non-Patent Document 13), retinal chromotherapy pores can act as an energy provider of (retinal chromophore) none. This is different from the carotenoid-bacterial chloroplast pair in the light-harvesting complex in which the S 2 and S 1 states serve as energy providers (Non-Patent Document 3, Non-Patent Document 18). The lowest excitation state (such as bacteriododocin and xanthododocin) in retinal proteins quantized with a sif base is strongly assumed to be a 1 1 B u -like state that exhibits a broad and strong absorption band in the visible range (Non Patent Literature 19). ). This state is characterized by a large oscillator intensity and a large transition as the S 2 state of the carotenoid (Non-Patent Document 19). The short distances between salinixanthin and retinal chromophores in xanthodoxin and their mutually appropriate orientations (Non-Patent Document 13, Non-Patent Document 20) are notable for significant electromagnetic coupling between the two junction chains of chromophores (non Causing patent document 21) [ca. 160-210 cm −1 (Non Patent Literature 14)], and effectively transfer excitation energy from carotenoids to retinal chromophores (Non Patent Literature 13). The simple single-chromophore carotenoid antenna doubles the light-harvesting ability of the retinal protein and provides additional optical cross sections, particularly in the cyan range where the retinal chromophores have low absorption. The binding of the carotenoids is accompanied by the appearance of optical activity indicating deepening of the vibrating electron band and immobilization of the 4-keto ring and the junction chain in the asymmetrical form in its absorption spectrum (Non-Patent Document 22). This form is controlled by retinal. The latter removal through hydrolysis removes the characteristic spectral characteristics of the bound carotenoids (Non Patent Literature 6, Non Patent Literature 22, and Non Patent Literature 23).

시아노박테리움 글레오박터 비올라세우스(비특허문헌 46)에서 발현되는 글레오박터 로돕신이 카로테노이드와 결합하여 카로테노이드-레티날 단백질 복합체를 형성한다는 보고는 아직 전무하다.
There is no report that the glycobacter rhodopsin expressed in cyanobacterium glaobacter violaseus (Non Patent Literature 46) is combined with a carotenoid to form a carotenoid-retinal protein complex.

본 발명자들은 글레오박터 로돕신의 광흡수율을 증가시키는 방법을 연구하던 중, 극 호염균인 살리니박터 루버에서 분리한 카로테노이드인 살리니잔틴이 글레오박터와 결합하여 복합체를 형성하는 것을 흡수 분광 분석을 통해 확인하였고, 살리니잔틴이 글레오박터 로돕신의 레티날 단백질로 에너지를 전달하는 것을 형광 스펙트럼 분석을 통한 여기 스펙트럼으로 확인하였으며, 광-흡수 안테나로서 기능하는 살리니잔틴이 글레오박터 로돕신과 재구성되어 광흡수 효율이 증가된 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
The present inventors were studying a method of increasing the light absorption rate of Gleobacter rhodopsin, and the absorption spectroscopic analysis of the formation of the complex by combining salolixanthin, a carotenoid isolated from the salinibacter louver, a polar basophils, with Gleobacter Fluorescence spectrum analysis confirmed that salinixanthin transfers energy to the retinal protein of Gleobacter rhodopsin, and Salinixanthin, which functions as a light-absorption antenna, is reconstituted with Gleobacter rhodopsin and absorbed light. The present invention was completed by confirming that the efficiency was increased.

