KR101035556B1 - Method of preparing natural killer cells, natural killer cells prepared by the method, and composition for treatment of solid cancer containing same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인터루킨-15(Interleukin-15, IL-15)를 이용하여 자연살해세포를 제조하는 방법, 이러한 방법에 의해 제조된 자연살해세포, 및 상기 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 고형 종양 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention is a method for producing natural killer cells using Interleukin-15 (IL-15), natural killer cells prepared by such a method, and treating solid tumors comprising the natural killer cells as an active ingredient. It relates to a composition for.

본 발명의 방법에 따르면, 증폭이 어려운 자연살해세포를 체외에서 (ex vivo) 충분히 활성화시켜 고형 종양 살해능이 우수한 자연살해세포를 얻을 수 있으며, 이러한 방법으로 얻어진 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 조성물은 신경모세포종(neuroblastoma)을 비롯한 고형 종양의 치료에 유용하게 활용될 수 있다. According to the method of the present invention, the natural killer cells having excellent solid tumor killing ability can be obtained by activating natural killer cells that are difficult to amplify in vitro ( ex vivo ), and the composition comprising the natural killer cells obtained by such a method as an active ingredient. May be useful for the treatment of solid tumors, including neuroblastoma.

인터루킨-15, 자연살해세포, 고형 종양 Interleukin-15, natural killer cells, solid tumors

Description

자연살해세포의 제조방법, 이러한 방법에 의해 제조된 자연살해세포, 및 이를 유효성분으로 포함하는 고형 종양 치료용 조성물 {METHOD OF PREPARING NATURAL KILLER CELLS, NATURAL KILLER CELLS PREPARED BY THE METHOD, AND COMPOSITION FOR TREATMENT OF SOLID CANCER CONTAINING SAME}METHOD OF PREPARING NATURAL KILLER CELLS, NATURAL KILLER CELLS PREPARED BY THE METHOD, AND COMPOSITION FOR TREATMENT OF SOLID CANCER CONTAINING SAME}

본 발명은 자연살해세포를 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 인터루킨-15(Interleukin-15, IL-15)를 이용하여 자연살해세포를 제조하는 방법, 이러한 방법에 의해 제조된 자연살해세포, 및 상기 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 고형 종양 치료용 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a method for producing natural killer cells, and more specifically, to a method for producing natural killer cells using Interleukin-15 (IL-15), natural killer prepared by such a method. Cells, and relates to a composition for treating solid tumors comprising the natural killer cells as an active ingredient.

종양 치료를 위해 수술, 방사선 치료, 화학요법 등의 다양한 치료법이 발전해 왔으나, 종양에 따라서는 빈번한 재발이 심각한 문제가 되고 있다. 이에 따라 환자의 면역기능을 이용한 세포치료의 가능성을 제기하게 되었다.Various treatments such as surgery, radiation therapy, chemotherapy, etc. have been developed for the treatment of tumors, but frequent recurrences become serious problems depending on the tumor. This raises the possibility of cell therapy using the immune function of patients.

종양을 제거하는 면역반응은 다양한 기능을 가진 면역세포들의 복잡한 상호작용을 통해 일어난다. 종양세포를 직접 제거하는 면역세포로는 자연살해세 포(Natural killer cell, NK cell)와 세포독성 T 림프구(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)가 있으며, 이들 효력세포(Effector cell)에게 항원을 제시해 주는 항원제시세포로는 수지상세포(Dendritic cell, DC)나 B 세포가 있고, 그밖에 각종 사이토카인(Cytokine)을 분비하는 보조 T 세포(Helper T cell, Th cell), 조절 T 세포(Regulatory T cell, Treg cell) 등이 함께 기여하게 된다. 이들 중 자연살해세포는 면역세포 치료법 중에서 가장 효과가 빠르고 효율적인 면역세포로 중요시되고 있다.Immune response to tumor removal occurs through the complex interaction of immune cells with different functions. Immune cells that directly remove tumor cells include natural killer cells (NK cells) and cytotoxic T lymphocytes (CTL), and antigens that present antigens to these effect cells. Presenting cells include dendritic cells (DC) or B cells, and other T cytokines (Helper T cells, Th cells) and regulatory T cells (Regulatory T cells, Treg cells) ) Will contribute together. Of these, natural killer cells are considered to be the most effective and efficient immune cells among immune cell therapies.

지금까지 개발되거나 시도된 자연살해세포 치료제는 백혈병과 같은 혈액 종양을 대상으로 동종 골수이식 후에 투여해 줌으로써 그 효과를 확인한 바가 있다 (Blood cells, Molecules & Disease, 33: 261-266 (2004)). 그러나, 혈액 종양을 제외한 고형 종양에 대해 어느 임상연구에서도 이렇다 할 만한 치료효과를 입증하지 못하고 있다. Natural killer cell therapies that have been developed or tried to date have been confirmed by administration after allogeneic bone marrow transplantation to blood tumors such as leukemia (Blood cells, Molecules & Disease, 33: 261-266 (2004)). However, none of the clinical studies of solid tumors except blood tumors have demonstrated such therapeutic effects.

구체적으로, 자연살해세포를 종양이 생기기 전부터 투여하여 종양의 생착을 방해할 수 있다는 보고가 있으나(Cancer immunology, immunotherapy, 56(11): 1733-1742 (2007)) 치료모델로 보기 어려우며, 복강으로 세포를 투여하여 유방암 세포의 성장을 저해한 실험도 있으나 자연살해세포에 의한 효과인지가 불분명하다 (Breast cancer research and treatment, 104(3): 267-275 (2007)). Specifically, natural killer cells have been reported to interfere with tumor engraftment prior to tumor development (Cancer immunology, immunotherapy, 56 (11): 1733-1742 (2007)). Some experiments have inhibited the growth of breast cancer cells by the administration of cells, but it is unclear whether the effect is caused by natural killer cells (Breast cancer research and treatment, 104 (3): 267-275 (2007)).

자연살해세포는 혈구세포의 약 10% 정도를 차지하는데 시험관내에서 (in vitro) 대량 증식이 잘 되지 않아 유효한 양의 치료제로 사용하기에는 한계가 있다. Natural killer cells make up about 10% of the blood cells, and because they do not grow well in vitro , there is a limit to using them in effective amounts.

이에, 본 발명자들은 기능적으로 우수한 자연살해세포를 다량으로 배양하는 방법을 찾기 위해 연구를 계속한 결과, 체외에서 (ex vivo) IL-15를 이용하여 자연살해세포를 배양하고 이를 고형 종양이 유도된 동물 모델에 투여했을 때 종양 세포 살해능이 우수한 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.Therefore, the present inventors continued to find a method for culturing a large amount of functionally excellent natural killer cells, and as a result, in vitro ( ex In vivo ) IL-15 was used to culture natural killer cells and when administered to a solid tumor-derived animal model, it was found that tumor cell killing ability was excellent and the present invention was completed.

본 발명의 목적은 인터루킨-15(Interleukin-15, IL-15)를 이용하여 자연살해세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a method for preparing natural killer cells using Interleukin-15 (IL-15).

본 발명의 다른 목적은 상기 방법을 이용하여 제조되고 고형 종양 특이적인 면역반응을 유도할 수 있는 자연살해세포를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide natural killer cells prepared using the above method and capable of inducing solid tumor specific immune responses.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 고형 종양 치료용 조성물을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a composition for treating solid tumors comprising the natural killer cells as an active ingredient.

