KR101046158B1 - Cell delivery system for the cell therapy comprising cells derived from embryonic stem cells - Google Patents
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Abstract
본 발명은 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 함유하는 세포치료용 세포 전달체(cell delivery system)로서, 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 마트리겔(matrigel)로 이루어진 담체의 내부에 삽입시켜 형성된 세포 전달체를 제공한다. 상기 세포 전달체는 질환 부위가 직접 접촉하지 않는 생체 내의 다른 부위에 이식되며; 상기 세포 전달체가 생체에 이식되었을 때, 상기 담체에 의하여 상기 이식 부위로부터의 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포의 생체 내 이동이 억제되고; 최종적으로 상기 이식 부위로부터 제거된다. 본 발명의 세포 전달체는 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포가 질환 부위에 직접적으로 접근하지 않은 상태에서 상기 세포가 분비하는 사이토카인 등의 물질만으로 세포 치료 목적을 달성함으로써 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포가 체내에 직접 이식되어 발생될 수 있는 암이나, 종양의 생성에 대한 문제를 배제할 수 있다. The present invention provides a cell delivery system for cell therapy containing cells derived from embryonic stem cells, wherein the cell delivery system is formed by inserting cells derived from the embryonic stem cells into a carrier made of matrigel. To provide. The cell carrier is implanted in another site in the body where the disease site is not in direct contact; When the cell carrier is transplanted into a living body, the in vivo migration of cells derived from the embryonic stem cells from the transplantation site is inhibited by the carrier; Finally, it is removed from the transplant site. In the cell carrier of the present invention, a cell derived from an embryonic stem cell is achieved by achieving a cell therapeutic purpose with a substance such as a cytokine secreted by the cell in a state in which cells derived from an embryonic stem cell do not directly approach a disease site. Cancer, which can be caused by direct transplantation into a tumor, or problems with tumor formation can be excluded.
세포 전달체, 배아 줄기 세포, 혈관 내피 세포 Cell Carrier, Embryonic Stem Cells, Vascular Endothelial Cells
Description
본 발명은 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 함유하는 세포치료용 세포 전달체(cell delivery system)에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 함유하는 세포치료용 세포 전달체(cell delivery system)로서, 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 마트리겔(matrigel)로 이루어진 담체의 내부에 삽입시켜 형성된 세포 전달체에 관한 것이다. 상기 세포 전달체는 질환 부위가 직접 접촉하지 않는 생체 내의 다른 부위에 이식되며; 상기 세포 전달체가 생체에 이식되었을 때, 상기 담체에 의하여 상기 이식 부위로부터의 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포의 생체 내 이동이 억제되고; 최종적으로 상기 이식 부위로부터 제거된다.The present invention relates to a cell delivery system for cell therapy containing cells derived from embryonic stem cells, and more particularly, a cell delivery system for cell therapy containing cells derived from embryonic stem cells. ), A cell carrier formed by inserting a cell derived from the embryonic stem cell into a carrier made of matrigel. The cell carrier is implanted in another site in the body where the disease site is not in direct contact; When the cell carrier is transplanted into a living body, the in vivo migration of cells derived from the embryonic stem cells from the transplantation site is inhibited by the carrier; Finally, it is removed from the transplant site.
인간 배아 줄기 세포는 무한한 자가 증식 능력과 인체를 구성하는 삼배엽성 세포로 분화할 수 있는 전분화능을 가진 세포로서(Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM, Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science (1998) 282:1145-1147), 신경, 혈관, 근육, 췌장 세포 등으로 분화를 유도한 연구들이 발표됨에 따라 오늘날 난치병 치료를 위한 연구에 중요한 세포로 인식되고 있다.Human embryonic stem cells are cells with infinite self-proliferative capacity and pluripotency capable of differentiating into trigeminal cells constituting the human body (Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones). JM, Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.Science (1998) 282: 1145-1147), which are important cells for research in the treatment of incurable diseases, with the publication of studies leading to differentiation into neurons, blood vessels, muscles, and pancreatic cells. Is recognized.
인간 배아 줄기 세포의 특정 세포로의 분화 유도 방법 및 고순도의 효율적 분리 방법을 통한 세포 치료제의 개발은 약물이나 수술적 요법에 의존하는 기존의 치료 방법을 뛰어넘을 수 있는 새로운 치료법으로 난치병 치료의 핵심적 기술을 제공할 수 있을 것으로 기대된다. 이러한 세포치료제로서의 적용에 있어서, 특히 혈관 내피 전구 세포를 이용한 세포치료는 급증하고 있는 혈관 관련 질환들(심혈관질환, 뇌손상질환, 당뇨성 궤양 등)의 치료에 직접적 혹은 간접적으로 그 응용 범위가 클 것으로 기대된다. The development of cell therapies through the method of inducing differentiation of human embryonic stem cells into specific cells and efficient separation of high purity is a new technology that can go beyond the existing treatment methods that depend on drugs or surgical therapies. It is expected to be able to provide. In the application of such cell therapy, cell therapy using vascular endothelial progenitor cells has a large scope of application directly or indirectly in the treatment of rapidly increasing vascular related diseases (cardiovascular diseases, brain injury diseases, diabetic ulcers, etc.). It is expected to be.
한편, 혈관신생(angiogenesis) 손상된 기존 혈관 주변에서 새로운 혈관이 발아하는 형태로 발생되어, 발아한 혈관은 자신을 늘리고, 다시 분지하고, 주변의 다른 혈관과 접촉하여 의사소통하는 네트워크를 형성시키는 과정으로서, 허혈성 혈관 질환 등의 혈관신생 부전-연관 질환의 치료는 신속한 신생 혈관의 형성 여부에 의존한다. 혈관신생 부전-연관 질환으로는 당뇨병성 궤양; 괴저; 치유를 위해 혈관신생이 요구되는 상처; 뷰르그병; 고혈압; 뇌혈관 허혈, 신장 허혈, 폐 허혈, 지절 허혈, 허혈성 심근경색 등을 포함하는 허혈성 질환, 폐색성 혈관 질환, 또는 심혈관 질환을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. On the other hand, angiogenesis occurs in the form of new blood vessels germinating around existing damaged blood vessels, and the germinated blood vessels expand, re-branch, and form a network in communication with other blood vessels in the vicinity. Treatment of angiogenesis-associated diseases, such as ischemic vascular disease, depends on the formation of rapid neovascularization. Angiogenesis-associated diseases include diabetic ulcers; Necrotic; Wounds requiring angiogenesis for healing; Burgue's disease; High blood pressure; Ischemic diseases, including, but not limited to, cerebrovascular ischemia, renal ischemia, pulmonary ischemia, ground ischemia, ischemic myocardial infarction, and the like.
상기 허혈성 혈관 질환 등의 혈관신생 부전-연관 질환의 치료방법으로는 약물요법, 경피적 동맥성형술, 동맥우회술 등이 이용되고 있으며, 최근에는 새로운 혈관의 생성을 촉진하는 단백질 또는 유전자를 허혈 부위에 투여하여 측부 혈관의 형성을 증진시킴으로써 허혈성 혈관질환을 극복하고자 하는 혈관신생 치료법 (therapeutic angiogenesis)이 새롭게 시도되고 있다. 상기 유전자 치료에 이용되고 있는 대표적인 성장인자가 VEGF이다. 또한, 상기 단백질 투여에 의한 치료로서 안지오포이에틴-1의 단밸질 구조 변형체를 족부 궤양, 심장병(심근경색과 심장 허혈증)과 뇌졸중 등의 심혈관계 질환의 치료에 사용한 예가 보고된 바 있다(Chung-Hyun Cho, Richard A. Kammerer, Hyuek jong Lee and Gou Young Koh, COMP-Ang1: a designed angiopoietin-1 variant with nonleaky angiogenec activity, PNAS(2004) 101 5547-5552). 이외에도, 혈관신생 촉진인자로는 FGF, TGF, PDGF 등이 알려져 있다. 그러나 상기 혈관신생 촉진 인자는 인간의 세포나 조직에서 얻어진 것이 아니라 E.coli 나 CHO 세포에서 배양된 것이 주로 사용되므로, 배양 시 수반될 수 있는 감염 물질 등에 대한 문제점 해결이 선행되어야 할 것이다.Drug treatment, percutaneous angioplasty, arterial bypass surgery, etc. are used as a method for treating angiogenesis-related diseases such as ischemic vascular diseases. Recently, a protein or gene that promotes the production of new blood vessels is administered to an ischemic site. Therapeutic angiogenesis is attempting to overcome ischemic vascular disease by enhancing the formation of lateral vessels. The representative growth factor used for the gene therapy is VEGF. In addition, there has been reported an example of using an angiopoietin-1 protein as a treatment of the protein administration in the treatment of cardiovascular diseases such as foot ulcers, heart disease (myocardial infarction and cardiac ischemia) and stroke (Chung- Hyun Cho, Richard A. Kammerer, Hyuek jong Lee and Gou Young Koh, COMP-Ang 1: a designed angiopoietin-1 variant with nonleaky angiogenec activity, PNAS (2004) 101 5547-5552). In addition, FGF, TGF, PDGF and the like are known as angiogenesis promoting factors. However, since the angiogenesis promoting factor is mainly obtained from E. coli or CHO cells rather than obtained from human cells or tissues, it should be preceded by the problem solving for infectious agents that may be involved in the culture.