Frank, H. A., and Cogdell, R. J. (1996) Photochem. Photobiol. 63, 25764. Frank, H. A., and Cogdell, R. J. (1996) Photochem. Photobiol. 63, 25764. Cogdell, R. J. et al., (1999) The Structure and Function of the LH2 Complex from Rhodopseudomonas acidophila Strain 10050, with Special Reference to the Bound Carotenoids. In The Photochemistry of Carotenoids (Frank, H. A., Young, A. J., Britton, G., and Cogdell, R. J., Eds.) pp 71-80, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. Cogdell, R. J. et al., (1999) The Structure and Function of the LH2 Complex from Rhodopseudomonas acidophila Strain 10050, with Special Reference to the Bound Carotenoids. In The Photochemistry of Carotenoids (Frank, H. A., Young, A. J., Britton, G., and Cogdell, R. J., Eds.) Pp 71-80, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. Polivka, T., and Sundstr€om, V. (2004) Chem. Rev. 104, 2021071. Polivka, T., and Sundström, V. (2004) Chem. Rev. 104, 2021071. Wilson, A. et al., (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 120752080. Wilson, A. et al., (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 120752080. Berera, R., et al., (2009) Biophys. J. 96, 2261267. Berera, R., et al., (2009) Biophys. J. 96, 2261267. Balashov, S. P. et al., (2005) Science 309, 2061064. Balashov, S. P. et al., (2005) Science 309, 2061064. Oesterhelt, D., and Stoeckenius, W. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 2853 2857.Oesterhelt, D., and Stoeckenius, W. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 2853 2857. Yoshimura, K., and Kouyama, T. (2008) J. Mol. Biol. 375, 1267281. Yoshimura, K., and Kouyama, T. (2008) J. Mol. Biol. 375, 1267281. Mukohata, Y. et al., (1991) Photochem. Photobiol. 54, 1039045. Mukohata, Y. et al., (1991) Photochem. Photobiol. 54, 1039045. Boichenko, V. A. et al., (2006) Biochim. Biophys. Acta 1757, 1649656. Boichenko, V. A. et al., (2006) Biochim. Biophys. Acta 1757, 1649656. Lutnaes, B. F. et al., (2002) J. Nat. Prod. 65, 1340343. Lutnaes, B. F. et al., (2002) J. Nat. Prod. 65, 1340343. Anton, J. et al., (2002) Int. J. Syst. Evol. Micrbiol. 52, 48591. Anton, J. et al., (2002) Int. J. Syst. Evol. Micrbiol. 52, 48591. Balashov, S. P. et al., (2008) Biophys. J. 95, 2402414. Balashov, S. P. et al., (2008) Biophys. J. 95, 2402414. Polvka, T. et al., (2009) Biophys. J. 96, 2268277. Polvka, T. et al., (2009) Biophys. J. 96, 2268277. Hudson, B. S., and Kohler, B. E. (1972) Chem. Phys. Lett. 14, 299 304.Hudson, B. S., and Kohler, B. E. (1972) Chem. Phys. Lett. 14, 299 304. Schulten, K., and Karplus, M. (1972) Chem. Phys. Lett. 14, 30509. Schulten, K., and Karplus, M. (1972) Chem. Phys. Lett. 14, 30509. Christensen, R. L. (1999) The electronic states of carotenoids. In The Photochemistry of Carotenoids (Frank, H. A., Young, A. J., Britton, G., and Cogdell, R. J., Eds.) pp 137-157, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. Christensen, R. L. (1999) The electronic states of carotenoids. In The Photochemistry of Carotenoids (Frank, H. A., Young, A. J., Britton, G., and Cogdell, R. J., Eds.) Pp 137-157, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. Cong, H. et al., (2008) J. Phys. Chem. B 112, 106890703. Cong, H. et al., (2008) J. Phys. Chem. B 112, 106890703. Birge, R. R., and Zhang, C.-F. (1990) J. Chem. Phys. 92, 7178195. Birge, R. R., and Zhang, C.-F. (1990) J. Chem. Phys. 92, 7178195. Luecke, H. et al., (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 165616565.Luecke, H. et al., (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 165616565. Scholes, G. D. (2003) Annu. Rev. Phys. Chem. 54, 577. Scholes, G. D. (2003) Annu. Rev. Phys. Chem. 54, 577. Balashov, S. P. et al., (2006) Biochemistry 45, 109981004. Balashov, S. P. et al., (2006) Biochemistry 45, 109981004. Imasheva, E. S. et al., (2008) Photochem. Photobiol. 84, 97784. Imasheva, E. S. et al., (2008) Photochem. Photobiol. 84, 97784. Luecke, H. et al., (1999) J. Mol. Biol. 291, 89911. Luecke, H. et al., (1999) J. Mol. Biol. 291, 89911. Litvin, F. F. et al., (1978) Nature 271, 47678.Litvin, F. F. et al., (1978) Nature 271, 47678. Sineshchekov, O. A., and Litvin, F. F. (1988) Mechanisms of Phototaxis of Microorganisms. In Molecular Mechanisms of Biological Effects of Optical Radiation (in Russian), pp 212-227, Nauka, Moscow.Sineshchekov, O. A., and Litvin, F. F. (1988) Mechanisms of Phototaxis of Microorganisms. In Molecular Mechanisms of Biological Effects of Optical Radiation (in Russian), pp 212-227, Nauka, Moscow. Ruiz-Gonzales, M. X., and Marin, I. (2004) J. Mol. Evol. 58, 34858. Ruiz-Gonzales, M. X., and Marin, I. (2004) J. Mol. Evol. 58, 34858. Spudich, J. L., and Jung, K.-H. (2005) Microbial Rhodopsins: Phylogenetic and Functional Diversity. In Handbook of photosensory receptors (Briggs,W. R., and Spudich, J. L., Eds.) pp 1-23,Wiley- VCH, Darmstadt, Germany. Spudich, J. L., and Jung, K.-H. (2005) Microbial Rhodopsins: Phylogenetic and Functional Diversity. In Handbook of photosensory receptors (Briggs, W. R., and Spudich, J. L., Eds.) Pp 1-23, Wiley-VCH, Darmstadt, Germany. Frigaard, N.-U. et al., (2006) Nature 439, 84750. Frigaard, N.-U. et al., (2006) Nature 439, 84750. Brown, L. S., and Jung,K.-H. (2006) Photochem. Photobiol. Sci. 5, 53846. Brown, L. S., and Jung, K.-H. (2006) Photochem. Photobiol. Sci. 5, 53846. Sharma, A. K. et al., (2006) Trends Microbiol. 14, 46369.Sharma, A. K. et al., (2006) Trends Microbiol. 14, 46369. Adamian, L. et al., (2006) Photochem. Photobiol. 82, 1426435.Adamian, L. et al., (2006) Photochem. Photobiol. 82, 1426435. Fuhrman, J. A. et al., (2008) Nat. Rev. Microbiol. 6, 488 494.Fuhrman, J. A. et al., (2008) Nat. Rev. Microbiol. 6, 488 494. Beja, O. et al., (2000) Science 289, 1902906.Beja, O. et al., (2000) Science 289, 1902906. Beja, O. et al., (2001) Nature 411, 78689. Beja, O. et al., (2001) Nature 411, 78689. Venter, J. C. et al., (2004) Science 304, 664.Venter, J. C. et al., (2004) Science 304, 664. Gomez-Consarnau, L. et al., (2007) Nature 445, 21013.Gomez-Consarnau, L. et al., (2007) Nature 445, 21013. Sharma, A. K. et al., (2009) ISME J. 3, 72637.Sharma, A. K. et al., (2009) ISME J. 3, 72637. Vogeley, L. et al., (2004) Science 306, 1390393. Vogeley, L. et al., (2004) Science 306, 1390393. Miranda, M. R. M. et al., (2009) Biophys. J. 96, 1471481.Miranda, M. R. M. et al., (2009) Biophys. J. 96, 1471481. Waschuk, S. A. et al., (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 6879883.Waschuk, S. A. et al., (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 6879883. Sineshchekov, O. A. et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8689 8694. Article Biochemistry, Vol. 48, No. 46, 2009 10955Sineshchekov, O. A. et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8689 8694. Article Biochemistry, Vol. 48, No. 46, 2009 10955 Mongodin, E. F. et al., (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 181478152.Mongodin, E. F. et al., (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 181478152. Giovannoni, S. J. et al., (2008) Environ. Microbiol. 10, 1771782.Giovannoni, S. J. et al., (2008) Environ. Microbiol. 10, 1771782. Sharma, A. K. et al., (2008) Environ. Microbiol. 10, 1039056. Sharma, A. K. et al., (2008) Environ. Microbiol. 10, 1039056. Nakamura, Y. et al., (2003) DNA Res. 10, 13745. Nakamura, Y. et al., (2003) DNA Res. 10, 13745. Dioumaev, A. K. et al., (2002) Biochemistry 41, 5348358. Dioumaev, A. K. et al., (2002) Biochemistry 41, 5348358. Imasheva, E. S. et al., (2006) Photochem. Photobiol. 82, 1406413.Imasheva, E. S. et al., (2006) Photochem. Photobiol. 82, 1406413. Takaichi, S., and Mochimaru, M. (2007) Cell. Mol. Life Sci. 64, 2607619. Takaichi, S., and Mochimaru, M. (2007) Cell. Mol. Life Sci. 64, 2607619. Britton, G. et al., (2004) Carotenoids Handbook , Birkhauser Verlag, Berlin. Britton, G. et al., (2004) Carotenoids Handbook, Birkhauser Verlag, Berlin. Goodwin, T. W. (1984) The Biochemistry of the Carotenoids , Vol. II Animals, Chapman and Hall, London. Goodwin, T. W. (1984) The Biochemistry of the Carotenoids, Vol. II Animals, Chapman and Hall, London. Davis, C. M. et al., (1995) J. Biol. Chem. 270, 5793804.Davis, C. M. et al., (1995) J. Biol. Chem. 270, 5793804. Frank, H. A. (1999) Incorporation of carotenoids into reaction center and light-harvesting pigment-protein complexes. In The Photochemistry of Carotenoids (Frank, H. A.,Young, A. J., Britton, G., and Cogdell, R. J., Eds.) pp 223-234, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands.Frank, H. A. (1999) Incorporation of carotenoids into reaction center and light-harvesting pigment-protein complexes. In The Photochemistry of Carotenoids (Frank, H. A., Young, A. J., Britton, G., and Cogdell, R. J., Eds.) Pp 223-234, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. Kouyama, T. et al., (1985) Biophys. J. 47, 434. Kouyama, T. et al., (1985) Biophys. J. 47, 434. Balashov, S. P. et al., (1988) Photochemical processes of light energy transformation in bacteriorhodopsin. In Physicochemical Biology Reviews (Skulachev, V. P., Ed.) pp 1-61, Harwood Academic Publishers GmbH, Basingstoke, U.K.Balashov, S. P. et al., (1988) Photochemical processes of light energy transformation in bacteriorhodopsin. In Physicochemical Biology Reviews (Skulachev, V. P., Ed.) Pp 1-61, Harwood Academic Publishers GmbH, Basingstoke, U.K. Song, L. et al., (1993) Science 261, 89194. Song, L. et al., (1993) Science 261, 89194. Mowery, P. C. et al., (1979) Biochemistry 18, 4100107. Mowery, P. C. et al., (1979) Biochemistry 18, 4100107. Fischer, U., and Oesterhelt, D. (1979) Biophys. J. 28, 21130.Fischer, U., and Oesterhelt, D. (1979) Biophys. J. 28, 21130.