상기 목적에 따라, 본 발명은 1) 포유동물의 비장세포를 분리하는 단계; 2) 분리된 비장세포에 IL-15를 첨가하여 3 내지 14일간 배양하는 단계; 및 3) 비장세포로부터 CD5- 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 자연살해세포의 제조방법을 제공한다.According to the above object, the present invention comprises the steps of: 1) separating the spleen cells of the mammal; 2) culturing for 3 to 14 days by adding IL-15 to the isolated splenocytes; And 3) isolating CD5 - cells from splenocytes.

상기 목적에 따라, 또한 본 발명은 1) 인간을 포함한 포유동물의 말초혈액으로부터 단핵구를 분리하는 단계; 2) 분리된 말초혈액 단핵구로부터 CD56+ 단구를 분리하는 단계; 및 3) 분리된 CD56+ 단구에 IL-15를 첨가하여 2 내지 30일간 배양하는 단계를 포함하는, 자연살해세포의 제조방법을 제공한다.In accordance with the above object, the present invention also provides a method for preparing a mononuclear cell, comprising the steps of: 1) separating monocytes from peripheral blood of a mammal, including human; 2) separating CD56 + monocytes from isolated peripheral blood monocytes; And 3) adding IL-15 to the isolated CD56 + monocytes, and culturing for 2 to 30 days to provide natural killer cells.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조되고 고형 종양 특이적인 면역반응을 유도할 수 있는 자연살해세포를 제공한다.According to this other object, the present invention provides a natural killer cell prepared by the above method and capable of inducing a solid tumor specific immune response.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명은 자연살해세포를 유효성분으로 함유하고 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 보조제를 포함하는, 고형 종양 치료용 조성물을 제공한다.In accordance with another object, the present invention provides a composition for treating solid tumors, comprising natural killer cells as an active ingredient and comprising one or more pharmaceutically acceptable carriers or adjuvants.

본 발명의 방법에 따르면, 증폭이 어려운 자연살해세포를 체외에서 (ex vivo) 충분히 활성화시켜 고형 종양 살해능이 우수한 자연살해세포를 얻을 수 있으며, 이러한 방법으로 얻어진 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 조성물은 신경모세포종(neuroblastoma)을 비롯한 고형 종양의 치료에 유용하게 활용할 수 있다. According to the method of the present invention, the natural killer cells having excellent solid tumor killing ability can be obtained by activating natural killer cells that are difficult to amplify in vitro ( ex vivo ), and the composition comprising the natural killer cells obtained by such a method as an active ingredient. May be useful for the treatment of solid tumors, including neuroblastoma.

본 발명에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용하였다. 또한, 본 명세서에 언 급된 문헌들은 모두 본 발명을 설명하기 위한 문헌으로 본 명세서에 포함시켰다.The terms, techniques, and the like described in the present invention are used as meanings generally used in the technical field to which the present invention belongs, unless otherwise specified. In addition, all the documents mentioned in this specification are included in this specification as the documents for demonstrating this invention.

본 발명에서, "고형 종양 (암)"은 혈액 종양 (암)을 제외한 덩어리로 이루어진 모든 종양 (암)을 가리키며, 그 대표적인 예로 흑색종, 신경모세포종 등을 들 수 있다.In the present invention, "solid tumor (cancer)" refers to all tumors (cancer) composed of lumps except blood tumors (cancer), and typical examples thereof include melanoma, neuroblastoma, and the like.

"자연살해세포의 활성화"라는 표현은 자연살해세포 표면에 NKG2D 등의 발현이 증가하고, 종양 세포에 대한 살해능이 현저히 향상되는 것을 의미한다.The expression "activation of natural killer cells" means that the expression of NKG2D and the like on the surface of natural killer cells is increased, and the ability to kill tumor cells is significantly improved.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 인터루킨-15(Interleukin-15, IL-15)를 이용하여 자연살해세포(Natural Killer cells, NK cells)를 제조하는 방법 및 이러한 방법에 의해 제조한 자연살해세포를 제공한다.The present invention provides a method for producing natural killer cells (Natural Killer cells, NK cells) using Interleukin-15 (IL-15) and natural killer cells prepared by the method.

본 발명의 자연살해세포는 Natural killer cells of the present invention

1) 포유동물의 비장세포를 분리하는 단계; 1) isolating splenocytes of a mammal;

2) 분리된 비장세포에 IL-15를 첨가하여 3 내지 14일간 배양하는 단계; 및2) culturing for 3 to 14 days by adding IL-15 to the isolated splenocytes; And

3) 비장세포로부터 CD5- 단구(monocyte)를 분리하는 단계3) Separating CD5 - monocytes from splenocytes

를 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있다.It can manufacture by the method containing.

상기 단계들을 보다 자세히 설명하면, 단계 1)에서의 비장세포 분리는 통상의 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 마우스의 비장세포는, 마우스로부터 비장을 무균적으로 적출하여 HBSS(Hank's balanced salt solution)로 세척하고 원 침(cell down)하여 상층액과 적혈구를 제거하는 방식으로 얻어질 수 있다. 비장세포는 분리 후 자연살해세포 배양 즉시 사용하는 것이 가장 바람직하나, 적절한 동결배지에 넣어 액체 질소에서 동결보존 후 사용할 수도 있다. In more detail, the splenocyte separation in step 1) can be performed by a conventional method. For example, splenocytes of a mouse can be obtained by aseptically removing the spleen from the mouse, washing with Hanks' balanced salt solution (HBSS), and cell down to remove supernatants and red blood cells. Splenocytes are most preferably used immediately after culturing spontaneous killer cells, but may be used after cryopreservation in liquid nitrogen in an appropriate freezing medium.

단계 2)는 자연살해세포를 활성화시키는 단계로, 바람직하게는 10 내지 100 ng/ml, 보다 바람직하게는 20 내지 30 ng/ml, 가장 바람직하게는 25 ng/ml의 IL-15를 사용할 수 있고, 분리한 비장세포를 배양한 지 2일째에 IL-15를 첨가하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 비장세포에 IL-15를 첨가하여 6일간 배양할 수 있다.Step 2) is a step of activating natural killer cells, preferably 10 to 100 ng / ml, more preferably 20 to 30 ng / ml, most preferably 25 ng / ml of IL-15 On the second day of culturing isolated splenocytes, it is preferable to add IL-15. Preferably, IL-15 may be added to splenocytes and cultured for 6 days.

단계 3)은 단계 2)에서 배양된 비장세포로부터 CD5- 단구를 분리하는 단계로, CD5- 단구만을 분리하기 위해 CD5+ 자기 비드(magnetic bead)를 이용한다. Step 3) is a step of separating CD5 monocytes from splenocytes cultured in step 2), using CD5 + magnetic beads to separate only CD5 monocytes.

본 발명의 자연살해세포는Natural killer cells of the present invention

1) 인간을 포함한 포유동물의 말초혈액으로부터 단핵구를 분리하는 단계; 1) separating monocytes from peripheral blood of a mammal, including human;

2) 분리된 말초혈액 단핵구로부터 CD56+ 단구를 분리하는 단계; 및 2) separating CD56 + monocytes from isolated peripheral blood monocytes; And

3) 분리된 CD56+ 단구에 IL-15를 첨가하여 2 내지 30일간 배양하는 단계3) culturing for 2 to 30 days by adding IL-15 to the isolated CD56 + monocytes

를 포함하는 방법에 의해서도 제조할 수 있다.It can also manufacture by the method containing.