허혈성 혈관 질환 등의 혈관신생 부전-연관 질환 치료를 위한 다른 방법 중, 세포 자체를 이용하는 치료법은 1997년 Asahara 등이 말초 혈액으로부터 혈관 내피 전구 세포의 분리와 그 특성을 보고한 바 있으며(Takayuki Asahara, Toyoaki Murohara, Alison Sullivan, Jeffrey M. Isner, Isolation of Putative Progenitor Endothelial Cells for Angiogenesis, SCIENCE (1997), 275, 964-967), 혈관 내피 전구 세포를 이용한 혈관신생 부전-연관 질환의 치료 가능성이 연구되고 있다. 예를 들어, 허 등은 Asahara 등이 분리한 혈관내피 전구세포가 두 가지의 서로 다른 특성을 가진 세포로 존재하고 있으며, 이를 초기와 후기로 구분지어 명명하였으며, 초기 혈관내피전구세포는 혈관신생시 혈관생성 촉진인자를 분비하는 특성을 가지고 있으며, 후기 혈관내피전구세포는 혈관신생시 직접 혈관형성에 관여하는 세포역할을 한다는 것을 규명한 바 있다(Jin Hur, Chang-Hwan Yoon, Hyo-Soo Kim, Young-Bae Park, Characterization of Two Types of Endothelial Progenitor Cells and Their Different Contributions to Neovasculogenesis (ATVB) 2004,24,288). 현재는 말초 혈액 뿐만 아니라 제대 혈이나, 골수에서 분리한 단핵구 세포를 배양하여 얻어진 혈관 내피 전구세포에 대해서도 세포치료제로의 사용가능성에 대한 연구가 진행되고 있으나, 환자에게 투여될 충분한 세포수의 확보가 새로운 문제점으로 제기되고 있다.Among other methods for the treatment of angiogenesis-related diseases such as ischemic vascular disease, the treatment using the cells themselves has been reported by Asahara et al. 1997 in isolation and characterization of vascular endothelial progenitor cells from peripheral blood (Takayuki Asahara, Toyoaki Murohara, Alison Sullivan, Jeffrey M. Isner, Isolation of Putative Progenitor Endothelial Cells for Angiogenesis, SCIENCE (1997), 275, 964-967), and the possibility of treatment of angiogenesis-associated diseases using vascular endothelial progenitor cells have. For example, Huh et al. Named Asahara et al. That vascular endothelial progenitor cells exist as cells with two different characteristics, which are named early and late, and early vascular endothelial progenitor cells are called angiogenesis. It has been shown to secrete angiogenesis-promoting factors, and late vascular endothelial progenitor cells have been found to play a role in cellular angiogenesis during angiogenesis (Jin Hur, Chang-Hwan Yoon, Hyo-Soo Kim, Young-Bae Park, Characterization of Two Types of Endothelial Progenitor Cells and Their Different Contributions to Neovasculogenesis (ATVB) 2004,24,288). Currently, research on the possibility of using as a cell therapy for vascular endothelial progenitor cells obtained by culturing monocytes isolated from umbilical cord blood or bone marrow, as well as peripheral blood, is underway. It is raised as a new problem.
1998년 인간 배아 줄기 세포가 최초로 확립된 이후, 인간 배아 줄기 세포를 이용하여 혈관내피세포로 분화시키는 방법들이 연구되어 왔으며, 2002년 Levenberg S 는 인간 배아 줄기 세포로부터 배상체를 형성한 후 자연분화 방법을 통해 분화시켜, 유세포 분석기(fluorescence activated cell sorter, FACS)를 이용하여 분화된 배상체에 존재하는 혈관 내피 세포만을 얻었으며(Levenberg S, Golub JS, Amit M, Itskovitz-Eldor J, Langer R. PNAS (2002) 99, 4391-4396), 김 등은 배상체 내에서 혈관내피세포만을 특이적으로 분리하여 많은 수의 혈관내피 세포수를 확보하는 방법을 보고한 바 있다(Kim J, Moon SH, Lee SH, Lee DR, Koh GY, Chung HM. Stem Cells Dev. 2007 Apr;16(2):269-80.). 또한, 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 혈관 내피 세포가 혈관질환의 세포치료제로서 사용될 수 있음이 보고된 바 있다(Lino S. Ferreira, Sharon Gerecht, Hester F. Shieh, Robert Langer, Vascular Progenitor Cells Isolated From Human Embryonic Stem Cells Give Rise to Endothelial and Smooth Muscle-Like Cells and From Vascular Networks In Vivo, Circulation Research, 2007 Aug 3;101(3):286-94). 그러나, 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 세포를 세포치료제로 사용하기에는 여전히 인간 배아 줄기 세포로부터 생성될 수 있는 악성 종양이나 기타 확인되지 아니한 부작용에 대한 안전성 문제가 아직 완전히 검증된 것은 아니다. Since human embryonic stem cells were first established in 1998, methods for differentiating them into vascular endothelial cells using human embryonic stem cells have been studied.In 2002, Levenberg S formed a embryoid body from human embryonic stem cells and then spontaneously differentiated them. The vascular endothelial cells present in the differentiated embryoid body were obtained using a flow cytometry (fluorescence activated cell sorter (FACS)) (Levenberg S, Golub JS, Amit M, Itskovitz-Eldor J, Langer R. PNAS). (2002) 99, 4391-4396), Kim et al. Have reported how to specifically isolate vascular endothelial cells in the embryonic body to secure a large number of vascular endothelial cells (Kim J, Moon SH, Lee) SH, Lee DR, Koh GY, Chung HM. Stem Cells Dev. 2007 Apr; 16 (2): 269-80.). In addition, it has been reported that vascular endothelial cells differentiated from human embryonic stem cells can be used as cell therapy for vascular diseases (Lino S. Ferreira, Sharon Gerecht, Hester F. Shieh, Robert Langer, Vascular Progenitor Cells Isolated From Human) Embryonic Stem Cells Give Rise to Endothelial and Smooth Muscle-Like Cells and From Vascular Networks In Vivo, Circulation Research, 2007 Aug 3; 101 (3): 286-94). However, the use of cells differentiated from human embryonic stem cells as cell therapy is still not fully validated for safety of malignant tumors or other unidentified side effects that may arise from human embryonic stem cells.
