KR101035522B1 - Combination therapy for neuroprotection - Google Patents

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Abstract

본 발명은 피루보일(pyruvoyl) 유사체와 항산화제(anti-oxidant)의 병용요법에 관한 것으로서, 각각의 물질의 단독투여 시에 비해 현저히 증가된 미세아교세포의 활성, 및 염증반응을 일으키는 사이토카인의 활성 억제에 의한 뇌조직의 손상 억제 효과, 및 운동능력 및 신경학적 손상 개선 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 손상 발생 6 시간 이후에도 장시간 지속적으로 높은 신경보호 효과를 나타낼 수 있다.The present invention relates to the combination therapy of pyruvoyl analogs and anti-oxidants, and cytokines that cause markedly increased microglial activity and inflammatory response compared to the administration of each substance alone. In addition to inhibiting the activity of the brain tissue by inhibiting the activity of the damage, and the ability to improve the motor capacity and neurological damage, as well as 6 hours after the onset of the damage can continue to exhibit a high neuroprotective effect.

Description

뇌신경 보호를 위한 병용요법{Combination therapy for neuroprotection}Combination therapy for neuroprotection

본 발명은 뇌신경 보호(neuroprotection)를 위한 병용요법(combination therapy)에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 피루보일(pyruvoyl) 유사체와 항산화제(anti-oxidant)를 병용함으로써 뇌허혈 후 뇌조직 경색 억제, 및 운동능력 및 신경학적 손상 개선 효과를 극대화할 수 있는 약제 및 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a combination therapy for neuroprotection, and more particularly, to inhibit brain infarction after cerebral ischemia by using a pyruvoyl analog and an anti-oxidant. And it relates to a drug and a method which can maximize the effect of improving the motor capacity and neurological damage.

뇌졸중(Stroke)은 단일 질환으로는 한국인 사망원인 1위인 주요 뇌혈관계 질환이다. 뇌허혈 후 뇌신경 세포가 손상을 입게 되는 과정은, 중추신경계의 중요한 흥분성 아미노산(excitatory amino acid) 신경전달 물질의 과도한 분비에 의한 글루타메이트 수용체(NMDA 또는 비-NMDA 수용체)의 지속적인 흥분에 의해 세포내외 칼슘의 정상적인 동적 평형이 파괴되어 신경독성이 일어나고, 재관류 과정에서 과잉 생성되는 산화질소(NO)와 유리 산소기(O2 -) 등의 활성 산소종에 의한 세포손상 및 미토콘드리아에서 일어나는 여러 가지 과정들을 포함한다. 뇌신경계에서 허혈-재관류가 진행되면, 흥분독성에 의한 급성 신경세포 사멸과정에 이어 수 시간 내지 수일에 걸쳐 서서히 진행되는 지연성 손상이 이어진다. 지연성 신경 세포사는 시간의 경과로 미루어 새로운 유전자의 발현을 수반하며, 신경염증 반응과 그 결과로 진행되는 2차적인 뇌 조직 손상과정이다. 이 경우, 빠른 시기에 적절한 치료를 하면 비가역적 세포 손상을 줄이는 것이 가능하다.Stroke is a major cerebrovascular disease that is the number one cause of death in Korea among single diseases. Cerebral nerve cells are damaged after cerebral ischemia due to the persistent excitation of glutamate receptors (NMDA or non-NMDA receptors) due to excessive excretion of important excitatory amino acid neurotransmitters of the central nervous system. Normal dynamic equilibrium is disrupted, resulting in neurotoxicity, cell damage caused by reactive oxygen species such as nitric oxide (NO) and free oxygen groups (O 2 − ) that are overproduced during reperfusion, and various processes that occur in the mitochondria. The ischemia-reperfusion progression in the cranial nervous system leads to acute neuronal cell death due to excitatory toxicity, followed by a slow progression of damage over several hours to days. Delayed neuronal death involves the expression of new genes over time, a neuroinflammatory response and the resulting secondary brain tissue damage process. In this case, it is possible to reduce irreversible cellular damage with proper treatment at an early time.

현재 임상에서 사용되고 있는 뇌졸중 치료제로는 조직 플라즈미노겐 활성제 (tissue plasminogen activator: 이하 'tPA')와 유로키나제(urokinase) 등의 혈전 용해제, 혈소판 억제제, 뇌혈관 확장제, 칼슘이온 채널l 억제제 등의 다양한 기전을 가진 것들이 있다. 그러나 이들은 발병 후 3 시간 이내에 투여해야 하거나, 비특이적 출혈, 피브리노겐 용해 등의 부작용을 수반하는 것으로 보고되었다.Stroke treatments currently being used in the clinic include various mechanisms such as tissue plasminogen activator (tPA) and thrombolytic agents such as urokinase, platelet inhibitors, cerebrovascular agents, and calcium ion channel inhibitors. There are things with it. However, they have been reported to be administered within 3 hours after onset, or are accompanied by side effects such as nonspecific bleeding, fibrinogen lysis.

피루베이트(pyruvate)는 세포의 해당작용(glycolysis)의 마지막 단계에서 피루베이트 키나제(pyruvate kinase)에 의해 주로 형성되며 알라닌(alanine)의 아민기 전이과정 등의 다른 대사과정을 통해서도 형성된다. 최근 들어, 피루베이트가 세포 내의 대사 중간 생성물로서의 역할을 할 뿐 아니라, 항산화 작용과 유리기 제거 기능을 수행하는 것이 보고되었다. 현재까지 보고된 피루베이트의 작용기전은, (1) TCA 회로의 중간 산물 및 대사물질(metabolic substance)로서의 역할 수행, (2) CH3CCOOO- + H2O2 → CH3COO- + H2O + CO2 의 과정을 통한 과산화수소 제거, (3) 활성산소종의 하나인 수산화 라디칼(hydroxyl radical, 이하 'OH.'제거, 및 (4) 피루베이트 자체의 이노트로픽(inotropic) 기능과 근소포체(sarcoplasmic reticular) ATPase 활성화 기능 등이다. 이와 같은 피루베이트의 세포보호 기능은 다양한 조직 질병 상태에서 연구되었는데, 염화피루베이트를 정맥주사로 투여하여 과산화수소에 의해 유도된 급성 신장 질환에서 최초로 보호 효과를 확인한 이래, 심근, 장, 간 등에서 허혈 관련 스트레스에서의 보호효과가 보고되었으며, 갈락토즈(galactose), 또는 당뇨에 의한 백내장(cataract), 및 대뇌 허혈과 내출혈 등의 동물모델에서의 보호 효과도 보고되었다. 그러나 피루베이트는 수용액 상에서 (1) 매우 낮은 용해도와 매우 높은 불안정성을 나타내는 점과, (2) 파라피루베이트(parapyruvate)로 전환되어 최종적으로 TCA 회로의 강력한 저해제가 된다는 점으로 인해 치료제로서의 실용화에 심각한 한계를 지니고 있다.Pyruvate It is formed mainly by pyruvate kinase in the final stage of glycolysis and also through other metabolic processes such as alanine amine transfer. Recently, it has been reported that pyruvate not only acts as a metabolic intermediate in cells but also performs antioxidant and free radical elimination functions. The reported mechanism of action of pyruvate to date include (1) an intermediate product, and metabolites of the TCA circuit performing functions as (metabolic substance), (2) CH 3 CCOOO - + H 2 O 2 → CH 3 COO - + H 2 O + CO peroxide removed with two courses, and (3) free radicals, one of the hydroxyl radical (hydroxyl radical, hereinafter 'OH.' Removal of the species, and (4) Ino of pyruvate itself Tropic function and sarcoplasmic reticular ATPase activation function, etc. This cytoprotective function of pyruvate has been studied in various tissue disease states, and it is induced by hydrogen peroxide by intravenous administration of pyruvate chloride. Since it was first identified as a protective effect in kidney disease, it has been reported to protect against ischemia-related stress in myocardium, intestine, liver, and other animals such as galactose or cataract due to diabetes, and cerebral ischemia and internal bleeding The protective effect in the model has also been reported, but pyruvate (1) shows very low solubility and very high instability in aqueous solution, and (2) parapyrube It is converted into bit (parapyruvate) and finally has a serious limitation to the practical use as therapeutic agents due to the fact that a strong inhibitor of the TCA cycle.

상기와 같은 피루베이트의 한계를 극복하기 위하여 다양한 피루베이트 유사체들(pyruvate derivatives), 예를 들어 하기 화학식 A의 알킬피루베이트가 연구되었다:To overcome such limitations of pyruvate, various pyruvate derivatives have been studied, for example alkylpyruvates of formula A:

[화학식 A][Formula A]

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그중에서도, 에틸피루베이트(ethyl pyruvate, 이하 'EP'라고도 함)는 다음과 같은 장점을 가지고 있어 피루베이트의 강력하고도 효율적인 대체물질이 될 가능성이 크다: 첫째, 에스테르 유사체이므로 지방 친화성이 높아서 세포 투과도가 현저히 높다. 둘째, 염수(saline)나 물에는 용해도가 낮으나 칼슘 용액(링거(Ringer) 용액)에서 용해도가 현저히 증가한다. 셋째, 칼슘 용액 (링거 용액)에서 이합체(dimer)가 되면서 에놀레이트 음이온(anionic enolate)을 형성하여 안정화되면서, 피루베이트의 전구체 역할을 할 수 있다. 넷째, 식품 첨가제로 허가되어 있는 만큼 안전성이 높은 물질이다.Among them, ethyl pyruvate (also referred to as 'EP') is likely to be a powerful and efficient substitute for pyruvate because it has the following advantages: Permeability is remarkably high. Second, the solubility in saline or water is low, but the solubility in calcium solution (Ringer solution) is significantly increased. Third, as a dimer in a calcium solution (Ringer's solution) is stabilized by forming an anionic enolate, it can serve as a precursor of pyruvate. Fourth, it is a material with high safety as it is approved as a food additive.

본 발명자들은 뇌졸중 동물모델에서 EP가 탁월한 신경보호 효과를 나타내어 뇌졸중 치료제로서의 가능성이 큼을 제시하였으며, EP를 유효성분으로 함유하는 뇌신경보호제에 대하여 한국특허 제686,652호를 획득하였다. 즉, EP를 허혈-재관류 후 12 시간에 복강 투여하면, 경색의 크기를 50% 이하로 줄일 수 있으며, 24 시간 후에 처치했을 때에도 경색의 크기를 20% 정도 줄일 수 있는 것으로 나타났다. 또한, 로타-로드 실험을 통해 경색 억제 효과가 운동기능 회복과 병행함을 확인하였고, 이 과정에서 미세아교세포 활성 억제, 염증 촉진성 사이토카인 발현 억제 등 EP의 항염증 효과를 관찰하였으며, 1차 배양세포를 사용하여 EP의 항산화 기능을 확인하였다. 특히 EP의 후처치 효과는 현재까지 보고된 모든 후보물질보다 우월하며, EP는 세포 내에 존재하고 있는 자연 물질이라는 장점이 있다. 이와 같은 EP의 높은 세포투과도와 안전성을 기반으로 한 다양한 기능으로부터, EP는 뇌졸중과 같은 복합적인 기전으로 진행되는 질병에 가장 효과적으로 적용될 수 있을 것으로 생각된다.The present inventors suggested that EP exhibits an excellent neuroprotective effect in a stroke animal model, and thus has a great possibility as a therapeutic agent for stroke, and obtained Korean Patent No. 686,652 for a neuroprotective agent containing EP as an active ingredient. In other words, the intraperitoneal administration of EP 12 hours after ischemia-reperfusion can reduce the infarct size to 50% or less, and reduce infarct size by 20% even when treated 24 hours later. In addition, it was confirmed that the infarct inhibitory effect was in parallel with the recovery of motor function through the rota-rod experiment. In this process, the anti-inflammatory effect of EP was observed, such as inhibiting microglial activity and inhibiting inflammation-promoting cytokine expression. Culture cells were used to confirm the antioxidant function of EP. In particular, the post-treatment effect of EP is superior to all candidate substances reported to date, and EP has the advantage of being a natural substance present in cells. From the various functions based on the high cell permeability and safety of EP, it is thought that EP can be most effectively applied to diseases that progress to complex mechanisms such as stroke.

하기 화학식 B의 아세틸살리실산(acetylsalicylic acid, 상품명: 아스피린(aspirin))은 심혈관 질환의 치료와 예방에 효과를 보이는 것으로 증명된 몇 가지 약물 중 하나이다:Acetylsalicylic acid (Aspirin) of Formula B is one of several drugs that have been shown to be effective in the treatment and prevention of cardiovascular diseases:

[화학식 B][Formula B]

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아세틸살리실산은 비가역적인 혈소판 응집 억제 기능을 통하여 혈관 차폐를 억제한다. 즉, 혈소판 응집의 강력한 유도제인 동시에 혈관 수축제인 트롬복산 A2 (thromboxane A2, 이하 'TXA2') 형성에 필수 효소인 사이클로옥시제나아제-1 (cyclooxygenase-1, 이하 'COX-1')과 사이클로옥시제나아제-2 (cyclooxygenase-2, 이하 'COX-2')를 비가역적으로 아세틸기로 치환시킴으로써, 혈소판 응집을 억제하고, 그 결과 허혈 상태의 뇌신경계에서 색전(emboli)의 크기를 줄이고 혈관 수축을 억제한다. NF-kB 억제를 통한 항염증 효과, 또는 항산화 작용 등을 통한 신경계 보호 작용도 보고되어 있으며, 세포 내의 ATP 손실을 지연시켜 저산소증(hypoxia)에 의한 손상을 억제하는 것으로도 알려져 있다. TXA2의 억제를 위해서는 낮은 용량(≥30 ㎎/일)의 아세틸살리실산으로 충분하나, 항염증 또는 항산화 작용 등을 통한 신경계 보호 작용을 효과적으로 수행하기 위해서는 상대적으로 높은 용량(3~6 g/일)이 필요하다. 아스피린의 복용량에 따른 심혈관계 질환 관련 효능에 관한 메타분석(meta-analysis) 결과를 보면, 75~325 ㎎의 아스피린을 매일 복용하면, 장기적으로 심혈관 질환의 치료와 예방에 효과가 있는 것으로 보고되었다.Acetylsalicylic acid inhibits vascular shielding through its irreversible platelet aggregation inhibition function. That is, the number of blood vessels at the same time a powerful inducer of platelet aggregation festival, thromboxane A 2 (thromboxane A 2, hereinafter 'TXA 2') a cycloalkyl-oxy enzyme required for forming agent or kinase -1 (cyclooxygenase-1, hereinafter 'COX-1' ) And cyclooxygenase-2 (hereinafter referred to as 'COX-2') are irreversibly substituted with an acetyl group to inhibit platelet aggregation and consequently increase the size of embolism in the ischemic brain nervous system. Reduce and inhibit vasoconstriction. The anti-inflammatory effect through the inhibition of NF-kB, or the protective effect of the nervous system through the antioxidant action, etc. has also been reported, it is also known to delay the damage caused by hypoxia by delaying ATP loss in the cells. Suppression of TXA 2 Low doses (≥30 mg / day) of acetylsalicylic acid are sufficient, but relatively high doses (3-6 g / day) are required to effectively protect the nervous system through anti-inflammatory or antioxidant activity. The meta-analysis of the effects of aspirin on cardiovascular disease has been reported to be effective in treating and preventing cardiovascular disease in the long term.

또한, 하기 화학식 C의 5-아미노살리실산 유사체는 강력한 항산화 효과, 또는 항산화 및 항염증 효과를 가져 급성 및 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방 및 치료에 적용 가능한 것으로 알려져 있다(미국특허공개 제2005-239896호, 한국특허 제751,888호 및 한국특허 제668,111호):In addition, the 5-aminosalicylic acid analog of Formula C is known to have a strong antioxidant effect, or an antioxidant and anti-inflammatory effect, and thus applicable to the prevention and treatment of acute and degenerative neurological diseases (US Patent Publication No. 2005-239896, Korean Patent No. 751,888 and Korean Patent 668,111):

[화학식 C][Formula C]

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상기 식에서,Where

R1 내지 R5는 각각 독립적으로 수소, C1 - 4알킬, 할로겐, 히드록시, C1 - 4알콕시, CF3 또는 니트로를 나타내고,R 1 to R 5 are each independently hydrogen, C 1 - 4 alkyl, halogen, hydroxy, C 1 - 4 alkoxy, CF 3, or represents nitro,

n은 0 내지 4의 정수이며,n is an integer of 0 to 4,

X는 CH2, O, S 또는 SO를 나타낸다.X represents CH 2 , O, S or SO.