상기 단계들을 보다 자세히 설명하면, 단계 1)에서는 건강한 공여자 또는 암환자의 말초혈액으로부터 단핵구를 분리하는 단계로 인체로부터 채취한 혈액을 이용하거나 혈액분반술(apheresis)을 이용하여 단핵구 농축액을 얻은 후 밀도구배 (density-gradient) 원심분리를 이용하여 단핵구만을 분리하며, 분리된 단핵구는 이후의 자연살해세포 배양에 사용하기 전까지 냉동저장하여 보관할 수 있다 (Fujiwara S et al., Journal of Immunol Methods 24:90(2); 265-273, 1986).In more detail, the step 1) is a step of separating monocytes from peripheral blood of a healthy donor or cancer patient, using a blood sample obtained from a human body, or obtaining a monocyte concentrate by using apheresis. Density-gradient centrifugation separates only monocytes, and the isolated monocytes can be frozen and stored until later use in natural killer cell culture (Fujiwara S et al., Journal of Immunol Methods 24:90). (2); 265-273, 1986.

단계 2)는 단계 1)에서 분리된 말초혈액 단핵구로부터 자연살해세포 배양을 위한 CD56+ 단구를 분리하는 단계로, 단핵구 중 CD56+ 단구만을 분리하기 위해 CD56+ 자기 비드를 이용한다.Step 2) is the step of separating the CD56 + monocytes for natural killer cell culture from the peripheral blood monocytes isolated in step 1), using CD56 + magnetic beads to separate only CD56 + monocytes in monocytes.

단계 3)은 분리된 CD56+ 단구에 IL-15를 첨가한 후 배양하여 자연살해세포를 활성화시키는 단계로, 바람직하게는 10 내지 100 ng/ml, 보다 바람직하게는 20 내지 30 ng/ml, 가장 바람직하게는 25 ng/ml의 IL-15를 사용할 수 있고, 14일 이상 배양하되 3-4일 간격으로 IL-15를 첨가해 줄 수 있다.Step 3) is a step of activating natural killer cells by adding IL-15 to the isolated CD56 + monocytes and culturing, preferably 10 to 100 ng / ml, more preferably 20 to 30 ng / ml, most Preferably, 25 ng / ml of IL-15 may be used, and cultured for 14 days or more, IL-15 may be added every 3-4 days.

상기와 같이 제조된 자연살해세포의 종양 치유 효과를 조사한 결과, 본 발명의 자연살해세포는 신경모세포종, 흑색종 등에서 높은 종양살해능을 보였다 (도 8, 9 15b 참조).As a result of examining the tumor healing effect of the natural killer cells prepared as described above, the natural killer cells of the present invention showed high tumor killing ability in neuroblastoma, melanoma and the like (see FIGS. 8, 9 and 15b ).

상기 결과로부터, 본 발명의 자연살해세포는 포유동물에 투여시 강력한 고형 종양 특이적인 세포독성 면역반응을 유도할 수 있어 신경모세포종, 흑색종 등의 고형 종양 치료를 위한 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.From the above results, the natural killer cells of the present invention can induce a strong solid tumor specific cytotoxic immune response when administered to a mammal, and thus can be useful as a composition for treating solid tumors such as neuroblastoma and melanoma.

본 발명의 이러한 측면에 따라 자연살해세포를 유효성분으로 하는 고형 종양 치료용 조성물은 타겟 종양에 적절한 경로로 투여할 수 있으며, 종양 부위에 인접하여 주사하는 것이 바람직하다.According to this aspect of the present invention, the composition for treating solid tumors using natural killer cells as an active ingredient can be administered to a target tumor by an appropriate route, and it is preferable to inject adjacent to the tumor site.

본 발명의 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 보조제와 함께 본 발명의 자연살해세포를 포함하는데, 이러한 담체 또는 보조제는 그 자체로 조성물을 투여받는 개체에 유해한 반응을 일으키지 않는 임의의 담체 또는 보조제인 것이 바람직하다.Compositions of the present invention comprise natural killer cells of the present invention in combination with one or more pharmaceutically acceptable carriers or adjuvants, which carriers or adjuvants in themselves do not cause any adverse reactions to the individual receiving the composition or It is preferred to be an adjuvant.

본 발명의 자연살해세포 또는 조성물의 투여량은 치료되어야 할 개체의 건강과 물리적 상태, 목적하는 보호의 정도, 의학적 상황의 평가 및 기타 관련 인자에 따라 달라진다. 이 양은 통상적인 시도를 통해 측정될 수 있는 비교적 광범위한 범위에 속할 것으로 예상하며, 예를 들어 신경모세포종의 치료를 위해서 성인 60 ㎏을 기준으로 1회 투여당 1.26×108 내지 1.32×109 세포의 양으로 투여할 수 있다.The dosage of natural killer cells or compositions of the present invention depends on the health and physical condition of the individual to be treated, the degree of protection desired, the assessment of the medical situation and other relevant factors. This amount is expected to fall within a relatively broad range that can be measured through routine trials, for example, from 1.26 × 10 8 to 1.32 × 10 9 cells per dose, based on 60 kg adult, for the treatment of neuroblastoma. It may be administered in an amount.

본 발명의 또 다른 측면은 질병 상태의 치료에 관련하여 본 발명의 자연살해세포를 사용하는 것에 관계된다. 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 질병의 예로는 신경모세포종 또는 흑색종과 같은 고형암을 포함한다.Another aspect of the invention relates to the use of natural killer cells of the invention in connection with the treatment of a disease state. Examples of diseases that can be treated in accordance with the methods of the invention include solid cancers such as neuroblastoma or melanoma.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 이들만으로 한정하는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.

실시예 1: 마우스 NK 세포, 종양세포주 및 마우스 종양모델의 제작Example 1 Construction of Mouse NK Cells, Tumor Cell Lines, and Mouse Tumor Models

<1-1> 마우스 NK 세포의 제조<1-1> Preparation of Mouse NK Cells

일본 SLC사로부터 구입한 6 주령된 A/J, C57BL/6 및 BALB/c 마우스로부터 비장을 무균적으로 적출하여 매시(mesh) 및 막자(pestle)를 이용하여 단일세포 현탁액을 제조하였다. Spleens were aseptically extracted from 6-week-old A / J, C57BL / 6 and BALB / c mice purchased from SLC, Japan, to prepare single cell suspensions using mesh and pestles.

1x HBSS(Mediatech, Inc)를 이용하여 세포를 세척하고 20℃, 1200 rpm으로 6분간 원침(cell down)시킨 다음, 상층액을 제거하고 2 ml의 염화암모늄 용액으로 적혈구를 제거하였다. Cells were washed with lx HBSS (Mediatech, Inc) and cell down at 20 ° C., 1200 rpm for 6 minutes, then the supernatant was removed and red blood cells were removed with 2 ml ammonium chloride solution.

1x HBSS로 2회 세척한 다음 70 ㎛의 세포 여과체(cell strainer, BD Falcon)에 통과시켜 통과한 용액을 6-웰 플레이트의 각 웰에 5 x 106 세포/ml가 되도록 웰당 2 ml의 양으로 분주하고 배양 2일째에 사이토카인 IL-15(R&D systems), IL-2(Calbiochem), IL-12(R&D systems) 및 IL-21(R&D systems)와 1 ml의 RPMI 배지(Gibco, 10% FBS, 0.055 mM 2-mercaptoethanol, 0.1mM sodium pyruvate, antibiotics, 2mM L-glutamine)를 첨가하였다.Wash twice with 1x HBSS and then pass through a 70 μm cell strainer (BD Falcon) in an amount of 2 ml per well to give 5 × 10 6 cells / ml to each well of a 6-well plate. And cytokine IL-15 (R & D systems), IL-2 (Calbiochem), IL-12 (R & D systems) and IL-21 (R & D systems) and 1 ml of RPMI medium (Gibco, 10%) on day 2 of culture. FBS, 0.055 mM 2-mercaptoethanol, 0.1 mM sodium pyruvate, antibiotics, 2 mM L-glutamine) were added.