본 발명의 목적은 광-수확률을 증가시키고, 로돕신을 광활성화 시킬 수 있는 글레오박터 로돕신-살리니잔틴 복합체 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
It is an object of the present invention to provide a glycobacter rhodopsin-salinixanthine complex and a method for preparing the same that can increase the light-probability and photoactivate the rhodopsin.

상기 목적을 달성하기 위하여, 글레오박터 로돕신을 발현하는 세포의 배양 배지에 살리니잔틴을 첨가하는 단계를 포함하는, 글레오박터 로돕신-살리니잔틴 복합체의 제조 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, it provides a method for producing a gliobacter rhodopsin-salinixanthine complex comprising the step of adding salinixanthin to the culture medium of the cells expressing the gliobacter rhodopsin.

또한, 본 발명은In addition,

1) 서열번호 2로 기재되는 글레오박터 로돕신을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 발현벡터를 제조하는 단계; 및, 1) preparing an expression vector operably linked with a polynucleotide encoding Gleobacter rhodopsin as set forth in SEQ ID NO: 2; And,

2) 살리니잔틴을 생산하는 세포에 단계 1)에서 제조한 발현벡터를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 글레오박터 로돕신-살리니잔틴 복합체의 제조 방법을 제공한다.2) provides a method for producing a glycobacter rhodopsin-salinixanthine complex, comprising the step of transforming the expression vector prepared in step 1 to cells producing salinixanthin.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 글레오박터 로돕신-살리니잔틴 복합체를 제공한다. The present invention also provides a glycobacter rhodopsin-salinixanthine complex prepared by the above method.

아울러, 본 발명은 상기 글레오박터 로돕신-살리니잔틴 복합체를 포함하는 센서를 제공한다.
In addition, the present invention provides a sensor comprising the glaobacter rhodopsin-salinixanthine complex.

본 발명의 글레오박터 로돕신-살리니잔틴 복합체는 광-수확 카로테노이드 안테나 역할을 담당하는 살리니잔틴이 글레오박터 로돕신의 레티날로 에너지를 전달하여 광-수확률을 높으며, 높은 에너지의 빛을 이용하여 로돕신을 광활성화시킬 수 있으므로, 로돕신을 이용한 센서에 유용하게 사용될 수 있다.
The glyobacter rhodopsin-salinixanthine complex of the present invention delivers energy to the retinal of the gliobacter rhodopsin, which acts as a light-harvesting carotenoid antenna, thereby increasing the light-yield ratio and using the high energy light of rhodopsin. Since it can be photoactivated, it can be usefully used for sensors using rhodopsin.

도 1은 글레오박터 로돕신 및/또는 살리니잔틴의 흡수 스펙트럼을 나타낸 도이다(1: 글레오박터 로돕신, 2: 살리니잔틴, 3: 글레오박터 로돕신+살리니잔틴, 4: 스펙트럼 3-스펙트럼 1)
도 2는 도 1의 스펙트럼 1 내지 3의 이차 유도체의 흡수 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 3은 살리니잔틴에 의한 글레오박터 로돕신의 적정 흡수 스펙트럼 그래프이다(하여 흡광도를 상기와 동일한 방법으로 측정하였다(스펙트럼 1-7: 각각 0, 4, 8, 11, 13, 16 또는 19 μM의 살리니잔틴 첨가).
도 4는 도 3의 스펙트럼 1 내지 7의 이차 유도체의 흡수 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 5는 보정된 720 nm의 방출에 대한 여기 스펙트럼을 나타낸 형광 분광 분석 결과를 나타낸 도이다(1: 글레오박터 로돕신, 2: 글레오박터 로돕신+살리니잔틴)1 is a diagram showing an absorption spectrum of Gleobacter Rhodopsin and / or Salinixanthin (1: Gleobacter Rhodopsin, 2: Salinixanthin, 3: Gleobacter Rhodopsin + Salinizanthin, 4: Spectrum 3-spectrum 1)
FIG. 2 is a diagram illustrating absorption spectra of secondary derivatives 1 to 3 of FIG. 1.
FIG. 3 is a graph of the appropriate absorption spectra of galibacter rhodopsin with salinixanthin (absorbance was measured in the same manner as above (Spectrum 1-7: 0, 4, 8, 11, 13, 16 or 19 μM, respectively). Salinixanthin).
4 is a diagram illustrating an absorption spectrum of secondary derivatives of spectra 1 to 7 of FIG. 3.
Fig. 5 shows the results of fluorescence spectroscopy showing excitation spectra for a calibrated emission of 720 nm (1: Gleobacter Rhodopsin, 2: Gleobacter Rhodopsin + Salinixanthin)

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 용어 "글레오박터 로돕신(Gloeobacter rhodopsin)"은 시아노박테리움(cyanobacterium)인 글레오박터 비올라세우스(Gloeobacter violaceus)에서 분리된 타입 I의 레티날(retinal) 결합 단백질을 의미한다. 상기 글레오박터 로돕신은 다른 박테리아에서 발견되는 박테리오로돕신(bacteriorhodopsin)과 마찬가지로 막 단백질로서 막통과 도메인(transmembrane domain)을 갖고 있으며, 발색단(chromophore)으로 작용하는 레티날과 결합하면 광-유도(light-driven) 프로톤 펌핑(proton pumping)기능을 갖게 되고, 세포가 색깔을 띠게 된다.The term "Gloeobacter rhodopsin" of the present invention means a type I retinal binding protein isolated from Gloeobacter violaceus , cyanobacterium . The glycobacter rhodopsin, like bacteriorhodopsin found in other bacteria, has a transmembrane domain as a membrane protein and is light-driven when combined with a retinal that acts as a chromophore. ) Proton pumping, and the cells become colored.

본 발명에서 용어 "살리니잔틴(salinixanthin)"은 호염성균인 살리니박터 루버(Salinibacter ruber)에서 생산되는 카로테노이드를 의미한다. In the present invention, the term "salinixanthin" refers to a carotenoid produced by Salinibacter ruber , which is a basophilic bacterium.