하기 화학식 D의 플루옥세틴(fluoxetine; 화학명: N-메틸-[4-(트리플루오로메틸)페녹시]벤젠프로판아민)은 일라이 릴리 제약회사에 의해 개발되었으며(미국특허 제4,018,895호), 1987년 FDA(Food and Drug Administration: 미국식품의약국)에서 승인 받은 이후 전 세계적으로 가장 많이 사용되는 항우울제이다:Fluoxetine (Chemical Name: N-methyl- [4- (trifluoromethyl) phenoxy] benzenepropanamine) of Formula D was developed by Eli Lilly Pharmaceuticals (US Pat. No. 4,018,895), FDA, 1987 Since being approved by the Food and Drug Administration, it is the most used antidepressant in the world:

[화학식 D][Formula D]

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플루옥세틴은 뇌에서 인간의 감정을 조절하는 신경전달물질인 세로토닌 (serotonin)을 증가시키는 작용을 하고, 기존의 항우울제에서 발생하는 불면증, 체중 증가, 시력 장애, 심장 부정맥, 입마름증, 변비 등의 항콜린성 부작용을 뚜렷하게 감소시키며, 하루에 한 번만, 음식물 섭취와 상관없이, 복용할 수 있는 간편성과 대부분의 의약품과 병용투여할 수 있는 것이 장점이다. 플루옥세틴은 뇌졸중 발병 후 많은 환자들이 겪는 뇌졸중 후 우울증(post-stroke depression, PSD)의 치료에도 많이 사용되며, 우울증의 완화와 함께, 운동 기능과 인지 기능의 회복에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 우울증 치료 이외에 강박장애, 폭식증, 대인공포증, 도벽, 천재지변 후에 흔히 겪게 되는 외상 후 스트레스 증후군, 발작적인 증세를 나타내는 공황 장애 등에도 효과를 볼 수 있고 안전성이 높은 물질이다. 신경세포에게 유해한 활성 산소군이나 산화질소의 생성은 여러 가지 신경세포 사멸을 유발하는데, 이는 국부성 및 허혈성 뇌졸중과 같은 많은 신경계 질환과 외상성 두부 손상과 관련된 것으로 보고되고 있으며, 플루옥세틴은 다양한 뇌신경보호 효과를 나타내는 것으로 보고되어 있다.Fluoxetine acts to increase serotonin, a neurotransmitter that regulates human emotions in the brain, and anticholinergic effects such as insomnia, weight gain, vision disorders, cardiac arrhythmias, dry mouth and constipation that occur in conventional antidepressants Significantly reduces sexual side effects, and only once a day, regardless of food intake, the simplicity to take and can be combined with most medicines. Fluoxetine is also widely used for the treatment of post-stroke depression (PSD), which is experienced by many patients after stroke, and is known to be effective in relieving depression and restoring motor and cognitive functions. In addition to the treatment of depression, obsessive-compulsive disorder, bulimia, interphobia, theft, after traumatic stress syndrome commonly experienced after natural disasters, it can be effective in the panic disorder showing the seizure symptoms and high substance. The generation of free radicals or nitric oxides that are harmful to neurons causes various neuronal cell deaths, which have been reported to be associated with many neurological disorders such as local and ischemic stroke and traumatic head injury. Fluoxetine has various neuroprotective effects. It is reported to indicate.

한편, 뇌졸중과 같이 다양한 기전으로 진행되는 질환에 대해서는 한 가지 이상의 약제를 함께 투여하는 병용요법의 필요성이 높다. 이와 동시에, 발병 후 일정한 시간이 경과한 후에 처치한 경우에 효과를 기대할 수 있는 후처치 약제 발굴의 중요성이 매우 크다. 그러나 상기 화학식 A의 알킬피루베이트와 상기 화학식 B 내지 D의 아세틸살리실산, 5-아미노살리실산 유사체 및 플루옥세틴으로부터 선택되는 항산화제의 병용 및 병용에 의한 뇌신경 보호, 특히 뇌졸중 예방 및 치료 효과에 대해서는 전혀 알려진 바 없었다.
On the other hand, for diseases that progress with various mechanisms, such as stroke, there is a high need for combination therapy in which one or more drugs are administered together. At the same time, it is very important to find a post-treatment drug that can be expected to be effective when treated after a certain period of time after the onset. However, there is no known neuroprotective effect, especially stroke prevention and treatment effect by the combination and combination of the alkylpyruvate of Formula A and an antioxidant selected from acetylsalicylic acid, 5-aminosalicylic acid analogs of Formulas B and D, and fluoxetine. There was no.

본 발명자들은 뇌졸중 후 신경계 손상의 다양한 기전에서 상대적 우위를 보이는 약제의 병용투여를 통하여 뇌허혈 후 뇌조직 경색을 억제하고, 운동능력 및 신경학적 손상을 개선하는 효과를 극대화함과 동시에, 발병 후 일정한 시간이 경과한 후에 처치한 경우에도 유효한 치료효과를 얻을 수 있는 방안을 모색하였다. 그 결과, 피루보일(pyruvoyl) 유사체와 항산화제의 병용투여가 상기 목적에 부합함을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.The present inventors use a combination of drugs that show a relative advantage in various mechanisms of neurological damage after stroke, while inhibiting cerebral infarction after cerebral ischemia, maximizing the effect of improving motor capacity and neurological damage, and at a certain time after onset. Even after treatment, the effective treatment effect was sought. As a result, it was confirmed that the co-administration of pyruvoyl analogs and antioxidants met the above object, and the present invention was completed.

따라서 본 발명의 목적은 유효성분으로서 피루보일(pyruvoyl) 유사체와 항산화제를 포함하는 뇌신경 보호제를 제공하기 위한 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a neuroprotective agent comprising a pyruvoyl analog and an antioxidant as an active ingredient.

본 발명의 다른 목적은 유효성분으로서 피루보일(pyruvoyl) 유사체와 항산화제를 포함하는 뇌신경 보호용 약제 키트를 제공하기 위한 것이다.Another object of the present invention is to provide a neuroprotective pharmaceutical kit comprising a pyruvoyl analog and an antioxidant as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은 피루보일(pyruvoyl) 유사체와 항산화제를 포함하는 뇌신경 보호용 약제 패키지를 제공하기 위한 것이다.
Still another object of the present invention is to provide a neuroprotective pharmaceutical package comprising a pyruvoyl analogue and an antioxidant.

첫째, 본 발명은 유효성분으로서,First, the present invention is an active ingredient,

(1) 화학식 1의 피루보일(pyruvoyl) 유사체; 및(1) pyruvoyl analogs of Formula 1; And

(2) 화학식 2의 아세틸살리실산 유사체, 화학식 3의 5-아미노살리실산 유사체, 화학식 4의 플루옥세틴 유사체 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 항산화제:(2) at least one antioxidant selected from the group consisting of acetylsalicylic acid analogs of Formula 2, 5-aminosalicylic acid analogs of Formula 3, fluoxetine analogs of Formula 4, and pharmaceutically acceptable salts thereof:

를 포함하는, 뇌신경 보호제에 관한 것이다:It relates to a neuroprotective agent comprising:

[화학식 1][Formula 1]

Figure 112011005457647-pat00005
Figure 112011005457647-pat00005

[상기 화학식 1에서, R1은 (C1-C6)알킬, (C6-C12)아릴, (C1-C6)알콕시, (C6-C12)아릴옥시, (C6-C12)아르(C1-C6)알킬, (C6-C12)아르(C1-C6)알킬옥시, NR21R22 또는 (C1-C6)알킬티오이고; R21 및 R22는 서로 독립적으로 수소, (C1-C6)알킬, (C6-C12)아릴, (C6-C12)아르(C1-C6)알킬, (C6-C12)아릴카보닐 또는 (C1-C6)알킬카보닐이고; 상기 R1, R21 및 R22의 알킬, 아릴, 알콕시, 아릴옥시, 아르알킬, 아르알킬옥시, 아릴카보닐 또는 알킬카보닐은 할로겐, 할로(C1-C6)알킬(특히, CF3), 할로(C1-C6)알킬(C6-C12)아릴옥시 및 히드록시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기가 더 치환될 수 있다.]
[In Formula 1, R 1 is (C1-C6) alkyl, (C6-C12) aryl, (C1-C6) alkoxy, (C6-C12) aryloxy, (C6-C12) ar (C1-C6) alkyl , (C6-C12) ar (C1-C6) alkyloxy, NR 21 R 22 or (C1-C6) alkylthio; R 21 And R 22 independently of one another is hydrogen, (C 1 -C 6) alkyl, (C 6 -C 12) aryl, (C 6 -C 12) ar (C 1 -C 6) alkyl, (C 6 -C 12) arylcarbonyl or (C 1 -C 6) Alkylcarbonyl; R 1 and R 21 And alkyl, aryl, alkoxy, aryloxy, aralkyl, aralkyloxy, arylcarbonyl or alkylcarbonyl of R 22 is halogen, halo (C1-C6) alkyl (particularly CF 3 ), halo (C1-C6) One or more substituents selected from the group consisting of alkyl (C6-C12) aryloxy and hydroxy may be further substituted.]

[화학식 2][Formula 2]

Figure 112011005457647-pat00006
Figure 112011005457647-pat00006

[상기 화학식 2에서, R2는 수소, (C1-C6)알킬카보닐 또는 (C6-C12)아릴카보닐이고, 상기 R2의 아릴카보닐은 (C1-C6)알킬, 히드록시 및 할로(C1-C6)알킬(특히, CF3)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기가 더 치환될 수 있고; R3은 수소, (C1-C6)알킬 또는 (C6-C12)아릴이고; R4는 수소, (C1-C6)알킬, 할로(C1-C6)알킬(특히, CF3), 할로겐, (C1-C6)알콕시, 히드록시 또는 니트로이다.]
[In Formula 2, R 2 is hydrogen, (C1-C6) alkylcarbonyl or (C6-C12) arylcarbonyl, and arylcarbonyl of R 2 is (C1-C6) alkyl, hydroxy and halo ( One or more substituents selected from the group consisting of C1-C6) alkyl (in particular CF 3 ) may be further substituted; R 3 is hydrogen, (C 1 -C 6) alkyl or (C 6 -C 12) aryl; R 4 is hydrogen, (C 1 -C 6) alkyl, halo (C 1 -C 6) alkyl (particularly CF 3 ), halogen, (C 1 -C 6) alkoxy, hydroxy or nitro.]

[화학식 3](3)

Figure 112011005457647-pat00007
Figure 112011005457647-pat00007

[상기 화학식 3에서, R5 내지 R9는 서로 독립적으로 수소, (C1-C6)알킬, 할로겐, 히드록시, (C1-C6)알콕시, CF3 또는 니트로이고; n은 0 내지 4의 정수이며; X는 CH2, O, S 또는 SO이다.]
[In Formula 3, R 5 to R 9 are independently of each other hydrogen, (C1-C6) alkyl, halogen, hydroxy, (C1-C6) alkoxy, CF 3 or nitro; n is an integer from 0 to 4; X is CH 2 , O, S or SO.]

[화학식 4][Formula 4]

Figure 112011005457647-pat00008
Figure 112011005457647-pat00008

[상기 화학식 4에서, R10 및 R11은 서로 독립적으로 수소, (C1-C6)알킬 또는 (C6-C12)아릴이다.]
[In Formula 4, R 10 and R 11 are each independently hydrogen, (C 1 -C 6) alkyl or (C 6 -C 12) aryl.]

둘째, 본 발명은 유효성분으로서,Second, the present invention is an active ingredient,

(1) 화학식 1의 피루보일(pyruvoyl) 유사체; 및(1) pyruvoyl analogs of Formula 1; And

(2) 화학식 2의 아세틸살리실산 유사체, 화학식 3의 5-아미노살리실산 유사체, 화학식 4의 플루옥세틴 유사체 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 항산화제:(2) at least one antioxidant selected from the group consisting of acetylsalicylic acid analogs of Formula 2, 5-aminosalicylic acid analogs of Formula 3, fluoxetine analogs of Formula 4, and pharmaceutically acceptable salts thereof:

를 포함하는, 뇌신경 보호용 약제 키트에 관한 것이다.
It relates to a pharmaceutical kit for protecting the nerves of the brain.

셋째, 본 발명은 유효성분으로서,Third, the present invention is an active ingredient,

(1) 화학식 1의 피루보일(pyruvoyl) 유사체; 및(1) pyruvoyl analogs of Formula 1; And

(2) 화학식 2의 아세틸살리실산 유사체, 화학식 3의 5-아미노살리실산 유사체, 화학식 4의 플루옥세틴 유사체 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 항산화제:(2) at least one antioxidant selected from the group consisting of acetylsalicylic acid analogs of Formula 2, 5-aminosalicylic acid analogs of Formula 3, fluoxetine analogs of Formula 4, and pharmaceutically acceptable salts thereof:

를 포함하는, 뇌신경 보호용 약제 패키지에 관한 것이다.
It includes, to a cranial nerve protective agent package.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 유효성분으로서 피루보일(pyruvoyl) 유사체와 항산화제를 병용함으로써 미세아교세포의 활성, 및 염증반응을 일으키는 사이토카인의 활성을 억제하여 뇌조직의 손상을 억제함에 있어서 각각의 단독 사용 시에 비해 현저히 증가된 효과를 제공하는 것이다. 나아가, 각각의 단독 사용 시에 비해 손상 발생으로부터 장시간, 예를 들어 6~24 시간, 경과 후에도 지속적인 효과를 제공하는 것이다. 따라서 본 발명의 약제는 각종 뇌혈관계 질환인 뇌허혈, 뇌경색, 뇌졸중, 헌팅톤병, 루게릭병 또는 혈관성 치매에 활용될 수 있으며, 특히 뇌졸중의 예방 또는 치료에 보다 효과적으로 사용될 수 있다.The present invention uses a pyruvoyl analogue and an antioxidant as an active ingredient to inhibit the activity of microglia and the cytokines causing an inflammatory reaction, thereby inhibiting brain tissue damage. To provide a significantly increased effect. Furthermore, the effect is sustained even after a long time, for example, 6 to 24 hours, elapses from the occurrence of damage as compared with the use of each alone. Therefore, the medicament of the present invention can be used in various cerebrovascular diseases such as cerebral ischemia, cerebral infarction, stroke, Huntington's disease, Lou Gehrig's disease or vascular dementia, and especially can be used more effectively in the prevention or treatment of stroke.

본 발명에서, 피루보일(pyruvoyl) 유사체는 In the present invention, pyruvoyl analogs

피루보일(pyruvoyl) 유사체가 Pyruvoyl analogs

에틸 피루베이트(피루보일옥시에탄); Ethyl pyruvate (pyruboyloxyethane);

프로필 피루베이트; Propyl pyruvate;

이소프로필 피루베이트; Isopropyl pyruvate;

n-부틸 피루베이트; n-butyl pyruvate;

sec-부틸 피루베이트; sec-butyl pyruvate;

이소부틸 피루베이트; Isobutyl pyruvate;

t-부틸 피루베이트; t-butyl pyruvate;

펜틸 피루베이트; Pentyl pyruvate;

헥실 피루베이트; Hexyl pyruvate;

헵틸 피루베이트; Heptyl pyruvate;

옥틸 피루베이트;Octyl pyruvate;

페닐 피루베이트;Phenyl pyruvate;

4-(4-트리플루오로메틸페닐옥시)페닐 피루베이트;4- (4-trifluoromethylphenyloxy) phenyl pyruvate;

(4-트리플루오로메틸)-2,3,5,6-테트라플루오로페닐 피루베이트;(4-trifluoromethyl) -2,3,5,6-tetrafluorophenyl pyruvate;

(4-트리플루오로메틸)페닐 피루베이트;(4-trifluoromethyl) phenyl pyruvate;

(4-트리플루오로메틸)벤질 피루베이트;(4-trifluoromethyl) benzyl pyruvate;

피루보일아미노에탄;Pyruboylaminoethane;

피루보일아미노메탄;Pyruboylaminomethane;

피루보일아미노프로판;Pyruboylaminopropane;

피루보일아미노부탄;Pyruboylaminobutane;

피루보일아미노펜탄;Pyruboylaminopentane;

피루보일아미노벤젠;Pyruboylaminobenzene;

피루보일아미노(4-트리플루오로메틸)벤젠;Pyruboylamino (4-trifluoromethyl) benzene;

피루보일아미노(4-트리플루오로메틸페닐)메탄;Pyruboylamino (4-trifluoromethylphenyl) methane;

피루보일아미노(4-트리플루오로메틸-2,3,5,6-테트라플루오로페닐)메탄;Pyruboylamino (4-trifluoromethyl-2,3,5,6-tetrafluorophenyl) methane;

피루보일아미노(4-트리플루오로메틸-2,3,5,6-테트라플루오로)벤젠;Pyruboylamino (4-trifluoromethyl-2,3,5,6-tetrafluoro) benzene;

피루보일아미노카보닐(4-트리플루오로메틸)벤젠;Pyruboylaminocarbonyl (4-trifluoromethyl) benzene;

피루보일아민다이에탄;Pyruboylamine diethan;

피루보일아민다이부탄;Pyruboylaminedibutane;

피루보일아민다이헥산;Pyruboylaminedihexane;

피루보일아민다이옥탄;Pyruboylaminedioctane;

피루보일(4-트리플루오로메틸-2-히드록시페닐카보닐)(에틸)아민;Pyruboyl (4-trifluoromethyl-2-hydroxyphenylcarbonyl) (ethyl) amine;

피루보일(4-트리플루오로메틸-2-히드록시페닐)(에틸)아민;Pyruboyl (4-trifluoromethyl-2-hydroxyphenyl) (ethyl) amine;

피루보일(4-트리플루오로메틸페닐)(에틸)아민;Pyruboyl (4-trifluoromethylphenyl) (ethyl) amine;

피루보일싸이오에탄; 및 Pyruboylthioethane; And

피루보일프로판;Pyruboylpropane;

으로 구성된 그룹으로부터 선택되어진다.It is selected from the group consisting of.