4일간 추가로 배양한 후, CD5+ 자기 비드(Miltenyi Biotec)를 이용하여 CD5+ 세포를 제거하였다. 구체적으로, 총 6일간 배양한 비장세포를 회수한 후 1x107개의 세포 당 80 ㎕의 MACS 러닝 버퍼(running buffer, PBS, 2mM EDTA, 0.5% BSA)를 넣 어 펠릿(pellet)을 풀어주고, 1x107개의 세포당 20 ㎕의 CD5+ 자기 비드를 넣어 4℃에서 15분간 반응시켰다. MACS 러닝 버퍼 35 ml로 세척한 후 1 ml의 MACS 러닝 버퍼로 펠릿을 풀어주고 AutoMACS 세포 분리기(AutoMACS cell sorter, Miltenyi Biotec)를 이용하여 CD5- 세포를 회수하였다.After further incubation for 4 days, CD5 + cells were removed using CD5 + magnetic beads (Miltenyi Biotec). Specifically, after recovering the splenocytes cultured for a total of 6 days, the pellet was put into 80 μl of MACS running buffer (PBS, 2mM EDTA, 0.5% BSA) per 1x10 7 cells to release the pellet, 1x10 20 μl of CD5 + magnetic beads per 7 cells were added and reacted at 4 ° C. for 15 minutes. After washing with 35 ml of MACS running buffer, pellets were released with 1 ml of MACS running buffer and CD5 - cells were recovered using an AutoMACS cell sorter (AutoMACS cell sorter, Miltenyi Biotec).

<1-2> 종양세포주의 제조<1-2> Preparation of Tumor Cell Line

종양 세포주 Neuro-2a, CT26, YAC-1, EL-4 및 B16F10(ATCC)을 피펫팅(pipetting) 또는 트립신(trypsin)-EDTA 방법으로 회수하고 1200 rpm에서 5분간 원침시킨 후 상층액을 최대한 제거하였다. Tumor cell lines Neuro-2a, CT26, YAC-1, EL-4, and B16F10 (ATCC) were recovered by pipetting or trypsin-EDTA, centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes, and the supernatant removed as much as possible. It was.

1x106개의 세포당 25 ㎕의 FBS와 100 ㎕의 크롬(51Cr, Sodium Chromate) 용액을 넣어 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 10 ml의 RPMI-1640 배지로 3회 세척하고 100 ㎕당 1x104 세포 수로 96-웰 플레이트의 각 웰에 분주하였다.25 μl of FBS and 100 μl of chromium ( 51 Cr, Sodium Chromate) solution per 1 × 10 6 cells were incubated at 37 ° C. for 1 hour. Washed three times with 10 ml RPMI-1640 medium and aliquoted into each well of a 96-well plate at 1 × 10 4 cells per 100 μl.

<1-3> 마우스 종양모델의 제작<1-3> Construction of mouse tumor model

100π 접시(Nunc, Denmark)에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양한 종양세포(신경모세포종, 흑색종 세포 (ATCC))를 1X PBS(Cambrex)로 세척하고, 트립신(trypsin)-EDTA를 이용하여 종양세포를 회수하였다. 1200 rpm, 20℃의 조건으로 6분간 원침(cell down)시키고 1X PBS로 3회 세척한 다음 1X PBS에 현탁시켰다. 이후, 30 게이지(gauge) 인슐린 주사기를 이용하여 마우스당 2x105개의 세포(흑색종 세포주의 경우) 또는 3x105개의 세포 (신경모세포종 세포주의 경우)의 양으로 마우스의 피하 또는 복강내로 주입하였다.Tumor cells (neuroblastoma, melanoma cells (ATCC)) incubated at 100 ° C. (Nunc, Denmark) at 37 ° C. and 5% CO 2 conditions were washed with 1 × PBS (Cambrex) and trypsin-EDTA. Tumor cells were recovered. Cells were centrifuged for 6 minutes at 1200 rpm and 20 ° C, washed three times with 1X PBS, and then suspended in 1X PBS. The mice were then injected subcutaneously or intraperitoneally with an amount of 2 × 10 5 cells (melanoma cell line) or 3 × 10 5 cells (neuroblastoma cell line) per mouse using a 30 gauge insulin syringe.

종양세포 도입 후 3일째에, 종양적하(tumor burden)가 형성된 것을 관찰하고 무작위적으로 그룹당 6~7마리씩 그룹화하였다.Three days after tumor cell introduction, tumor burden was observed and randomly grouped 6-7 per group.

실시예 2: 인간 NK 세포의 제조Example 2: Preparation of Human NK Cells

먼저, 특별한 질환이 없는 건강한 성인 남녀로부터 혈액 100 ml씩을 채취하여 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 피콜-히스토파크 (Ficoll-Histopaque) 밀도 구배 방법(Sigma, St. Louis, Mo)으로 분리하였다.First, 100 ml of blood was collected from healthy adult men and women who did not have special diseases, and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were collected using Ficoll-Histopaque density gradient method (Sigma, St. Louis, Mo. ).

분리한 PBMC를 자기비드 분리법(AutoMACS, Miltenyi Biotec)에 의해 4℃에서 15분간 반응시켜 NK 세포를 분리하였다.The isolated PBMC was reacted for 15 minutes at 4 ° C. by magnetic bead separation (AutoMACS, Miltenyi Biotec) to separate NK cells.

분리된 NK 세포를 1.5x106 세포/ml의 양으로 10% FBS가 들어있는 RPMI1640 배지에서 희석시켜 12-웰 플레이트의 각 웰에 2 ml씩 분주하였다. The isolated NK cells were diluted in RPMI1640 medium containing 10% FBS in an amount of 1.5 × 10 6 cells / ml and aliquoted into 2 wells of each well of a 12-well plate.

이후, 사이토카인 IL-2 및 IL-15를 3-4일 간격으로 처리하였다. The cytokines IL-2 and IL-15 were then treated at 3-4 day intervals.

실시예 3:Example 3: 사이토카인의 종류 및 첨가량에 따른 NK 세포의 함량 및 세포독성(cytotoxicity) 평가Evaluation of NK Cell Content and Cytotoxicity According to Kinds and Amounts of Cytokines

실시예 <1-1>에 기재된 바와 같이 각종 사이토카인을 첨가하여 배양한 NK 세포의 증식 및 살해능을 평가하기 위해, NK 세포와 크롬(51Cr, Sodium Chromate)이 표지된 표적 세포(실시예 <1-2>에서 제조된 종양 세포주)(E:T = 20:1, 10:1, 5:1) 100 ㎕씩을 96-웰 플레이트의 각 웰에 분주하여 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 후, 2000 rpm에서 3분간 원심분리하고 각 웰의 상층액 100 ㎕씩을 취하여 5 ml의 그린튜브에 분주하고, 암세포가 살해되어 배양액으로 유리된 크롬의 양을 감마 카운터(γ-counter)에서 분당 카운트 수(cpm)로 측정하였다. 암세포 살해능(lysis(%))은 하기 식에 의하여 계산하였다.In order to evaluate the proliferation and killing ability of NK cells cultured by adding various cytokines as described in Example <1-1>, target cells labeled with NK cells and chromium ( 51 Cr, Sodium Chromate) (Example Tumor cell lines prepared in <1-2> (E: T = 20: 1, 10: 1, 5: 1) were injected into each well of a 96-well plate and incubated at 37 ° C. for 4 hours. After incubation, centrifuge at 2000 rpm for 3 minutes, take 100 µl of the supernatant of each well, and divide into 5 ml of green tube, and the amount of chromium released from the cancer cells by killing the cancer cells per minute at the gamma counter (γ-counter). It was measured by count number (cpm). Cancer cell killing ability (lysis (%)) was calculated by the following formula.