본 발명자들은 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포(예를 들어, 혈관 내피 전구 세포 또는 혈관 내피 세포)를 사용한 세포 치료제로서, 배아 줄기 세포로부터 생성될 수 있는 악성 종양이나 기타 확인되지 아니한 부작용에 대한 안전성 문제를 회피할 수 있는 세포 전달체(cell delivery system)를 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 배아 줄기 세포로부터 유래된 혈관 내피 세포 등의 세포를 특정 담체에 삽입시켜 세포 전달체를 형성시키고, 이를 생체에 이식하였을 때, 상기 세포의 생체 내 이동이 상기 담체에 의해 억제됨과 동시에 상기 세포로부터 분비되는 사이토카인 등의 물질에 의해 원하는 치료효과를 얻을 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 상기 치료 목적이 종료한 후 이식된 세포전달체를 외과적 수술 등에 의해 제거함으로써, 생체 내에서 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포에 의해 생성될 수 있는 악성 종양 등의 부작용을 회피할 수 있다.We are a cell therapy using cells derived from embryonic stem cells (e.g., vascular endothelial progenitor cells or vascular endothelial cells), and safety issues against malignant tumors or other unidentified side effects that may be generated from embryonic stem cells. Various studies have been carried out to develop a cell delivery system that can avoid. As a result, cells such as vascular endothelial cells derived from embryonic stem cells are inserted into a specific carrier to form a cell carrier, and when transplanted into a living body, in vivo migration of the cells is inhibited by the carrier and at the same time. It has been found that desired therapeutic effects can be obtained by cytokines and the like secreted from the present invention. In addition, by removing the transplanted cell transporter after surgery, such as by surgical surgery, side effects such as malignant tumors that may be generated by cells derived from embryonic stem cells in vivo can be avoided.
따라서, 본 발명은 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 함유하는 세포치료 용 세포 전달체(cell delivery system)로서, 종양 발생 등의 부작용을 회피할 수 있는 세포 전달체를 제공하는 것을 목적으로 한다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a cell delivery system for cell therapy containing cells derived from embryonic stem cells, which can avoid side effects such as tumor development.
본 발명의 일 태양에 따라, 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 함유하는 세포치료용 세포 전달체(cell delivery system)로서, 상기 세포 전달체가 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 마트리겔(matrigel)로 이루어진 담체의 내부에 삽입시켜 형성된 세포 전달체가 제공된다. 상기 세포 전달체는 질환 부위가 직접 접촉하지 않는 생체 내의 다른 부위에 이식되며; 상기 세포 전달체가 생체에 이식되었을 때, 상기 담체에 의하여 상기 이식 부위로부터의 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포의 생체 내 이동이 억제되고; 최종적으로 상기 이식 부위로부터 제거된다. According to an aspect of the present invention, there is provided a cell delivery system for cell therapy containing cells derived from embryonic stem cells, wherein the cell delivery system comprises cells derived from the embryonic stem cells as matrigel. Provided are cell carriers formed by insertion into a carrier. The cell carrier is implanted in another site in the body where the disease site is not in direct contact; When the cell carrier is transplanted into a living body, the in vivo migration of cells derived from the embryonic stem cells from the transplantation site is inhibited by the carrier; Finally, it is removed from the transplant site.
상기 담체의 내부에 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포의 삽입은 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포의 응집 세포군(aggregated cell clusters)을 상기 담체의 내부에 삽입함으로써 수행되는 것이 바람직하다. 상기 담체로는 성장인자를 함유하지 않는 마트리겔을 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 상기 배아 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포인 것이 바람직하며, 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포는 형광물질, 바람직하게는 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 퍼클로레이트로 표지되어 있는 것이 바람직하다.Insertion of cells derived from embryonic stem cells into the carrier is preferably performed by inserting aggregated cell clusters of cells derived from the embryonic stem cells into the carrier. As the carrier, a matrigel containing no growth factor can be preferably used. In addition, the embryonic stem cells are preferably human embryonic stem cells, cells derived from the embryonic stem cells is a fluorescent material, preferably 1,1'- diodecyl-3,3,3 ', 3'- It is preferably labeled with tetramethylindocarbocyanine perchlorate.
본 발명의 다른 태양에 따라, 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 혈관 내피 세포를 함유하는 혈관신생 부전-연관 질환 치료용 세포 전달체(cell delivery system)로서, 상기 세포 전달체가 상기 분화된 혈관 내피 세포를 마트리겔(matrigel)로 이루어진 담체의 내부에 삽입시켜 형성된 세포 전달체가 제공된다. 상기 세포 전달체는 질환 부위가 직접 접촉하지 않는 생체 내의 다른 부위에 이식되며; 상기 세포 전달체가 생체에 이식되었을 때, 상기 담체에 의하여 상기 이식 부위로부터의 상기 분화된 혈관 내피 세포의 생체 내 이동이 억제되고; 최종적으로 상기 이식 부위로부터 제거된다.According to another aspect of the invention, there is provided a cell delivery system for the treatment of angiogenic insufficiency-associated disease containing vascular endothelial cells differentiated from human embryonic stem cells, wherein the cell carriers may mart the differentiated vascular endothelial cells. Provided is a cell carrier formed by inserting into a carrier made of a matrigel. The cell carrier is implanted in another site in the body where the disease site is not in direct contact; When the cell carrier is implanted into a living body, the in vivo migration of the differentiated vascular endothelial cells from the transplantation site is inhibited by the carrier; Finally, it is removed from the transplant site.
상기 담체의 내부에 상기 분화된 혈관 내피 세포의 삽입은 상기 분화된 혈관 내피 세포의 응집 세포군(aggregated cell clusters)을 상기 담체의 내부에 삽입함으로써 수행되는 것이 바람직하다. 상기 담체로는 성장인자를 함유하지 않는 마트리겔을 바람직하게 사용할 수 있다.Insertion of the differentiated vascular endothelial cells into the carrier is preferably performed by inserting aggregated cell clusters of the differentiated vascular endothelial cells into the carrier. As the carrier, a matrigel containing no growth factor can be preferably used.
상기 혈관신생 부전-연관 질환은 당뇨병성 궤양; 괴저; 치유를 위해 혈관신생이 요구되는 상처; 뷰르그병; 고혈압; 뇌혈관 허혈, 신장 허혈, 폐 허혈, 지절 허혈 및 허혈성 심근경색을 포함하는 허혈성 질환; 폐색성 혈관 질환; 및 심혈관 질환으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.The angiogenesis-associated disease may include diabetic ulcers; Necrotic; Wounds requiring angiogenesis for healing; Burgue's disease; High blood pressure; Ischemic diseases including cerebrovascular ischemia, renal ischemia, pulmonary ischemia, ground ischemia and ischemic myocardial infarction; Obstructive vascular disease; And cardiovascular disease.
또한, 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포는 형광물질, 바람직하게는 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 퍼클로레이트로 표지되어 있는 것이 바람직하다.In addition, cells derived from the embryonic stem cells are preferably labeled with a fluorescent substance, preferably 1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanin perchlorate. .
본 발명의 세포 전달체는 배아 줄기 세포로부터 유래된 혈관 내피 세포 등의 세포를 마트리겔(matrigel) 등의 담체로 감싸줌(enveloping)으로써, 상기 배아 줄 기 세포로부터 유래된 세포가 상기 담체 외부로 이동하는 것을 방지함과 동시에 상기 세포로부터 분비되는 사이토카인 등의 물질은 효과적으로 방출하도록 설계되어 있다. 따라서, 본 발명의 세포 전달체는 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포가 질환 부위에 직접적으로 접근하지 않은 상태에서 상기 세포가 분비하는 사이토카인 등의 물질만으로 세포 치료 목적을 달성함으로써 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포가 체내에 직접 이식되어 발생될 수 있는 암이나, 종양의 생성에 대한 문제를 배제할 수 있다. The cell transporter of the present invention envelops cells such as vascular endothelial cells derived from embryonic stem cells with a carrier such as matrigel, thereby transferring cells derived from the embryonic stem cells to the outside of the carrier. It is designed to effectively release substances such as cytokines secreted from the cells while preventing them from being prevented. Accordingly, the cell carrier of the present invention is a cell derived from an embryonic stem cell by achieving a cell therapeutic purpose only with a substance such as a cytokine secreted by the cell in a state in which the cell derived from an embryonic stem cell does not have direct access to a disease site. Cancer can be generated by implanting directly into the body, or problems with the production of tumors can be excluded.