본 발명에서 약제학적으로 허용되는 염은 약제학적으로 허용되는 산 부가염을 포함할 수 있으며, 상기 염 화합물의 수화물을 비롯한 용매화물 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 약제학적으로 허용되는 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻어지는 것일 수 있다. 구체적인 예로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 들 수 있으며, 보다 특히 염산염이 예시될 수 있다.Pharmaceutically acceptable salts in the present invention may include pharmaceutically acceptable acid addition salts, solvates including hydrates of the salt compounds are also included in the scope of the present invention. Pharmaceutically acceptable acid addition salts include inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitrous acid or phosphorous acid and aliphatic mono and dicarboxylates, phenyl-substituted alkanoates, hydroxy al It may be one obtained from non-toxic organic acids such as canoates and alkanedioates, aromatic acids, aliphatic and aromatic sulfonic acids. Specific examples include sulfate, pyrosulfate, bisulfate, sulfite, bisulfite, nitrate, phosphate, monohydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, metaphosphate, pyrophosphate chloride, bromide, iodide, fluoride, acetate , Propionate, decanoate, caprylate, acrylate, formate, isobutyrate, caprate, heptanoate, propiolate, oxalate, malonate, succinate, suverate, sebacate, fumarate , Maleate, butyne-1,4-dioate, hexane-1,6-dioate, benzoate, chlorobenzoate, methylbenzoate, dinitro benzoate, hydroxybenzoate, methoxybenzoate, phthalate, Terephthalate, benzenesulfonate, toluenesulfonate, chlorobenzenesulfonate, xylenesulfo Yate, Phenyl Acetate, Phenylpropionate, Phenylbutyrate, Citrate, Lactate, β-hydroxybutyrate, Glycolate, Maleate, Tartrate, Methanesulfonate, Propanesulfonate, Naphthalene-1-sulfonate, Naphthalene -2-sulfonate or mandelate, and more particularly hydrochloride may be exemplified.

또한, 아세틸살리실산 유사체는 In addition, acetylsalicylic acid analogs

아세틸살리실산;Acetylsalicylic acid;

2-(2-히드록시-4-(트리플루오로메틸)벤조일옥시)-4-(트리플루오로메틸)벤조산; 및 2- (2-hydroxy-4- (trifluoromethyl) benzoyloxy) -4- (trifluoromethyl) benzoic acid; And

2-(2-(2-옥소프로파노일옥시)-4-(트리플루오로메틸)벤조일옥시)-4-(트리플루오로메틸)벤조산;2- (2- (2-oxopropanoyloxy) -4- (trifluoromethyl) benzoyloxy) -4- (trifluoromethyl) benzoic acid;

으로 구성된 그룹으로부터 선택되어진다.
It is selected from the group consisting of.

또한, 5-아미노살리실산 유사체는In addition, 5-aminosalicylic acid analogs

2-하이드록시-5-(2,3,5,6-테트라플루오로-4-(트리플루오로메틸)벤질아미노)벤조산;2-hydroxy-5- (2,3,5,6-tetrafluoro-4- (trifluoromethyl) benzylamino) benzoic acid;

2-하이드록시-5-(4-(트리플루오로메틸)페닐에틸아미노)벤조산;2-hydroxy-5- (4- (trifluoromethyl) phenylethylamino) benzoic acid;

5-(2-(4-클로로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산;5- (2- (4-chlorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid;

5-(2-(2,4-디클로로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산;5- (2- (2,4-dichlorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid;

2-하이드록시-5-(2-(2,4,5-트리클로로페녹시)에틸아미노)벤조산;2-hydroxy-5- (2- (2,4,5-trichlorophenoxy) ethylamino) benzoic acid;

2-하이드록시-5-(2-페닐설포닐에틸아미노)벤조산;2-hydroxy-5- (2-phenylsulfonylethylamino) benzoic acid;

2-하이드록시-5-(2-(4-요오도페녹시)에틸아미노)벤조산;2-hydroxy-5- (2- (4-iodophenoxy) ethylamino) benzoic acid;

5-(2-(4-브로모페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산;5- (2- (4-bromophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid;

2-하이드록시-5-(3-페녹시프로필아미노)벤조산;2-hydroxy-5- (3-phenoxypropylamino) benzoic acid;

5-(2-(2,6-디클로로-4-플루오로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산;5- (2- (2,6-dichloro-4-fluorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid;

5-(3-(4-플루오로페녹시)프로필아미노)-2-하이드록시벤조산;5- (3- (4-fluorophenoxy) propylamino) -2-hydroxybenzoic acid;

5-(2-(2,6-디클로로-4-플루오로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산;5- (2- (2,6-dichloro-4-fluorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid;

5-(2-(4-클로로-2-메틸페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산;5- (2- (4-chloro-2-methylphenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid;

2-하이드록시-5-(2-p-톨릴옥시에틸아미노)벤조산;2-hydroxy-5- (2-p-tolyloxyethylamino) benzoic acid;

2-하이드록시-5-(2-페녹시에틸아미노) 벤조산;2-hydroxy-5- (2-phenoxyethylamino) benzoic acid;

5-(2-(2,6-디플루오로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시 벤조산; 및5- (2- (2,6-difluorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxy benzoic acid; And

2-하이드록시-5-(2-(4-메톡시페녹시)에틸아미노)벤조산:2-Hydroxy-5- (2- (4-methoxyphenoxy) ethylamino) benzoic acid:

으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
It is preferably selected from the group consisting of.

또한, 플루옥세틴 유사체는 In addition, fluoxetine analogs

플루옥세틴;Fluoxetine;

3-(4-(트리플루오로메틸)페녹시)-N-메틸-3-페닐프로판-1-아민;3- (4- (trifluoromethyl) phenoxy) -N-methyl-3-phenylpropan-1-amine;

3-(4-(트리플루오로메틸)페녹시)-N,N-다이메틸-3-페닐프로판-1-아민;3- (4- (trifluoromethyl) phenoxy) -N, N-dimethyl-3-phenylpropan-1-amine;

N-(3-(4-(트리플루오로메틸)페녹시)-3-페닐프로필)-N-페닐벤젠아민; 및N- (3- (4- (trifluoromethyl) phenoxy) -3-phenylpropyl) -N-phenylbenzeneamine; And

N-(3-(4-(트리플루오로메틸)페녹시)-3-페닐프로필)-N-페닐벤젠아민;N- (3- (4- (trifluoromethyl) phenoxy) -3-phenylpropyl) -N-phenylbenzeneamine;

으로 구성된 그룹으로부터 선택되어진다.
It is selected from the group consisting of.

본 발명에서, 피루보일(pyruvoyl) 유사체와 항산화제는 단일 또는 별도의 단위 제형(unit dosage form) 내에 포함되어 있을 수 있으며, 동시 투여되거나 일정한 시간 간격을 두고 또는 시간 간격 없이 순차적으로 투여될 수 있다. 따라서 두 유효성분을 함께 또는 별도로 약제학적으로 허용되는 통상적인 담체와 함께 배합하여 투여 목적에 따라, 정제, 경질 또는 연질 캡슐제, 과립제, 츄잉정, 환제, 분말, 엘릭시르, 현탁제, 에멀젼, 용액, 시럽과 경구 투여용 제제 또는 에어로졸, 새세이, 멸균 주사용액 또는 멸균 분말 등과 같은 비경구 투여용 제제의 형태로 제형화할 수 있다. 경구 투여의 목적으로 본 발명의 유효성분을 정제, 캡슐제, 과립제, 츄잉정, 환제, 분말, 엘릭시르, 현탁제, 에멀젼, 용액, 시럽 등의 제제로 제형화하는 경우에는, 아라비아 고무, 옥수수 전분, 미세결정질 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 인산이칼슘 또는 락토오즈와 같은 부형제, 알긴산, 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 붕해제, 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제, 슈크로오즈 또는 사카린과 같은 감미제 및 페퍼민트, 메틸 살리실산염 또는 과일향과 같은 향미제가 포함될 수 있다. 단위 제형이 캡슐제인 경우에는 상기 성분 외에도 폴리에틸렌 글리콜 또는 지방유와 같은 액상 담체가 포함될 수도 있다. 또한, 비경구 투여를 위한 용액 또는 현탁액 형태의 주사제는 비경구적으로, 예를 들면 피하, 정맥내, 근육내 또는 복강내로 투여될 수 있다. 일반적으로, 주사가능한 용액 또는 현탁액은 물, 염수, 수성 덱스트로스 및 관련된 설탕 용액제, 비휘발성 오일, 에탄올, 글리세린, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜류 등의 약제학적으로 허용되는 액상 담체 중에 유효량의 유효성분을 균질하게 혼합시켜 제조할 수 있다. 이외에도 필요에 따라 항세균제, 킬레이트제, 완충제, 보존제와 같은 보조제를 포함시킬 수도 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체로는 약제학적으로 순수하고, 실질적으로 무독성이며, 유효성분의 작용을 저해하지 않는 임의의 모든 보조제를 사용할 수 있다.In the present invention, pyruvoyl analogs and antioxidants may be contained in a single or separate unit dosage form and may be administered simultaneously or sequentially at regular time intervals or without time intervals. have. Thus, the two active ingredients may be combined together or separately together with conventionally acceptable pharmaceutically acceptable carriers to give tablets, hard or soft capsules, granules, chewing tablets, pills, powders, elixirs, suspensions, emulsions, solutions, depending on the purpose of administration. It may be formulated in the form of a preparation for oral administration, or a preparation for parenteral administration such as aerosols, assays, sterile injectable solutions or sterile powders. When the active ingredient of the present invention is formulated into tablets, capsules, granules, chewing tablets, pills, powders, elixirs, suspensions, emulsions, solutions, syrups and the like for the purpose of oral administration, gum arabic, corn starch , Binders such as microcrystalline cellulose or gelatin, excipients such as dicalcium phosphate or lactose, disintegrants such as alginic acid, corn starch or potato starch, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose or saccharin and peppermint, Flavoring agents may be included, such as methyl salicylate or fruit flavor. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as polyethylene glycol or fatty oil may be included in addition to the above components. In addition, injections in the form of solutions or suspensions for parenteral administration can be administered parenterally, eg, subcutaneously, intravenously, intramuscularly or intraperitoneally. Generally, the injectable solution or suspension is an effective amount in a pharmaceutically acceptable liquid carrier such as water, saline, aqueous dextrose and related sugar solutions, nonvolatile oils, glycols such as ethanol, glycerin, polyethylene glycol, propylene glycol, and the like. It can be prepared by mixing the active ingredient homogeneously. In addition, if necessary, auxiliary agents such as antibacterial agents, chelating agents, buffers, and preservatives may be included. As the pharmaceutically acceptable carrier, any adjuvant may be used that is pharmaceutically pure, substantially non-toxic, and which does not inhibit the action of the active ingredient.

본 발명에서 피루보일(pyruvoyl) 유사체는 1~60 ㎎/㎏의 용량으로, 항산화제는 1~40 ㎎/㎏의 용량으로 투여되는 것이 바람직하지만, 이는 투여대상의 연령, 성별, 식이, 건강상태, 상태의 중증도, 투여방법, 투여시간, 약제혼합 등에 따라 적의 증감될 수 있다.
In the present invention, the pyruvoyl analog is preferably administered at a dose of 1 to 60 mg / kg, and the antioxidant is administered at a dose of 1 to 40 mg / kg. Depending on the condition, the severity of the condition, the method of administration, the time of administration, drug mixture, etc. may be increased or decreased.

본 발명에 따르면, 피루보일(pyruvoyl) 유사체와 다양한 항산화제를 병용투여함으로써 각각의 물질의 단독투여 시에 비해 현저히 증가된 미세아교세포의 활성, 및 염증반응을 일으키는 사이토카인의 활성 억제에 의한 뇌조직의 손상 억제 효과, 및 운동능력 및 신경학적 손상 개선 효과를 나타낸다. 더욱이, 항산화제의 경우 손상 발생 6 시간 이후 처치 시 그 효과가 현저히 떨어지고, 피루보일(pyruvoyl) 유사체의 경우에도 손상 발생 6 시간 이후부터 그 효과가 점차 떨어지는 경향을 나타냄에 비해, 병용투여에 의해 손상 발생 6 시간 이후에도 장시간 지속적으로 높은 신경보호 효과를 나타낼 수 있다.
According to the present invention, a combination of pyruvoyl analogues and various antioxidants are combined to significantly increase the activity of microglia compared with the administration of each substance alone, and to inhibit the activity of cytokines causing an inflammatory response. Inhibitory effects of brain tissues, and motor and neurological damage improvement effects. In addition, antioxidants tend to have a significant effect on treatment after 6 hours of injury, and in the case of pyruvoyl analogs, the effect tends to gradually decrease after 6 hours of injury. After 6 hours of injury, it can show long lasting high neuroprotective effect.