Lysis(%) = (ER-SR/MR-SR)x 100Lysis (%) = (ER-SR / MR-SR) x 100

상기 식에서, ER(experimental release)은 실험군으로부터 유리된 상층액의 분당 카운트 수이고, SR(spontaneous release)은 NK 세포가 들어있지 않은 표적 세포 대조군(RPMI-1640 배지)에서 자연적으로 유리된 상층액의 분당 카운트 수이며, MR(maximum release)은 표적 세포에 Triton X-100 4% 용액을 가하여 100% 방사능을 유리시킨 상층액의 분당 카운트 수이다. In this formula, experimental release (ER) is the number of counts per minute of supernatant released from the experimental group, and spontaneous release (SR) is the amount of supernatant naturally released in the target cell control group (RPMI-1640 medium) that does not contain NK cells. Counts per minute, MR (maximum release) is the number of counts per minute of supernatant that release 100% radioactivity by adding Triton X-100 4% solution to target cells.

그 결과, IL-2를 첨가한 경우 전체적인 세포 수는 증가하지만 종양세포 살해능은 낮고, IL-12 및 IL-21을 첨가한 경우 살해능은 증가하나 전체적으로 얻을 수 있는 NK 세포의 수가 매우 제한적인 반면에, IL-15를 첨가한 경우 NK 세포의 전체적인 수뿐만 아니라 종양세포 살해능 또한 우수하였다 (도 12). 특히, 25 ng/ml 농도의 IL-15을 첨가하였을 때 가장 효과적인 증식을 보여주었다 (도 3a 3b).As a result, the addition of IL-2 increases the overall cell number, but the tumor cell killing ability is low. The addition of IL-12 and IL-21 increases the killing ability, but the total number of NK cells that can be obtained is very limited. On the other hand, when IL-15 was added, the total number of NK cells as well as tumor cell killing ability were excellent ( FIGS. 1 and 2 ). In particular, the most effective proliferation was shown when the concentration of IL-15 at 25 ng / ml was added ( FIGS. 3A and 3B ).

실시예 4: IL-15의 첨가시기에 따른 세포독성 평가 (1)Example 4 Evaluation of Cytotoxicity According to Time of Addition of IL-15 (1)

NK 세포는 NK 세포 마커로 익히 알려진 NK1.1, DX5가 결합된 자기 비드를 이용하여 양성적으로 분리(positive selection)하거나 CD3, CD5가 결합된 자기 비드를 이용하여 음성적으로 분리(negative selection)할 수도 있다. 본 실시예에서는 전자의 방법에 따라 NK 세포를 분리하였다. NK cells can be positively selected using NK1.1, DX5 bound magnetic beads, well known as NK cell markers, or negatively selected using CD3, CD5 bound magnetic beads. It may be. In this example, NK cells were isolated by the former method.

구체적으로, 비장세포에서 NK 세포를 분리하고 배양하게 되면 6일 후에 높은 순도로 NK 세포 집단(NK cell population)이 잘 유지되고 있는 것을 볼 수 있으나, 실시예 3에서와 같은 방법으로 측정한 세포 살해능은 매우 저조하였다 (도 4의 (C)). 반면에, 실시예 <1-1>에서와 같이 비장세포를 6일간 배양한 후 분리한 NK 세포는 비교적 높은 순도의 NK 세포를 유지하면서 세포 살해능도 매우 높게 나타났다 (도 4의 (B)).Specifically, when NK cells are isolated and cultured in splenocytes, NK cell population can be seen to be well maintained in high purity after 6 days, but the cell killing measured in the same manner as in Example 3 The capacity was very low ( FIG . 4C ). On the other hand, NK cells isolated after culturing splenocytes for 6 days as in Example <1-1> showed very high cell killing ability while maintaining relatively high purity NK cells ( FIG. 4B) . .

실시예 5: IL-15의 첨가시기에 따른 세포독성 평가 (2)Example 5 Evaluation of Cytotoxicity According to Time of Addition of IL-15 (2)

본 실시예에서는, 도 4의 (B)와 동일한 방법으로 NK 세포를 배양하되, IL-15의 첨가시기를 배양 2일째와 4일째로 달리하여 실험을 수행하였다. 그 결과 2일째 추가하는 조건이 NK 세포의 수적 증가면에서 보다 효율적인 것으로 나타났다 (도 5의 (A)). In this example, the NK cells were cultured in the same manner as in FIG. 4B, but the experiment was performed by varying the addition time of IL-15 on the second and fourth days of culture. As a result, the conditions added on day 2 were found to be more efficient in terms of increasing the number of NK cells ( FIG. 5A ).

또한, 종양세포주 Neuro-2a, B16F10 및 CT26에 대해서 배양 2일째 IL-15를 추가한 경우에 세포독성이 10~15% 가량 증가하는 것으로 나타났다 (도 5의 (B)).In addition, the cytotoxicity of the tumor cell lines Neuro-2a, B16F10 and CT26 was increased by 10-15% when IL-15 was added on the second day of culture ( FIG. 5B ).

실시예 6: NK 세포의 순도 평가Example 6: Evaluation of Purity of NK Cells

실시예 <1-1>의 방법에 따라 마우스 비장세포를 IL-15(25 ng/ml)을 이용해 6일간 배양하고 CD5+ 자기 비드를 이용하여 CD5- 세포만을 최종적으로 분리하였다. 결과가 도 6에 도시되어 있다.Mouse splenocytes were cultured for 6 days using IL-15 (25 ng / ml) according to the method of Example <1-1>, and only CD5 - cells were finally isolated using CD5 + magnetic beads. The results are shown in FIG .

도 6에 도시된 바와 같이, 배양 전에는 3~5%에 불과하던 NK 세포 (CD3-DX5+)가 76% 가량 증가되었고, T 세포(CD3+DX5-)는 배양 전 33%에서 배양 후 13%로 절반 가량으로 감소했으며, 최종적으로 70~88.5%의 NK 세포(CD3-DX5+)를 얻을 수 있었다. 이는 본 발명의 방법에 따라 NK 세포가 선택적으로 증폭될 수 있고, 도 4의 (B)의 방법과 비교했을 때, DX5+ 분리방법보다 CD5- 분리방법이 보다 바람직함을 알 수 있다. 6, the culture until NK cells was only 3-5% was increased by a 76% (CD3 DX5 +), T cells (CD3 + DX5 -) are then incubated in culture before 33% 13% It was reduced by about half, and finally 70-88.5% of NK cells (CD3 - DX5 + ) were obtained. This NK cell can be selectively amplified, compared to the method of (B) in FIG. 4, CD5 than DX5 + separation method according to the process of the present invention can be seen that the separation method is more preferable.

실시예 7: 자가 (autologous) NK 세포 및 동종 (allogenic) NK 세포의 세포독성 비 교Example 7: Cytotoxicity Comparison of Autologous NK Cells and Allogenic NK Cells

MHC와 표적 세포(target cell)의 수용체가 매칭되지 않으면 비자기세포로 인식하여 NK 세포가 표적 세포를 더욱 잘 살해할 수 있다. If the MHC and the target cell (receptor) of the target (target cell) does not match, it is recognized as a non-magnetic cell, NK cells can kill the target cells better.