본 발명에서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사 조절 인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
In the present invention, the term "operably linked" means a functional binding between a nucleic acid expression control sequence (eg, an array of promoters, signal sequences, or transcriptional regulatory element binding sites) and other nucleic acid sequences, thereby The sequence will control the transcription and / or translation of said other nucleic acid sequence.

본 발명은 글레오박터 로돕신-살리니잔틴 복합체의 제조 방법을 제공한다. The present invention provides a method for preparing the Gleobacter rhodopsin-salinixanthine complex.

상기 글레오박터 로돕신-살리니잔틴 복합체는 하기 방법 Ⅰ 또는 방법 Ⅱ로 제조되는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다:The Gleobacter rhodopsin-salinixanthine complex is preferably prepared by the following method I or method II, but is not limited thereto:

방법 ⅠMethod Ⅰ

글로에박터 로돕신을 발현하는 세포의 배양 배지에 살리니잔틴을 첨가하는 단계를 포함하는, 글로에박터 로돕신-살리니잔틴 복합체의 제조 방법.A method for producing a gloebacter rhodopsin-salinixanthine complex, comprising adding salinixanthin to a culture medium of cells expressing gloebacter rhodopsin.

방법 ⅡMethod II

1) 서열번호 2로 기재되는 글레오박터 로돕신을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 발현벡터를 제조하는 단계; 및, 1) preparing an expression vector operably linked with a polynucleotide encoding Gleobacter rhodopsin as set forth in SEQ ID NO: 2; And,

2) 살리니잔틴을 생산하는 세포에 단계 1)에서 제조한 발현벡터를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 글레오박터 로돕신-살리니잔틴 복합체의 제조 방법.2) transforming the expression vector prepared in step 1 into a cell producing salinixanthin, the method for producing a glycobacter rhodopsin-salinixanthine complex.

상기 글레오박터 로돕신은 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. The Gleobacter rhodopsin is preferably encoded by a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.

상기 글레오박터 로돕신을 발현하는 세포는 자연적으로 글레오박터 로돕신을 발현하는 세포 또는 서열번호 2로 기재되는 글레오박터 로돕신을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 발현벡터로 형질전환된 세포인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않으며 글레오박터 로돕신을 발현하는 세포라면 모두 사용가능하다.The cells expressing Gleobacter rhodopsin are naturally transformed cells expressing Gleobacter rhodopsin or cells transformed with an expression vector operably linked to a polynucleotide encoding Gleobacter rhodopsin as set forth in SEQ ID NO: 2. Preferably, but not limited thereto, any cell expressing Gleobacter rhodopsin may be used.

상기 살리니잔틴은 살리니박터 루버로부터 분리한 것을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않으며 살리니잔틴을 자연적 또는 인위적으로 생산하는 세포로부터 분리하여 사용할 수 있다.The salinixanthin is preferably used that is separated from the Salinibacter louver, but is not limited thereto, and can be used to separate the salinixanthin from natural or artificially produced cells.

상기 형질전환은 리포펙타민(Lipofectamine), 도진도(Dojindo)사의 힐리맥스(Hilymax), 퓨젠(Fugene), 제트 피이아이(jetPEI), 이펙텐(Effectene) 및 드림펙트(DreamFect)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 상용화된 형질도입용 시약을 이용하는 방법; 칼슘-인산(calcium-phosphate), 양전하성 고분자, 리포좀, 나노입자, 뉴클레오펙션(nucleofection), 전기 천공법(electroporation), 열 충격(heat shock), 마그네토펙션(magnetofection)을 이용하는 방법; 및 레트로 바이러스를 이용하는 방법으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행되는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.The transformation was carried out from the group consisting of Lipofectamine, Lidofectamine, Dojindo's Hilymax, Fugene, JetPEI, Effectene and DreamFect. Using any one of the selected commercialized transduction reagents; Methods using calcium-phosphate, positively charged polymers, liposomes, nanoparticles, nucleofection, electroporation, heat shock, magnetofection; And it is preferably carried out by any one method selected from the group consisting of a method using a retrovirus, but is not limited thereto.

본 발명의 구체적 실시예에서, 글레오박터 로돕신의 흡수 분광 스펙트럼은 살리니잔틴을 첨가하였을 때, 살리니잔틴의 흡수 분광 스펙트럼과 유사하게 변화되었고(도 1 참조), 살리니잔틴으로 재구성된 글레오박터 로돕신은 살리니잔틴보다 좁은 패턴의 흡수 스펙트럼을 가지며(도 2 참조), 살리니잔틴의 첨가량의 증가와 비례하여 재구성된 글레오박터 로돕신의 빛 흡수량도 ca. 1:1 카로테노이드: 레티날 화학양론으로 포화될 때 까지 추가로 증가하였다(도 3 내지 도 5 참조). 또한, 살리니잔틴으로 재구성되거나 되지 않은 글레오박터 로돕신의 형광 분광 분석으로 여기 스펙트럼을 분석한 결과, 살리니잔틴이 글레오박터 로돕신의 레티날 단백질로 약 50 %의 에너지를 전달해 주고, 살리니잔틴으로 재구성된 글레오박터 로돕신의 여기 스펙트럼은 521, 488, 458 nm에서 추가적으로 관찰되어, 레티날 크로모포어의 545 nm에서의 흡수 최대값이 레드 쉬프트(red-shift)되는 것을 확인하였다(도 6). In a specific embodiment of the present invention, the absorption spectral spectrum of gliobacter rhodopsin was changed to the absorption spectral spectrum of salinixanthin upon addition of salinixanthin (see FIG. 1), and reconstructed to salioxanthin gliobacter rhodopsin Has a narrower absorption spectrum than salinixanthin (see FIG. 2), and the light absorption of the reconstituted glycobacter rhodopsin in proportion to the increase in the amount of salinixanthin addition was ca. 1: 1 carotenoids: increased further until saturated with retinal stoichiometry (see FIGS. 3-5). In addition, excitation spectra were analyzed by fluorescence spectroscopic analysis of Gleobacter Rhodopsin, either with or without Salinixanthine, to deliver approximately 50% energy to the retinal protein of Gleobacter Rhodopsin, which was reconstituted with Salinixanthin. Excitation spectra of the glaleobacter rhodopsin were additionally observed at 521, 488 and 458 nm, confirming that the absorption maximum at 545 nm of the retinal chromophores was red-shifted (FIG. 6).

상기 결과로부터, 글레오박터 로돕신에 잔토로돕신이 보조적인 빛-수확 카로테노이드 안테나로서 결합하여 글레오박터 로돕신의 광-흡수 효율을 증가시키고, 청-록 범위의 스펙트럼을 빨간색 부위의 스펙트럼으로 스펙트럼의 전환을 야기하는 것을 확인하였다.
From these results, the combination of Gleobacter Rhodopsin with Zantorodocin as an auxiliary light-harvesting carotenoid antenna increases the light-absorption efficiency of Gleobacter Rhodopsin and converts the spectrum of the blue-green range into the spectrum of the red region. It was confirmed to cause.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 글레오박터 로돕신-살리니잔틴 복합체를 제공한다. The present invention also provides a glycobacter rhodopsin-salinixanthine complex prepared by the above method.