도 1a는 국소 허혈 동물모델에 중대뇌동맥 폐색(middle cerebral artery occlusion, 이하 'MCAO') 후 에틸피루베이트(ethyl pyruvate, 이하 'EP')를 투여하여 TTC 염색으로 뇌절편의 허혈을 관찰한 사진이고;
도 1b는 EP의 농도에 따른 뇌절편의 허혈을 나타낸 그래프이며;
도 1c는 EP의 투여시간에 따른 전체 허혈의 부피를 나타낸 그래프이고;
도 1d는 EP 투여 후 로타-로드 시험결과를 나타낸 그래프이며;
도 1e는 EP 투여 후 위치반사 및 앞다리 위치잡기 시험결과를 나타낸 그래프이고;
도 2a는 MCAO 후 EP 및 아세틸살리실산을 각각 단독투여 또는 병용투여하여 TTC 염색으로 뇌절편의 허혈을 관찰한 사진이며;
도 2b는 EP 및 아세틸살리실산의 농도에 따른 뇌절편의 허혈을 나타낸 그래프이고;
도 2c는 EP 및 아세틸살리실산의 투여시간에 따른 전체 허혈의 부피를 나타낸 그래프이며;
도 2d는 EP 및 아세틸살리실산 병용투여 후 로타-로드 시험결과를 나타낸 그래프이고;
도 2e는 EP 및 아세틸살리실산 병용투여 후 위치반사 및 앞다리 위치잡기 시험결과를 나타낸 그래프이며;
도 3a 및 3b는 MCAO 후 EP 및 염화 2-하이드록시-5-(2,3,5,6-테트라플루오로-4-(트리플루오로메틸)벤질아미노)벤조에이트의 투여시간에 따른 전체 허혈의 부피를 나타낸 그래프이고;
도 3c는 EP 및 염화 2-하이드록시-5-(2,3,5,6-테트라플루오로-4-(트리플루오로메틸)벤질아미노)벤조에이트 병용투여 후 위치반사 및 앞다리 위치잡기 시험결과를 나타낸 그래프이며;
도 4는 MCAO 후 EP 및 염화 2-하이드록시-5-(4-(트리플루오로메틸)페닐에틸아미노)벤조에이트를 병용투여하여 TTC 염색으로 뇌절편의 허혈을 관찰한 사진이고;
도 5a는 MCAO 후 EP 및 염화 5-(2-(4-클로로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산의 투여시간에 따른 전체 허혈의 부피를 나타낸 그래프이며;
도 5b는 EP 및 염화 5-(2-(4-클로로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산 병용투여 후 위치반사 및 앞다리 위치잡기 시험결과를 나타낸 그래프이고;
도 6a는 MCAO 후 EP 및 염화 5-(2-(2,4-디클로로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산의 투여시간에 따른 전체 허혈의 부피를 나타낸 그래프이며;
도 6b는 EP 및 염화 5-(2-(2,4-디클로로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산 병용투여 후 위치반사 및 앞다리 위치잡기 시험결과를 나타낸 그래프이고;
도 7a는 MCAO 후 EP 및 염화 2-하이드록시-5-(2-(2,4,5-트리클로로페녹시)에틸아미노)벤조산의 투여시간에 따른 전체 허혈의 부피를 나타낸 그래프이며;
도 7b는 EP 및 염화 2-하이드록시-5-(2-(2,4,5-트리클로로페녹시)에틸아미노)벤조산 병용투여 후 위치반사 및 앞다리 위치잡기 시험결과를 나타낸 그래프이고;
도 8a는 MCAO 후 EP 및 염화 2-하이드록시-5-(2-(4-메톡시페녹시)에틸아미노)벤조산의 투여시간에 따른 전체 허혈의 부피를 나타낸 그래프이며;
도 8b는 EP 및 염화 2-하이드록시-5-(2-(4-메톡시페녹시)에틸아미노)벤조산 병용투여 후 위치반사 및 앞다리 위치잡기 시험결과를 나타낸 그래프이고;
도 9a는 MCAO 후 염화플루옥세틴을 투여하여 TTC 염색으로 뇌절편의 허혈을 관찰한 사진 및 염화플루옥세틴의 농도에 따른 뇌절편의 허혈을 나타낸 그래프이며;
도 9b는 EP 및 염화플루옥세틴의 투여시간에 따른 전체 허혈의 부피를 나타낸 그래프이고;
도 9c는 EP 및 염화플루옥세틴 병용투여 후 위치반사 및 앞다리 위치잡기 시험결과를 나타낸 그래프이고;
도 10은 MCAO 후 피루보일아민다이에탄과 2-아세톡시-4-(트리플루오로메틸)벤조산(triflusal)을 병용투여하여 TTC 염색으로 뇌절편의 허혈을 관찰한 사진이며;
도 11은 MCAO 후 피루보일아민다이에탄과 2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조산(HTB)을 병용투여하여 TTC 염색으로 뇌절편의 허혈을 관찰한 사진이며;
도 12는 MCAO 후 피루보일아미노에탄과 2-아세톡시-4-(트리플루오로메틸)벤조산(triflusal)을 병용투여하여 TTC 염색으로 뇌절편의 허혈을 관찰한 사진이며;
도 13은 MCAO 후 피루보일아미노에탄과 2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조산(HTB)을 병용투여하여 TTC 염색으로 뇌절편의 허혈을 관찰한 사진이다.Figure 1a is a photograph of the ischemia of the cerebral sections by TTC staining by administering ethyl pyruvate (EP) after middle cerebral artery occlusion (MCAO) in the ischemic animal model. ;
1B is a graph showing ischemia of brain slices according to the concentration of EP;
1C is a graph showing the volume of total ischemia over time of administration of EP;
1D is a graph showing the rota-rod test results after EP administration;
Figure 1e is a graph showing the results of position reflection and forelimb positioning test after EP administration;
Figure 2a is a photograph of the ischemia of the brain slices by TTC staining by or alone administration of EP and acetylsalicylic acid after MCAO, respectively;
2B is a graph showing ischemia of brain slices according to the concentrations of EP and acetylsalicylic acid;
Figure 2c is a graph showing the volume of total ischemia with the administration time of EP and acetylsalicylic acid;
Figure 2d is a graph showing the results of the rota-rod test after co-administration of EP and acetylsalicylic acid;
Figure 2e is a graph showing the results of position reflection and forelimb positioning test after co-administration of EP and acetylsalicylic acid;
3A and 3B show total ischemia according to the time of administration of EP and MC-hydroxy 2-hydroxy-5- (2,3,5,6-tetrafluoro-4- (trifluoromethyl) benzylamino) benzoate after MCAO A graph showing the volume of;
Figure 3c shows the results of position reflection and forelimb positioning after co-administration of EP and 2-hydroxy-5- (2,3,5,6-tetrafluoro-4- (trifluoromethyl) benzylamino) benzoate Is a graph showing;
Fig. 4 is a photograph of ischemia of brain sections observed by TTC staining by co-administration of EP and 2-hydroxy-5- (4- (trifluoromethyl) phenylethylamino) benzoate after MCAO;
5A is a graph showing the volume of total ischemia over the administration time of EP and 5- (2- (4-chlorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid after MCAO;
5B is a graph showing the results of positional reflection and forelimb positioning after co-administration of EP and 5- (2- (4-chlorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid;
6A is a graph showing the volume of total ischemia with administration time of EP and 5- (2- (2,4-dichlorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid after MCAO;
6B is a graph showing the results of positional reflection and forelimb positioning after co-administration of EP and 5- (2- (2,4-dichlorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid;
7A is a graph showing the volume of total ischemia over the administration time of EP and 2-hydroxy-5- (2- (2,4,5-trichlorophenoxy) ethylamino) benzoic acid after MCAO;
7B is a graph showing the results of positional reflection and forelimb positioning after co-administration of EP and 2-hydroxy-5- (2- (2,4,5-trichlorophenoxy) ethylamino) benzoic acid;
8A is a graph showing the volume of total ischemia with administration time of EP and 2-hydroxy-5- (2- (4-methoxyphenoxy) ethylamino) benzoic acid after MCAO;
8B is a graph showing the results of positional reflection and forelimb positioning after co-administration of EP and 2-hydroxy-5- (2- (4-methoxyphenoxy) ethylamino) benzoic acid;
Figure 9a is a graph showing the ischemia of brain slices by TTC staining after administration of fluoxetine chloride after MCAO and the brain ischemia according to the concentration of fluoxetine chloride;
Figure 9b is a graph showing the volume of total ischemia with the administration time of EP and fluoxetine chloride;
Figure 9c is a graph showing the results of position reflection and forelimb positioning test after co-administration of EP and fluoxetine chloride;
FIG. 10 is a photograph showing ischemia of brain sections by TTC staining by combining pyruboylaminediene and 2-acetoxy-4- (trifluoromethyl) benzoic acid (triflusal) after MCAO;
FIG. 11 is a photograph of ischemia of brain sections with TTC staining by co-administering pyruboylaminediene and 2-hydroxy-4-trifluoromethylbenzoic acid (HTB) after MCAO;
FIG. 12 is a photograph of ischemia of brain sections with TTC staining by combining pyruboylaminoethane and 2-acetoxy-4- (trifluoromethyl) benzoic acid (triflusal) after MCAO;
FIG. 13 is a photograph of ischemia of brain sections by TTC staining by co-administering pyruboylaminoethane and 2-hydroxy-4-trifluoromethylbenzoic acid (HTB) after MCAO.

이하 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 식으로든지 제한하고자 하는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples, which are intended to help the understanding of the present invention and are not intended to limit the scope of the present invention in any way.

제조예1Preparation Example 1 : : 피루보일아미노에탄의Of pyruboylaminoethane 제조 Produce

Figure 112011005457647-pat00009
Figure 112011005457647-pat00009

2 M 농도의 에틸아민 (14.1 mL, 28.2 mmol)을 다이클로로메탄 (40 mL)을 사용하여 녹였다. 용액에 트리에틸아민 (4.0 mL, 28.2 mmol)을 넣고 5분간 교반시킨 뒤 반응용액에 피루보일 클로라이드 (3.0 g, 28.2 mmol)를 적하하고 상온에서 교반하였다. 20 분 후 물을 넣어 반응 종료시킨 후, 1N HCl 수용액을 이용하여 pH 7이 되도록 적정하였다. 물층을 다이클로로메탄으로 3회 추출한 후, 유기층을 증류수와 소금물로 3회 씻어주었다. 무수황산나트륨을 이용하여 유기층을 건조 한 후 감압증류하여 다이클로로메탄을 제거한 후 분리정제하여 피루보일아미노에탄 (620 mg, 19%)를 제조하였다.Ethylamine (14.1 mL, 28.2 mmol) at 2 M concentration was dissolved using dichloromethane (40 mL). Triethylamine (4.0 mL, 28.2 mmol) was added to the solution, stirred for 5 minutes, and pyruboyl chloride (3.0 g, 28.2 mmol) was added dropwise to the reaction solution, followed by stirring at room temperature. After 20 minutes, water was added to terminate the reaction, and the mixture was titrated to pH 7 using 1 N HCl aqueous solution. The water layer was extracted three times with dichloromethane, and the organic layer was washed three times with distilled water and brine. The organic layer was dried using anhydrous sodium sulfate, distilled under reduced pressure to remove dichloromethane, and purified by separation to prepare pyruboylaminoethane (620 mg, 19%).

투명오일; 1H NMR (CDCl3) δ 3.34 (q, 2H), 2.47 (s, 3H), 1.26 (t, 3H)
Transparent oil; 1 H NMR (CDCl 3 ) δ 3.34 (q, 2H), 2.47 (s, 3H), 1.26 (t, 3H)

제조예2Preparation Example 2 : : 피루보일아민다이에탄의Pyruboylaminediene 제조 Produce

Figure 112011005457647-pat00010
Figure 112011005457647-pat00010

다이에탄아민 (2.9 mL, 28.2 mmol)을 다이클로로메탄 (40 mL)을 사용하여 녹였다. 용액에 트리에틸아민 (4.0 mL, 28.2 mmol)을 넣고 5 분간 교반시킨 뒤 반응용액에 피루보일 클로라이드 (3.0 g, 28.2 mmol)를 적하하고 상온에서 교반하였다. 20 분 후 물을 넣어 반응 종료시킨 후, 1N HCl수용액을 이용하여 pH 7이 되도록 적정하였다. 물층을 다이클로로메탄으로 3회 추출한 후, 유기층을 증류수와 소금물로 3회 씻어주었다. 무수황산나트륨을 이용하여 유기층을 건조 한 후 감압증류하여 다이클로로메탄을 제거한 후 분리정제하여 피루보일아민다이에탄 (650 mg, 16%)를 제조하였다. Diethanamine (2.9 mL, 28.2 mmol) was dissolved using dichloromethane (40 mL). Triethylamine (4.0 mL, 28.2 mmol) was added to the solution, stirred for 5 minutes, and pyruboyl chloride (3.0 g, 28.2 mmol) was added dropwise to the reaction solution, followed by stirring at room temperature. After 20 minutes, water was added to terminate the reaction, and the mixture was titrated to pH 7 using 1N HCl aqueous solution. The water layer was extracted three times with dichloromethane, and the organic layer was washed three times with distilled water and brine. The organic layer was dried using anhydrous sodium sulfate, distilled under reduced pressure to remove dichloromethane, and purified by separation to prepare pyruboylamine diethan (650 mg, 16%).

투명오일; 1H NMR (CDCl3) δ 3.44 (q, 2H), 3.32 (q, 2H), 2.42 (s, 3H), 1.21 (m, 6H)
Transparent oil; 1 H NMR (CDCl 3 ) δ 3.44 (q, 2H), 3.32 (q, 2H), 2.42 (s, 3H), 1.21 (m, 6H)

제조예3Preparation Example 3 : : 피루보일싸이오에탄의Of pyruboylthioethane 제조 Produce

Figure 112011005457647-pat00011
Figure 112011005457647-pat00011

에탄싸이올 (2.33 g, 37.6 mmol)을 다이클로로메탄 (40 mL)을 사용하여 녹이고 반응용액을 0 ˚C로 냉각한 후 10 분간 교반하였다. 파이루보일 클로라이드 (2.01 g, 18.8 mmol)를 적하하고 10 분간 교반하였다. 상온으로 천천히 승온한 후 무수황산나트륨을 이용하여 수분을 제거하고 감압여과, 감압증류하였다. 분리정제하여 피루보일싸이오에탄 (1.11 g, 45%)를 얻었다.Ethanol (2.33 g, 37.6 mmol) was dissolved in dichloromethane (40 mL), the reaction solution was cooled to 0 ° C and stirred for 10 minutes. Pyruboyl chloride (2.01 g, 18.8 mmol) was added dropwise and stirred for 10 minutes. After slowly warming to room temperature, water was removed using anhydrous sodium sulfate, filtered under reduced pressure, and distilled under reduced pressure. Separation and purification gave pyruboylthioethane (1.11 g, 45%).

투명오일; 1H NMR (CDCl3) δ 2.94 (q, 2H), 2.42 (s, 3H), 1.30 (t, 3H)
Transparent oil; 1 H NMR (CDCl 3 ) δ 2.94 (q, 2H), 2.42 (s, 3H), 1.30 (t, 3H)

비교예Comparative example : : 에틸피루베이트(EP)의Of ethyl pyruvate (EP) 뇌경색 억제 효과 평가 Evaluation of Cerebral Infarction Inhibitory Effect

뇌졸중 동물모델을 사용하여 EP의 신경보호 효과를 조사하기 위하여, 론가(Longa) 방법(1989)을 따른 래트 국소 허혈 모델을 사용하였다. 나일론 삽입사(suture)를 사용하여 중대뇌동맥(middle cerebral artery, MCA)을 1 시간 동안 결찰하여 뇌졸중(middle cerebral artery occlusion, MCAO) 동물모델을 제작하였다. 뇌허혈이 일어난 뇌에서 EP가 치료효과가 있는지 알아보기 위하여, 래트를 재관류 후에 목을 자르고 전체 뇌는 금속성 뇌 주형을 사용하여 2 ㎜ 절편의 관상으로 잘랐다. 절편은 즉시 1% TTC(2,3,5-tryphenyl tetrazolium chloride)에 담가 염색하였다. 37 ℃에서 15 분 동안 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 용액에 보관된 각 섹션의 뇌허혈 부위들은 퀀티티 원(Quantity One) 프로그램 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 측정, 분석하였다. 1 시간 MCAO 모델을 적용하고 1, 5, 10 및 20 ㎎/㎏ 농도의 EP를 정맥 투여하였다.In order to investigate the neuroprotective effect of EP using a stroke animal model, a rat focal ischemia model according to the Longa method (1989) was used. A nylon cerebral artery (MCA) was ligated for 1 hour using a nylon suture to prepare an animal model of a middle cerebral artery occlusion (MCAO). To determine whether EP was therapeutic in brains with cerebral ischemia, rats were cut off after reperfusion and the whole brain was cut into tubular sections of 2 mm using a metallic brain template. Sections were immediately stained in 1% TTC (2,3,5-tryphenyl tetrazolium chloride). Cerebral ischemic sites in each section stored in 4% paraformaldehyde solution at 37 ° C. for 15 minutes were measured and analyzed using the Quantity One program (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). . A 1 hour MCAO model was applied and EP was administered intravenously at concentrations of 1, 5, 10 and 20 mg / kg.

(1) 시간별 농도별 뇌절편에서 허혈 부위 측정 (1) Measurement of ischemic sites in brain sections by concentrations over time

5 ㎎/㎏의 EP를 MCAO 모델에 재관류 6 시간 후 투여한 경우 뇌경색을 확인한 결과, 백색을 띠는 경색부위가 대조구 동물에 비해 감소하였음을 알 수 있다(도 1a). 1 시간 MCAO 모델에 EP를 1, 5, 10 및 20 ㎎/㎏ 농도로 재관류 6 시간 후에 정맥 투여한 경우 1 ㎎/㎏에서는 허혈 부위의 부피에 변화가 없었으며 5, 10 및 20 ㎎/㎏에서는 허혈 부위의 부피가 각각 대조구 동물의 33.6%, 41.7%, 및 61.6%로 감소되었다(도 1b). 신경보호 효과의 효과적인 시간범위를 알아보기 위하여, EP를 5 ㎎/㎏ 농도로 MCAO 모델에 재관류 30 분 전 및 재관류 30 분, 6, 9, 12 시간 후에 정맥 투여한 경우 허혈 부위의 부피가 각각 9.0%와 17.5%, 34.0%, 58.7% 및 58.0%으로 감소되었다(도 1c). 이는 EP를 MCAO 모델에 투여하면 뇌허혈이 일어난 뇌에서 상당한 신경보호 효과를 나타내는 것을 보여주는 것이다. When 5 mg / kg of EP was administered after 6 hours of reperfusion in the MCAO model, cerebral infarction was confirmed. As a result, it was found that the white infarct region was reduced compared to the control animals (FIG. 1A). In the 1 hour MCAO model, when the IV was administered intravenously after 6 hours of reperfusion at 1, 5, 10 and 20 mg / kg concentrations, there was no change in the volume of the ischemic site at 1 mg / kg and at 5, 10 and 20 mg / kg. The volume of the ischemic site was reduced to 33.6%, 41.7%, and 61.6% of control animals, respectively (FIG. 1B). To determine the effective time range of the neuroprotective effect, the volume of the ischemic site was 9.0 when the EP was administered intravenously in the MCAO model 30 minutes prior to reperfusion 30 minutes, 6, 9 and 12 hours after reperfusion at 9.0 mg / kg. % And 17.5%, 34.0%, 58.7% and 58.0% (FIG. 1C). This shows that administration of EP to the MCAO model has a significant neuroprotective effect in the brain where cerebral ischemia has occurred.