이러한 내용을 확인해보기 위해, 본 실시예에서는 시험관내에서 (in vitro) NK 세포의 세포독성을 평가해 보았다. 결과를 도 7a7b에 도시하였다.In order to confirm this, in this embodiment, in vitro ( in In vitro ) NK cells were evaluated for cytotoxicity. The results are shown in Figures 7a and 7b .

도 7a 7b에 도시된 바에 따르면, MHC-1 타입이 Kb인 C57BL/6 마우스에서 종양세포살해 능력은 neuro-2a (Ka), CT26 (Kd), B16F10 (Kb) 순서로 나타났고, Kd 타입인 BALB/c 마우스에서는 neuro-2a (Ka), B16F10 (Kb), CT26 (Kd) 순서로 나타났다. 이러한 결과는 NK 세포가 자가 유래의 표적세포보다 동종 표적세포를 살해하는데 있어 더욱 효과적임을 보여준다. As shown in FIGS . 7A and 7B , tumor cell killing ability in C57BL / 6 mice with Mb-1 type K b is shown in the order of neuro-2a (K a ), CT26 (K d ), and B16F10 (K b ). In BALB / c mice of type K d , neuro-2a (K a ), B16F10 (K b ), and CT26 (K d ) were shown. These results show that NK cells are more effective at killing allogeneic target cells than autologous target cells.

실시예 8: 마우스 종양모델에서의 세포독성 평가Example 8: Cytotoxicity Assessment in Mouse Tumor Models

본 실시예에서는 실제 종양 모델을 이용하여 종양 부피(tumor volume)를 측정하여 종양회귀(tumor regression) 정도를 평가하였다. 종양 부피는 종양 부피를 계산하는 일반적인 공식인 다음 공식에 따라 계산하였다: In this example, the tumor regression was evaluated by measuring the tumor volume using a real tumor model. Tumor volume was calculated according to the following formula, which is a general formula for calculating tumor volume:

(short length)2 x (long length) x 0.523(short length) 2 x (long length) x 0.523

(여기서, short length는 형성된 종양의 최단축 길이를 의미하고 long length는 종양의 최장축 길이를 의미한다.)(Here, short length means the shortest axis length of the formed tumor and long length means the longest axis length of the tumor.)

실시예 <1-3>에서 제작된 마우스 신경모세포종 및 흑색종 모델에 종양 접종 3일째부터 연속 6일간 매일 NK 세포를 3x106의 양으로 주입하였다. 결과를 도 89에 도시하였다.The mouse neuroblastoma and melanoma models prepared in Example <1-3> were injected with NK cells in an amount of 3 × 10 6 every day for six consecutive days from the third day of tumor inoculation. The results are shown in FIGS. 8 and 9 .

도 89에 나타낸 바에 따르면, 신경모세포종 모델에서는 자가 NK 세포 도입군이 PBS 도입군에 비해 80%의 종양 회귀를 보인 반면에, 동종 NK 세포 도입군은 90%의 종양 회귀를 나타내었다. 한편, 흑색종 모델에서는 자가 및 동종 NK 세포 도입군 모두 비슷한 수준의 종양 회귀 및 마우스 생존율을 나타내었다. 8 and 9 , in the neuroblastoma model, the autologous NK cell introduction group showed 80% tumor regression compared to the PBS introduction group, while the homologous NK cell introduction group showed 90% tumor regression. In the melanoma model, both autologous and allogeneic NK cell introduction groups showed similar levels of tumor regression and mouse survival.

실시예 9: NK 세포가 처리된 마우스 신경모세포종 모델에서 T 세포 및 NK 세포의 변화Example 9 Changes of T Cells and NK Cells in a Mouse Neuroblastoma Model Treated with NK Cells

마우스 신경모세포종 모델에서 6회의 NK 요법 후 종양 크기를 추적해 NK 세포의 항암효과를 확인했고, 28일째 그룹별로 치료가 된 마우스와 되지 않은 마우스의 비장과 림프절(lymph node)에서 면역세포(immune cell)의 변화를 FACS (fluorescence activated cell sorter)를 통해 확인해 보았다. 결과를 도 10a, 10b11에 도시하였다. In the mouse neuroblastoma model, the tumor size was tracked after 6 times of NK therapy, and the anti-cancer effects of NK cells were confirmed.The immune cells in the spleen and lymph nodes of the treated and untreated mice were treated on the 28th day. ) Was confirmed by FACS (fluorescence activated cell sorter). The results are shown in FIGS. 10A, 10B and 11 .

도 10a 10b에 도시된 바에 따르면, 종양을 주입하지 않은 정상 마우스군 에 비해 PBS 대조군은 비장과 림프절에서 CTL 세포(CD3+CD8+) 및 Th 세포(CD3+CD4+)의 수치가 떨어져 있었다. 그러나, NK 세포에 의해 치료된 마우스와 치료되지 않은 마우스를 비교했을 때, 치료된 마우스에서 CTL과 Th 세포의 수치가 정상보다 높게 나타났으며 이는 유효 T 세포가 활성화되어 있음을 알 수 있다 (도 10a(A), (B), (C)(D)). 그러나, 비장과 림프절에서 NK 세포(CD3-DX5+)의 변화는 관측되지 않았다 (도 10b(E)(F)). 이러한 결과는 NK 세포에 의한 CTL의 증식과 활성화를 통해 종양을 치료할 수 있음을 보여준다. As shown in FIGS. 10A and 10B , the PBS control group had a lower level of CTL cells (CD3 + CD8 + ) and Th cells (CD3 + CD4 + ) in the spleen and lymph nodes than the normal mouse group without tumor injection. However, when comparing mice treated with NK cells with those not treated, the levels of CTL and Th cells were higher than normal in treated mice, indicating that effective T cells were activated ( FIG. (A), (B), (C) and (D) of 10a . However, no changes in NK cells (CD3 - DX5 + ) were observed in the spleen and lymph nodes ( (E) and (F) in FIG. 10B ). These results show that tumors can be treated through the proliferation and activation of CTL by NK cells.

특히, CD5- NK 세포 투여 후 비장에서 활성화된 CTL과 메모리 CTL의 증가를 확인할 수 있었다 (도 11).In particular, after administration of CD5 - NK cells, the increase in activated CTL and memory CTL in the spleen was confirmed ( FIG. 11 ).

실시예 10: 인간 PBMC에서 NK 세포의 함량 및 활성화 정도Example 10 Content and Activation Degree of NK Cells in Human PBMC

실시예 2에 기재된 바와 같이 정상인의 혈액으로부터 PBMC를 분리하였다.PBMCs were isolated from blood of normal individuals as described in Example 2.

채혈 후 분리한 PBMC에는 약 10-20%의 NK 세포가 포함되어 있지만 (도 12의 (A)), NK 세포 활성화 마커인 NKp44는 거의 발현되지 않았다 (도 12의 (B)).PBMCs isolated after blood collection contained about 10-20% of NK cells ( FIG. 12A ), but NKp44, an NK cell activation marker, was hardly expressed ( FIG. 12B ).

실시예 11: 인간 NK 세포의 종양세포 살해능 평가Example 11 Evaluation of Tumor Cell Killing Capacity of Human NK Cells

실시예 2에 기재된 바와 같이 PBMC로부터 분리된 CD56+ 세포에 IL-15 (50 ng/ml)를 처리하여 14일간 배양하고, 이렇게 배양된 인간 NK 세포를 이용하여 종양세포주에 대한 살해능을 비교하였다.CD56 + cells isolated from PBMC were treated with IL-15 (50 ng / ml) for 14 days as described in Example 2, and the killing ability of tumor cell lines was compared using the cultured human NK cells. .