본 발명의 구체적 실시예에서 글레오박터 로돕신 및 살리니잔틴이 특이적으로 결합하여 재구성되는 것을 흡수 분광 스펙트럼 분석을 통해 확인하였으며, 형광 흡수 스펙트럼 분석을 통해 여기 스펙트럼을 분석한 결과, 살리니잔틴으로 재구성된 글레오박터 로돕신에서 광흡수 효율이 증가한 것을 확인하였으므로, 본 발명의 글레오박터 로돕신-살리니잔틴 복합체는 센서의 광흡수율을 증진시키는데 사용될 수 있다.
In a specific embodiment of the present invention, it was confirmed by absorption spectroscopic analysis that glyobacter rhodopsin and salinanthin were specifically bound and reconstituted, and the excitation spectrum was analyzed by fluorescence absorption spectrum analysis. Since it was confirmed that the light absorption efficiency was increased in Gleobacter rhodopsin, the Gleobacter rhodopsin-salinixanthine complex of the present invention can be used to enhance the light absorption of the sensor.

아울러, 본 발명은 상기 글레오박터 로돕신-살리니잔틴 복합체를 포함하는 센서를 제공한다. In addition, the present invention provides a sensor comprising the glaobacter rhodopsin-salinixanthine complex.

본 발명의 글레오박터 로돕신-살리니잔틴 복합체는 다수의 기술적 적용성이 있다. 예를 들어, 이들은 광발색성 적용, 광전 적용 및/또는 광수송 적용이 있는 기구 또는 장치에 포함될 수 있다.The gliobacter rhodopsin-salinixanthine complex of the present invention has numerous technical applications. For example, they may be included in instruments or devices with photochromic applications, photoelectric applications and / or light transport applications.

광발색성 적용 하에, 본 발명의 글레오박터로돕신-살리니잔틴 복합체는 광학 데이터 저장, 간섭계 측정 및/또는 광학에서의 그의 흡광 특성에 대해 이용될 수 있다. 광발색성 적용에는, 이에 제한되지 않으나, 홀로그램 필름이 포함된다. 본 발명의 글레오박터 로돕신-살리니잔틴 복합체는 광학 데이터 저장 장치, 예컨대 2-D 저장장치, 3-D 저장장치, 홀로그램 저장장치, 연관 저장장치 등에 이용될 수 있다. 본 발명의 글레오박터 로돕신-살리니잔틴 복합체는 정보 프로세싱, 예컨대 광학 쌍안정/광 스윗칭, 광학 필터링, 신호 조건화, 신경망, 공간 광변조기, 상콘쥬게이션(phase conjugation), 패턴 인식, 간섭계 측정 등을 위한 장치에 이용될 수 있다.Under photochromic applications, the Gleobacterdogsin-Salanixanthin complex of the invention can be used for optical data storage, interferometer measurements and / or its absorbance properties in optics. Photochromic applications include, but are not limited to, holographic films. The gliobacter rhodopsin-salinixanthine complex of the present invention can be used in optical data storage devices such as 2-D storage, 3-D storage, hologram storage, associative storage, and the like. The Gleobacter rhodopsin-salinixanthine complex of the present invention can be used for information processing such as optical bistable / light switching, optical filtering, signal conditioning, neural networks, spatial light modulators, phase conjugation, pattern recognition, interferometry, etc. It can be used in the device for.

광수송 적용 하에서, 본 발명의 글레오박터 로돕신-살리니잔틴 복합체는 막을 통과하는 그의 광유도성 양자 수송, 예컨대 포토볼틱 장치(photovoltaic device) 에 이용될 수 있다. 한 가지 상기 포토볼틱 장치는 프로테오로돕신을 포함하는 광구동 에너지 생성기로서, 광 에너지를 화학 에너지로 전환시킬 수 있다. 본 발명의 글레오박터 로돕신-살리니잔틴 복합체는 또한 반응기 내 ATP 생성, 해수의 탈염 및/또는 태양광의 전기로의 변환을 위한 장치에 이용될 수 있다.Under light transport applications, the Gleobacter rhodopsin-salinixanthine complex of the present invention can be used for its photoinductive proton transport through a membrane, such as a photovoltaic device. One such photovoltaic device is a photodrive energy generator that includes proteorodosin, which can convert light energy into chemical energy. The Gleobacter rhodopsin-salinixanthine complex of the present invention can also be used in devices for ATP production in reactors, desalination of seawater and / or conversion of sunlight to electricity.

본 발명의 글레오박터 로돕신-살리니잔틴 복합체는 또한 2D 조화파 발생, 방사선 유무 확인(radiation detection), 바이오센서 적용 등을 위한 장치에 이용될 수 있다.The Gleobacter rhodopsin-salinixanthine complex of the present invention can also be used in devices for 2D harmonic generation, radiation detection, biosensor applications, and the like.

하나의 실시예에서, 본 발명은 광학 정보 캐리어에 적합한 재료를 제공한다. 특히, 상기 재료는 광학 데이터 저장 재료 또는 위조방지 광학 데이터 캐리어에 적합하다.In one embodiment, the present invention provides a material suitable for an optical information carrier. In particular, the material is suitable for optical data storage materials or anti-counterfeiting optical data carriers.

하나의 실시예에서, 본 발명은 광학 정보 저장 및 프로세싱에 적합한 재료를 제공한다.In one embodiment, the present invention provides a material suitable for optical information storage and processing.

하나의 실시예에서, 본 발명은 광학 데이터 저장(기록) 용 재료를 제공하며, 상기 재료는 데이터를 보유하면서 상기 데이터의 비파괴적인 검출(검독) 을 가능하게 하며, 데이터의 광학적인 소거 후 재사용가능하다.In one embodiment, the present invention provides a material for storing (recording) optical data, which material enables nondestructive detection (reading) of the data while retaining the data, and reusable after optical erasing of the data. Do.

하나의 실시예에서, 본 발명은 위조업자가 모방하기 어려운 광학 정보 캐리어 재료를 제공한다.In one embodiment, the present invention provides an optical information carrier material that is difficult for counterfeiters to imitate.

하나의 실시예에서, 본 발명은 노광시 색상이 변화하는 위조방지 잉크를 제공한다.
In one embodiment, the present invention provides an anti-counterfeiting ink that changes color upon exposure.

[실시예][Example]

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by the following examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited by the following examples.