본 발명은 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 함유하는 세포치료용 세포 전달체(cell delivery system)로서, 상기 세포 전달체가 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 마트리겔(matrigel)로 이루어진 담체의 내부에 삽입시켜 형성되고; 상기 세포 전달체는 질환 부위가 직접 접촉하지 않는 생체 내의 다른 부위에 이식되며; 상기 세포 전달체가 생체에 이식되었을 때, 상기 담체에 의하여 상기 이식 부위로부터의 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포의 생체 내 이동이 억제되고; 최종적으로 상기 이식 부위로부터 제거되는, 세포 전달체를 포함한다.The present invention relates to a cell delivery system for cell therapy containing cells derived from embryonic stem cells, wherein the cell carriers insert cells derived from the embryonic stem cells into a carrier made of matrigel. Formed; The cell carrier is implanted in another site in the body where the disease site is not in direct contact; When the cell carrier is transplanted into a living body, the in vivo migration of cells derived from the embryonic stem cells from the transplantation site is inhibited by the carrier; And cell carriers that are finally removed from the implantation site.
상기 배아 줄기 세포는 포유동물 유래의 모든 배아 줄기 세포를 포함하며, 바람직하게는 인간에서 유래된 배아 줄기 세포를 사용할 수 있다. 상기 인간 배아 줄기세포는 인간 상실배의 내부 세포 괴로부터 유래된 전능 세포를 말한다. 상기 인간 배아 줄기세포는 예를 들어 CHA-hES3 (Ahn SE, Kim S, Park KH, Moon SH, Lee HJ, Kim GJ, Lee YJ, Park KH, Cha KY, Chung HM. Primary bone-derived cells induce osteogenic differentiation without exogenous factors in human embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2006 10;340(2):403-408) 등이 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 인간 배아 줄기세포는 당업자에 의하여 용이하게 구축될 수 있다. The embryonic stem cells include all embryonic stem cells derived from mammals, preferably embryonic stem cells derived from humans. The human embryonic stem cells refer to omnipotent cells derived from the internal cell mass of human morula. The human embryonic stem cells are for example CHA-hES3 (Ahn SE, Kim S, Park KH, Moon SH, Lee HJ, Kim GJ, Lee YJ, Park KH, Cha KY, Chung HM.Primary bone-derived cells induce osteogenic differentiation without exogenous factors in human embryonic stem cells.Biochem Biophys Res Commun. 2006 10; 340 (2): 403-408), but is not limited to these examples. In addition, human embryonic stem cells can be easily constructed by those skilled in the art.
상기 배아 줄기 세포(바람직하게는 인간 배아 줄기 세포)로부터 유래된 세포는 세포 치료(cell therapy)의 목적으로 사용되는 미성숙 또는 성숙 세포를 모두 포함하며, 특별히 제한되는 것은 아니다. 상기 미성숙 또는 성숙 세포는 공지의 방법에 따라 배아 줄기 세포(바람직하게는 인간 배아 줄기 세포)로부터 분화(부분 분화 또는 완전 분화)시킴으로써 얻을 수 있으며, 그 종류 및 방법은 제한되지 아니한다. 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 혈관 내피 세포는 공지의 방법, 예를 들어, Kim J, Moon SH, Lee SH, Lee DY, Koh GY and Chung HM, "Effective Isolation and Culture of Endothelial Cells in Embryoid Body Differentiated from Human Embryonic Stem Cells" Stem cell and Development (2007) 16:269.280 에 개시된 방법에 따라 얻을 수 있다.Cells derived from said embryonic stem cells (preferably human embryonic stem cells) include all immature or mature cells used for cell therapy, and are not particularly limited. The immature or mature cells can be obtained by differentiating (partially or fully differentiating) from embryonic stem cells (preferably human embryonic stem cells) according to known methods, and the kind and method thereof are not limited. For example, vascular endothelial cells differentiated from human embryonic stem cells are known methods, such as Kim J, Moon SH, Lee SH, Lee DY, Koh GY and Chung HM, “Effective Isolation and Culture of Endothelial Cells in Embryoid Body Differentiated from Human Embryonic Stem Cells "Stem cell and Development (2007) 16: 269.280.
본 발명에 따른 세포 전달체는 마트리겔(matrigel) 담체를 포함한다. 상기 담체는 그 내부에 삽입된 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포가 이식 부위에서 다른 곳으로 이동하는 것을 차단함과 동시에 삽입된 세포로부터 분비되는 사이토카인 등의 다양한 물질이 효과적으로 방출되도록 기능한다. 따라서, 상기 담체의 사용은 본 발명에 따른 세포 전달체가 질환 부위가 직접 접촉하지 않는 생체 내의 다른 부위에 이식되는 것을 가능하게 한다.The cell carrier according to the present invention comprises a matrigel carrier. The carrier functions to effectively release various substances such as cytokines secreted from the inserted cells while preventing the cells derived from the embryonic stem cells inserted therein from moving from the transplantation site to another. Thus, the use of such carriers makes it possible for cell carriers according to the invention to be implanted at other sites in the body where the disease site is not in direct contact.
상기 담체로는 마트리겔을 바람직하게 사용할 수 있다. "마트리겔(matrigel)"은 종양세포주로부터 분리된 분비된 세포외 매트릭스 물질의 일종으로서 Engelbreth-Holm-Swarm 종양 분비 매트릭스이다. 마트리겔은 라미닌, 콜라겐 4형, 헤파린, 알려지지 않은 다양한 종류의 성장 인자들을 함유한다. 마트리겔은 세포성장에 탁월한 기질을 제공하므로(예, Vukicevic 등, Exp. Cell Res, 202(1), 1-8(1992)), 세포의 배양이나 증식에 기질로서 사용되고 있다. 된다. 또한, 마트리겔은 상온에서 겔 형태를 유지하며, 4 ℃에서는 액체로 존재하고, -20 ℃에서는 고체를 형성한다. 여러 가지 성장인자가 혼합된 마트리겔에서 혈관 내피 세포 혹은 혈관 내피 전구 세포를 배양하게 되면 다양한 성장인자가 혈관신생을 위한 기질로 작용하기 때문에 혈관 코드 또는 혈관 튜브가 형성된다고 알려져 있다. 상기 성장인자로는 Engelbreth-Holm-Swarm 종양에서 분비되는 TGF-beta, fibroblast growth factor 등이 있다. 본 발명의 세포전달체는 담체로서, 상기 성장인자들이 제거된 마트리겔(예를 들어, 상업적으로 구입가능한 성장인자들이 제거된 마트리겔(BD Bioscience 사(미국))을 더욱 바람직하게 사용할 수 있다. Matrigel can be preferably used as the carrier. "Matrigel" is a Engelbreth-Holm-Swarm tumor secretion matrix that is a kind of secreted extracellular matrix material isolated from tumor cell lines. Matrigel contains laminin, collagen type 4, heparin, and various unknown growth factors. Since Matrigel provides an excellent substrate for cell growth (eg, Vukicevic et al., Exp. Cell Res, 202 (1), 1-8 (1992)), it is used as a substrate for cell culture and proliferation. do. In addition, Matrigel maintains its gel form at room temperature, is present as a liquid at 4 ° C, and forms a solid at -20 ° C. When vascular endothelial cells or vascular endothelial progenitor cells are cultured in a mixture of various growth factors, vascular cords or vascular tubes are formed because various growth factors serve as substrates for angiogenesis. The growth factors include TGF-beta and fibroblast growth factor secreted from Engelbreth-Holm-Swarm tumors. As the carrier of the present invention, as a carrier, a matrigel in which the growth factors have been removed (for example, a matrigel in which the commercially available growth factors have been removed) may be more preferably used.
상기 세포 전달체는 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 마트리겔(matrigel) 등의 상기 담체의 내부에 삽입시켜 형성되며, 상기 담체의 내부에 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포의 삽입은 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포의 응집 세포군(aggregated cell clusters)을 상기 담체의 내부에 삽입함으로써 수행되는 것이 보다 효율적인 이동 방지 효과를 달성할 수 있으므로 바람직하다. The cell carrier is formed by inserting cells derived from embryonic stem cells into the carrier, such as a Matrigel (matrigel), the insertion of cells derived from the embryonic stem cells into the carrier from the embryonic stem cells It is preferable to carry out by inserting aggregated cell clusters of derived cells into the carrier so that a more efficient anti-migration effect can be achieved.