그 결과, CD56+ 자기 비드를 이용하여 분리한 NK 세포(도 13a)는 높은 수준의 종양살해능을 나타냈으나, T 세포(도 13b)는 매우 낮은 살해능을 나타냈다.As a result, NK cells ( FIG. 13A ) isolated using CD56 + magnetic beads showed high levels of tumor killing ability, whereas T cells ( FIG. 13B ) showed very low killing ability.

실시예 12: 혈액제공자의 KIR 타입과 종양세포의 HLA 타입의 미스매칭 정도에 따른 종양세포 살해능 평가Example 12 Assessment of Tumor Cell Killing Capacity According to the Mismatching Level of Blood Provider's KIR Type and HLA Type of Tumor Cells

NK 세포는 세포의 표면에 자신과 동일한 MHC분자가 발현하는 경우 자기(self)로 인식하여 살해하지 않지만 MHC 발현이 낮은 종양세포나 타인의 MHC를 발현하는 경우 직접 살해할 수 있다. NK cells do not recognize and kill themselves when they express the same MHC molecule on the surface of the cell, but can directly kill when they express tumor cells or other MHCs with low MHC expression.

이에, 혈액제공자의 KIR 타입과 종양세포의 HLA 타입의 차이에 따른 표적세포에 대한 살해능을 평가하기 위해, KIR 타입이 서로 다른 두 혈액제공자로부터 혈액을 제공받아 NK 세포를 실시예 2의 방법으로 14일간 배양하고, HLA와 미스매칭(mismatch)되는 정도에 따라 종양세포의 살해능을 비교하였다. Thus, in order to evaluate the killing ability of the target cell according to the difference between the blood donor's KIR type and tumor cell's HLA type, NK cells were provided with blood from two blood donors with different KIR types. After 14 days of incubation, tumor cell killing ability was compared according to the extent of mismatch with HLA.

그 결과, 혈액제공자의 KIR 타입과 종양세포의 HLA 타입이 완전히 일치하는 경우보다 하나 또는 두 개의 KIR만 매치되는 경우에 종양세포 살해능이 우수한 것으로 나타났다 (도 14a 14b).As a result, it was shown that tumor cell killing ability was better when only one or two KIR matched than when the KIR type of the blood donor and the HLA type of the tumor cell matched completely ( FIGS. 14A and 14B ).

실시예 13: 인간 NK 세포의 분리에 따른 증식율 및 종양세포 살해능 평가Example 13: Evaluation of proliferation rate and tumor cell killing ability according to the isolation of human NK cells

실시예 2의 방법에 따라 인간 NK 세포를 분리한 후 약 3주 (21일) 동안 배양하면서 증식율과 세포 살해능을 비교하였다.Human NK cells were isolated and cultured for about 3 weeks (21 days) according to the method of Example 2 to compare the proliferation rate and cell killing ability.

그 결과, 전체적인 세포 수에 있어서, 분리하지 않고 배양한 경우 (약 11배 증가)가 분리하고 배양한 경우(약 3배 증가)에 비해 높지만 (도 15a), 실제 종양세포에 대한 살해능은 분리하고 배양한 NK 세포가 20~30% 높은 것으로 나타났다 (도 15b).As a result, in the total number of cells, culturing without separation (about 11-fold increase) was higher than that of cultivating and cultivating (about 3-fold increase) ( FIG. 15A ), but the killing ability to actual tumor cells was separated. The cultured NK cells were found to be 20-30% higher ( FIG. 15B ).

도 1은 사이토카인의 다양한 조합을 이용하여 마우스 비장세포를 배양했을 때 전체적인 세포 및 NK 세포의 수적 변화를 나타낸 것이고 (A: 총 세포수, B: NK 세포 수); Figure 1 shows the change in the total number of cells and NK cells when cultured mouse splenocytes using various combinations of cytokines (A: total cell number, B: NK cell number);

도 2는 사이토카인의 다양한 조합을 이용하여 마우스 비장세포를 배양했을 때 종양세포의 살해능을 나타낸 것이며 (YAC-1: 마우스 림프종 세포 (양성 대조군), EL-4: 백서 백혈병 세포 (음성 대조군), Neuro-2a: 신경모세포종 세포주, B16F10: 흑색종 세포주, CT26: 대장암종 세포주); Figure 2 shows the killing of tumor cells when cultured mouse splenocytes using various combinations of cytokines (YAC-1: mouse lymphoma cells (positive control), EL-4: white leukemia cells (negative control) Neuro-2a: neuroblastoma cell line, B16F10: melanoma cell line, CT26: colorectal carcinoma cell line);

도 3a3b는 25 ng/ml의 IL-15를 이용하여 마우스 비장세포를 배양했을 때 NK 세포의 활성화가 가장 우수한 결과를 보여주는 것이며; 3A and 3B show the best results of NK cell activation when mouse splenocytes were cultured using 25 ng / ml IL-15;

도 4는 비장세포에 IL-15를 처리한 후 6일간 배양한 경우와 비장세포로부터 DX5+ NK 세포를 분리한 후 IL-15를 처리하여 배양한 경우 세포독성 (cytotoxicity) 정도를 보여주는 것이며 (A: 벌크 NK 세포 배양액, B: 배양 후 분리된 DX5+ NK 세포, C: DX5+로 분리 후 배양한 NK 세포); Figure 4 shows the degree of cytotoxicity when cultured for 6 days after treatment with IL-15 in splenocytes and when treated with IL-15 after separating DX5 + NK cells from splenocytes (A : Bulk NK cell culture, B: DX5 + NK cells isolated after culturing, C: NK cells isolated after culturing with DX5 + );

도 5는 비장세포를 배양한 지 2일째 및 4일째에 IL-15를 첨가하여 배양한 후 분리된 DX5+ NK 세포에 대한 세포독성 정도를 보여주는 것이며 (Neuro-2a: 신경모세포종 세포주, B16F10: 흑색종 세포주, CT26: 대장암종 세포주); FIG. 5 shows the cytotoxicity of the isolated DX5 + NK cells after incubation with IL-15 on days 2 and 4 of splenocytes cultured (Neuro-2a: neuroblastoma cell line, B16F10: black color) Species cell line, CT26: colorectal carcinoma cell line);

도 6은 IL-15를 이용하여 6일간 배양한 벌크 (bulk) NK 세포와 CD5+ 자기 비드를 이 용하여 분리한 CD5- NK 세포의 순도를 비교하여 나타낸 것이며; 6 is a comparison of the purity of bulk NK cells cultured using IL-15 for 6 days and CD5 - NK cells isolated using CD5 + magnetic beads;

도 7a7b는 동종 NK 세포와 자가 NK 세포의 활성도와 세포독성 정도를 비교하여 나타낸 것이며 (Neuro-2a: 신경모세포종 세포주, B16F10: 흑색종 세포주, CT26: 대장암종 세포주); 7a and 7b show the comparison of the activity and cytotoxicity of allogeneic NK cells and autologous NK cells (Neuro-2a: neuroblastoma cell line, B16F10: melanoma cell line, CT26: colorectal carcinoma cell line);

도 8은 마우스 신경모세포종 모델에서 CD5- NK 세포에 의한 종양회귀(tumor regression) 정도를 보여주는 것이며; 8 shows the extent of tumor regression by CD5 - NK cells in a mouse neuroblastoma model;