(2) 개체 수준의 뇌허혈 개선 확인 (2) Confirmation of improvement of individual cerebral ischemia

(2-1) 로타-로드(Rota-rod) 테스트(2-1) Rota-rod test

뇌허혈로 인한 손상 후의 운동기능 퇴화와 인지 결함은 이전에 보고된 바 있는데(Yamamoto M. et al., Brain Res. 452: 323-328, 1988; Roger D.C. et al., Stroke 28: 2060-2065, 1997), MCAO로 손상을 입은 쥐의 운동기능을 로타-로드 테스트를 이용하여 래트가 로타-로드에 머무른 시간으로 측정하였다.Motor function degeneration and cognitive deficits after injury due to cerebral ischemia have been previously reported (Yamamoto M. et al., Brain Res. 452: 323-328, 1988; Roger DC et al., Stroke 28: 2060-2065, 1997), the motor function of rats damaged by MCAO was measured by the time the rat stayed on the rota-rod using the Rota-rod test.

1 시간의 MCAO로부터 24 시간 경과 후까지 각각의 래트가 5 rpm 속도의 로타-로드에 남아있는 시간을 측정하였다. 뒤이어 각각의 래트가 10 rpm과 15 rpm의 속도로 작동되는 로타-로드에 남아있는 시간을 1 시간 간격으로 측정하였다. 그 결과, EP는 MCAO 후의 운동기능 손상을 개선하였다(도 1d). 즉, MCAO/재관류 24 시간 후 정상 그룹과 샴 수술한 그룹 간에 5 rpm 속도의 로타-로드에서 나타나는 행동에는 아무런 차이가 없었다. 1 시간 MCAO 후 재관류시킨 뇌허혈 쥐의 로타-로드 위에서의 행동은 현저히 퇴화되었는데 시간에 따라 그들이 로타-로드에서 보내는 시간이 짧아졌다. 5 ㎎/㎏의 EP를 MCAO/재관류 6 시간 후에 정맥투여하면, 래트가 꽤 긴 시간을 로타-로드에서 보내므로 운동 능력이 상당부분 회복되는 것으로 나타났다. 이 점수는 반복실험을 통해 얻어졌으며, 1 시간 간격으로 10 rpm과 15 rpm으로 회전 속도를 증가시킨 상태에서 반복실험을 수행하여 확인하였다.The time remaining for each rat in the rota-rod at 5 rpm speed was measured from 24 hours after 1 hour of MCAO. The time remaining for each rat in the rota-rods running at 10 rpm and 15 rpm was then measured at 1 hour intervals. As a result, EP improved motor impairment after MCAO (FIG. 1D). In other words, there was no difference in behavior at 5 rpm of rota-rod between normal and Siamese-operated groups after 24 hours of MCAO / reperfusion. The behavior on the rota-rod of reperfusion cerebral ischemic rats after 1 hour MCAO was markedly deteriorated, with the time spent on the rota-rod shortened. Intravenous administration of 5 mg / kg of EP after 6 hours of MCAO / reperfusion showed that the rats spent quite a long time in the rota-rod and recovered a significant amount of motor performance. This score was obtained through repeated experiments, and was confirmed by performing the repeated experiments with the rotational speeds increased at 10 rpm and 15 rpm at 1 hour intervals.

(2-2) 신경학적 결손 평가(2-2) neurological deficit assessment

신경학적 결손 평가는 MCAO/재관류 이틀 후에 수행되었다. 변형된 체위반사와 헤미파레시스(hemiparesis) 테스트(Bederson J.B. et al., Stroke 17; 472-476)와 앞다리 위치잡기 테스트를 포함한 5종류의 운동 테스트를 운동기능 평가에 사용하였다. 체위반사를 4 점수체계(Bederson J.B. et al., Stroke 17; 472-476)로 채점하였다(0: 정상기능, 1: 몸통 굽히기와 반대쪽 꼬리로 동물을 들어올리기, 2: 반대쪽 면으로 회전, 쉴 때는 정상자세, 3: 쉴 때 반대쪽으로 눕기, 4: 자발적인 운동성 없음). 앞다리 위치잡기는 이전에 기술된 방법(De Ryck M. et al., Stroke 20; 1388-1390)에 따라 채점하였다(0: 즉각적이고 완벽한 위치잡기, 1: 지체되거나 불완전한 위치잡기, 2: 위치잡지 않음). 체위 반사와 앞다리 위치잡기에 대한 점수를 각각의 동물에 대해 합산하였다. 이를 포함하여 총 18점의 운동 능력 손상 점수를 측정하였다. 그 결과 EP는 MCAO/재관류에 따르는 신경학적 결함을 억제하는 효과를 나타내었다(도 1e).
Neurological deficit assessment was performed two days after MCAO / reperfusion. Five types of exercise tests were used to assess motor function, including modified positional reflection and hemiparesis test (Bederson JB et al., Stroke 17; 472-476) and forelimb positioning tests. Postural reflexes were scored using a four-point system (Bederson JB et al., Stroke 17; 472-476) (0: normal function, 1: bending the body and lifting the animal with the opposite tail, 2: rotating on the opposite side, resting) Normal posture, 3: lying on the opposite side when resting, 4: no spontaneous motility). Forelimb positioning was scored according to the previously described method (De Ryck M. et al., Stroke 20; 1388-1390) (0: immediate and perfect positioning, 1: delayed or incomplete positioning, 2: positioning) Not). Scores for position reflex and forelimb positioning were summed for each animal. Including this, a total of 18 exercise impairment scores were measured. As a result, EP showed the effect of inhibiting neurological defects following MCAO / reperfusion (FIG. 1E).

실시예 1: 에틸피루베이트(EP)와 아세틸살리실산 병용투여 시 뇌경색 억제효과 평가 Example 1 Evaluation of Inhibitory Effect of Cerebral Infarction on Combination of Ethylpyruvate (EP) and Acetylsalicylic Acid

(1) 시간별 농도별 뇌절편에서 허혈 부위 측정 (1) Measurement of ischemic sites in brain sections by concentrations over time

EP와 아세틸살리실산 병용요법의 효과를 조사하기 위하여, EP와 아세틸살리실산을 각각 5 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏과 20 ㎎/㎏의 농도로 동시에 투여하였다. EP 5 ㎎/㎏과 아세틸살리실산 5 ㎎/㎏을 병용투여한 경우, 각각을 10 ㎎/㎏의 농도로 투여한 경우 보다 경색 억제 효과가 우수한 것으로 나타났고, 이 때 5 ㎎/㎏의 농도로 투여한 경우 가장 우수한 경색 억제 효과를 보였으며, 10 ㎎/㎏으로 농도를 더 높였을 때 더 이상 효과가 증진되지 않았다. 이는 EP와 아세틸살리실산의 효능이 상호 보완적임을 시사한다(도 2a 및 2b).To investigate the effect of the combination of EP and acetylsalicylic acid, EP and acetylsalicylic acid were simultaneously administered at concentrations of 5 mg / kg, 10 mg / kg and 20 mg / kg, respectively. When 5 mg / kg of acetylsalicylic acid and 5 mg / kg of acetylsalicylic acid were used in combination, the effect of inhibiting infarction was better than that of 10 mg / kg, respectively, at a concentration of 5 mg / kg. In one case, it showed the best infarction effect, and the effect was no longer enhanced when the concentration was increased to 10 mg / kg. This suggests that the efficacy of EP and acetylsalicylic acid is complementary (FIGS. 2A and 2B).

EP와 아세틸살리실산의 병용요법을 통한 효과의 증진이 지속되는 시간대 범위(window)를 조사하기 위하여, 시간대별 동시투여의 효과를 조사하였다. 1 시간 MCAO 30 분전, 및 30 분, 6 시간, 9 시간 및 12 시간 후에 EP(5 ㎎/㎏)와 아세틸살리실산(5 ㎎/㎏)의 동시투여를 시행하고 재관류로부터 24 시간이 경과한 후에 TTC 염색을 통해 뇌경색 부피를 측정하였다. 30 분전 처치의 경우 EP에 의한 효과가 매우 우수하여 추가 효과를 측정하기 어려울 것으로 추정되나, 30 분후 처치에서 효과가 유의하게 증진되는 것으로 관찰되었다. 6 시간 후 처치의 효과는 상기와 동일하게 증진 효과를 보이며, 이와 같은 증진 효과는 재관류 9 시간 후 처치 시에도 관찰되었다(도 2c). To investigate the window of time in which the enhancement of the effect through the combination of EP and acetylsalicylic acid persists, the effect of time-phased co-administration was investigated. 30 minutes before 1 hour MCAO, and after 30 minutes, 6 hours, 9 hours and 12 hours, co-administration of EP (5 mg / kg) and acetylsalicylic acid (5 mg / kg) was performed and after 24 hours from reperfusion. Cerebral infarct volume was measured via TTC staining. It was estimated that the effect by EP was very good in the case of 30 minutes before treatment, so that it was difficult to measure additional effects, but it was observed that the effect was significantly enhanced after 30 minutes of treatment. The effect of treatment after 6 hours showed the same enhancement effect as above, and this enhancement effect was also observed upon treatment after 9 hours of reperfusion (FIG. 2C).

(2) 개체 수준의 뇌허혈 개선 확인 (2) Confirmation of improvement of individual cerebral ischemia

(2-1) 로타-로드 테스트(2-1) Rota-Rod Test

상기 비교예에 기재된 방법에 따라 로타-로드 테스트를 실시하였다. 5 ㎎/㎏의 아세틸살리실산을 MCAO/재관류 6 시간 후에 정맥 투여하면, 운동 능력이 정상의 30% 정도로 회복되고, 5 ㎎/㎏의 EP를 MCAO/재관류 6 시간 후에 정맥 투여하면, 운동 능력이 정상의 70% 정도로 회복되었다. 이에 비해, EP와 아세틸살리실산을 병용투여하면, 운동 능력이 80% 정도까지 회복되었다(도 2d).The rota-rod test was carried out according to the method described in the comparative example. When intravenously administered 5 mg / kg of acetylsalicylic acid after 6 hours of MCAO / reperfusion, the motor capacity was restored to about 30% of normal, and when intravenously administered 5 mg / kg of EP after 6 hours of MCAO / reperfusion, the exercise capacity was normal. 70% of the time was recovered. In comparison, when EP and acetylsalicylic acid were administered in combination, motor performance was restored to about 80% (FIG. 2D).

(2-2) 신경학적 결손 평가(2-2) neurological deficit assessment

상기 비교예에 기재된 방법에 따라 신경학적 결손을 평가하였다. 신경증적 손상에 있어서, 6 시간 후에 아세틸살리실산만을 투여한 경우에는 약한 효과가 보이나, EP를 투여한 경우에는 신경증적 손상이 60% 정도 호전되는 결과를 보였다. EP와 아세틸살리실산을 병용투여하면, 각각을 투여한 경우보다 운동 능력 손상이 72% 정도까지 현저히 회복되었다(도 2e). 이로부터 EP와 아세틸살리실산의 병용투여는 MCAO/재관류에 따르는 신경학적 결함 억제에 현저히 증가된 효과를 나타냄을 알 수 있다. 즉, 뇌경색 억제 효과와 함께 기능적 회복이 수반되며, 기능적 회복도 상호 보완적임을 시사한다.
Neurological deficits were evaluated according to the method described in the comparative example. In neurotic injuries, the administration of acetylsalicylic acid only showed a weak effect after 6 hours, but the neurotic injuries improved by 60%. When combined with EP and acetylsalicylic acid, the impairment in motor performance was remarkably recovered by 72% compared with the administration of each (FIG. 2E). It can be seen from this that co-administration of EP and acetylsalicylic acid showed a markedly increased effect on the inhibition of neurological defects following MCAO / reperfusion. In other words, functional recovery is accompanied with the effect of suppressing cerebral infarction, and the functional recovery is complementary.

실시예 2: 에틸피루베이트(EP)와 염화 2- 하이드록시 -5-(2,3,5,6- 테트라플루오로-4-(트리플루오로메틸)벤질아미노)벤조에이트 병용투여 시 뇌경색 억제효과 평가 Example 2 Inhibition of Cerebral Infarction with Ethylpyruvate (EP) and 2 -Hydroxy -5- (2,3,5,6 - tetrafluoro - 4- (trifluoromethyl) benzylamino) benzoate Effect evaluation

(1) 시간별 뇌절편에서 허혈 부위 측정 (1) Measurement of ischemic sites in brain sections over time

EP와 염화 2-하이드록시-5-(2,3,5,6-테트라플루오로-4-(트리플루오로메틸)벤질아미노)벤조에이트 병용요법의 효과를 조사하기 위하여, 각 약제를 5 ㎎/㎏의 용량으로 재관류 5 분, 4 시간, 6 시간 및 12 시간 후에 동시에 정맥 투여하였다. 4 시간에 투여한 경우, EP와 염화 2-하이드록시-5-(2,3,5,6-테트라플루오로-4-(트리플루오로메틸)벤질아미노)벤조에이트는 뇌경색을 각각 48% 및 30% 억제하였으며, 두 약제를 병용투여한 경우, 뇌경색을 76%까지 억제하여 매우 높은 보완 효과를 나타내었다(도 3a). 이러한 보완 효과는 6 시간 후까지도 지속되었다(도 3b).In order to investigate the effect of the combination of EP and 2-hydroxy-5- (2,3,5,6-tetrafluoro-4- (trifluoromethyl) benzylamino) benzoate chloride, 5 mg of each drug was used. The dose per kg was administered intravenously simultaneously after 5 minutes, 4 hours, 6 hours and 12 hours of reperfusion. When administered at 4 hours, EP and 2-hydroxy-5- (2,3,5,6-tetrafluoro-4- (trifluoromethyl) benzylamino) benzoate had 48% cerebral infarction and It was inhibited by 30%, and when the two drugs were administered in combination, it inhibited cerebral infarction by 76% and showed a very high complementary effect (FIG. 3A). This complementary effect lasted even after 6 hours (FIG. 3B).

(2) 개체 수준의 뇌허혈 개선 확인 (2) Confirmation of improvement of individual cerebral ischemia

상기 비교예에 기재된 방법에 따라 신경학적 결손을 평가하였다. 신경증적 손상에 대해서는, 이른 시간에 투여한 경우일수록 효과적인 회복을 보였다. 4 시간 후에 염화 2-하이드록시-5-(2,3,5,6-테트라플루오로-4-(트리플루오로메틸)벤질아미노)벤조에이트를 투여한 경우에는 약간의 신경증적 손상 회복 효과를 보였으나, EP를 투여한 경우에는 신경증적 손상이 40% 회복되는 결과를 보였다. 4 시간에 EP와 2-하이드록시-5-(2,3,5,6-테트라플루오로-4-(트리플루오로메틸)벤질아미노)벤조에이트를 병용투여한 경우에는 신경증적 손상이 50% 정도 회복되어 EP보다 10% 효과가 증진되는 것을 확인하였다(도 3c). 즉, EP나 2-하이드록시-5-(2,3,5,6-테트라플루오로-4-(트리플루오로메틸)벤질아미노)벤조에이트의 단독투여 시보다 EP와 2-하이드록시-5-(2,3,5,6-테트라플루오로-4-(트리플루오로메틸)벤질아미노)벤조에이트를 병용투여한 경우 현저한 뇌경색 부피의 감소와 운동 기능 증진을 보여 상기 두 약제의 효능이 상호 보완적임을 보여준다.
Neurological deficits were evaluated according to the method described in the comparative example. For neurotic injuries, the earlier recovery, the more effective the recovery. After 4 hours, 2-hydroxy-5- (2,3,5,6-tetrafluoro-4- (trifluoromethyl) benzylamino) benzoate was given a slight neurological damage recovery effect. However, when EP was administered, neurotic damage was recovered by 40%. Neurotic damage is 50% when EP and 2-hydroxy-5- (2,3,5,6-tetrafluoro-4- (trifluoromethyl) benzylamino) benzoate are combined at 4 hours It was confirmed that the recovery was improved to 10% effect than the EP (Fig. 3c). That is, EP and 2-hydroxy-5 than single administration of EP or 2-hydroxy-5- (2,3,5,6-tetrafluoro-4- (trifluoromethyl) benzylamino) benzoate Combined administration of-(2,3,5,6-tetrafluoro-4- (trifluoromethyl) benzylamino) benzoate resulted in a significant decrease in cerebral infarct volume and enhanced motor function. Show complementary

실시예 3: 에틸피루베이트(EP)와 염화 2- 하이드록시 -5-(4-( 트리플루오로메틸)페닐에틸아미노)벤조에이트 병용투여 시 뇌경색 억제효과 평가 Example 3 Evaluation of Cerebral Infarction Inhibition Effect When Ethyl Pyruvate (EP) and 2 -Hydroxy -5- (4- ( trifluoromethyl ) phenylethylamino) benzoate

(1) 시간별 뇌절편에서 허혈 부위 측정 (1) Measurement of ischemic sites in brain sections over time

EP와 염화 2-하이드록시-5-(4-(트리플루오로메틸)페닐에틸아미노)벤조에이트의 병용요법의 효과를 조사하기 위하여, 각 약제를 5 ㎎/㎏의 용량으로 재관류 30 분, 6 시간 및 12 시간 후에 정맥 투여하였다. 6 시간 후에 EP와 염화 2-하이드록시-5-(4-(트리플루오로메틸)페닐에틸아미노)벤조에이트를 병용투여한 경우, 각각을 5 ㎎/㎏의 농도로 투여한 경우보다 경색 억제 효과가 우수한 것으로 나타났다. 즉, EP와 염화 2-하이드록시-5-(4-(트리플루오로메틸)페닐에틸아미노)벤조에이트는 각각 66% 및 58%로 뇌경색 크기를 억제한 것에 비해, 두 약제를 병용투여한 경우, 74% 정도로 뇌경색 크기를 억제하여 EP와 염화 2-하이드록시-5-(4-(트리플루오로메틸)페닐에틸아미노)벤조에이트의 효능이 상호 보완적임을 시사하고 있다(도 4).
To investigate the effect of the combination therapy of EP and 2-hydroxy-5- (4- (trifluoromethyl) phenylethylamino) benzoate, each drug was reperfused at a dose of 5 mg / kg for 30 minutes, 6 IV and 12 hours later. In the case of co-administration of EP and 2-hydroxy-5- (4- (trifluoromethyl) phenylethylamino) benzoate after 6 hours, the effect of inhibiting infarction was higher than that of 5 mg / kg each. Was found to be excellent. In other words, EP and 2-hydroxy-5- (4- (trifluoromethyl) phenylethylamino) benzoate were 66% and 58%, respectively, in contrast to the inhibition of cerebral infarct size. , 74% inhibition of cerebral infarct size suggests that the efficacy of EP and 2-hydroxy-5- (4- (trifluoromethyl) phenylethylamino) benzoate is complementary (FIG. 4).