상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포 및 담체의 사용량은 세포 치료의 목적을 달성하기 위하여 필요한 함량으로 사용될 수 있으며, 당업자는 어려움 없이 상기 세포 및 담체의 사용량을 정할 수 있다. 예를 들어, 허혈성 혈관에 대한 세포치료를 목적으로 혈관 내피 세포를 사용하는 경우, 상기 혈관 내피 세포는 5.0 X 106 cells를 9-11개 정도의 세포군으로 준비하여 상기 세포군 모두를 약 400∼500 ul의 마트리겔 내부에 삽입시킬 수 있다. 물론, 상기 세포 및 담체의 사용량은 필요에 따라 변경될 수 있다.The amount of cells and carriers derived from the embryonic stem cells may be used in an amount necessary to achieve the purpose of cell therapy, and those skilled in the art may determine the amount of the cells and carriers used without difficulty. For example, when vascular endothelial cells are used for the purpose of cell therapy for ischemic blood vessels, the vascular endothelial cells prepare 5.0 X 10 6 cells in about 9-11 cell groups, and all of the cell groups are about 400 to 500. Can be inserted inside the ul matrigel. Of course, the amount of the cells and the carrier can be changed as necessary.
상기 세포 전달체에 세포 치료를 위한 세포로서 함유되는 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포는 형광물질로 표지되어 있는 것이 바람직하다. 상기 형광물질로는 DiA [4-(4-디테트라데실아미노스티릴)-N-메틸피리디니움 아이오다이드(4-(4-ditetradecylaminostyryl)-N-methylpyridinium iodide)], DiD [DiIC18(5) 즉 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도디카르보시아닌, 4-클로로벤젠술포네이트 염], DiI (DiIC18(3) 즉, 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 퍼클로레이트(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)], DiO [DiOC18(3) 즉, 3,3'-디옥타데실옥사카르보시아닌 퍼클로레이트], DiO-C14(3) [히드록시에탄술포네이트 (3,3'-디헥사 데실옥사카르보시아닌, 히드록시에탄술포네이트], DiR [DiIC18(7), 즉 1,1'-디옥타데실테트라메틸 인도트리카르보시아닌 아이오다이드(1,1'-dioctadecyltetramethyl indotricarbocyanine Iodide)] 등을 사용할 수 있다. 이 중 약 533nm 파장대의 DiI 또는 488nm 파장대인 Dio를 바람직하게 사용할 수 있으며, 약 533nm 파장대의 DiI를 더욱 바람직하게 사용할 수 있다. 상기 형광물질을 통하여, 본 발명의 세포 전달체의 생체 내 거동을 실시간으로 모니터하는 것이 가능하다. 예를 들어, 형광 분석 이미지 장치(Xenogen 사) 등을 이용하여 체내에 이식된 세포의 위치를 실시간으로 모니터할 수 있다. Cells derived from embryonic stem cells contained in the cell carrier as cells for cell therapy are preferably labeled with a fluorescent material. The fluorescent material is DiA [4- (4-ditetradecylaminostyryl) -N-methylpyridinium iodide (4- (4-ditetradecylaminostyryl) -N-methylpyridinium iodide)], DiD [DiIC18 (5 ) 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate salt], DiI (DiIC18 (3)
본 발명에 따른 세포 전달체는 최종적으로 즉 치료목적을 달성한 후, 외과적 수술 등의 방법으로 이식 부위로부터 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포 전달체는 치료 목적으로 이식된 내포로부터 발생할 수 있는 암, 종양 등의 발생 위험을 완전히 배제할 수 있다.The cell carrier according to the present invention can finally be removed from the implantation site, ie after surgical objectives have been achieved, by surgical procedures or the like. Thus, the cell carrier of the present invention can completely exclude the risk of developing cancer, tumors, and the like, which may arise from inclusions implanted for therapeutic purposes.
본 발명의 일 구현예에 따라, 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 혈관 내피 세포를 함유하는 혈관신생 부전-연관 질환 치료용 세포 전달체(cell delivery system)로서, 상기 세포 전달체가 상기 분화된 혈관 내피 세포를 마트리겔(matrigel)로 이루어진 담체의 내부에 삽입시켜 형성되고; 상기 세포 전달체는 질환 부위가 직접 접촉하지 않는 생체 내의 다른 부위에 이식되며; 상기 세포 전달체가 생체에 이식되었을 때, 상기 담체에 의하여 상기 이식 부위로부터의 상기 분화된 혈관 내피 세포의 생체 내 이동이 억제되고; 최종적으로 상기 이식 부위로부터 제거되는, 세포 전달체가 제공된다.According to one embodiment of the present invention, a cell delivery system for treating angiogenesis-associated disease containing vascular endothelial cells differentiated from human embryonic stem cells, wherein the cell delivery system is characterized in that the differentiated vascular endothelial cells Formed by inserting into a carrier made of matrigel; The cell carrier is implanted in another site in the body where the disease site is not in direct contact; When the cell carrier is implanted into a living body, the in vivo migration of the differentiated vascular endothelial cells from the transplantation site is inhibited by the carrier; Finally, cell carriers are provided that are removed from the transplant site.
상기 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 혈관 내피 세포는 공지의 방법, 예를 들어, Kim J, Moon SH, Lee SH, Lee DY, Koh GY and Chung HM, "Effective Isolation and Culture of Endothelial Cells in Embryoid Body Differentiated from Human Embryonic Stem Cells" Stem cell and Development (2007) 16:269.280 에 개시된 방법에 따라 얻을 수 있다. 상기 분화된 세포 중 배상체로부터 분화된 혈관 내피 세포군만을 분리 증식하여 유세포 분석기로 혈관내피세포 표지인자(PECAM, CD34, KDR/Flk-1, CD133, Tie-2, VE-cadherin, vWF 등)에 양성인 세포를 분리하여 사용하는 것이 더욱 바람직하다.Vascular endothelial cells differentiated from human embryonic stem cells are known methods, for example, Kim J, Moon SH, Lee SH, Lee DY, Koh GY and Chung HM, "Effective Isolation and Culture of Endothelial Cells in Embryoid Body Differentiated from Human Embryonic Stem Cells "Stem cell and Development (2007) 16: 269.280. Only vascular endothelial cell groups differentiated from embryoid bodies of the differentiated cells were isolated and propagated to flow vessel analyzers for vascular endothelial cell markers (PECAM, CD34, KDR / Flk-1, CD133, Tie-2, VE-cadherin, vWF, etc.). It is more preferable to isolate positive cells.
상기 혈관신생 부전-연관 질환 치료용 세포 전달체는 마트리겔(matrigel) 담체를 포함한다. 상기 담체는 그 내부에 삽입된 분화된 혈관 내피 세포가 이식 부위에서 다른 곳으로 이동하는 것을 차단함과 동시에 삽입된 혈관 내피 세포로부터 분비되는 사이토카인 등의 다양한 물질이 효과적으로 방출되도록 기능한다. 따라서, 상기 담체의 사용은 본 발명에 따른 세포 전달체가 질환 부위가 직접 접촉하지 않는 생체 내의 다른 부위에 이식되는 것을 가능하게 한다. 상기 담체로는 성장인자를 함유하지 않는 마트리겔(예를 들어, 상업적으로 구입가능한 성장인자들이 제거된 마트리겔(BD Bioscience 사(미국))을 바람직하게 사용할 수 있다. The cell carrier for treating angiogenesis-associated disease includes a matrigel carrier. The carrier functions to effectively block various substances such as cytokines secreted from the inserted vascular endothelial cells while preventing the differentiated vascular endothelial cells inserted therein from moving from the transplantation site to another. Thus, the use of such carriers makes it possible for cell carriers according to the invention to be implanted at other sites in the body where the disease site is not in direct contact. As the carrier, a matrigel containing no growth factor (for example, a matrigel without commercially available growth factors removed) (BD Bioscience, Inc., USA) may be preferably used.
