KR101035375B1 - Biopolymer/apatite nano composite immobilized biopolymer on calcium phosphate thin film formed by electron-beam evaporation and preparation method thereof - Google Patents
Biopolymer/apatite nano composite immobilized biopolymer on calcium phosphate thin film formed by electron-beam evaporation and preparation method thereof Download PDFInfo
- Publication number
- KR101035375B1 KR101035375B1 KR1020080079380A KR20080079380A KR101035375B1 KR 101035375 B1 KR101035375 B1 KR 101035375B1 KR 1020080079380 A KR1020080079380 A KR 1020080079380A KR 20080079380 A KR20080079380 A KR 20080079380A KR 101035375 B1 KR101035375 B1 KR 101035375B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- calcium phosphate
- biopolymer
- thin film
- apatite
- sample
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82B—NANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
- B82B3/00—Manufacture or treatment of nanostructures by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
Abstract
본 발명은 전자빔 증착에 의해 형성된 칼슘 포스페이트 박막 상에 생체고분자를 고정화시킨 생체고분자/아파타이트 나노 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 생체고분자/아파타이트 나노 복합체는 전자빔 증착에 의해 형성된 칼슘 포스페이트 박막에 생체고분자를 결합함으로써 골 형성을 촉진하고, 벌크한 물질 대신 칼슘 포스페이트 박막을 사용함으로써 다양한 용도에 적용할 수 있다. 생체고분자로는 시토크롬(cyt) C, 및 cyt C와 유사한 분자량 및 등전위점을 갖는 섬유아세포 성장인자 등의 생리활성 단백질을 칼슘 포스페이트 박막에 결합하여 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 생체고분자/아파타이트 나노 복합체는 치과 및 정형외과 임플란트 등과 같이 골접합을 필요로 하는 생체 이식 재료로 유용하게 사용할 수 있다.The present invention relates to a biopolymer / apatite nanocomposite in which biopolymers are immobilized on a calcium phosphate thin film formed by electron beam deposition, and a method of manufacturing the same. The biopolymer / apatite nanocomposite according to the present invention promotes bone formation by combining biopolymers with calcium phosphate thin films formed by electron beam deposition, and can be applied to various applications by using calcium phosphate thin films instead of bulk materials. As the biopolymer, physiologically active proteins such as cytochrome C and fibroblast growth factor having a molecular weight and isoelectric point similar to that of cyt C may be used in combination with the calcium phosphate thin film. Therefore, the biopolymer / apatite nanocomposite according to the present invention can be usefully used as a biograft material requiring bone bonding, such as dental and orthopedic implants.
임플란트, 티타늄, 칼슘 포스페이트, 전자빔, 증착, 생체고분자, 아파타이트 Implant, Titanium, Calcium Phosphate, Electron Beam, Deposition, Biopolymer, Apatite
Description
본 발명은 전자빔 증착에 의해 형성된 칼슘 포스페이트 박막 상에 생체고분자를 고정화시킨 생체고분자/아파타이트 나노 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 전자빔 증착에 의해 형성된 칼슘 포스페이트 박막에 생체고분자를 결합함으로써 골 형성을 촉진하고, 벌크한 물질 대신 칼슘 포스페이트 박막을 사용함으로써 치과 및 정형외과 임플란트 등과 같이 골접합을 필요로 하는 생체 이식 재료로 유용하게 사용할 수 있는 생체고분자/아파타이트 나노 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a biopolymer / apatite nanocomposite in which biopolymers are immobilized on a calcium phosphate thin film formed by electron beam deposition, and to a method for preparing the same, and more particularly, by combining the biopolymer with a calcium phosphate thin film formed by electron beam deposition. Biopolymer / apatite nanocomposites and methods for preparing the same, which can be used as a biograft material that requires bone bonding, such as dental and orthopedic implants, by promoting bone formation and using a thin film of calcium phosphate instead of bulk materials will be.
인간의 평균수명 연장과 함께 고령화 시대로 접어들면서 인공골, 인공치아 또는 인공 고·슬관절 등의 골조직 대체재료의 수요가 빠르게 증가하고 있다. 따라서, 골조직 대체재료의 개발 및 개선을 위하여 많은 연구가 이루어지고 있으며, 이러한 목적으로 개발된 합성 고분자, 티타늄, 히드록시아파타이트와 같은 여러 종류 의 생체재료들이 조직 및 인공장기를 대체하기 위하여 사용되고 있다. 특히, 히드록시아파타이트(HAp; Ca10(PO4)6(OH)2)는 크기, 결정도, 형태에 있어서 실제 뼈 조직과 가장 유사하기 때문에, 노화 또는 사고에 의해 손상된 뼈 조직을 대체하는 물질로 널리 활용되고 있을 뿐만 아니라, 생체적합성이 우수하여 정형외과용 혹은 치과용 임플란트의 표면특성을 향상시켜 뼈 생성을 개선하기 위한 코팅물질로도 널리 이용되고 있다.As the average life expectancy of human beings enters the age of aging, the demand for bone substitutes such as artificial bones, artificial teeth or artificial knee and knee joints is increasing rapidly. Therefore, many studies have been made for the development and improvement of bone tissue substitute materials, and various kinds of biomaterials such as synthetic polymers, titanium, and hydroxyapatite developed for this purpose have been used to replace tissues and artificial organs. In particular, hydroxyapatite (HAp; Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ) is a substance that replaces bone tissue damaged by aging or accidents because it is most similar to actual bone tissue in size, crystallinity, and shape. In addition to being widely used as a coating material, it is widely used as a coating material for improving bone formation by improving the surface properties of orthopedic or dental implants due to its excellent biocompatibility.
생체재료는 생리적 환경과 접촉하고 상호작용하기 때문에, 이의 표면 특성은 특정 용도에서 생체적합성을 결정하는데 중요한 역할을 한다. 따라서, 생체재료의 표면 특성을 향상시키기 위해 다양한 방법이 연구되어 왔으며, 그 중에서도 특히 골이식의 골유착에 대한 연구가 가장 활발히 연구되고 있다.Because biomaterials contact and interact with the physiological environment, their surface properties play an important role in determining biocompatibility in certain applications. Therefore, various methods have been studied to improve the surface properties of biomaterials, and among them, research on bone adhesion of bone grafts is particularly actively studied.