실시예 4: 에틸피루베이트(EP)와 염화 5-(2-(4- 클로로페녹시 ) 에틸아미노 )-2-하이드록시벤조산 병용투여 시 뇌경색 억제효과 평가 Example 4 Evaluation of Cerebral Infarction Inhibition Effect When Ethyl Pyruvate (EP) and 5- (2- (4 -Chlorophenoxy ) ethylamino ) -2 -hydroxybenzoic Acid in Combination Administration

(1) 시간별 뇌절편에서 허혈 부위 측정 (1) Measurement of ischemic sites in brain sections over time

EP와 염화 5-(2-(4-클로로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산 병용요법의 효과를 조사하기 위하여, 각 약제를 5 ㎎/㎏의 용량으로 재관류 30 분, 6 시간 및 12 시간 후에 정맥 투여하였다. 6 시간 후에 EP와 염화 5-(2-(4-클로로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산을 병용투여한 경우, 각각을 5 ㎎/㎏의 농도로 투여한 경우보다 경색 억제 효과가 우수한 것으로 나타났다. 즉, EP와 염화 5-(2-(4-클로로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산은 각각 66% 및 55%로 뇌경색 크기를 억제하였으며, 두 약제를 병용투여한 경우, 72% 정도 경색 크기를 억제하여 EP와 염화 5-(2-4-클로로페녹시)에틸아미노)2-하이드록시벤조산의 효능이 상호 보완적임을 시사하고 있다(도 5a).To investigate the effect of the combination of EP and 5- (2- (4-chlorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid, each drug was reperfused at a dose of 5 mg / kg for 30 minutes, 6 hours and After 12 hours intravenously. In case of co-administration of EP and 5- (2- (4-chlorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid after 6 hours, the effect of inhibiting infarction was lower than that of 5 mg / kg each. Found to be excellent. That is, EP and 5- (2- (4-chlorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid inhibited cerebral infarct size by 66% and 55%, respectively. Suppressing the extent of infarct suggests that the efficacy of EP and 5- (2-4-chlorophenoxy) ethylamino) 2-hydroxybenzoic acid is complementary (FIG. 5A).

(2) 개체 수준의 뇌허혈 개선 확인 (2) Confirmation of improvement of individual cerebral ischemia

상기 비교예에 기재된 방법에 따라 신경학적 결손을 평가하였다. 신경증적 손상에 대해서는, 이른 시간에 투여한 경우일수록 효과적인 신경증적 손상 회복 정도를 보였다. 6 시간 후에 염화 5-(2-(4-클로로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산을 투여한 경우에는 약간의 신경증적 손상 회복 효과가 보이나, EP를 투여한 경우, 신경증적 손상이 40% 회복되는 결과를 보였다. 6 시간 후에 EP와 염화 5-(2-(4-클로로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산을 병용투여한 경우에는 신경증적 손상이 45% 정도 회복되어 EP의 결과보다 5% 효과가 증진되는 것을 확인하였다(도 5b). 즉, EP나 염화 5-(2-(4-클로로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산의 단독투여 시보다 EP와 염화 5-(2-(4-클로로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산을 재관류 6 시간 후에 병용투여한 경우 현저한 뇌경색 부피의 감소와 운동 기능 증진을 보여 상기 두 약제의 효능이 상호 보완적임을 보여준다.
Neurological deficits were evaluated according to the method described in the comparative example. For neurotic injuries, the earlier administered, the more effective neurotic damage recovery was. After 6 hours, administration of 5- (2- (4-chlorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid showed a slight neurological damage recovery effect, whereas with EP, neurotic damage was observed. 40% recovery was obtained. After 6 hours, in combination with EP and 5- (2- (4-chlorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid, neurotic damage was recovered by 45%, which was 5% more effective than EP. It was confirmed to be enhanced (FIG. 5B). Namely, EP and 5- (2- (4-chlorophenoxy) ethylamino) -EP than chloride or 5- (2- (4-chlorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid alone. Co-administration of 2-hydroxybenzoic acid after 6 hours of reperfusion showed a significant decrease in cerebral infarct volume and enhanced motor function, indicating that the efficacy of the two agents was complementary.

실시예 5: 에틸피루베이트(EP)와 염화 5-(2-(2,4- 디클로로페녹시 ) 에틸아미노)-2-하이드록시벤조산 병용투여 시 뇌경색 억제효과 평가 Example 5 Evaluation of Cerebral Infarction Inhibitory Effect When Ethyl Pyruvate (EP) and 5- (2- (2,4- dichlorophenoxy ) ethylamino ) -2-hydroxybenzoic Acid Coadministered

(1) 시간별 뇌절편에서 허혈 부위 측정 (1) Measurement of ischemic sites in brain sections over time

EP와 염화 5-(2-(2,4-디클로로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산 병용요법의 효과를 조사하기 위하여, 각 약제를 5 ㎎/㎏의 용량으로 재관류 30 분, 6 시간 및 12 시간 후에 정맥 투여하였다. 6 시간 후에 EP와 염화 5-(2-(2,4-디클로로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산을 병용투여한 경우, 각각을 5 ㎎/㎏의 농도로 투여한 경우보다 경색 억제 효과가 우수한 것으로 나타났다. EP와 염화5-(2-(2,4-디클로로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산은 각각 66% 및 61%로 뇌경색 크기를 억제하였으며, 두 약제를 병용투여한 경우, 74% 정도 경색 크기를 억제하여 EP와 염화 5-(2-(2,4-디클로로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산의 효능이 상호 보완적임을 시사하고 있다(도 6a). To investigate the effect of the combination of EP and 5- (2- (2,4-dichlorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid chloride, each drug was reperfused at a dose of 5 mg / kg for 30 minutes, 6 IV and 12 hours later. 6 hours later, in combination with EP and 5- (2- (2,4-dichlorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid, inhibition of infarction was higher than that of 5 mg / kg each. The effect was found to be excellent. EP and 5- (2- (2,4-dichlorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid inhibited cerebral infarct size by 66% and 61%, respectively, and 74% when both drugs were administered in combination. Inhibiting the extent of infarct size suggests that the efficacy of EP and 5- (2- (2,4-dichlorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid is complementary (FIG. 6A).

(2) 개체 수준의 뇌허혈 개선 확인 (2) Confirmation of improvement of individual cerebral ischemia

상기 비교예에 기재된 방법에 따라 신경학적 결손을 평가하였다. 신경증적 손상에 대해서는, 이른 시간에 투여한 경우일수록 효과적인 신경증적 손상 회복 정도를 보였다. 6 시간 후에 염화 5-(2-(2,4-디클로로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산을 투여한 경우에는 신경증적 손상 회복 효과가 미미하나, EP를 투여한 경우, 신경증적 손상이 40% 회복되는 결과를 보였다. 6 시간 후에 EP와 염화5-(2-(2,4-디클로로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산을 병용투여한 경우에는 신경증적 손상이 52% 정도 회복되어 EP의 결과보다 12% 효과가 증진되는 것을 확인하였다(도 6b). 즉, EP나 염화 5-(2-(2,4-디클로로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산의 단독투여 시보다 EP와 염화 5-(2-(2,4-디클로로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산을 재관류 6 시간 후에 병용투여한 경우 현저한 뇌경색 부피의 감소와 운동 기능 증진을 보여 상기 두 약제의 효능이 상호 보완적임을 보여준다(도 6b).
Neurological deficits were evaluated according to the method described in the comparative example. For neurotic injuries, the earlier administered, the more effective neurotic damage recovery was. After 6 hours, the administration of 5- (2- (2,4-dichlorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid showed a negligible neurological damage recovery effect. 40% recovery was obtained. After 6 hours, when EP and 5- (2- (2,4-dichlorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid were co-administered, neurotic damage was recovered by 52%, 12% more than the result of EP. It was confirmed that the effect was enhanced (FIG. 6B). That is, EP and 5- (2- (2,4-dichlorophenoxy) than EP or 5- (2- (2,4-dichlorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid alone. Co-administration of ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid after 6 hours of reperfusion showed a significant decrease in cerebral infarct volume and enhancement of motor function, indicating that the efficacy of the two agents was complementary (FIG. 6B).

실시예 6: 에틸피루베이트(EP)와 염화 2- 하이드록시 -5-(2-(2,4,5- 트리클로로페녹시)에틸아미노)벤조산 병용투여 시 뇌경색 억제효과 평가 Example 6 Evaluation of Cerebral Infarction Inhibition Effect When Ethyl Pyruvate (EP) and 2 -Hydroxy -5- (2- (2,4,5- trichlorophenoxy ) ethylamino) benzoic Acid

(1) 시간별 뇌절편에서 허혈 부위 측정 (1) Measurement of ischemic sites in brain sections over time

EP와 염화 2-하이드록시-5-(2-(2,4,5-트리클로로페녹시)에틸아미노)벤조산 병용요법의 효과를 조사하기 위하여, 각 약제를 5 ㎎/㎏의 용량으로 재관류 30 분, 6 시간 및 12 시간 후에 정맥 투여하였다. 6 시간 후에 EP와 염화 2-하이드록시-5-(2-(2,4,5-트리클로로페녹시)에틸아미노)벤조산을 병용투여한 경우, 각각을 5 ㎎/㎏의 농도로 투여한 경우보다 경색 억제 효과가 우수한 것으로 나타났다. EP와 염화 2-하이드록시-5-(2-(2,4,5-트리클로로페녹시)에틸아미노)벤조산은 각각 66% 및 64%로 뇌경색 크기를 억제하였으며, 두 약제를 병용투여한 경우, 78% 정도 경색 크기를 억제하여 EP와 염화 2-하이드록시-5-(2-(2,4,5-트리클로로페녹시)에틸아미노)벤조산의 효능이 상호 보완적임을 시사하고 있다(도 7a).To investigate the effect of the combination of EP and 2-hydroxy-5- (2- (2,4,5-trichlorophenoxy) ethylamino) benzoic acid chloride, each drug was reperfused at a dose of 5 mg / kg. Intravenously administered minutes, 6 hours and 12 hours later. When 6 hours later, in combination with EP and 2-hydroxy-5- (2- (2,4,5-trichlorophenoxy) ethylamino) benzoic acid, each was administered at a concentration of 5 mg / kg. It was shown that the infarction inhibitory effect is more excellent. EP and 2-hydroxy-5- (2- (2,4,5-trichlorophenoxy) ethylamino) benzoic acid inhibited cerebral infarct size by 66% and 64%, respectively. Inhibition of the infarct size by 78% suggests that the efficacy of EP and 2-hydroxy-5- (2- (2,4,5-trichlorophenoxy) ethylamino) benzoic acid is complementary (Fig. 7a).

(2) 개체 수준의 뇌허혈 개선 확인 (2) Confirmation of improvement of individual cerebral ischemia

상기 비교예에 기재된 방법에 따라 신경학적 결손을 평가하였다. 신경증적 손상에 대해서는, 이른 시간에 투여한 경우일수록 효과적인 신경증적 손상 회복 정도를 보였다. 6 시간 후에 염화 2-하이드록시-5-(2-(2,4,5-트리클로로페녹시)에틸아미노)벤조산을 투여한 경우에는 EP와 유사한 신경증적 손상 회복 효과가 나타났으며, EP를 투여한 경우, 신경증적 손상이 40% 회복되는 결과를 보였다. 6 시간 후에 EP와 염화 2-하이드록시-5-(2-(2,4,5-트리클로로페녹시)에틸아미노)벤조산을 병용투여한 경우에는 신경증적 손상이 55% 정도 회복되어 EP보다 15% 효과가 증진되는 것을 확인하였다(도 7b). 즉, EP나 염화 2-하이드록시-5-(2-(2,4,5-트리클로로페녹시)에틸아미노)벤조산의 단독투여 시보다 EP와 염화 2-하이드록시-5-(2-(2,4,5-트리클로로페녹시)에틸아미노)벤조산을 재관류 6 시간 후에 병용투여 한 경우 현저한 뇌경색 부피의 감소와 운동 기능 증진을 보여 상기 두 약제의 효능이 상호 보완적임을 보여준다.
Neurological deficits were evaluated according to the method described in the comparative example. For neurotic injuries, the earlier administered, the more effective neurotic damage recovery was. Administration of 2-hydroxy-5- (2- (2,4,5-trichlorophenoxy) ethylamino) benzoic acid after 6 hours showed neurotic damage repair effects similar to those of EP. In the case of administration, neurotic damage was recovered by 40%. After 6 hours, when EP and 2-hydroxy-5- (2- (2,4,5-trichlorophenoxy) ethylamino) benzoic acid were co-administered, neurotic damage was recovered by 55%. It was confirmed that the% effect was enhanced (FIG. 7B). That is, EP and 2-hydroxy-5- (2- (chloride) are more effective than EP or 2-hydroxy-5- (2- (2,4,5-trichlorophenoxy) ethylamino) benzoic acid alone. Co-administration of 2,4,5-trichlorophenoxy) ethylamino) benzoic acid after 6 hours of reperfusion showed a marked decrease in cerebral infarct volume and enhanced motor function, indicating that the efficacy of the two agents was complementary.

실시예 7: 에틸피루베이트(EP)와 염화 2- 하이드록시 -5-(2-(4- 메톡시페녹시 )에틸아미노)벤조산 병용투여 시 뇌경색 억제효과 평가 Example 7 Evaluation of Cerebral Infarction Inhibitory Effect When Ethyl Pyruvate (EP) Co-administered with 2 -Hydroxy -5- (2- (4 -methoxyphenoxy ) ethylamino) benzoic Acid

(1) 시간별 뇌절편에서 허혈 부위 측정 (1) Measurement of ischemic sites in brain sections over time

EP와 염화 2-하이드록시-5-(2-(4-메톡시페녹시)에틸아미노)벤조산 병용요법의 효과를 조사하기 위하여, 각 약제를 5 ㎎/㎏의 용량으로 재관류 30 분, 6 시간 및 12 시간 후에 정맥 투여하였다. 6 시간 후에 EP와 염화 2-하이드록시-5-(2-(4-메톡시페녹시)에틸아미노)벤조산을 병용투여한 경우, 각각을 5 ㎎/㎏의 농도로 투여한 경우보다 경색 억제 효과가 우수한 것으로 나타났다. EP와 염화 2-하이드록시-5-(2-(4-메톡시페녹시)에틸아미노)벤조산은 각각 66% 및 53%로 뇌경색 크기를 억제하였으며, 두 약제를 병용투여한 경우, 69% 정도 경색 크기를 억제하여 EP와 염화 2-하이드록시-5-(2-(4-메톡시페녹시)에틸아미노)벤조산의 효능이 상호 보완적임을 시사하고 있다(도 8a). To investigate the effect of the combination of EP and 2-hydroxy-5- (2- (4-methoxyphenoxy) ethylamino) benzoic acid chloride, each drug was reperfused at a dose of 5 mg / kg for 30 minutes and 6 hours. And 12 hours later intravenously. In case of co-administration of EP and 2-hydroxy-5- (2- (4-methoxyphenoxy) ethylamino) benzoic acid after 6 hours, the effect of inhibiting infarction was higher than that of each administered at a concentration of 5 mg / kg. Was found to be excellent. EP and 2-hydroxy-5- (2- (4-methoxyphenoxy) ethylamino) benzoic acid inhibited cerebral infarct size by 66% and 53%, respectively. Inhibition of infarct size suggests that the efficacy of EP and 2-hydroxy-5- (2- (4-methoxyphenoxy) ethylamino) benzoic acid is complementary (FIG. 8A).