상기 세포 전달체는 분화된 혈관 내피 세포를 마트리겔(matrigel) 등의 담체의 내부에 삽입시켜 형성되며, 상기 담체의 내부에 분화된 혈관 내피 세포의 삽입은 상기 분화된 혈관 내피 세포의 응집 세포군(aggregated cell clusters)을 상기 담체의 내부에 삽입함으로써 수행되는 것이 보다 효율적인 이동 방지 효과를 달성할 수 있으므로 바람직하다. 예를 들어, 혈관 내피 세포 5.0 X 106 cells를 9-11개 정도의 세포군으로 준비하여 상기 세포군 모두를 약 400∼500 ul의 마트리겔 내부에 삽입시켜 혈관신생 부전-연관 질환 치료용 세포 전달체를 형성시킬 수 있다. 물 론, 상기 혈관 내피 세포 및 담체의 사용량은 필요에 따라 변경될 수 있다.The cell carrier is formed by inserting differentiated vascular endothelial cells into a carrier such as a Matrigel (matrigel), the insertion of differentiated vascular endothelial cells into the carrier is an aggregated cell group (aggregated) of the differentiated vascular endothelial cells Performing by inserting cell clusters) into the carrier is preferred because it can achieve a more efficient movement prevention effect. For example, vascular endothelial cells 5.0 X 10 6 cells were prepared into 9-11 cell groups, and all of the cell groups were inserted into about 400-500 ul of Matrigel to provide cell carriers for treating angiogenesis-associated diseases. Can be formed. Of course, the amount of the vascular endothelial cells and the carrier can be changed as necessary.
상기 혈관신생 부전-연관 질환은 당뇨병성 궤양; 괴저; 치유를 위해 혈관신생이 요구되는 상처; 뷰르그병; 고혈압; 뇌혈관 허혈, 신장 허혈, 폐 허혈, 지절 허혈 및 허혈성 심근경색을 포함하는 허혈성 질환; 폐색성 혈관 질환; 및 심혈관 질환으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.The angiogenesis-associated disease may include diabetic ulcers; Necrotic; Wounds requiring angiogenesis for healing; Burgue's disease; High blood pressure; Ischemic diseases including cerebrovascular ischemia, renal ischemia, pulmonary ischemia, ground ischemia and ischemic myocardial infarction; Obstructive vascular disease; And cardiovascular disease.
상기 세포 전달체에 세포 치료를 위한 세포로서 함유되는 분화된 혈관 내피 세포는 형광물질로 표지되어 있는 것이 바람직하다. 상기 형광물질로는 DiA [4-(4-디테트라데실아미노스티릴)-N-메틸피리디니움 아이오다이드(4-(4-ditetradecylaminostyryl)-N-methylpyridinium iodide)], DiD [DiIC18(5) 즉 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도디카르보시아닌, 4-클로로벤젠술포네이트 염], DiI (DiIC18(3) 즉, 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 퍼클로레이트(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)], DiO [DiOC18(3) 즉, 3,3'-디옥타데실옥사카르보시아닌 퍼클로레이트], DiO-C14(3) [히드록시에탄술포네이트 (3,3'-디헥사 데실옥사카르보시아닌, 히드록시에탄술포네이트], DiR [DiIC18(7), 즉 1,1'-디옥타데실테트라메틸 인도트리카르보시아닌 아이오다이드(1,1'-dioctadecyltetramethyl indotricarbocyanine Iodide)] 등을 사용할 수 있다. 이 중 약 533nm 파장대의 DiI 또는 488nm 파장대인 Dio를 바람직하게 사용할 수 있으며, 약 533nm 파장대의 DiI를 더욱 바람직하게 사용할 수 있다. 상기 형광물질을 통하여, 본 발명의 세포 전달체의 생체 내 거동을 실시간으로 모니터하는 것이 가능하다. 예를 들어, 형광 분석 이미지 장치(Xenogen 사) 등을 이용하여 체내에 이식된 세포의 위치를 실시간으로 모니터할 수 있다. Differentiated vascular endothelial cells contained in the cell carrier as cells for cell therapy are preferably labeled with a fluorescent material. The fluorescent material is DiA [4- (4-ditetradecylaminostyryl) -N-methylpyridinium iodide (4- (4-ditetradecylaminostyryl) -N-methylpyridinium iodide)], DiD [DiIC18 (5 ) 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate salt], DiI (DiIC18 (3)
본 발명에 따른 세포 전달체는 최종적으로 즉 치료목적을 달성한 후, 외과적 수술 등의 방법으로 이식 부위로부터 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포 전달체는 치료 목적으로 이식된 내포로부터 발생할 수 있는 암, 종양 등의 발생 위험을 완전히 배제할 수 있다.The cell carrier according to the present invention can finally be removed from the implantation site, ie after surgical objectives have been achieved, by surgical procedures or the like. Thus, the cell carrier of the present invention can completely exclude the risk of developing cancer, tumors, and the like, which may arise from inclusions implanted for therapeutic purposes.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 1. DiI (1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 퍼클로레이트)로 염색된 혈관 내피 세포Example 1 Vascular Endothelial Cells Stained with DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanin Perchlorate)
인간 배아 줄기세포 CHA-hES3 (Ahn SE, Kim S, Park KH, Moon SH, Lee HJ, Kim GJ, Lee YJ, Park KH, Cha KY, Chung HM. Primary bone-derived cells induce osteogenic differentiation without exogenous factors in human embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2006 10;340(2):403-408)를 Kim 등의 방법(Kim J, Moon SH, Lee SH, Lee DY, Koh GY and Chung HM, "Effective Isolation and Culture of Endothelial Cells in Embryoid Body Differentiated from Human Embryonic Stem Cells" Stem cell and Development (2007) 16:269.280)에 따라 자연분화시켜 얻은 혈관 내피세포로부터 유세포 분석기로 vWF 양성 세포만을 분리하였다.Human embryonic stem cells CHA-hES3 (Ahn SE, Kim S, Park KH, Moon SH, Lee HJ, Kim GJ, Lee YJ, Park KH, Cha KY, Chung HM.Primary bone-derived cells induce osteogenic differentiation without exogenous factors in human embryonic stem cells.Biochem Biophys Res Commun. 2006 10; 340 (2): 403-408, by Kim et al. (Kim J, Moon SH, Lee SH, Lee DY, Koh GY and Chung HM, “Effective Isolation and Only vWF positive cells were isolated from vascular endothelial cells obtained by spontaneous differentiation according to Culture of Endothelial Cells in Embryoid Body Differentiated from Human Embryonic Stem Cells "Stem cell and Development (2007) 16: 269.280).
혈청이 배제된 DMEM 고 글루코오즈(high glucose) 배지에 DiI (1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 퍼클로레이트) 용액(10 ul)을 1:200으로 희석하여, 세포-표지 용액을 제조한 후, 상기에서 분리한 혈관 내피세포와 혼합한 후, 37 ℃ 배양기에서 약 15-20 분 동안 배양하였다. 배양액을 제거하고 인산완충식염수(PBS)로 3회 세척한 후, 형광 현미경으로 DiI가 제대로 염색되었는지 확인하였다.DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanin perchlorate) solution (10 ul) was added to DMEM high glucose medium without serum. Dilute to: 200 to prepare a cell-labeled solution, mix with the vascular endothelial cells isolated above, and incubate for about 15-20 minutes in a 37 ° C incubator. After the culture solution was removed and washed three times with phosphate buffered saline (PBS), it was confirmed by the fluorescence microscope that DiI was properly stained.