골유착성에 기초한 금속 임플란트는 1969년 스웨덴에서 최초로 시술된 이래, 티타늄 및 이의 합금이 가장 우수한 임상 결과를 보이고 있다. 티타늄 및 이의 합금은 우수한 생체적합성을 가질 뿐만 아니라 내식성, 내구력, 및 강도 등의 우수한 기계적 특성을 갖고 있기 때문에 인공 치근 (artificial tooth roots) 또는 인공 관절(joint prosthesis)과 같은 생체이식재료로 널리 사용되고 있다. 그러나, 티타늄에는 생체활성이 없기 때문에 골 생성반응이 느려 치유기간이 길고, 골과 임플란트 사이의 접착력이 약한 단점이 있다. 따라서 이러한 결점을 해결하기 위하여 임플란트의 표면적을 늘리고 표면형상을 변화시키거나 물리적 및 화학적 표면처리를 통하여 골결합력을 향상시키고자 하는 연구가 진행되어 왔으나, 티타늄이 지닌 물 질적인 한계를 극복하지 못하고 있다. 따라서 1990년대 이후, 골과의 유착율을 높이면서 임플란트 주위골의 흡수를 최소화하고 또 주변 연조직과의 친화성과 결합력을 더 좋게 하기 위한 방법으로 다양한 표면개질 시도가 꾸준히 이루어지고 있다. 최근에는, 티타늄 금속의 양극 산화 처리가 많은 관심을 받고 있다([1] Das K et al., Acta Biomater . 2007;3:573-85; [2] Park KH et al., J. Oral Rehabil . 2007;34:517-27; [3] Park YJ et al., Appl . Surf . Sci . 2007;253:6013-8; [4] Cheng FT et al., J. Alloy Compd . 2007;438:238-42; [5] Sohn SH et al., J. Oral Rehabil. 2006;33:898-911).Metallic implants based on osteoadhesiveness have had the best clinical results with titanium and its alloys since it was first performed in Sweden in 1969. Titanium and its alloys are widely used as biografts such as artificial tooth roots or joint prosthesis because they have excellent mechanical properties such as corrosion resistance, durability, and strength as well as excellent biocompatibility. However, since titanium has no bioactivity, the bone formation reaction is slow and the healing period is long, and adhesion between the bone and the implant is weak. Therefore, in order to solve these drawbacks, studies have been conducted to increase the surface area of implants, change the surface shape, or improve bone bonding strength through physical and chemical surface treatments, but do not overcome the material limitations of titanium. . Therefore, since the 1990s, various surface modification attempts have been made in a way to minimize the absorption of the bone around the implant while improving the adhesion rate with the bone and to improve the affinity and bonding strength of the surrounding soft tissues. Recently, anodic oxidation treatment of titanium metals has received much attention ([1] Das K et al., Acta Biomater . 2007; 3: 573-85; [2] Park KH et al., J. Oral Rehabil . 2007; 34: 517-27; [3] Park YJ et al., Appl . Surf . Sci . 2007; 253: 6013-8; [4] Cheng FT et al., J. Alloy Compd . 2007; 438: 238-42; [5] Sohn SH et al., J. Oral Rehabil. 2006; 33: 898-911).
박 등(Park et al.)은 양극처리된 티타늄 임플란트가 기계가공 임플란트에 비해 더 높은 비틀림 제거력(removal torque values)을 가지고, 임플란트에 대한 뼈의 접촉면(bone-to-implant contact) 및 나사선 중 뼈의 영역면에서 모두 더 높은 퍼센트를 가지는 것으로 나타났다고 보고했다(Park KH et al., J. Oral Rehabil. 2007;34:517-27). 한편, 칼슘 포스페이트는 일반적으로 빠른 고정을 위한 코팅 물질로서 금속 임플란트에 적용되어져 그것이 나타내는 생체 반응성과 골전도성에 의하여 임플란트-뼈 부착을 견고하게 한다. 최근에, 다양한 Ca/P 비율을 가진 얇은 칼슘 포스페이트 박막이 전자빔 증착에 의해 제작되어졌으며, 이들 박막은 우수한 결합 강도를 가지고, Ca/P 비율에 의존하여 다른 용해 거동(dissolution behaviors)을 나타냈다([1] Lee IS et al., Mater Sci Eng C 2002;22:15-20; [2] Lee IS et al., Biomaterials 2002;23:609-15; [3] Lee IS et al., Surf . Coat . Technol. 2000;131:181-6).Park et al. Noted that anodized titanium implants have higher removal torque values than machined implants, and bone-to-implant contacts to bone implants and bones in the thread It was reported that all of them had higher percentages (Park KH et al., J. Oral Rehabil. 2007; 34: 517-27). Calcium phosphate, on the other hand, is generally applied to metal implants as a coating material for fast fixation, thereby stiffening the implant-bone attachment by the bioreactivity and osteoconductivity it exhibits. Recently, thin calcium phosphate thin films with various Ca / P ratios have been fabricated by electron beam deposition, which have excellent bond strengths and exhibit different dissolution behaviors depending on the Ca / P ratio ([ 1] Lee IS et al., Mater Sci Eng C 2002; 22: 15-20; [2] Lee IS et al., Biomaterials 2002; 23: 609-15; [3] Lee IS et al., Surf . Coat . Technol. 2000; 131: 181-6).
현재 사용되고 있는 금속 임플란트의 표면 개질을 위한 칼슘 포스페이트 코팅방법으로는 플라즈마 분사법, 분말 소결(powder sintering), 산 에칭, 입자분사 (blasting), 마이크로-아크 양극 산화(micro-arc anodic oxidation), 이온빔 스퍼터링 증착법, 펄스 레이저 증착법(pulsed laser deposition) 및 이온빔 보조 증착법(ion-beam-assisted deposition; IBAD) 등이 있다. 그러나 상기와 같은 방법으로 금속 임플란트의 표면을 칼슘 포스페이트로 코팅하는 방법은 제조에 상당한 시간이 필요하며, 코팅시의 조건이 인체에서 뼈 조직이 생성될 때의 환경, 즉, 온도, pH 등과 다르다는 문제점이 있다. 이러한 방법들은 제조과정에서 뿐만 아니라 실제적인 응용 측면에 있어서도 상당한 제한을 갖는데, 예를 들면 플라즈마 분사법은 굴곡이 심하거나 다공성이 높은 표면을 갖는 구조의 인체 삽입물을 대상으로 하는 경우 표면에 칼슘 포스페이트 박막을 균일하게 형성하는 것이 매우 어렵고 처리공정의 온도가 매우 높기 때문에 고온에서 형성된 칼슘 포스페이트 박막은 천연의 뼈 조직보다 훨씬 더 높은 결정성을 가지게 되고, 산화물 등과 같은 불순물들이 포함될 수 있어 실제 뼈 조직과 상당히 다른 박막이 형성될 수 있다.Calcium phosphate coating methods for surface modification of currently used metal implants include plasma spraying, powder sintering, acid etching, particle spraying, micro-arc anodic oxidation, and ion beam Sputter deposition, pulsed laser deposition, and ion-beam-assisted deposition (IBAD). However, the method of coating the surface of the metal implant with calcium phosphate in the above manner requires a considerable time for manufacturing, the conditions that the coating conditions differ from the environment when bone tissue is produced in the human body, that is, temperature, pH, etc. There is this. These methods have significant limitations not only in the manufacturing process but also in practical applications. For example, plasma spraying involves the use of thin films of calcium phosphate on the surface when targeting human implants with structures that have highly curved or highly porous surfaces. Because it is very difficult to form uniformly and the process temperature is very high, the calcium phosphate thin film formed at high temperature has much higher crystallinity than natural bone tissue, and it may contain impurities such as oxide, which is quite different from actual bone tissue. Other thin films can be formed.
따라서, 결정성이 낮고 생체 반응성이 좋은 칼슘 포스페이트 박막을 생체 친화적으로 형성할 수 있는 방법에 대한 연구가 절실히 요구되고 있다.Therefore, there is an urgent need for a method of forming a calcium phosphate thin film having low crystallinity and good bioreactivity in a biocompatible manner.