도 9는 마우스 흑색종 모델에서 CD5- NK 세포에 의한 종양회귀 정도를 보여주는 것이며; 9 shows the extent of tumor regression by CD5 - NK cells in a mouse melanoma model;

도 10a10b는 마우스 신경모세포종 모델에 CD5- NK 세포를 처리한 후 비장 및 림프절에서 T 세포 및 NK 세포의 변화를 보여주는 것이며; 10A and 10B show changes in T cells and NK cells in the spleen and lymph nodes after treatment of CD5 - NK cells in a mouse neuroblastoma model;

도 11은 마우스 신경모세포종 모델에 CD5- NK 세포를 처리한 후 비장에서 활성화된 CTL (A), Th 세포 (B), 메모리 CTL (C) 및 메모리 Th 세포 (D)의 함량을 비교하여 보여주는 것이며; Figure 11 shows the comparison of the contents of activated CTL (A), Th cells (B), memory CTL (C) and memory Th cells (D) in the spleen after treatment of mouse neuroblastoma model CD5 - NK cells ;

도 12는 인간 PBMC에서 NK세포의 함량 및 활성화 정도를 보여주는 것이며; 12 shows the content and activation of NK cells in human PBMC;

도 13a 13b는 본 발명의 방법에 따라 인간 PBMC에서 분리된 CD56+ 세포에 IL-15를 처리하여 14일간 배양하여 얻어진 NK 세포의 종양세포 살해능을 보여주는 것이며 (도 13a: 정제된 CD56+NK 세포, 도 13b: CD3+ T 세포, K562: 흉선종 세포주, SK- N-SH: 혈액제공자의 KIR 타입과 2개 HLA이 매칭되는 신경모세포종 세포주, SK-N-BE (2): 혈액 제공자의 KIR 타입과 완전 매칭되는 신경모세포종 세포주, SK-N-DZ (G1): 혈액 제공자의 KIR 타입과 1 개 HLA이 매칭되는 신경모세포종 세포주); 13A and 13B show tumor cell killing ability of NK cells obtained by incubating 14 days of treatment with IL-15 in CD56 + cells isolated from human PBMC according to the method of the present invention ( FIG. 13A : Purified CD56 + NK Cells, FIG. 13B : CD3 + T cells, K562: thymoma cell line, SK-N-SH: neuroblastoma cell line with matching KIR type of blood donor and 2 HLA, SK-N-BE (2): KIR of blood donor Neuroblastoma cell line, which perfectly matches the type, SK-N-DZ (G1): neuroblastoma cell line in which one HLA matches the KIR type of the blood donor);

도 14a 14b는 혈액제공자의 KIR 타입과 종양세포의 HLA 타입의 차이에 따른 종양세포 살해능을 보여주는 것이며 (녹색 막대: NK 세포, 노란색 막대: T 세포, K562: 흉선종 세포주, SK-N-SH: 혈액제공자의 KIR 타입과 2개 HLA이 매칭되는 신경모세포종 세포주, SK-N-BE(2): 혈액 제공자의 KIR 타입과 완전 매칭되는 신경모세포종 세포주, SK-N-DZ(G1): 혈액 제공자의 KIR 타입과 1개 HLA이 매칭되는 신경모세포종 세포주); 14A and 14B show tumor cell killing ability according to the difference between the HIR type of the blood donor and the KIR type of the blood donor (green bar: NK cell, yellow bar: T cell, K562: thymic cell line, SK-N-SH) : Neuroblastoma cell line with KIR type matched with two HLA of blood donor, SK-N-BE (2): Neuroblastoma cell line with KIR type matched with blood donor, SK-N-DZ (G1): Blood donor Neuroblastoma cell line with a KIR type of 1 and one HLA);

도 15a 15b는 인간 PBMC에서 IL-15를 처리하여 NK 세포를 21일간 배양하여 얻어진 PBMC와 본 발명의 방법에 따라 인간 PBMC로부터 분리된 CD56+ 세포에 IL-15를 처리하여 21일간 배양된 NK 세포에 대한 세포 증식율 (도 15a) 및 종양세포 살해능 (도 15b)을 보여주는 것이다. 15A and 15B show NK cells cultured for 21 days by treating IL-15 on CDB + cells isolated from human PBMCs and PBMCs obtained by culturing NK cells for 21 days by treating IL-15 in human PBMCs. Cell proliferation ( FIG. 15A ) and tumor cell killing ability ( FIG. 15B ) for the cells.

Claims (14)

삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 1) 인간을 포함한 포유동물의 말초혈액으로부터 단핵구를 분리하는 단계; 1) separating monocytes from peripheral blood of a mammal, including human; 2) 분리된 말초혈액 단핵구로부터 CD56+ 자기 비드를 이용하는 공정만으로 CD56+ 단구를 분리하는 단계; 및2) from the separated peripheral blood mononuclear cells and separating the CD56 + monocytes only processes using CD56 + magnetic beads; And 3) 분리된 CD56+ 단구에 IL-15를 첨가하여 2 내지 30일간 배양하는 단계3) culturing for 2 to 30 days by adding IL-15 to the isolated CD56 + monocytes 를 포함하는, 자연살해세포의 제조방법.Containing, method for producing natural killer cells. 제 6 항에 있어서,The method of claim 6, 단계 3)에서, IL-15를 10 내지 100 ng/ml의 양으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 자연살해세포의 제조방법.In step 3), the method for producing natural killer cells, characterized in that the IL-15 is added in an amount of 10 to 100 ng / ml. 청구항 8은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.Claim 8 was abandoned when the registration fee was paid. 제 6 항에 있어서,The method of claim 6, 단계 3)에서, IL-15를 20 내지 30 ng/ml의 양으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 자연살해세포의 제조방법.In step 3), the method for producing natural killer cells, characterized in that the addition of IL-15 in an amount of 20 to 30 ng / ml. 청구항 9은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.Claim 9 was abandoned upon payment of a set-up fee. 제 6 항에 있어서,The method of claim 6, 단계 3)에서, IL-15를 25 ng/ml의 양으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 자연살해세포의 제조방법.In step 3), the production method of natural killer cells, characterized in that the addition of IL-15 in an amount of 25 ng / ml. 제 6 항에 있어서,The method of claim 6, 단계 3)에서, 분리된 CD56+ 단구에 IL-15를 첨가하여 14 내지 30일간 배양하는 것을 특징으로 하는 자연살해세포의 제조방법.In step 3), the method for producing natural killer cells, characterized in that culture for 14 to 30 days by adding IL-15 to the isolated CD56 + monocytes. 제 6 항의 방법에 의해 제조되고 고형 종양 특이적인 면역반응을 유도할 수 있는 자연살해세포.A natural killer cell prepared by the method of claim 6 and capable of inducing a solid tumor specific immune response. 제 11 항에 있어서,The method of claim 11, 자연살해세포가 동종(allogenic) 자연살해세포인 것을 특징으로 하는 자연살해세포.Natural killer cells, wherein the natural killer cells are allogenic natural killer cells. 제 11 항의 자연살해세포를 유효성분으로 함유하고 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 보조제를 포함하는, 고형 종양 치료용 조성물.A composition for treating solid tumors, comprising the natural killer cells of claim 11 as an active ingredient and comprising one or more pharmaceutically acceptable carriers or adjuvants. 제 13 항에 있어서,The method of claim 13, 고형 종양이 흑색종, 신경모세포종 (neuroblastoma) 또는 대장암종인 것을 특징으로 하는 조성물.A composition characterized in that the solid tumor is melanoma, neuroblastoma or colorectal carcinoma.
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