실시예Example 1.  One. 글레오박터Gleobacter 로돕신의Rhodopsin 제조 Produce

글로에박터 로돕신(서열번호 1)을 암호화하는 유전자(서열번호 2)를 발현하는 발현벡터로 형질전환된 대장균(Escherichia coli)으로부터 글레오박터 로돕신을 공지의 방법을 사용하여 발현 및 정제하였다(비특허문헌 40). 간략하게, 글로에박터 로돕신이 형질전환된 대장균을 밤새 배양한 후, 이를 1/100로 희석하여 600 nm 파장에서 O.D.값이 0.4가 될 때까지 30℃에서 배양하였다. 상기에서 배양된 세포를 5-10 μM의 all-trans-레티날(Sigma, USA) 및 1 mM IPTG(Applichem, USA)으로 30℃에서 6시간 동안 단백질 발현을 유도(induction)하였다. 상기에서 유도된 세포들은 회수하여 50 mM Tris(pH 7.0) 및 150 mM NaCl 내에서 희석시키고, 4℃에서 소니케이션(Branson sonifier 250)을 수행하여 파쇄시킨 다음, 저속(3,220 g/20 분) 원심분리기(Eppendorf centrifuge 5810R)에 의해 세포 부스러기를 제거하였다. 이후, 상등액을 Ni2 +-NTA 아가로오스(Quiagen)과 혼합한 후 저속 진탕기(shaker)로 4℃에서 밤샘 혼합시켰다. 혼합물을 25 mM 이미다졸(Sigma)의 20 배 부피로 세정하고 0.02％ DM을 포함하는 동일한 버퍼내의 250 mM 이미다졸로 용출시켰다. 글로에박터 로돕신을 포함하는 분획(fraction)을 회수하고 이미다졸을 제거하고 정제된 글로에박터 로돕신 단백질을 농축하기 위해서 Amicon Ultra-4 10,000 MWCO 원심분리 필터(Millipore)로 농축시켰다. 농축된 단백질의 농도를 BCA Protein Assay Kit(Pierce, 미국)를 이용하여 결정하여 실험에 사용하였다.Gleobacter rhodopsin was expressed and purified from Escherichia coli transformed with an expression vector expressing a gene encoding Gloebacter rhodopsin (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 2). Patent Document 40). Briefly, E. coli transformed with Globacter rhodopsin was incubated overnight, and then diluted to 1/100 and incubated at 30 ° C. until the OD value became 0.4 at 600 nm wavelength. The cells cultured above were induced protein expression at 30 ° C. for 6 hours with 5-10 μM all-trans-retinal (Sigma, USA) and 1 mM IPTG (Applichem, USA). The derived cells were harvested and diluted in 50 mM Tris (pH 7.0) and 150 mM NaCl, disrupted by performing Sonysonation 250 at 4 ° C, and then centrifuged at low speed (3,220 g / 20 min). Cell debris was removed by a separator (Eppendorf centrifuge 5810R). Then, the supernatant liquid with a slow shaker (shaker) and then a solution of agarose (Quiagen) with Ni 2 + -NTA agarose was mixed overnight at 4 ℃. The mixture was washed with a 20-fold volume of 25 mM imidazole (Sigma) and eluted with 250 mM imidazole in the same buffer containing 0.02% DM. Fractions containing Gloebacter rhodopsin were recovered, concentrated with Amicon Ultra-4 10,000 MWCO centrifugal filter (Millipore) to remove imidazole and concentrate the purified Gloebacter rhodopsin protein. The concentration of the concentrated protein was determined using the BCA Protein Assay Kit (Pierce, USA) and used for the experiment.

실시예Example 2.  2. 살리니잔틴의Salinizantine 제조 Produce

살리니박터 루버(Salinibacter ruber)의 세포막으로부터 아세톤/메탄올 혼합액(7:3)을 이용하여 살리니잔틴을 분리하였다. 세포막의 지질은 차가운 아세톤으로 침전시켜 제거시켰으며, 분리된 살리니잔틴은 -20℃에서 에탄올에 녹여서 보관하였다.
Salinixanthine was isolated from a cell membrane of Salinibacter ruber using acetone / methanol mixture (7: 3). Lipids of the cell membranes were removed by precipitation with cold acetone, and the separated salinixanthin was stored in ethanol at -20 ° C.

실시예Example 3.  3. 흡수분광분석(Absorption Spectroscopy)을Absorption Spectroscopy 통한  through 글레오박터Gleobacter 로돕신Rhodopsin 및  And 살리니잔틴의Salinizantine 재구성( Reconstruction reconstitutionreconstitution ) 확인) Confirm

본 발명자들은 0.2 M의 하이드록시라민으로 처리하기 전, 후의 글레오박터 로돕신(16 μM), 살리니잔틴(8 μM) 또는, 글레오박터 로돕신(16 μM) 및 살리니잔틴(8 μM)에서 공지의 기술을 사용하여 541 nm에서의 흡광계수의 최대값을 측정하였다(13). 흡광계수의 최대값은 스펙트럼의 변화로부터 추정되었으며, 흡수 스펙트럼은 4 mm×10 mm 셀에서 Shimadzu 1701 분광계로 기록되었다(4 mm 경로). 빛 세기(N)로 교정된 형광 및 형광 여기 스펙트럼은 공지의 기술에 따라 SLM-Aminco 분광형광계로 기록되었다(비특허문헌 13). 상기 흡광도 측정시 버퍼조건은 0.02% DDM(pH 7.2) 및 100 mM NaCl이었다. The inventors of the present invention prior to and after treatment with 0.2 M of hydroxylamin are known in Gleobacter Rhodopsin (16 μM), Salinixanthin (8 μM) or Gleobacter Rhodopsin (16 μM) and Salinixanthin (8 μM). The technique was used to determine the maximum extinction coefficient at 541 nm (13). The maximum value of the extinction coefficient was estimated from the change in the spectrum, and the absorption spectrum was recorded with a Shimadzu 1701 spectrometer in a 4 mm × 10 mm cell (4 mm path). Fluorescence and fluorescence excitation spectra corrected by light intensity (N) were recorded with an SLM-Aminco spectrofluorometer according to a known technique (Non-Patent Document 13). The buffer conditions for measuring the absorbance were 0.02% DDM (pH 7.2) and 100 mM NaCl.