코팅의 안정도와 관련하여, 인산염생리식염완충액(PBS)(Boyd AR et al., Surf. Coat . Tech . 2006;200:6002-13), HBSS(Hank's balanced salt solution)([1] Heimann RB et al., Materialwiss Werksttech 2001;32:913-21; [2] Marques P et al., J. Mater . Chem . 2003;13:1484-90), 및 코쿠보의 유사생체용액(Kokubo's simulated body fluid (SBF))([1] Marques P et al., J. Mater . Chem . 2003;13:1484-90; [2] Ding SJ et al., J. Biomed . Mater . Res . 1999;47:551-63)과 같은 혈장의 무기 분획과 유사한 이온 조성을 가진 용액 중에서 칼슘 포스페이트 코팅의 액침 거동(immersion behavior)을 조사하기 위한 많은 노력들을 기울여 왔다. 이러한 시험관 내 연구들은 코팅의 생체 내 거동에 대한 얼마간의 암시를 줄 수 있다는 점에서 실질적으로 중요하다. 이들은 특별히 얇은 코팅 층에 대해 수행되어졌다. 결과적으로, 이러한 테스트들은 뼈와 유사한(bone-like) 아파타이트 층의 형성을 통한 잠재적인 생체재료의 생체 반응성을 평가하기 위한 첫 번째 단계로서 수행된다([1] Wei DQ et al., Surf . Coat . Tech . 2007;201:8715-22; [2] Wong MH et al., Appl . Surf . Sci . 2007;253:7527-34; [3] Sandrini E et al., J. Mater. Sci . Mater . Med . 2007;18:1225-37).Regarding the stability of the coating, phosphate physiological salt buffer (PBS) (Boyd AR et al., Surf. Coat . Tech . 2006; 200: 6002-13), HBSS (Hank's balanced salt solution) [1] Heimann RB et al., Materialwiss Werksttech 2001; 32: 913-21; [2] Marques P et al., J. Mater . Chem . 2003; 13: 1484-90), and Kokubo's simulated body fluid ( SBF)) ([1] Marques P et al., J. Mater . Chem . 2003; 13: 1484-90; [2] Ding SJ et al., J. Biomed . Mater . Res . 1999; 47: 551- Many efforts have been made to investigate the immersion behavior of calcium phosphate coatings in solutions with ionic compositions similar to inorganic fractions of plasma such as 63). These in vitro studies are of substantial importance in that they may give some indication of the in vivo behavior of the coating. These have been carried out especially for thin coating layers. As a result, these tests are performed as a first step to assess the bioreactivity of potential biomaterials through the formation of a bone-like apatite layer (1) Wei DQ et al., Surf . Coat . Tech 2007; 201:. 8715-22 ; [2] Wong MH et al, Appl Surf Sci 2007; 253:....... 7527-34; [3] Sandrini E et al, J. Mater Sci Mater . Med 2007; 18:. 1225-37 ).
한편, 생체재료와 함께 일정한 생물학적으로 활성인 단백질을 첨가하는 것이 재료의 생체 반응성을 향상시킬 것이라는 점은 의심할 여지가 없다. 몇몇의 단백질들과, 특별히 성장인자들이 잠재적인 골형성 유도인자인 것으로 나타났다. 섬유아세포 성장인자(bFGF)는 골 형성 과정에 결정적인 특성을 가지는, 몇몇의 잘 특성화된 성장 인자들 중 하나이다(Zellin G et al., Bone 2000;26:161-8). 그러므로, 생리활성 단백질과 결합된 생체재료는 의용생체공학(biomedical engineering) 및 조직공학(tissue engineering) 분야에서 전도유망하다. 따라서, 연구자들은 물리적 흡수, 정전기적 자기 조립(electrostatic self-assembly) 및 화학적 교차결합(chemical crosslink)과 같은, 단백질을 수반하는 기질을 생산하기 위한 다양한 방법을 찾기 위해 노력하여 왔다. 단단하고 고밀도로 고정화된 단백질은 임플란트에 세포 부착을 향상시켜, 마침내 조직-임플란트 부착을 형성한다. On the other hand, there is no doubt that adding certain biologically active proteins with biomaterials will enhance the bioreactivity of the material. Several proteins, especially growth factors, have been shown to be potential osteoinducers. Fibroblast growth factor (bFGF) is one of several well characterized growth factors that are critical for the bone formation process (Zellin G et al., Bone 2000; 26: 161-8). Therefore, biomaterials combined with bioactive proteins are promising in the fields of biomedical engineering and tissue engineering. Thus, researchers have sought to find a variety of methods for producing substrates involving proteins, such as physical absorption, electrostatic self-assembly, and chemical crosslinks. Tight, high-density immobilized proteins enhance cell adhesion to the implant, eventually forming tissue-implant attachment.
섬유아세포 성장인자(bFGF 또는 FGF-2)는 골형성 및 상처-치유 과정에서 결정적 특성을 갖는다. FGF-2의 지속 방출을 위해, 히드록시아파타이트 및 생체분해성 고분자를 포함하는 다른 지지체를 FGF-2의 담체로 사용하여 왔다. 시토크롬 C (cyt C, 12.3 kDa, pI=10)의 분자량 및 등전위점(isoelectric point)은 FGF-2(18 kDa, pI=9.6)의 분자량 및 등전위점과 거의 동일하기 때문에, cyt C는 FGF-2를 위한 가상 단백질로 사용될 수 있다.Fibroblast growth factor (bFGF or FGF-2) has decisive properties during bone formation and wound-healing. For the sustained release of FGF-2, other supports including hydroxyapatite and biodegradable polymers have been used as carriers of FGF-2. Since the molecular weight and isoelectric point of cytochrome C (cyt C, 12.3 kDa, pI = 10) are almost identical to the molecular weight and isoelectric point of FGF-2 (18 kDa, pI = 9.6), cyt C is FGF- Can be used as a hypothetical protein for two.
지금까지, 단백질은 단백질을 함유하고 있는 과포화 칼슘 포스페이트 용액 내에 생체재료를 담금으로써, 다양한 기질 위에 형성되어 있는 단백질-아파타이트 복합층에 단단히 고정화되어 왔다. 소고(Sogo) 등은 임플란트의 표면 위에 활성 분자와 아파타이트의 공침을 형성하기 위해 생리적 온도에서 cyt C를 함유하고 있는 과포화 칼슘 포스페이트 용액 내에 히드록시아파타이트 세라믹을 담금으로써 균질하게 골 같은 아파타이트층 내에 cyt C를 결합하는 표면 개질 방법을 개발하였다[Y. Sogo, A. Ito, K. Fukasawa, N. Kondo, Y. Ishikawa, N. Ichinose, A. Yamazaki, Curr. Appl. Phys. 5 (2005) 526-530]. 그러나, 상기 방법은 히드록시아파타이트 세라믹과 같은 벌크한 물질을 그대로 사용함으로써 칼슘 포스페이트 막의 형성속도를 조절하기 어렵고 다양한 용도로 적용하지 못하는 문제점이 있다.Up to now, proteins have been firmly immobilized on protein-apatite composite layers formed on various substrates by immersing the biomaterial in a supersaturated calcium phosphate solution containing the protein. Sogo et al. Cyt C in a homogeneous bone-like apatite layer by immersing the hydroxyapatite ceramic in a supersaturated calcium phosphate solution containing cyt C at physiological temperature to form co-precipitation of active molecules and apatite on the surface of the implant. A surface modification method was developed that combines [Y. Sogo, A. Ito, K. Fukasawa, N. Kondo, Y. Ishikawa, N. Ichinose, A. Yamazaki, Curr. Appl. Phys. 5 (2005) 526-530. However, the method is difficult to control the formation rate of the calcium phosphate film by using a bulk material such as hydroxyapatite ceramics, and there is a problem that can not be applied to various applications.