실시예 2. 마트리겔(matrigel)을 사용한 세포 전달체의 제조Example 2 Preparation of Cell Carrier Using Matrigel
실시예 1에서 준비한 Dil로 염색된 혈관 내피 세포 5 X 105 cells를 EGM-2/MV 배양액(Cambrex사, 미국)에 넣어 배양 접시 바닥에 방울의 형태로 만든 후, 배양접시를 뒤집어 24 시간 동안 배양기에서 배양하여 세포가 응집하여 공과 같은 형태를 이룬 응집된 세포군(sorted cells 또는 aggregated cell clusters)를 얻었다. 겔 형태의 성장인자가 제거된 마트리겔(BD Bioscience 사, 미국)을 지름 50-70 mm, 높이 50-70mm의 원통형으로 자르고, 상기 응집된 세포군을 상기 원통형 마트리겔의 내부에 삽입한 후, 37 ℃ 배양기에 30 분 동안 배양하여, 세포가 마트리겔로 감싸여진 형태의 세포 전달체를 얻었다 (도 1의 C-E 참조). Example 1 Dil the vascular endothelial cell 5 X 10 5 cells to EGM-2 / MV culture stained with prepared from it in (Cambrex, USA) then made in the form of drops of a petri dish bottom, turn the petri dish for 24 hours The cells were cultured in an incubator to obtain aggregated cell clusters (sorted cells or aggregated cell clusters) having a ball-like shape. After removing the gel growth factor, Matrigel (BD Bioscience, USA) was cut into cylinders 50-70 mm in diameter and 50-70 mm in height, and the aggregated cell population was inserted into the cylindrical Matrigel. Incubation was carried out for 30 minutes in an incubator to obtain a cell carrier in the form of cells surrounded by Matrigel (see CE of FIG. 1).
성장인자가 포함된 마트리겔(BD Bioscience 사, 미국)을 사용하여 상기와 동일한 방법으로 세포 전달체를 제조하였다. 그러나, 얻어진 세포 전달체로부터 빠른 시간(24 시간) 내에 응집된 세포군으로부터 세포가 뻗어나옴으로써(도 1의 F 참조 ), 생체 내에서 세포의 이동을 억제시키는데 있어서는 한계가 있음을 알 수 있다.Using Matrigel (BD Bioscience, USA) containing a growth factor was prepared in the same manner as the cell carrier. However, it can be seen that there is a limit in inhibiting the movement of cells in vivo because the cells extend from the aggregated cell population in a short time (24 hours) from the obtained cell transporter.
시험예 1.Test Example 1.
(1) 하지 허혈 마우스 모델의 제작(1) Fabrication of the lower limb ischemic mouse model
6-7 주령의 면역 결핍 누드 마우스(Balb/C Nude, Charles River Laboratories 사)에 케타민(ketamine)과 럼푼(Rumpun)을 4:1의 비율로 조제한 마취제를 마리당 50 ul의 양으로 복강 주사하였다. 마취된 마우스를 고정하여 배와 대퇴부 경계면의 피부를 1cm 정도 세로로 절개한 후, 배와 대퇴부 경계면의 지방을 제거하였다. 외장골 동맥(Iliac artery)를 따라 배쪽의 총 외장 동맥(common illiac artery)를 4-0 black silk 봉합사로 두 번 묶어 주었다. 외장골 동맥을 따라 발목 부분에서 두 갈래로 나뉘는 혈관 바로 위를 한번 묶어 주었다. 발목 혈관 매듭 위에서부터 대퇴부 매듭 아래까지 혈관을 잘 잡아서 근육이 최대한 손상되지 않게 혈관만 박리하였다. 조직을 정리한 후 피부를 봉합하였다.6-7 week old immunodeficiency nude mice (Balb / C Nude, Charles River Laboratories) were intraperitoneally injected with anesthesia with ketamine and lumpun at a ratio of 4: 1 in an amount of 50 ul per horse. The anesthetized mouse was fixed, and the skin at the abdomen and thigh interface was incised about 1 cm vertically, and then the fat at the abdomen and thigh interface was removed. The common illiac artery of the abdomen was bundled twice with 4-0 black silk suture along the iliac artery. Along the exoskeleton artery, the anesthesia was divided into two separate branches. The blood vessels were removed from the ankle vascular knot to the bottom of the femoral knot so that the muscles were not damaged as much as possible. After the tissue was cleaned up, the skin was closed.
(2) 세포 전달체의 투여에 의한 혈관신생의 평가(2) Evaluation of Angiogenesis by Administration of Cell Carriers
상기 (1)에서 제조한 하지 허열 마우스를 각각 2 군(n=5)으로 나누고, 제1군은 성장인자가 제거된 마트리겔을 이식하고, 제2군은 실시예 2에서 제조한 세포 전달체(성장인자가 제거된 마트리겔을 사용하여 얻어진 세포 전달체)를 각각 상기 마우스의 등 부위에 이식하였다. 상기 마트리겔 또는 세포전달체의 이식은 하지 허혈 마우스의 등 피부를 약 1 cm 정도 세포로 절개한 후, 상기 마트리겔 또는 세포전달체를 약제 스푼으로 떠서 형태의 변화 없이 마우스의 등에 이식한 후, 피부를 봉합함으로써, 이식하였다. 상기 이식된 마트리겔 또는 세포전달체의 제거는 이식 부위 주변의 피부와 함께 수술용 가위로 제거함으로써 수행하였으며, 상기 제거 후 봉합하였다. The lower limbs fever mice prepared in (1) were divided into two groups (n = 5), the first group was transplanted with Matrigel from which the growth factor was removed, and the second group was the cell carrier prepared in Example 2 ( Cell carriers obtained using Matrigel from which growth factors were removed) were respectively implanted into the dorsal region of the mice. The implantation of the Matrigel or cell carrier is performed by cutting the back skin of the ischemic mouse with about 1 cm of cells, and then grafting the Matrigel or cell carrier with the medicine spoon and implanting the skin on the back of the mouse without any change in shape. By suture, the graft was transplanted. Removal of the transplanted Matrigel or cell carrier was performed by removal with surgical scissors along with the skin around the implant site, and then sutured after removal.
도 2의 A 및 B는 마트리겔 또는 본 발명의 세포 전달체를 각각 투여한 후 2 주 경과한 후에 형광 분석 이미지 장치(Xenogen 사, 미국)를 사용하여 측정한 하지 허혈 마우스의 사진이며, 또한 도 2의 C 및 D는 마트리겔 또는 본 발명의 세포 전달체를 각각 투여한 후 3 주 경과한 후에 상기 마트리겔 및 세포 전달체를 제거한 후 형광 분석 이미지 장치(Xenogen 사, 미국)를 사용하여 측정한 하지 허혈 마우스의 사진이다. 도 2의 B에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 제작된 세포 전달체를 투여한 경우, 효과적인 혈관신생에 의해 괴사가 발생하지 않았으며, 상기 세포 전달체가 이식 부위에 그대로 머물러 있음을 알 수 있다. 또한, 상기 마트리겔 또는 세포 전달체를 제거한 후 측정한 하지 허혈 마우스(도 2의 C 및 D)의 왼쪽 하지 조직을 채취하여 혈관신생 인자인 VEGF와 Ang-1의 발현을 RT-PCR로 측정한 결과, VEGF와 Ang-1이 특이적으로 발현됨을 알 수 있다 (도 2의 E 참조).2A and 2B are photographs of lower limb ischemic mice measured using a fluorescence analysis imaging device (Xenogen, USA) two weeks after the administration of the Matrigel or the cell carrier of the present invention, respectively, and FIG. C and D of the lower limb ischemic mouse measured using a fluorescence analysis imaging device (Xenogen, USA) after removing the Matrigel and the
도 3의 A 및 B는 마트리겔 또는 본 발명의 세포 전달체를 각각 투여한 후 12 주 경과한 후에(세포 전달체의 제거 및 봉합 수술은 세포 전달체를 투여하고 3 주 경과한 후에 실시하였다) 형광 분석 이미지 장치(Xenogen 사, 미국)를 사용하여 측정한 하지 허혈 마우스의 사진이며, 또한 도 3의 C 및 D는 괴사가 발생하지 않은 마우스(도 3의 B)의 하지를 해부한 결과를 나타낸다. 상기 도 3의 B로부터 알 수 있는 바와 같이, 일정기간 치료효과가 진행된 후에는 이식된 세포를 제거하더라도 치료효과가 지속적으로 유지됨을 확인할 수 있다. 또한, 도 3의 D로부터, 검은색 화살표 부분의 혈관이 제거된 부위에 파란색 화살표 부분에서 새로운 혈관이 생성된 것을 알 수 있다.3A and 3B show fluorescence analysis images after 12 weeks after the administration of the Matrigel or the cell carrier of the present invention (removal and closure of the cell carrier was performed after 3 weeks after the cell carrier was administered). It is a photograph of the lower limb ischemic mouse measured using the apparatus (Xenogen Co., USA), and C and D in Fig. 3 show the results of dissecting the lower extremity of the mouse (B in Fig. 3) where necrosis did not occur. As can be seen from B of FIG. 3, after the treatment effect has been progressed for a certain period, it can be confirmed that the therapeutic effect is maintained even if the transplanted cells are removed. In addition, it can be seen from FIG. 3D that new blood vessels are generated at the blue arrow portion at the portion where the blood vessel of the black arrow portion is removed.