그 결과, 글레오박터 로돕신의 541 nm에서의 흡광계수의 최대값은 ca. 50000M-1 cm-1일 것으로 평가되었다. 도 1에서 나타난 바와 같이, 계면활성제(DDM)에 용해시킨 글레오박터 로돕신이 단독으로 존재할 때, pH 7.2에서 541 nm에서 최대값의 단일 흡수량을 갖는 스펙트럼을 나타내었다(도 1의 스펙트럼 1). 또한, 살리니잔틴이 단독으로 존재시, 부실하게 결정된 진동 전자 최대값을 가졌다(도 1의 스펙트럼 2). 상기 글레오박터 로돕신 단백질에 살리니잔틴의 첨가하였을 때, 생성된 산물의 스펙트럼은 두 첨가물의 특이적 결합을 나타내는 카로테노이드 진동 전자 밴드에 특징적인 피크의 좁아짐을 확인하였다(도 1의 스펙트럼 3 및 4). 카로테노이드의 결합은 ~5분의 시상수에서 일어났다(데이터 보여주지 않음). 결합된 카로테노이드의 양은 흡수 스펙트럼의 이차 유도체의 진폭으로부터 평가할 수 있다(도 2). 비처리된 글레오박터 로돕신, 비결합된 살리니잔틴 및 살리니잔틴으로 재구성된 글레오박터 로돕신의 이차 유도체의 비교에서 알 수 있듯이(도 2의 스펙트럼 1-3), 결합에 따른 흡수 밴드의 좁은 피크는 그들의 이차 유도체의 진폭의 증가를 초래하였다.
As a result, the maximum extinction coefficient at 541 nm of Gleobacter rhodopsin was ca. It was estimated to be 50000M -1 cm -1 days. As shown in FIG. 1, when Gleobacter rhodopsin dissolved in surfactant (DDM) alone was present, it showed a spectrum with a single maximum absorption at 541 nm at pH 7.2 (spectrum 1 of FIG. 1). In addition, when salinixanthin alone was present, it had a poorly determined oscillation electron maximum (spectrum 2 of FIG. 1). When the salinixanthin was added to the Gleobacter rhodopsin protein, the resulting product spectra were found to narrow the peaks characteristic of the carotenoid oscillating electron bands indicating the specific binding of the two additives (spectrums 3 and 4 of FIG. 1). . The binding of the carotenoids occurred at a time constant of ˜5 minutes (data not shown). The amount of bound carotenoids can be estimated from the amplitude of the secondary derivatives in the absorption spectrum (FIG. 2). As can be seen from the comparison of untreated Gleobacter Rhodopsin, unbound Salinixanthin and secondary derivatives of Gleobacter Rhodopsin reconstituted with Salinixanthin (spectrum 1-3 in FIG. 2), the narrow peak of the absorption band upon binding Resulted in an increase in the amplitude of their secondary derivatives.

또한, 본 발명자들은 상기에서 확인한 글레오박터 로돕신 및 살리니잔틴의 특이적 결합의 화학양론을 분석하기 위하여 16 μM의 글레오박터 로돕신에 0, 4, 8, 11, 13, 16 또는 19 μM의 살리니잔틴을 첨가하여 흡광도를 상기와 동일한 방법으로 측정하였다(도 3 및 4에서 각각 스펙트럼 1-7). In addition, the inventors of the present invention found that 0, 4, 8, 11, 13, 16 or 19 μM of Salini into 16 μM of Gleobacter Rhodopsin to analyze the stoichiometry of specific binding of Gleobacter Rhodopsin and Salinixanthin. Xanthine was added and the absorbance was measured in the same manner as above (spectrum 1-7 in FIGS. 3 and 4, respectively).

살리니잔틴의 첨가량 증가시 이용가능한 결합 부위가 ca. 1:1 카로테노이드: 레티날 화학양론으로 포화될 때 까지 추가적 결합을 야기하였다(도 3). 결합된 카로테노이드의 양은 자유 카로테노이드에 대한 진폭의 값이 0이 되는 파장인, 541 nm에서 진폭을 나타낸 후(도 4), 흡수 스펙트럼의 이차 유도체로부터 평가하여 적정곡선을 나타내었다(도 5).
The available binding site upon increasing the amount of salinixanthin is ca. 1: 1 carotenoids: caused further binding until saturated with retinal stoichiometry (FIG. 3). The amount of bound carotenoids showed amplitude at 541 nm, the wavelength at which the amplitude value for free carotenoids became zero (FIG. 4), and then evaluated from secondary derivatives of the absorption spectrum to show titration curves (FIG. 5).

아울러, 본 발명자들은 글레오박터 로돕신 및 살리니잔틴의 결합(재구성) 전, 후의 여기 스펙트럼의 최대값을 pH 4.5에서 공지의 방법으로 측정하였다(비특허문헌 13). 상기 결과로부터 살리니잔틴이 빛을 흡수하여 레티날로 약 50 %의 에너지를 전달해 주는 것을 확인하였다. 레티날 크로모포어의 545 nm에서의 흡수 최대값이 레드 쉬프트(red-shift)되는 것을 확인하였다. 살리니잔틴으로 재구성된 글로에박터 로돕신의 여기 스펙트럼은 521, 488, 458 nm에서 추가적으로 관찰되었다. 이는 살리니잔틴으로부터 레티날로 에너지의 전달이 있었음을 명백히 시사한다(도 6). In addition, the present inventors measured the maximum value of the excitation spectrum before and after binding (reconstitution) of gliobacter rhodopsin and salinixanthin by a well-known method at pH 4.5 (nonpatent literature 13). From the above results, it was confirmed that salinixanthin absorbed light and delivered about 50% of energy to retinal. It was confirmed that the absorption maximum at 545 nm of the retinal chromophores was red-shifted. Excitation spectra of Gloibacter rhodopsin reconstituted with salinixanthin were additionally observed at 521, 488, 458 nm. This clearly suggests that there was a transfer of energy from salinixanthin to retinal (FIG. 6).

서열목록 전자파일 첨부Attach an electronic file to a sequence list

Claims (7)

글레오박터 로돕신을 발현하는 세포의 배양 배지에 살리니잔틴을 첨가하는 단계를 포함하는, 글레오박터 로돕신-살리니잔틴 복합체의 제조 방법.
A method for producing a glycobacter rhodopsin-salinixanthine complex, comprising adding salinixanthin to a culture medium of cells expressing gleobacter rhodopsin.
제 1항에 있어서, 상기 글레오박터 로돕신은 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 방법.
2. The method of claim 1, wherein said Gleobacter rhodopsin is encoded by a polynucleotide set forth in SEQ ID NO: 2.
제 1항에 있어서, 상기 글레오박터 로돕신을 발현하는 세포는 자연적으로 글레오박터 로돕신을 발현하는 세포 또는 서열번호 2로 기재되는 글레오박터 로돕신을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 발현벡터로 형질전환된 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 1, wherein the cells expressing Gleobacter rhodopsin are cells expressing Gleobacter rhodopsin or an expression vector operably linked to a polynucleotide encoding Gleobacter rhodopsin as set forth in SEQ ID NO: 2. The transformed cells.
1) 서열번호 2로 기재되는 글레오박터 로돕신을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 발현벡터를 제조하는 단계; 및,
2) 살리니잔틴을 생산하는 세포에 단계 1)에서 제조한 발현벡터를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 글레오박터 로돕신-살리니잔틴 복합체의 제조 방법.
1) preparing an expression vector operably linked with a polynucleotide encoding Gleobacter rhodopsin as set forth in SEQ ID NO: 2; And,
2) transforming the expression vector prepared in step 1 into a cell producing salinixanthin, the method for producing a glycobacter rhodopsin-salinixanthine complex.
제 4항에 있어서, 상기 형질전환은 리포펙타민(Lipofectamine), 도진도(Dojindo)사의 힐리맥스(Hilymax), 퓨젠(Fugene), 제트 피이아이(jetPEI), 이펙텐(Effectene) 및 드림펙트(DreamFect)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 상용화된 형질도입용 시약을 이용하는 방법; 칼슘-인산(calcium-phosphate), 양전하성 고분자, 리포좀, 나노입자, 뉴클레오펙션(nucleofection), 전기 천공법(electroporation), 열 충격(heat shock), 마그네토펙션(magnetofection)을 이용하는 방법; 및 레트로 바이러스를 이용하는 방법으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
According to claim 4, wherein the transformation is Lipofectamine (Lipofectamine), Dojindo (Hilymax), Fugene (Fugene), JetPEI (Effectene) and Dreamfect ( DreamFect) using any one of the commercialized transduction reagents selected from the group consisting of; Methods using calcium-phosphate, positively charged polymers, liposomes, nanoparticles, nucleofection, electroporation, heat shock, magnetofection; And a retrovirus, the method comprising any one selected from the group consisting of.
제 1항 또는 제 4항의 방법으로 제조된 글레오박터 로돕신-살리니잔틴 복합체.
Gleobacter rhodopsin-salinixanthine complex prepared by the method of claim 1.
제 6항의 글레오박터 로돕신-살리니잔틴 복합체를 포함하는 센서. A sensor comprising the gliobacter rhodopsin-salinixanthine complex of claim 6.
KR1020100036536A 2010-04-20 2010-04-20 Gloeobacter rhodopsin with reconstituted carotenoid KR101061482B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100036536A KR101061482B1 (en) 2010-04-20 2010-04-20 Gloeobacter rhodopsin with reconstituted carotenoid