본 발명자들은 상기한 문제점들을 해결하기 위하여 생체재료의 표면 개질 방법에 대해 연구하던 중, 히드록시아파타이트 세라믹과 같은 벌크한 물질 대신 전자 빔 증착에 의해 형성된 칼슘 포스페이트 박막을 시토크롬 C, 섬유아세포 성장인자 등과 같은 생체고분자와 결합함으로써 골 형성을 촉진하고 다양한 용도에 적용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.In order to solve the above problems, the present inventors have studied the surface modification method of the biomaterial, and instead of the bulk material such as hydroxyapatite ceramics, the calcium phosphate thin film formed by electron beam deposition, cytochrome C, fibroblast growth factor, etc. By combining with the same biopolymer, it was confirmed that it can promote bone formation and can be applied to various applications, and completed the present invention.
본 발명의 목적은 전자빔 증착에 의해 형성된 칼슘 포스페이트 박막 상에 생체고분자를 고정화시킨 생체고분자/아파타이트 나노 복합체을 제공하고자 하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a biopolymer / apatite nanocomposite in which biopolymers are immobilized on a calcium phosphate thin film formed by electron beam deposition.
본 발명의 다른 목적은 전자빔 증착에 의해 형성된 칼슘 포스페이트 박막 상에 생체고분자를 고정화시킴으로써 생체고분자/아파타이트 나노 복합체를 제조하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for preparing a biopolymer / apatite nanocomposite by immobilizing the biopolymer on a calcium phosphate thin film formed by electron beam deposition.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 첫 번째 양태에서는 전자빔 증착에 의해 형성된 칼슘 포스페이트 박막 상에 생체고분자를 고정화시킨 생체고분자/아파타이트 나노 복합체를 제공한다.In order to achieve the above object, the first aspect of the present invention provides a biopolymer / apatite nanocomposite in which a biopolymer is immobilized on a calcium phosphate thin film formed by electron beam deposition.
또한, 본 발명의 두 번째 양태에서는 In addition, in the second aspect of the present invention,
1) 전자빔 증착을 통해 칼슘 포스페이트를 기질에 증착하고 열처리하여 칼슘 포스페이트 박막을 제조하는 단계,1) preparing a calcium phosphate thin film by depositing calcium phosphate on the substrate and heat treatment through electron beam deposition,
2) 초순수 물에 둘베코 인산염 완충용액 및 CaCl2를 녹여 DPBS 용액을 제조하는 단계,2) dissolving Dulbecco's phosphate buffer solution and CaCl 2 in ultrapure water to prepare a DPBS solution,
3) 상기 2)단계에서 제조한 DPBS 용액에 생체고분자를 첨가하여 생체고분자를 함유한 DPBS 용액을 제조하는 단계, 및3) preparing a DPBS solution containing the biopolymer by adding the biopolymer to the DPBS solution prepared in step 2), and
4) 상기 1)단계에서 제조한 칼슘 포스페이트 박막을 상기 생체고분자를 함유한 DPBS 용액에 담궈 생체고분자를 칼슘 포스페이트 박막에 고정화시키는 단계를 포함하는 생체고분자/아파타이트 나노 복합체의 제조방법을 제공한다.4) It provides a method for producing a biopolymer / apatite nanocomposite comprising the step of immobilizing the calcium phosphate thin film prepared in step 1) in a DPBS solution containing the biopolymer to the calcium phosphate thin film.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명에 따른 생체고분자/아파타이트 나노 복합체는 전자빔 증착에 의해 형성된 칼슘 포스페이트 박막 상에 생체고분자를 고정화시킨 것을 특징으로 한다.The biopolymer / apatite nanocomposite according to the present invention is characterized in that the biopolymer is immobilized on a calcium phosphate thin film formed by electron beam deposition.
상기 생체고분자는 시토크롬 C 또는 cyt C와 유사한 분자량 및 등전위점을 갖는 섬유아세포 성장인자(bFGF 또는 FGF-2), 펩타이드, 라미닌(laminin) 등의 생리활성 단백질을 포함한다.The biopolymer includes bioactive proteins such as fibroblast growth factor (bFGF or FGF-2), peptides, laminin, etc., which have a molecular weight and isoelectric point similar to that of cytochrome C or cyt C.
상기 펩타이드로는 하기를 사용할 수 있다:As the peptide, the following may be used:
RGD: Arg-Gly-Asp 세 개의 아미노산이 연결된 트리펩타이드로서, cell attatchment에 주로 영향을 줌RGD: Arg-Gly-Asp is a tripeptide linked to three amino acids that mainly affect cell attatchment
OGP(osteogenic growth peptide): osteoblast 분화유도Osteogenic growth peptide (OPP): osteoblast differentiation induction
TP508: osteoblast 분화유도 (Chrysalin® MW=2,311; AGYKPDEGKRGDACEGDSGGPFV)TP508: osteoblast differentiation induction (Chrysalin ® MW = 2,311; AGYKPDEGKRGDACEGDSGGPFV)
본 발명에 따른 생체고분자/아파타이트 나노 복합체의 제조방법을 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the method of preparing the biopolymer / apatite nanocomposite according to the present invention will be described in detail.
상기 1)단계는 전자빔 증착에 의해 칼슘 포스페이트 박막을 제조하는 단계로, 칼슘 포스페이트를 기질 위에 전자빔으로 증착시킨 후 열처리함으로써 수행될 수 있다. Step 1) is a step of preparing a calcium phosphate thin film by electron beam deposition, it can be performed by depositing calcium phosphate on the substrate by an electron beam and then heat treatment.
본 발명에서, 상기 증착된 칼슘 포스페이트의 열처리는 300 내지 800℃의 온도에서 수행할 수 있다.In the present invention, the heat treatment of the deposited calcium phosphate may be carried out at a temperature of 300 to 800 ℃.
본 발명에서, 상기 열처리시 가열속도는 5℃/min으로 수행할 수 있다.In the present invention, the heating rate during the heat treatment may be carried out at 5 ℃ / min.
본 발명에서, 상기 열처리는 1시간 동안 유지시키는 것이 바람직하며, 열처리 후에는 냉각시켜 기질 위에 증착된 칼슘 포스페이트 박막을 얻는다. In the present invention, the heat treatment is preferably maintained for 1 hour, and after the heat treatment is cooled to obtain a calcium phosphate thin film deposited on the substrate.