시험예 2. 마트리겔과 혈관 내피 세포와의 혼합물 이식Test Example 2 Mixture of Matrigel with Vascular Endothelial Cells
실시예 2와 동일한 방법으로 얻은 혈관 내피 세포의 응집된 세포군을 성장인자가 배제된 마트리겔 약 450 g과 혼합한 후, 얻어진 혼합물을 하지 허혈 마우스의 등 및 엉덩이 부위에 이식하였다. 1 주 후, 형광 분석 이미지 장치(Xenogen 사, 미국)를 사용하여 측정한 결과는 도 4와 같다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 세포를 마트리겔로 감싸지 않고, 단순히 혼합한 경우에는 세포가 이식 부위 주변으로 이동하므로, 이식되는 세포로부터 발생할 수 있는 종양 생성 등의 부작용을 배제할 수 없다.The aggregated cell population of vascular endothelial cells obtained in the same manner as in Example 2 was mixed with about 450 g of Matrigel excluding growth factors, and the resulting mixture was transplanted into the back and hip area of the lower limb ischemic mouse. After one week, the results measured using a fluorescence analysis imaging device (Xenogen, USA) are as shown in FIG. 4. As can be seen in Figure 4, the cells are not wrapped with Matrigel, but simply mixed, the cells move around the implantation site, and thus side effects such as tumor formation that may occur from the transplanted cells cannot be excluded.
시험예 3. 혈관신생 인자의 직접 투여와의 비교Test Example 3 Comparison with Direct Administration of Angiogenic Factors
혈관신생 인자로 알려져 있는 VEGF 100 ng를 하지 허열 마우스의 꼬리 정맥을 통하여 2 주간 2일 간격으로 주입하였다. 또한, VEGF 100 ng를 하지 허열 마우스의 하지 허열 부위 주변에 2 주간 2일 간격으로 주입하였다. 그 결과는 도 5와 같다. 도 5의 A(꼬리 정맥에 주입) 및 B(하지 허열 부위 주변에 주입) 모두 괴사가 진행되었다. 이는 본 발명의 세포 전달체를 투여하였을 때 괴사가 발생하지 않은 것은 세포 전달체 내부에 삽입된 분화된 혈관 내피세포가 분비하는 혈관신생과 관련된 인자에 의한 것임을 반증한다.100 ng of VEGF, known as angiogenesis factor, was injected through the tail vein of the lower extremity fever mice at 2-day intervals for 2 weeks. In addition, 100 ng of VEGF was injected at intervals of 2 weeks for 2 weeks around the lower extremity fever region of the lower extremity fever mouse. The result is shown in FIG. Necrosis progressed in both A (injection into the tail vein) and B (injection around the lower extremities) in FIG. This proves that necrosis does not occur when the cell carrier of the present invention is caused by factors related to angiogenesis secreted by differentiated vascular endothelial cells inserted into the cell carrier.
도 1은 본 발명의 세포 전달체이 제작 과정을 도식화한 것으로, A는 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 혈관 내피 세포를 분리한 후, 이를 배양한 세포의 사진이며, B는 상기 배양된 세포를 DiI로 염색한 사진이다. C-E는 DiI로 염색된 혈관 내피 세포를 성장인자가 제거된 마트리겔 내부에 삽입시켜 제조한 세포 전달체의 모식도 및 72 시간이 경과한 후에 측정한 사진이며, F는 성장인자가 포함된 마트리겔로 DiI로 염색된 혈관 내피 세포를 감싼 전달체로서, 24 시간이 경과한 후에 측정한 사진이다. 1 is a diagram illustrating the manufacturing process of the cell transporter of the present invention, where A is a photograph of cells cultured after separating differentiated vascular endothelial cells from human embryonic stem cells, and B is stained with DiI. One picture. CE is a schematic diagram of a cell carrier prepared by inserting DiI-stained vascular endothelial cells into a growth factor-removed matrigel and after 72 hours, and F is a matrigel containing growth factor. Carrier wrapped with vascular endothelial cells stained with, is a photograph measured after 24 hours.
도 2는 하지 허혈 마우스에 마트리겔 또는 본 발명의 세포 전달체를 이식한 후 2 주 또는 3 주 경과한 후에 측정한 형광 분석 이미지 장치(Xenogen 사, 미국)를 사용하여 측정한 하지 허혈 마우스의 사진이다. A 및 B는 마트리겔 또는 본 발명의 세포 전달체를 각각 투여한 후 2 주 경과한 후에 측정한 하지 허혈 마우스의 사진이며, C 및 D는 마트리겔 또는 본 발명의 세포 전달체를 각각 투여한 후 3 주 경과한 후에 상기 마트리겔 및 세포 전달체를 제거한 후 측정한 하지 허혈 마우스의 사진이다. E는 상기 마트리겔 또는 세포 전달체를 제거한 후 측정한 하지 허혈 마우스(도 2의 C 및 D)의 왼쪽 하지 조직을 채취하여 혈관신생 인자인 VEGF와 Ang-1의 발현을 RT-PCR(역전사 중합 효소 연쇄반응)로 측정한 결과를 나타낸다.FIG. 2 is a photograph of lower limb ischemic mice measured using a fluorescence analysis imaging device (Xenogen, USA) measured two or three weeks after implanting Matrigel or the cell carrier of the present invention into the lower limb ischemic mouse. . A and B are photographs of the lower limb ischemic mice measured 2 weeks after the administration of the Matrigel or the cell carrier of the present invention, respectively, and C and D are 3 weeks after the Matrigel or the cell carrier of the present invention, respectively. It is a photograph of the lower limb ischemic mouse measured after removal of the Matrigel and the cell carrier. E extracts the left lower extremity tissue of the lower limb ischemic mouse (C and D of FIG. 2) measured after removing the Matrigel or the cell carrier to express the expression of VEGF and Ang-1, RT-PCR (reverse transcription polymerase). Measured by chain reaction).
도 3의 A 및 B는 마트리겔 또는 본 발명의 세포 전달체를 각각 투여한 후 12 주 경과한 후에 형광 분석 이미지 장치(Xenogen 사, 미국)를 사용하여 측정한 하지 허혈 마우스의 사진이며, 도 3의 C 및 D는 괴사가 발생하지 않은 마우스(도 3의 B) 의 하지를 해부한 결과를 나타낸다.3A and 3B are photographs of lower limb ischemic mice measured using a fluorescence analysis imaging device (Xenogen, USA) after 12 weeks of administration of Matrigel or the cell carrier of the present invention, respectively. C and D show the results of dissecting the lower extremities of mice (B in FIG. 3) where necrosis did not occur.
도 4는 혈관 내피 세포 및 성장인자가 배제된 마트리겔의 혼합물을 하지 허혈 마우스의 등 및 엉덩이 부위에 이식한 후, 형광 분석 이미지 장치(Xenogen 사, 미국)를 사용하여 측정한 결과를 나타낸다.Figure 4 shows the results measured using a fluorescence analysis imaging device (Xenogen, USA) after implanting a mixture of vascular endothelial cells and growth factors excluded Matrigel in the back and hip area of the ischemic mouse.
도 5는 혈관신생 인자로 알려져 있는 VEGF 하지 허열 마우스의 꼬리 정맥 도는 하지 허열 부위 주변에 2 주간 2일 간격으로 주입하였을 때의 결과를 나타낸다. Figure 5 shows the results when injected at intervals of 2 days and 2 days around the tail vein or the lower limbs of the VEGF lower fever mice known as angiogenic factors.
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