(2) 개체 수준의 뇌허혈 개선 확인 (2) Confirmation of improvement of individual cerebral ischemia

상기 비교예에 기재된 방법에 따라 신경학적 결손을 평가하였다. 신경증적 손상에 대해서는, 이른 시간에 투여한 경우일수록 효과적인 신경증적 손상 회복 정도를 보였다. 6 시간 후에 염화 2-하이드록시-5-(2-(4-메톡시페녹시)에틸아미노)벤조산을 투여한 경우에는 신경증적 손상 회복 효과가 미비하였으며, EP를 투여한 경우, 신경증적 손상이 40% 회복되는 결과를 보였다. 6 시간 후에 EP와 염화 2-하이드록시-5-(2-(4-메톡시페녹시)에틸아미노)벤조산을 병용투여한 경우에는 신경증적 손상이 43% 정도 회복되어 EP보다 3% 효과가 증진되는 것을 확인하였다(도 8b). 즉, EP나 염화 2-하이드록시-5-(2-(4-메톡시페녹시)에틸아미노)벤조산의 단독투여 시보다 EP와 염화 2-하이드록시-5-(2-(4-메톡시페녹시)에틸아미노)벤조산을 재관류 6 시간 후에 병용투여한 경우 현저한 뇌경색 부피의 감소와 운동 기능 증진을 보여 상기 두 약제의 효능이 상호 보완적임을 보여준다.
Neurological deficits were evaluated according to the method described in the comparative example. For neurotic injuries, the earlier administered, the more effective neurotic damage recovery was. After 6 hours, the administration of 2-hydroxy-5- (2- (4-methoxyphenoxy) ethylamino) benzoic acid had insufficient neurological damage recovery effect. 40% recovery was obtained. After 6 hours, when EP and 2-hydroxy-5- (2- (4-methoxyphenoxy) ethylamino) benzoic acid were co-administered, neurotic damage was recovered by 43%, which was 3% more effective than EP. It was confirmed that (Fig. 8b). That is, EP and 2-hydroxy-5- (2- (4-methoxy) than EP or 2-hydroxy-5- (2- (4-methoxyphenoxy) ethylamino) benzoic acid alone. The combination of phenoxy) ethylamino) benzoic acid after 6 hours of reperfusion showed a significant decrease in cerebral infarct volume and enhanced motor function, indicating that the efficacy of the two agents was complementary.

실시예Example 8:  8: EPEP 와 염화플루옥세틴 병용투여 시 뇌경색 억제효과 평가Inhibition of Cerebral Infarction in Combination with Fluoxetine Chloride

(1) 시간별 농도별 뇌절편에서 허혈 부위 측정 (1) Measurement of ischemic sites in brain sections by concentrations over time

EP와 염화플루옥세틴 병용요법 효과가 각 약제의 용량 증가에 의해 재현되는지를 조사하기 위하여, EP와 염화플루옥세틴을 1 ㎎/㎏, 2 ㎎/㎏, 5 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏과 20 ㎎/㎏의 농도로 각각 처치하였다. 1 시간 국소허혈 동물모델을 제작한 후, 재관류 6 시간에 EP와 염화플루옥세틴을 다양한 농도로 정맥 투여하고 뇌경색의 크기를 측정하였다. 두 약제 공통적으로 5 ㎎/㎏의 농도에서 경색 크기를 가장 효과적으로 감소시켰으며 10 ㎎/㎏로 농도를 증가시킨 경우에 경색 억제 효과의 증진이 관찰되지 않았다(도 9a).To investigate whether the effect of the combination of EP and fluoxetine chloride was reproduced by increasing dose of each drug, EP and fluoxetine chloride were administered at 1 mg / kg, 2 mg / kg, 5 mg / kg, 10 mg / kg and 20 mg / g. Each was treated at a concentration of kg. One hour local ischemia animal model was constructed, and 6 hours after reperfusion, EP and fluoxetine chloride were administered at various concentrations to measure cerebral infarction. Both drugs reduced the infarct size most effectively at a concentration of 5 mg / kg and no increase in infarct inhibition effect was observed when the concentration was increased to 10 mg / kg (FIG. 9A).

EP와 염화플루옥세틴의 병용요법 효과를 조사하기 위하여, 각 약제를 5 ㎎/㎏의 용량으로 재관류 30 분, 6 시간, 12 시간 후에 정맥 투여하였다. 6 시간 후에 투여한 경우, 각각을 5 ㎎/㎏의 농도로 투여한 경우보다 경색 억제 효과가 더 크게 나타났다. EP와 염화플루옥세틴의 효능이 각각 66% 및 59%이며, 병용투여한 경우, 76% 의 뇌경색 억제 효과를 나타내어 상호 보완적임을 시사하고 있다(도 9b). To investigate the combination therapy effect of EP and fluoxetine chloride, each drug was administered intravenously 30 minutes, 6 hours, 12 hours after reperfusion at a dose of 5 mg / kg. When administered after 6 hours, the infarct inhibitory effect was greater than when each was administered at a concentration of 5 mg / kg. The efficacy of EP and fluoxetine chloride is 66% and 59%, respectively, and when administered in combination, it shows a 76% cerebral infarction inhibitory effect, suggesting that they are complementary (FIG. 9B).

(2) 개체 수준의 뇌허혈 개선 확인 (2) Confirmation of improvement of individual cerebral ischemia

상기 비교예에 기재된 방법에 따라 신경학적 결손을 평가하였다. 6 시간 후에 EP와 염화플루옥세틴을 병용투여한 경우 EP를 단독투여한 경우보다 10% 정도 우수한 신경학적 결함 억제 효과를 나타내었다(도 9c). 즉, EP나 염화플루옥세틴의 단독투여 시보다 EP와 염화플루옥세틴을 재관류 6 시간 후에 병용투여한 경우 현저한 뇌경색 부피의 감소와 함께 운동 기능 증진을 보여 상기 두 약제의 효능이 상호 보완적임을 보여준다.
Neurological deficits were evaluated according to the method described in the comparative example. After 6 hours, the combination of EP and fluoxetine showed a 10% better neurological defect suppression effect than that of EP alone (FIG. 9C). That is, when EP and fluoxetine were administered in combination with EP and fluoxetine 6 hours after reperfusion, they showed a significant decrease in cerebral infarction and enhanced motor function, indicating that the efficacy of the two drugs was complementary.

실시예 9: 피루보일아민다이에탄과 2- 아세톡시 -4-( 트리플루오로메틸 )벤조산(triflusal) 병용투여 시 뇌경색 억제효과 평가 Example 9 Evaluation of Cerebral Infarction Inhibitory Effect When Pyruboylaminediethane Co-administered with 2- acetoxy- 4- ( trifluoromethyl ) benzoic Acid (triflusal)

(1) 시간별 뇌절편에서 허혈 부위 측정 (1) Measurement of ischemic sites in brain sections over time

피루보일아민다이에탄(제조예 2)과 2-아세톡시-4-(트리플루오로메틸)벤조산 병용요법의 효과를 조사하기 위하여, 각 약제를 2.5 ㎎/㎏의 용량으로 재관류 30 분, 6 시간 및 12 시간 후에 정맥 투여하였다. 6 시간 후에 피루보일아민다이에탄과 2-아세톡시-4-(트리플루오로메틸)벤조산을 병용투여한 경우, 각각을 2.5 ㎎/㎏의 농도로 투여한 경우보다 경색 억제 효과가 우수한 것으로 나타났다. 피루보일아민다이에탄과 2-아세톡시-4-(트리플루오로메틸)벤조산은 각각 40% 및 23%로 뇌경색 크기를 억제하였으며, 두 약제를 병용투여한 경우, 60% 정도 경색 크기를 억제하여 피루보일아민다이에탄과 2-아세톡시-4-(트리플루오로메틸)벤조산의 효능이 상호 보완적임을 시사하고 있다(도 10). To investigate the effect of the combination of pyruboylaminediene (Preparation Example 2) and 2-acetoxy-4- (trifluoromethyl) benzoic acid, each drug was reperfused at a dose of 2.5 mg / kg for 30 minutes, 6 IV and 12 hours later. In combination with pyruboylaminediene and 2-acetoxy-4- (trifluoromethyl) benzoic acid after 6 hours, the effect of inhibiting infarction was superior to that of 2.5 mg / kg each. . Pyruboylaminediene and 2-acetoxy-4- (trifluoromethyl) benzoic acid inhibited cerebral infarct size by 40% and 23%, respectively, and by 60% when both drugs were administered in combination This suggests that the efficacy of pyruboylaminediene and 2-acetoxy-4- (trifluoromethyl) benzoic acid is complementary (FIG. 10).

(2) 개체 수준의 뇌허혈 개선 확인 (2) Confirmation of improvement of individual cerebral ischemia

상기 비교예에 기재된 방법에 따라 신경학적 결손을 평가하였다. 6 시간 후에 피루보일아민다이에탄과 2-아세톡시-4-(트리플루오로메틸)벤조산을 병용투여한 경우 EP를 단독투여한 경우보다 30% 정도 우수한 신경학적 결함 억제 효과를 나타내었다. 즉, 피루보일아민다이에탄이나 2-아세톡시-4-(트리플루오로메틸)벤조산의 단독투여 시보다 피루보일아민다이에탄과 2-아세톡시-4-(트리플루오로메틸)벤조산을 재관류 6 시간 후에 병용투여한 경우 현저한 뇌경색 부피의 감소와 함께 운동 기능 증진을 보여 상기 두 약제의 효능이 상호 보완적임을 보여준다.
Neurological deficits were evaluated according to the method described in the comparative example. After 6 hours, the combination of pyruboylaminediene and 2-acetoxy-4- (trifluoromethyl) benzoic acid showed about 30% better neurological defect suppression effect than that of EP alone. In other words, pyruboylaminediene and 2-acetoxy-4- (trifluoromethyl) benzoic acid may be dissolved in pyruboylaminediene or 2-acetoxy-4- (trifluoromethyl) benzoic acid alone. Co-administration after 6 hours of reperfusion showed a marked reduction in cerebral infarct volume and enhanced motor function, indicating that the efficacy of the two agents was complementary.

실시예 10: 피루보일아민다이에탄과 2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조산(HTB) 병용투여 시 뇌경색 억제효과 평가 Example 10: Evaluation of Cerebral Infarction Inhibitory Effect When PyruboylamineDiethane and 2-Hydroxy-4-trifluoromethylbenzoic Acid (HTB) Combination Administration

(1) 시간별 뇌절편에서 허혈 부위 측정 (1) Measurement of ischemic sites in brain sections over time

피루보일아민다이에탄(제조예 2)과 2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조산 병용요법의 효과를 조사하기 위하여, 각 약제를 2.5 ㎎/㎏의 용량으로 재관류 30 분, 6 시간 및 12 시간 후에 정맥 투여하였다. 6 시간 후에 피루보일아민다이에탄과 2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조산을 병용투여한 경우, 각각을 2.5 ㎎/㎏의 농도로 투여한 경우보다 경색 억제 효과가 우수한 것으로 나타났다. 피루보일아민다이에탄과 2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조산은 각각 31% 및 30%로 뇌경색 크기를 억제하였으며, 두 약제를 병용투여한 경우, 42% 정도 경색 크기를 억제하여 피루보일아민다이에탄과 2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조산의 효능이 상호 보완적임을 시사하고 있다(도 11). To investigate the effect of the combination of pyruboylaminediene (Preparation Example 2) and 2-hydroxy-4-trifluoromethylbenzoic acid, each agent was reperfused at a dose of 2.5 mg / kg for 30 minutes, 6 hours and After 12 hours intravenously. After 6 hours, when pyruboylaminediethane and 2-hydroxy-4-trifluoromethylbenzoic acid were co-administered, the infarct inhibitory effect was superior to that of 2.5 mg / kg each. Pyruboylaminediethane and 2-hydroxy-4-trifluoromethylbenzoic acid inhibited cerebral infarct size by 31% and 30%, respectively. It suggests that the efficacy of ruboylaminediene and 2-hydroxy-4-trifluoromethylbenzoic acid is complementary (FIG. 11).

(2) 개체 수준의 뇌허혈 개선 확인 (2) Confirmation of improvement of individual cerebral ischemia

상기 비교예에 기재된 방법에 따라 신경학적 결손을 평가하였다. 6 시간 후에 피루보일아민다이에탄과 2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조산을 병용투여한 경우 EP를 단독투여한 경우보다 17% 정도 우수한 신경학적 결함 억제 효과를 나타내었다. 즉, 피루보일아민다이에탄이나 2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조산의 단독투여 시보다 피루보일아민다이에탄과 2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조산을 재관류 6 시간 후에 병용투여한 경우 현저한 뇌경색 부피의 감소와 함께 운동 기능 증진을 보여 상기 두 약제의 효능이 상호 보완적임을 보여준다.
Neurological deficits were evaluated according to the method described in the comparative example. In combination with pyruboylaminediene and 2-hydroxy-4-trifluoromethylbenzoic acid after 6 hours, neuroprotective effect was about 17% better than that of EP alone. That is, 6 hours after reperfusion of pyruboylaminediene and 2-hydroxy-4-trifluoromethylbenzoic acid than when pyruboylaminediene or 2-hydroxy-4-trifluoromethylbenzoic acid was administered alone. When administered in combination, there is a marked reduction in cerebral infarction volume and enhanced motor function, indicating that the efficacy of the two agents is complementary.

실시예 11: 피루보일아미노에탄과 2- 아세톡시 -4-( 트리플루오로메틸 )벤조산(triflusal) 병용투여 시 뇌경색 억제효과 평가 Example 11 Evaluation of Cerebral Infarction Inhibitory Effect When Pyruboylaminoethane and 2- Acetoxy- 4- ( trifluoromethyl ) benzoic Acid Combined

(1) 시간별 뇌절편에서 허혈 부위 측정 (1) Measurement of ischemic sites in brain sections over time

피루보일아미노에탄(제조예 1)과 2-아세톡시-4-(트리플루오로메틸)벤조산 병용요법의 효과를 조사하기 위하여, 각 약제를 2.5 ㎎/㎏의 용량으로 재관류 30 분, 6 시간 및 12 시간 후에 정맥 투여하였다. 6 시간 후에 피루보일아미노에탄과 2-아세톡시-4-(트리플루오로메틸)벤조산을 병용투여한 경우, 각각을 2.5 ㎎/㎏의 농도로 투여한 경우보다 경색 억제 효과가 우수한 것으로 나타났다. 피루보일아미노에탄과 2-아세톡시-4-(트리플루오로메틸)벤조산은 각각 20% 및 23%로 뇌경색 크기를 억제하였으며, 두 약제를 병용투여한 경우, 54% 정도 경색 크기를 억제하여 피루보일아미노에탄과 2-아세톡시-4-(트리플루오로메틸)벤조산의 효능이 상호 보완적임을 시사하고 있다(도 12). To investigate the effect of the combination of pyruboylaminoethane (Preparation Example 1) and 2-acetoxy-4- (trifluoromethyl) benzoic acid, each drug was reperfused at a dose of 2.5 mg / kg for 30 minutes and 6 hours. And 12 hours later intravenously. After 6 hours, when pyruboylaminoethane and 2-acetoxy-4- (trifluoromethyl) benzoic acid were administered in combination, the infarct inhibitory effect was superior to that of 2.5 mg / kg. Pyruboylaminoethane and 2-acetoxy-4- (trifluoromethyl) benzoic acid inhibited cerebral infarct size by 20% and 23%, respectively. It suggests that the efficacy of pyruboylaminoethane and 2-acetoxy-4- (trifluoromethyl) benzoic acid are complementary (FIG. 12).

(2) 개체 수준의 뇌허혈 개선 확인 (2) Confirmation of improvement of individual cerebral ischemia

상기 비교예에 기재된 방법에 따라 신경학적 결손을 평가하였다. 6 시간 후에 피루보일아미노에탄과 2-아세톡시-4-(트리플루오로메틸)벤조산을 병용투여한 경우 EP를 단독투여한 경우보다 18% 정도 우수한 신경학적 결함 억제 효과를 나타내었다. 즉, 피루보일아미노에탄이나 2-아세톡시-4-(트리플루오로메틸)벤조산의 단독투여 시보다 피루보일아미노에탄과 2-아세톡시-4-(트리플루오로메틸)벤조산을 재관류 6 시간 후에 병용투여한 경우 현저한 뇌경색 부피의 감소와 함께 운동 기능 증진을 보여 상기 두 약제의 효능이 상호 보완적임을 보여준다.
Neurological deficits were evaluated according to the method described in the comparative example. After 6 hours, the combination of pyruboylaminoethane and 2-acetoxy-4- (trifluoromethyl) benzoic acid showed about 18% better neurological defect suppression effect than that of EP alone. In other words, pyruboylaminoethane and 2-acetoxy-4- (trifluoromethyl) benzoic acid were reperfused 6 more than pyruboylaminoethane or 2-acetoxy-4- (trifluoromethyl) benzoic acid alone. Co-administration after time showed a significant decrease in cerebral infarct volume and enhanced motor function, indicating that the efficacy of the two agents was complementary.