본 발명의 일 실시예로서, 기질 위에 증착된 칼슘 포스페이트 박막은 기질의 기계가공표면(machined surface) 위에 전자빔으로 증착된 칼슘 포스페이트 박막을 가열로에서 5℃/min의 가열속도로 700℃로 가열시킨 다음 냉각시켜 제조할 수 있다(M700).In one embodiment of the present invention, the calcium phosphate thin film deposited on the substrate is heated to 700 ℃ at a heating rate of 5 ℃ / min in a heating furnace of the calcium phosphate thin film deposited by electron beam on the machined surface of the substrate It can be prepared by cooling (M700).
본 발명의 다른 일 실시예로서, 기질 위에 증착된 칼슘 포스페이트 박막은 기질의 양극처리표면(anodized surface) 위에 전자빔으로 증착된 칼슘 포스페이트 박막을 가열로에서 5℃/min의 가열속도로 450℃로 가열시킨 다음 냉각시켜 제조할 수 있다(A450).In another embodiment of the present invention, the calcium phosphate thin film deposited on the substrate is heated to 450 ° C. at a heating rate of 5 ° C./min in a heating furnace by heating the calcium phosphate thin film deposited by electron beam on the anodized surface of the substrate. It may be prepared by cooling (A450).
본 발명의 또 다른 일 실시예로서, 기질 위에 증착된 칼슘 포스페이트 박막은 기질의 양극처리표면 위에 전자빔으로 증착된 칼슘 포스페이트 박막을 진공에서 5℃/min의 가열속도로 350℃로 가열시킨 다음 냉각시켜 제조할 수 있다(A350).In another embodiment of the present invention, the calcium phosphate thin film deposited on the substrate is heated by heating the calcium phosphate thin film deposited by electron beam on the anodized surface of the substrate to 350 ℃ at a heating rate of 5 ℃ / min and then cooled It may be prepared (A350).
본 발명에서, 기질로는 금속, 세라믹 및 유리 등을 포함할 수 있으며, 특히, 금속, 그 중에서도 티타늄을 사용하는 것이 바람직하다.In the present invention, the substrate may include metals, ceramics, glass, and the like, and in particular, it is preferable to use metals, especially titanium.
상기 3)단계는 생체고분자를 함유하는 DPBS 용액을 제조하는 단계로, 시토크롬 C(cyt C, 12.3 kDa, pI=10), 및 cyt C와 유사한 분자량 및 등전위점 (isoelectric point)을 갖는 섬유아세포 성장인자(bFGF 또는 FGF-2), 펩타이드, 라미닌 등의 생리활성 단백질을 사용할 수 있다.Step 3) is a step of preparing a DPBS solution containing a biopolymer, fibroblast growth having a molecular weight and isoelectric point similar to cytochrome C (cyt C, 12.3 kDa, pi = 10), and cyt C Bioactive proteins such as factors (bFGF or FGF-2), peptides, laminin can be used.
본 발명에서, DPBS 용액은 칼슘과 마그네슘이 제거된(Calcium/Magnesium free) 것을 사용하는 것이 바람직하다.In the present invention, the DPBS solution is preferably used to remove calcium and magnesium (Calcium / Magnesium free).
상기 4)단계는 칼슘 포스페이트 박막에 생체고분자를 결합하는 단계로, 상기 1)단계에서 제조한 칼슘 포스페이트 박막을 각각 1~3일, 가장 바람직하기로는 2일 동안, 35~38℃, 가장 바람직하기로는 37℃에서, 생체고분자를 함유한 DPBS 용액에 담궈 생체고분자를 칼슘 포스페이트 박막에 고정화시킨다.Step 4) is a step of binding the biopolymer to the calcium phosphate thin film, the calcium phosphate thin film prepared in step 1), respectively, 1 to 3 days, most preferably 2 days, 35 ~ 38 ℃, most preferably to Is soaked in DPBS solution containing biopolymers at 37 ° C. to immobilize the biopolymers on a thin film of calcium phosphate.
본 발명의 방법에 따라 얻어진 cyt C-칼슘 포스페이트 복합층에 따르면, 시료 A350의 경우 결합된 시토크롬 C의 양이 최대이며, cyt C-칼슘 포스페이트 복합층의 표면 형태 변화는 박편 같은 결정이 칼슘 포스페이트 박막의 표면을 덮는다. 결정의 형태학적 변화를 살펴보면, 시료 A450 및 A350 간에는 무시할 정도의 차이가 있으나 시료 M700 위에서는 결정이 다른 시료들에 비해 점점 더욱 크게 성장한다. 또한, cyt C-칼슘 포스페이트 복합층을 광전자 분광기로 관찰한 결과, 시토크롬 C에 존재하는 질소가 3개의 시료 (M700, A450, A350)에서 모두 관찰되어 cyt C 와 결합한 얇은 새로운 칼슘 포스페이트 층이 3개의 시료군 모두에서 형성됨을 알 수 있다. 또한, 시료(M700, A450, A350)를 생리식염수에 담그면, 시토크롬 C가 칼슘 포스페이트 박막 표면 위에 새롭게 형성된 cyt C-칼슘 포스페이트 복합층으로부터 서서히 방출되고 10일 동안 계속 방출된다. 시료 A350의 경우 cyt C의 방출 속도는 10일의 모든 기간에 걸쳐 다소 일정하게 체류하여 cyt C-칼슘 포스페이트 복합층 내 cyt C의 결합은 균질하게 된다. 시료를 37℃에서 3일 동안 생리식염수에 담근 후 cyt C-칼슘 포스페이트 복합층의 표면 형태 변화는 칼슘 포스페이트 층의 용해를 가리키는 것으로, 시료(M700, A450, A350)를 DPBSC 용액에 담구었을 때 진공에서 가열된 시료(A350) 위에 증착된 칼슘 포스페이트의 용해는 공기 중에서 가열된 시료(A450) 위에서 보다 더 쉽게 용해된다. 용해와 침전은 용액 내에서 동시에 발생한다. 따라서, 증착된 칼슘 포스페이트가 용해하면 칼슘 포스페이트가 시료의 표면 위에 침전된다. 용해가 더 쉽게 발생할수록, 칼슘 및 포스페이트 이온이 용액 속에 더 있게 되고, cyt C-아파타이트 복합층이 시료의 표면 위에 더 형성될 것이다. 따라서, 시료 A350이 가장 많은 양의 cyt C와 결합됨을 알 수 있다.According to the cyt C-calcium phosphate composite layer obtained according to the method of the present invention, in the case of sample A350, the amount of bound cytochrome C is the maximum, and the surface morphological change of the cyt C-calcium phosphate composite layer is a flake-like calcium phosphate thin film. Cover the surface of the. Looking at the morphological changes of the crystals, there is a negligible difference between Samples A450 and A350, but on Sample M700 the crystals grow larger and larger than other samples. In addition, when the cyt C-calcium phosphate composite layer was observed with an photoelectron spectrophotometer, nitrogen present in the cytochrome C was observed in all three samples (M700, A450, A350), resulting in three thin new calcium phosphate layers bound to cyt C. It can be seen that it is formed in both sample groups. In addition, when samples (M700, A450, A350) are immersed in physiological saline, cytochrome C is slowly released from the newly formed cyt C-calcium phosphate composite layer on the calcium phosphate thin film surface and continues to be released for 10 days. For sample A350, the release rate of cyt C stays somewhat constant over all 10 days, resulting in homogeneous binding of cyt C in the cyt C-calcium phosphate composite layer. The change in surface morphology of the cyt C-calcium phosphate composite layer after immersing the sample in physiological saline for 3 days at 37 ° C indicates the dissolution of the calcium phosphate layer, and the sample (M700, A450, A350) was immersed in DPBSC solution in vacuum. Dissolution of the calcium phosphate deposited on the heated sample A350 is more readily dissolved on the heated sample A450 in air. Dissolution and precipitation occur simultaneously in solution. Thus, when the deposited calcium phosphate dissolves, calcium phosphate precipitates on the surface of the sample. The easier dissolution occurs, the more calcium and phosphate ions will be in solution and the more cyt C-apatite composite layer will form on the surface of the sample. Thus, it can be seen that Sample A350 is combined with the largest amount of cyt C.