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100036536A KR101061482B1 (en) 2010-04-20 2010-04-20 Gloeobacter rhodopsin with reconstituted carotenoid

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101061482B1 true KR101061482B1 (en) 2011-09-02

Family

ID=44956807

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100036536A KR101061482B1 (en) 2010-04-20 2010-04-20 Gloeobacter rhodopsin with reconstituted carotenoid

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101061482B1 (en)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101479541B1 (en) 2012-05-31 2015-01-07 서강대학교산학협력단 Compositions comprising Marine Microorganism-derived Rhodopsin Proteins
KR101528353B1 (en) * 2012-07-19 2015-06-12 한국생명공학연구원 NQ rhodopsin gene from the marine flavobacterium Donghaeana dokdonensis DSW-6
WO2020148913A1 (en) * 2019-01-18 2020-07-23 俊英 栗原 Preventing, and suppressing progression of, retinal disease, improving visual cognitive behavioral function, and strengthening visual function
US11771741B2 (en) 2019-09-13 2023-10-03 Restore Vision Inc. Nucleic acid construct that encodes chimeric rhodopsin
US11932679B2 (en) 2016-09-02 2024-03-19 Keio University Agent for restoring visual function or agent for preventing deterioration in visual function

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biochemistry(2010) Vol.49, pp.3343-3350 (2010.03.)
Biochemisty(2006) Vol.45, pp.10998-11004
Photochem. Photobiol.(2008) Vol.84, No.4, pp.977-984

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101479541B1 (en) 2012-05-31 2015-01-07 서강대학교산학협력단 Compositions comprising Marine Microorganism-derived Rhodopsin Proteins
KR101528353B1 (en) * 2012-07-19 2015-06-12 한국생명공학연구원 NQ rhodopsin gene from the marine flavobacterium Donghaeana dokdonensis DSW-6
US11932679B2 (en) 2016-09-02 2024-03-19 Keio University Agent for restoring visual function or agent for preventing deterioration in visual function
WO2020148913A1 (en) * 2019-01-18 2020-07-23 俊英 栗原 Preventing, and suppressing progression of, retinal disease, improving visual cognitive behavioral function, and strengthening visual function
JPWO2020148913A1 (en) * 2019-01-18 2021-12-02 株式会社レストアビジョン Prevention and progression of retinal disease, improvement of visual cognitive behavioral function, and enhancement of visual function
JP7299632B2 (en) 2019-01-18 2023-06-28 株式会社レストアビジョン Prevention and progression of retinal diseases, improvement of visual cognitive behavioral function, and enhancement of visual function
US11771741B2 (en) 2019-09-13 2023-10-03 Restore Vision Inc. Nucleic acid construct that encodes chimeric rhodopsin

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101061482B1 (en) Gloeobacter rhodopsin with reconstituted carotenoid
Bryant et al. How nature designs light-harvesting antenna systems: design principles and functional realization in chlorophototrophic prokaryotes
Mirkovic et al. Light absorption and energy transfer in the antenna complexes of photosynthetic organisms
Fleming et al. Design principles of photosynthetic light-harvesting
Ma et al. A rising tide of blue‐absorbing biliprotein photoreceptors–characterization of seven such bilin‐binding GAF domains in N ostoc sp. PCC 7120
Lavaud et al. General features of photoprotection by energy dissipation in planktonic diatoms (Bacillariophyceae) 1
Stadnichuk et al. Phycobiliproteins: Structure, functions and biotechnological applications
Li et al. Novel chlorophylls and new directions in photosynthesis research
Kim et al. Screening and characterization of proteorhodopsin color-tuning mutations in Escherichia coli with endogenous retinal synthesis
Brazard et al. Spectro− Temporal Characterization of the Photoactivation Mechanism of Two New Oxidized Cryptochrome/Photolyase Photoreceptors
Operamolla et al. “Garnishing” the photosynthetic bacterial reaction center for bioelectronics
Choi et al. Cyanobacterial light-driven proton pump, Gloeobacter rhodopsin: complementarity between rhodopsin-based energy production and photosynthesis
Fushimi et al. Cyanobacteriochrome photoreceptors lacking the canonical Cys residue
Itoh et al. Function of chlorophyll d in reaction centers of photosystems I and II of the oxygenic photosynthesis of Acaryochloris marina
Giovagnetti et al. A siphonous morphology affects light-harvesting modulation in the intertidal green macroalga Bryopsis corticulans (Ulvophyceae)
Imasheva et al. pH‐dependent transitions in xanthorhodopsin
Zulfiqar et al. Role of carotenoids in photosynthesis
Kikukawa et al. Probing the Cl−-pumping photocycle of pharaonis halorhodopsin: Examinations with bacterioruberin, an intrinsic dye, and membrane potential-induced modulation of the photocycle
Ganapathy et al. Redshifted and Near‐infrared Active Analog Pigments Based upon Archaerhodopsin‐3
Qin et al. Isolation and characterization of a PSI–LHCI super-complex and its sub-complexes from a siphonaceous marine green alga, Bryopsis Corticulans
Makhneva et al. 3-Acetyl-chlorophyll formation in light-harvesting complexes of purple bacteria by chemical oxidation
Maksimov et al. Hybrid systems of quantum dots mixed with the photosensitive protein phycoerythrin
Babu et al. Effect of light quality on phycobilisome components of the cyanobacterium Spirulina platensis
Wu et al. Responses of a marine red tide alga Skeletonema costatum (Bacillariophyceae) to long-term UV radiation exposures
Li et al. The identification of IsiA proteins binding chlorophyll d in the cyanobacterium Acaryochloris marina

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140711

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150810

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160829

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170703

Year of fee payment: 7

LAPS Lapse due to unpaid annual fee