실시예 12: 피루보일아미노에탄과 2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조산(HTB) 병용투여 시 뇌경색 억제효과 평가 Example 12: Evaluation of Cerebral Infarction Inhibitory Effect When Pyruboylaminoethane and 2-Hydroxy-4-trifluoromethylbenzoic Acid (HTB) Combination Administration

(1) 시간별 뇌절편에서 허혈 부위 측정 (1) Measurement of ischemic sites in brain sections over time

피루보일아미노에탄(제조예 1)과 2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조산 병용요법의 효과를 조사하기 위하여, 각 약제를 2.5 ㎎/㎏의 용량으로 재관류 30 분, 6 시간 및 12 시간 후에 정맥 투여하였다. 6 시간 후에 피루보일아미노에탄과 2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조산을 병용투여한 경우, 각각을 2.5 ㎎/㎏의 농도로 투여한 경우보다 경색 억제 효과가 우수한 것으로 나타났다. 피루보일아미노에탄과 2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조산은 각각 25% 및 30%로 뇌경색 크기를 억제하였으며, 두 약제를 병용투여한 경우, 49% 정도 경색 크기를 억제하여 피루보일아미노에탄과 2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조산의 효능이 상호 보완적임을 시사하고 있다(도 13). To investigate the effect of the combination of pyruboylaminoethane (Preparation Example 1) and 2-hydroxy-4-trifluoromethylbenzoic acid, each drug was reperfused at a dose of 2.5 mg / kg for 30 minutes, 6 hours and 12 hours. Intravenously after hours. After 6 hours, when pyruboylaminoethane and 2-hydroxy-4-trifluoromethylbenzoic acid were co-administered, the infarct inhibitory effect was superior to the case where each was administered at a concentration of 2.5 mg / kg. Pyruboylaminoethane and 2-hydroxy-4-trifluoromethylbenzoic acid inhibited cerebral infarct size by 25% and 30%, respectively. It suggests that the efficacy of monoaminoethane and 2-hydroxy-4-trifluoromethylbenzoic acid is complementary (FIG. 13).

(2) 개체 수준의 뇌허혈 개선 확인 (2) Confirmation of improvement of individual cerebral ischemia

상기 비교예에 기재된 방법에 따라 신경학적 결손을 평가하였다. 6 시간 후에 피루보일아미노에탄과 2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조산을 병용투여한 경우 EP를 단독투여한 경우보다 12% 정도 우수한 신경학적 결함 억제 효과를 나타내었다. 즉, 피루보일아미노에탄이나 2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조산의 단독투여 시보다 피루보일아미노에탄과 2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조산을 재관류 6 시간 후에 병용투여한 경우 현저한 뇌경색 부피의 감소와 함께 운동 기능 증진을 보여 상기 두 약제의 효능이 상호 보완적임을 보여준다.Neurological deficits were evaluated according to the method described in the comparative example. In combination with pyruboylaminoethane and 2-hydroxy-4-trifluoromethylbenzoic acid after 6 hours, the neurological defect suppression effect was about 12% better than that of EP alone. In other words, pyruboylaminoethane and 2-hydroxy-4-trifluoromethylbenzoic acid were co-administered after 6 hours of reperfusion than pyruboylaminoethane or 2-hydroxy-4-trifluoromethylbenzoic acid alone. In one case, a significant reduction in cerebral infarct volume was shown to enhance motor function, indicating that the efficacy of the two agents was complementary.

Claims (7)

(1) 화학식 1의 피루보일(pyruvoyl) 유사체; 및
(2) 화학식 2의 아세틸살리실산 유사체, 화학식 3의 5-아미노살리실산 유사체, 화학식 4의 플루옥세틴 유사체 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 항산화제:
를 포함하는, 뇌신경 보호용 조성물:
[화학식 1]
Figure 112011005457647-pat00012

[상기 화학식 1에서, R1은 (C1-C6)알킬, (C6-C12)아릴, (C1-C6)알콕시, (C6-C12)아릴옥시, (C6-C12)아르(C1-C6)알킬, (C6-C12)아르(C1-C6)알킬옥시, NR21R22 또는 (C1-C6)알킬티오이고; R21 및 R22는 서로 독립적으로 수소, (C1-C6)알킬, (C6-C12)아릴, (C6-C12)아르(C1-C6)알킬, (C6-C12)아릴카보닐 또는 (C1-C6)알킬카보닐이고; 상기 R1, R21 및 R22의 알킬, 아릴, 알콕시, 아릴옥시, 아르알킬, 아르알킬옥시, 아릴카보닐 또는 알킬카보닐은 할로겐, 할로(C1-C6)알킬, 할로(C1-C6)알킬(C6-C12)아릴옥시 및 히드록시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기가 더 치환될 수 있다.]
[화학식 2]
Figure 112011005457647-pat00013

[상기 화학식 2에서, R2는 수소, (C1-C6)알킬카보닐 또는 (C6-C12)아릴카보닐이고, 상기 R2의 아릴카보닐은 (C1-C6)알킬, 히드록시 및 할로(C1-C6)알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기가 더 치환될 수 있고; R3은 수소, (C1-C6)알킬 또는 (C6-C12)아릴이고; R4는 수소, (C1-C6)알킬, 할로(C1-C6)알킬, 할로겐, (C1-C6)알콕시, 히드록시 또는 니트로이다.]
[화학식 3]
Figure 112011005457647-pat00014

[상기 화학식 3에서, R5 내지 R9는 서로 독립적으로 수소, (C1-C6)알킬, 할로겐, 히드록시, (C1-C6)알콕시, CF3 또는 니트로이고; n은 0 내지 4의 정수이며; X는 CH2, O, S 또는 SO이다.]
[화학식 4]
Figure 112011005457647-pat00015

[상기 화학식 4에서, R10 및 R11은 서로 독립적으로 수소, (C1-C6)알킬 또는 (C6-C12)아릴이다.](1) pyruvoyl analogs of Formula 1; And
(2) at least one antioxidant selected from the group consisting of acetylsalicylic acid analogs of Formula 2, 5-aminosalicylic acid analogs of Formula 3, fluoxetine analogs of Formula 4, and pharmaceutically acceptable salts thereof:
Containing, the composition for protecting the nerves:
[Formula 1]
Figure 112011005457647-pat00012

[In Formula 1, R 1 is (C1-C6) alkyl, (C6-C12) aryl, (C1-C6) alkoxy, (C6-C12) aryloxy, (C6-C12) ar (C1-C6) alkyl , (C6-C12) ar (C1-C6) alkyloxy, NR 21 R 22 or (C1-C6) alkylthio; R 21 And R 22 independently of one another is hydrogen, (C 1 -C 6) alkyl, (C 6 -C 12) aryl, (C 6 -C 12) ar (C 1 -C 6) alkyl, (C 6 -C 12) arylcarbonyl or (C 1 -C 6) Alkylcarbonyl; R 1 and R 21 And alkyl, aryl, alkoxy, aryloxy, aralkyl, aralkyloxy, arylcarbonyl or alkylcarbonyl of R 22 is halogen, halo (C1-C6) alkyl, halo (C1-C6) alkyl (C6-C12) One or more substituents selected from the group consisting of aryloxy and hydroxy may be further substituted.]
(2)
Figure 112011005457647-pat00013

[In Formula 2, R 2 is hydrogen, (C1-C6) alkylcarbonyl or (C6-C12) arylcarbonyl, and arylcarbonyl of R 2 is (C1-C6) alkyl, hydroxy and halo ( One or more substituents selected from the group consisting of C1-C6) alkyl may be further substituted; R 3 is hydrogen, (C 1 -C 6) alkyl or (C 6 -C 12) aryl; R 4 is hydrogen, (C 1 -C 6) alkyl, halo (C 1 -C 6) alkyl, halogen, (C 1 -C 6) alkoxy, hydroxy or nitro.]
(3)
Figure 112011005457647-pat00014

[In Formula 3, R 5 to R 9 are independently of each other hydrogen, (C1-C6) alkyl, halogen, hydroxy, (C1-C6) alkoxy, CF 3 or nitro; n is an integer from 0 to 4; X is CH 2 , O, S or SO.]
[Chemical Formula 4]
Figure 112011005457647-pat00015

[In Formula 4, R 10 and R 11 are each independently hydrogen, (C 1 -C 6) alkyl or (C 6 -C 12) aryl.] 제1항에 있어서,
뇌허혈, 뇌경색, 뇌졸중, 헌팅톤병, 루게릭병 또는 혈관성 치매를 예방 또는 치료하기 위한 뇌신경 보호용 조성물.The method of claim 1,
Cranial nerve protection composition for preventing or treating cerebral ischemia, cerebral infarction, stroke, Huntington's disease, Lou Gehrig's disease or vascular dementia. 제1항 또는 제2항에 있어서,
피루보일(pyruvoyl) 유사체가
에틸 피루베이트(피루보일옥시에탄);
프로필 피루베이트;
이소프로필 피루베이트;
n-부틸 피루베이트;
sec-부틸 피루베이트;
이소부틸 피루베이트;
t-부틸 피루베이트;
펜틸 피루베이트;
헥실 피루베이트;
헵틸 피루베이트;
옥틸 피루베이트;
페닐 피루베이트;
4-(4-트리플루오로메틸페닐옥시)페닐 피루베이트;
(4-트리플루오로메틸)-2,3,5,6-테트라플루오로페닐 피루베이트;
(4-트리플루오로메틸)페닐 피루베이트;
(4-트리플루오로메틸)벤질 피루베이트;
피루보일아미노에탄;
피루보일아미노메탄;
피루보일아미노프로판;
피루보일아미노부탄;
피루보일아미노펜탄;
피루보일아미노벤젠;
피루보일아미노(4-트리플루오로메틸)벤젠;
피루보일아미노(4-트리플루오로메틸페닐)메탄;
피루보일아미노(4-트리플루오로메틸-2,3,5,6-테트라플루오로페닐)메탄;
피루보일아미노(4-트리플루오로메틸-2,3,5,6-테트라플루오로)벤젠;
피루보일아미노카보닐(4-트리플루오로메틸)벤젠;
피루보일아민다이에탄;
피루보일아민다이부탄;
피루보일아민다이헥산;
피루보일아민다이옥탄;
피루보일(4-트리플루오로메틸-2-히드록시페닐카보닐)(에틸)아민;
피루보일(4-트리플루오로메틸-2-히드록시페닐)(에틸)아민;
피루보일(4-트리플루오로메틸페닐)(에틸)아민;
피루보일싸이오에탄; 및
피루보일프로판;
으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 뇌신경 보호용 조성물.The method according to claim 1 or 2,
Pyruvoyl analogs
Ethyl pyruvate (pyruboyloxyethane);
Propyl pyruvate;
Isopropyl pyruvate;
n-butyl pyruvate;
sec-butyl pyruvate;
Isobutyl pyruvate;
t-butyl pyruvate;
Pentyl pyruvate;
Hexyl pyruvate;
Heptyl pyruvate;
Octyl pyruvate;
Phenyl pyruvate;
4- (4-trifluoromethylphenyloxy) phenyl pyruvate;
(4-trifluoromethyl) -2,3,5,6-tetrafluorophenyl pyruvate;
(4-trifluoromethyl) phenyl pyruvate;
(4-trifluoromethyl) benzyl pyruvate;
Pyruboylaminoethane;
Pyruboylaminomethane;
Pyruboylaminopropane;
Pyruboylaminobutane;
Pyruboylaminopentane;
Pyruboylaminobenzene;
Pyruboylamino (4-trifluoromethyl) benzene;
Pyruboylamino (4-trifluoromethylphenyl) methane;
Pyruboylamino (4-trifluoromethyl-2,3,5,6-tetrafluorophenyl) methane;
Pyruboylamino (4-trifluoromethyl-2,3,5,6-tetrafluoro) benzene;
Pyruboylaminocarbonyl (4-trifluoromethyl) benzene;
Pyruboylamine diethan;
Pyruboylaminedibutane;
Pyruboylaminedihexane;
Pyruboylaminedioctane;
Pyruboyl (4-trifluoromethyl-2-hydroxyphenylcarbonyl) (ethyl) amine;
Pyruboyl (4-trifluoromethyl-2-hydroxyphenyl) (ethyl) amine;
Pyruboyl (4-trifluoromethylphenyl) (ethyl) amine;
Pyruboylthioethane; And
Pyruboylpropane;
The composition for nerve protection of the brain is selected from the group consisting of. 제1항 또는 제2항에 있어서,
5-아미노살리실산 유사체가
2-하이드록시-5-(2,3,5,6-테트라플루오로-4-(트리플루오로메틸)벤질아미노)벤조산;
2-하이드록시-5-(4-(트리플루오로메틸)페닐에틸아미노)벤조산;
5-(2-(4-클로로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산;
5-(2-(2,4-디클로로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산;
2-하이드록시-5-(2-(2,4,5-트리클로로페녹시)에틸아미노)벤조산;
2-하이드록시-5-(2-페닐설포닐에틸아미노)벤조산;
2-하이드록시-5-(2-(4-요오도페녹시)에틸아미노)벤조산;
5-(2-(4-브로모페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산;
2-하이드록시-5-(3-페녹시프로필아미노)벤조산;
5-(2-(2,6-디클로로-4-플루오로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산;
5-(3-(4-플루오로페녹시)프로필아미노)-2-하이드록시벤조산;
5-(2-(2,6-디클로로-4-플루오로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산;
5-(2-(4-클로로-2-메틸페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산;
2-하이드록시-5-(2-p-톨릴옥시에틸아미노)벤조산;
2-하이드록시-5-(2-페녹시에틸아미노) 벤조산;
5-(2-(2,6-디플루오로페녹시)에틸아미노)-2-하이드록시벤조산; 및
2-하이드록시-5-(2-(4-메톡시페녹시)에틸아미노)벤조산:
으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 뇌신경 보호용 조성물.The method according to claim 1 or 2,
5-aminosalicylic acid analog
2-hydroxy-5- (2,3,5,6-tetrafluoro-4- (trifluoromethyl) benzylamino) benzoic acid;
2-hydroxy-5- (4- (trifluoromethyl) phenylethylamino) benzoic acid;
5- (2- (4-chlorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid;
5- (2- (2,4-dichlorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid;
2-hydroxy-5- (2- (2,4,5-trichlorophenoxy) ethylamino) benzoic acid;
2-hydroxy-5- (2-phenylsulfonylethylamino) benzoic acid;
2-hydroxy-5- (2- (4-iodophenoxy) ethylamino) benzoic acid;
5- (2- (4-bromophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid;
2-hydroxy-5- (3-phenoxypropylamino) benzoic acid;
5- (2- (2,6-dichloro-4-fluorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid;
5- (3- (4-fluorophenoxy) propylamino) -2-hydroxybenzoic acid;
5- (2- (2,6-dichloro-4-fluorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid;
5- (2- (4-chloro-2-methylphenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid;
2-hydroxy-5- (2-p-tolyloxyethylamino) benzoic acid;
2-hydroxy-5- (2-phenoxyethylamino) benzoic acid;
5- (2- (2,6-difluorophenoxy) ethylamino) -2-hydroxybenzoic acid; And
2-Hydroxy-5- (2- (4-methoxyphenoxy) ethylamino) benzoic acid:
The composition for nerve protection of the brain is selected from the group consisting of. 제1항 또는 제2항에 있어서,
약제학적으로 허용되는 염이 염산염인 뇌신경 보호용 조성물.The method according to claim 1 or 2,
A pharmaceutically acceptable salt is a neuroprotective composition for hydrochloride. 제1항 또는 제2항에 있어서,
피루보일(pyruvoyl) 유사체가 1~60 ㎎/㎏의 용량으로, 항산화제가 1~40 ㎎/㎏의 용량으로 투여되는 뇌신경 보호용 조성물.The method according to claim 1 or 2,
A neuroprotective composition in which a pyruvoyl analog is administered at a dose of 1 to 60 mg / kg and an antioxidant is administered at a dose of 1 to 40 mg / kg. 제1항 또는 제2항에 있어서,
정맥 내 또는 경구 투여되는 뇌신경 보호용 조성물.The method according to claim 1 or 2,
Intravenous or orally administered compositions for nerve protection.
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