본 발명에서, 전자 빔 증착에 의한 칼슘 포스페이트 증착은 양극처리된 Ti 표면의 다공성 형태를 변화시키지 않는다. 또한, DPBS 용액내에서 배양함으로써, 전자 빔 증착에 의해 코팅된 칼슘 포스페이트 상에 새로운 아파타이트 층이 쉽게 형성됨을 확인할 수 있다. 더 나아가, DPBS 용액에 bFGF를 첨가하고 여기에 전자 빔 증착에 의해 형성된 칼슘 포스페이트 박막을 배양함으로써, bFGF를 새롭게 형성 된 아파타이트 층 안에 고정화시킬 수 있다. 전자 빔 증착을 통한 양극처리된 표면과 칼슘 포스페이트 증착물의 결합은 생체내 골유착 상에 상승적 효과를 보여준다.In the present invention, calcium phosphate deposition by electron beam deposition does not change the porous morphology of the anodized Ti surface. In addition, by culturing in DPBS solution, it can be seen that a new apatite layer is easily formed on the coated calcium phosphate by electron beam deposition. Furthermore, bFGF can be immobilized in the newly formed apatite layer by adding bFGF to the DPBS solution and incubating the thin film of calcium phosphate formed by electron beam deposition. The combination of anodized surface and calcium phosphate deposits via electron beam deposition shows a synergistic effect on osteointegration in vivo.
본 발명에서, 1일 동안 FGF-2가 없는 DPBS 용액에 담근 시료 표면과 비교했을 때, FGF-2가 혼합된 시료의 표면 형태는 더욱 균질하고 더욱 미세하다. 이는 용액에 bFGF가 존재하기 때문이다. bFGF 분자는 한편으로, 균질한 결정의 핵을 제공하고, 다른 한편으로, 새롭게 형성된 결정의 공간을 유지하고 결정의 성장을 억제함으로써 더욱 균질하고 더욱 미세한 표면을 형성하도록 유도한다.In the present invention, the surface morphology of the sample mixed with FGF-2 is more homogeneous and finer when compared to the sample surface soaked in DPBS solution without FGF-2 for 1 day. This is due to the presence of bFGF in the solution. The bFGF molecule, on the one hand, provides the nuclei of homogeneous crystals and, on the other hand, leads to the formation of more homogeneous and finer surfaces by maintaining the space of newly formed crystals and inhibiting the growth of crystals.
결과적으로, 본 발명에 따른 생체고분자/아파타이트 나노 복합체는 전자빔 증착에 의해 형성된 칼슘 포스페이트 박막에 생체고분자를 결합함으로써 골 형성을 촉진하고, 벌크한 물질 대신 칼슘 포스페이트 박막을 사용함으로써 다양한 용도에 적용할 수 있다. 생체고분자로는 cyt C, 및 cyt C와 유사한 분자량 및 등전위점을 갖는 생리활성 단백질을 칼슘 포스페이트 박막에 결합하여 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 생체고분자/아파타이트 나노 복합체는 치과 및 정형외과 임플란트 등과 같이 골접합을 필요로 하는 생체 이식 재료로 유용하게 사용할 수 있다.As a result, the biopolymer / apatite nanocomposite according to the present invention promotes bone formation by binding biopolymers to calcium phosphate thin films formed by electron beam deposition, and can be applied to various applications by using calcium phosphate thin films instead of bulk materials. have. As the biopolymer, cyt C and a bioactive protein having a molecular weight and isoelectric point similar to that of cyt C may be used in combination with the calcium phosphate thin film. Therefore, the biopolymer / apatite nanocomposite according to the present invention can be usefully used as a biograft material requiring bone bonding, such as dental and orthopedic implants.
본 발명에 따른 생체고분자/아파타이트 나노 복합체는 전자빔 증착에 의해 형성된 칼슘 포스페이트 박막에 생체고분자를 결합함으로써 골 형성을 촉진하고, 벌크한 물질 대신 칼슘 포스페이트 박막을 사용함으로써 다양한 용도에 적용할 수 있다. 특히, 치과 및 정형외과 임플란트와 같이 골접합을 필요로 하는 생체 이식 재료로 유용하게 사용할 수 있다.The biopolymer / apatite nanocomposite according to the present invention promotes bone formation by combining biopolymers with calcium phosphate thin films formed by electron beam deposition, and can be applied to various applications by using calcium phosphate thin films instead of bulk materials. In particular, it can be usefully used as a living implant material requiring bone bonding, such as dental and orthopedic implants.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the examples.
실시예Example 1 One : : 시토크롬Cytochrome C-칼슘 C-calcium 포스페이트Phosphate 복합층의Composite 제조 Produce
1. 칼슘 Calcium 포스페이트Phosphate 박막의 제조 Manufacture of thin film
상업적으로 이용할 수 있는, 다양한 표면처리를 한 순수한 Ti 디스크(10㎜의 직경 및 2㎜의 두께)를 기질로 사용하였다. 상기 Ti 디스크를 각각 전자빔 증착기(10kW 급, 가속전압 : 7.5kV, 가속전류 : 140mA, 증착시간 : 1시간 내외)에 넣고 칼슘 포스페이트로 전자빔 증착하여, 칼슘 포스페이트 박막을 500㎚의 두께로 각각 Ti 디스크 위에 증착하였다. 증착 후 열처리하여 1시간 동안 유지시킨 다음 냉각시켜 Ti 디스크 위에 증착된 칼슘 포스페이트 박막을 얻었다. 열처리는 3 개의 다른 그룹으로 나누어 수행하였다. 구체적으로, 하나의 시료는 Ti 디스크의 기계가공표면 (machined surface) 위에 칼슘 포스페이트를 전자빔으로 증착시킨 뒤 가열로에서 5℃/min의 가열속도로 700℃로 가열시켜 얻은 것이다(M700). 다른 하나의 시료는 Ti 디스크의 양극처리표면(anodized surface) 위에 칼슘 포스페이트를 전자빔으로 증착시킨 뒤 가열로에서 5℃/min의 가열속도로 450℃로 가열시켜 얻은 것이다(A450). 또 다른 하나의 시료는 Ti 디스크의 양극처리표면 위에 칼슘 포스페이트를 전자빔으로 증착시킨 뒤 진공에서 5℃/min의 가열속도로 350℃로 가열시켜 얻은 것이다(A350). 본 실험에 사용된 양극처리 과정과 증착은 문헌에 기재되어 있는 방법을 사용하였다[J.M. Choi, H.E. Kim, I.S. Lee, Biomaterials 21 (2000) 469.; J.M. Choi, Y.M. Kong, S. Kim, H.E. Kim, C.S. Kwang, I.S. Lee, J. Mater. Res. 14 (1999) 2980].Commercially available pure Ti disks (10 mm diameter and 2 mm thickness) with various surface treatments were used as substrates. The Ti disks were respectively placed in an electron beam evaporator (10 kW, acceleration voltage: 7.5 kV, acceleration current: 140 mA, deposition time: about 1 hour), and electron beam deposited with calcium phosphate, respectively, to form a thin film of calcium phosphate Ti disk with a thickness of 500 nm. Deposited on top. After deposition, heat treatment was performed for 1 hour and then cooled to obtain a thin film of calcium phosphate deposited on the Ti disk. The heat treatment was performed in three different groups. Specifically, one sample was obtained by depositing calcium phosphate with an electron beam on a machined surface of a Ti disk and heating it at 700 ° C. at a heating rate of 5 ° C./min in a heating furnace (M700). Another sample was obtained by depositing calcium phosphate with an electron beam on the anodized surface of a Ti disk and heating it to 450 ° C. at a heating rate of 5 ° C./min in a furnace (A450). Another sample was obtained by depositing calcium phosphate with an electron beam on the anodized surface of a Ti disk and heating it at 350 ° C. at a heating rate of 5 ° C./min in vacuum (A350). The anodization procedure and deposition used in this experiment used the methods described in the literature [JM Choi, HE Kim, IS Lee, Biomaterials 21 (2000) 469 .; JM Choi, YM Kong, S. Kim, HE Kim, CS Kwang, IS Lee, J. Mater. Res. 14 (1999) 2980].
2. 칼슘 2. Calcium 포스페이트Phosphate 박막과 Thin film and 시토크롬Cytochrome C의 결합 Combination of C
초순수 물에 둘베코 인산염 완충용액(칼슘/마그네슘 프리(free), Gibcobrl Life Technologies, USA) 및 CaCl2(100㎎/ℓ)를 녹여 DPBS 용액을 제조하였다.Dulbecco's phosphate buffer solution (calcium / magnesium free, Gibcobrl Life Technologies, USA) and CaCl 2 (100 mg / L) were dissolved in ultrapure water to prepare a DPBS solution.
상기 제조한 DPBS 용액에 시토크롬 C(Sigma Chemicals, USA, 40 ㎍/㎖)를 가하여 DPBSC 용액을 제조하였다.Cytochrome C (Sigma Chemicals, USA, 40 ㎍ / ㎖) was added to the DPBS solution prepared above to prepare a DPBSC solution.
상기 1에서 제조한 시료(M700, A450, A350)를 각각 2일 동안 37℃에서 2.0㎖의 DPBSC 용액에 담구었다.Samples (M700, A450, A350) prepared in 1 were immersed in 2.0 ml of DPBSC solution at 37 ° C. for 2 days, respectively.
실험예Experimental Example 1 One : 칼슘 : calcium 포스페이트Phosphate 박막과 결합한 Combined with thin film 시토크롬Cytochrome C의 양 Quantity of C
상기 실시예 1에서 제조한 시료(M700, A450, A350)를 DPBSC 용액에 담근 후 DPBSC 용액에 남아있는 시토크롬 C의 농도를 BCA 방법을 이용하여 측정하였다 (Micro BCA™ protein assay kit, Pierce Biotechnology Inc, USA). 시험 전에, 0.1㎖의 0.1M HCl 용액을 보충하여 용액 내 분산되어 있는 칼슘 포스페이트 침전물 을 녹였다. 생리식염수 내에 방출된 시토크롬 C의 양도 BCA 방법에 의해 분석하였다.After dipping the samples prepared in Example 1 (M700, A450, A350) in DPBSC solution, the concentration of cytochrome C remaining in DPBSC solution was measured by BCA method (Micro BCA ™ protein assay kit, Pierce Biotechnology Inc, USA). Before the test, 0.1 ml of 0.1 M HCl solution was supplemented to dissolve the calcium phosphate precipitate dispersed in the solution. The amount of cytochrome C released in saline was also analyzed by the BCA method.
cyt C-칼슘 포스페이트 복합층에 고정화된 시토크롬 C의 양은 도 1에 나타내었다.The amount of cytochrome C immobilized on the cyt C-calcium phosphate composite layer is shown in FIG. 1.
도 1에 나타난 바와 같이, DPBSC 용액 내 시토크롬 C의 농도는 3개의 시료군 (M700, A450, A350)에서 모두 감소하였다. 시료 A350의 경우 다른 2개의 시료군 (M700, A450)에 비해 결합된 시토크롬 C의 양(4.545 ㎍/disk)이 최대이었다. 양극처리된 시료의 표면적은 거칠음 때문에 기계가공 시료의 표면보다 더 크다. 또한, 진공에서 가열하는 것은, 보다 적은 산소 때문에 전자빔 증착에 의해서 Ti 디스크 위에 증착된 칼슘 포스페이트의 구조가 공기 중에서 가열하는 것보다 덜 규칙적이다. 따라서, 시료 A350과 결합된 시토크롬 C의 양이 최대임을 알 수 있다.As shown in Figure 1, the concentration of cytochrome C in the DPBSC solution was reduced in all three sample groups (M700, A450, A350). Sample A350 had the largest amount of cytochrome C bound (4.545 μg / disk) compared to the other two sample groups (M700, A450). The surface area of the anodized sample is larger than the surface of the machined sample because of the roughness. In addition, heating in vacuum is less regular than heating in air the structure of calcium phosphate deposited on Ti disks by electron beam deposition because of less oxygen. Thus, it can be seen that the amount of cytochrome C bound to sample A350 is the maximum.
실험예Experimental Example 2 2 : : 시토크롬Cytochrome C-칼슘 C-calcium 포스페이트Phosphate 복합층의Composite 표면 분석 Surface analysis
1. 주사전사현미경(1. Scanning microscope SEMSEM ) 관찰) observe
상기 실시예 1에서 제조한 시료(M700, A450, A350)를 각각 초순수 물로 2번 세척하고 담근 후 실온에서 건조시켰다. 시료의 표면 형태를 주사전사현미경(SEM, S-4200, Hitachi, Japan)으로 관찰하였다.The samples prepared in Example 1 (M700, A450, A350) were each washed twice with ultrapure water, immersed and dried at room temperature. The surface morphology of the sample was observed by scanning transfer microscope (SEM, S-4200, Hitachi, Japan).
시료(M700, A450, A350)를 37℃에서 2일 동안 DPBSC 용액에 담그기 전 및 후에 시료의 표면 형태를 주사전사현미경으로 관찰한 결과는 도 2에 나타내었다.The surface morphology of the sample (M700, A450, A350) before and after immersing in DPBSC solution for 2 days at 37 ℃ is shown in the scanning electron microscopy is shown in FIG.
도 2에 나타난 바와 같이, 일단 시료(M700, A450, A350)를 DPBSC 용액에 담 그면 박편 같은 결정이 칼슘 포스페이트 박막의 표면을 덮었다. 결정의 형태는 시료 A450 및 시료 A350 사이에서 단지 약간의 차이를 나타낸 반면, 시료 M700 위에 형성된 결정은 점점 크게 성장하였다.As shown in FIG. 2, once the samples (M700, A450, A350) were immersed in DPBSC solution, flake-like crystals covered the surface of the calcium phosphate thin film. The morphology of the crystal showed only a slight difference between Sample A450 and Sample A350, while the crystals formed on Sample M700 grew larger and larger.
2. 광전자 분광기(2. Optoelectronic spectroscopy ( XPSXPS ) 관찰) observe
상기 실시예 1에서 제조한 시료의 표면을 Al Kα X-선을 갖는 광전자 분광기 (XPS, PHI 5700)를 이용하여 분석하였다. 광전자 이륙각(take-off angle)은 XPS를 위해 45°에 맞추었다.The surface of the sample prepared in Example 1 was analyzed using an photoelectron spectroscopy (XPS, PHI 5700) having Al Kα X-rays. The optoelectronic take-off angle was set at 45 ° for the XPS.
cyt C-칼슘 포스페이트 복합층(M700)의 표면을 광전자 분광기로 관찰한 결과는 도 3에 나타내었다[(a) 시료 M700을 DPBSC 용액에 담그기 전의 X-선 광전자 스펙트럼, (b) 시료 M700을 DPBSC 용액에 담근 후의 X-선 광전자 스펙트럼].The result of observing the surface of the cyt C-calcium phosphate composite layer (M700) with the photoelectron spectrometer is shown in FIG. 3 ((a) X-ray photoelectron spectrum before dipping Sample M700 in DPBSC solution, (b) DPBSC for Sample M700) X-ray photoelectron spectrum after soaking in solution].
도 3에 나타난 바와 같이, 시료 M700을 DPBSC 용액에 담근 후, 시토크롬 C에 존재하는 질소가 시료 M700에서 관찰되었다. 따라서, cyt C와 결합한 얇은 새로운 칼슘 포스페이트 층이 시료 M700에서 형성되었음을 알 수 있었다.As shown in FIG. 3, after immersing sample M700 in DPBSC solution, nitrogen present in cytochrome C was observed in sample M700. Thus, it was found that a thin new calcium phosphate layer combined with cyt C was formed in sample M700.
실험예Experimental Example 3 3 : : 시토크롬Cytochrome C-칼슘 C-calcium 포스페이트Phosphate 복합층에서In the composite layer 시토크롬Cytochrome C의 방출 시험 C release test
상기 실시예 1에서 제조한 시료(M700, A450, A350)를 생리식염수로 2회 세척한 다음 1㎖의 생리식염수에 담그고, 수욕 상에서 10일 동안 37℃에서 두었다. 생리식염수는 초순수 물에 NaCl(142mM)을 녹이고 TRIS(50mM) 및 1M HCl을 사용하여 37℃에서 pH 7.4로 완충시켜 제조하였다. 사용하기 전에, 모든 용액은 0.22㎛의 기 공크기를 갖는 막을 이용하여 여과시켜 멸균하였다.Samples (M700, A450, A350) prepared in Example 1 were washed twice with physiological saline and then immersed in 1 ml of physiological saline, and placed at 37 ° C. for 10 days in a water bath. Physiological saline was prepared by dissolving NaCl (142mM) in ultrapure water and buffering to pH 7.4 at 37 ° C using TRIS (50mM) and 1M HCl. Prior to use, all solutions were sterilized by filtration using membranes having a pore size of 0.22 μm.
또한, 시료(M700, A450, A350)를 생리식염수에 3일 동안 담근 후 cyt C-칼슘 포스페이트 복합층의 형태 변화를 주사전자현미경으로 관찰하였다.In addition, after immersing the samples (M700, A450, A350) in physiological saline for 3 days, the morphological changes of the cyt C- calcium phosphate composite layer was observed by scanning electron microscopy.
cyt C-칼슘 포스페이트 복합층으로부터 방출되는 시토크롬 C의 양은 도 4에 나타내었으며, 시료(M700, A450, A350)를 37℃에서 3일 동안 생리식염수에 담근 후 cyt C-칼슘 포스페이트 복합층의 표면 형태 변화를 주사전자현미경으로 관찰한 결과는 도 5에 나타내었다.The amount of cytochrome C released from the cyt C-calcium phosphate composite layer is shown in FIG. 4, and the surface morphology of the cyt C-calcium phosphate composite layer after soaking the samples (M700, A450, A350) in physiological saline for 3 days at 37 ° C. The results of observing the changes with the scanning electron microscope are shown in FIG. 5.
도 4에 나타난 바와 같이, 시료(M700, A450, A350)를 생리식염수에 담그면, 시토크롬 C가 시료의 표면 위에 새롭게 형성된 칼슘 포스페이트 층으로부터 서서히 방출되었다. 방출은 10일 동안 계속되었으며, 시료 M700 및 A450의 방출 곡선은 1일 이내 갑자기 방출되었고, 이때 방출된 cyt C의 양은 10일 동안 방출된 양의 거의 절반에 달하였다. 이후 방출 속도는 서서히 낮아지며 유지되었다. 또한 시료 A350의 cyt C의 방출 속도는 10일의 모든 기간에 걸쳐 다소 일정하게 유지되었다. cyt C가 일정하게 방출되기 때문에 cyt C-칼슘 포스페이트 복합층 내 cyt C의 결합이 균질하게 됨을 알 수 있다.As shown in FIG. 4, when samples (M700, A450, A350) were immersed in physiological saline, cytochrome C was slowly released from the newly formed calcium phosphate layer on the surface of the sample. Release continued for 10 days, and the release curves of samples M700 and A450 suddenly released within 1 day, with the amount of cyt C released nearly half of the amount released for 10 days. The release rate was then slowly lowered. In addition, the release rate of cyt C of Sample A350 remained somewhat constant over all periods of 10 days. Since cyt C is constantly released, it can be seen that the binding of cyt C in the cyt C-calcium phosphate composite layer is homogeneous.
도 5에 나타난 바와 같이, 도 4에 나타난 cyt C-칼슘 포스페이트 복합층 내 cyt C의 결합은 칼슘 포스페이트 층의 용해를 가리키는 것으로, 시료(M700, A450, A350)를 DPBSC 용액에 담구었을 때, 진공에서 가열된 시료(A350) 위에 증착된 칼슘 포스페이트의 용해는 공기 중에서 가열된 시료(A450) 위에서 보다 더 쉽게 용해되었다. 따라서, 용해와 침전은 용액 내에서 동시에 발생함을 알 수 있다. 증착된 칼 슘 포스페이트가 용해되면, 칼슘 포스페이트가 시료의 표면 위에 침전된다. 용해가 더 쉽게 발생할수록, 칼슘 및 포스페이트 이온이 용액 속에 더 있게 되고, cyt C-칼슘 포스페이트 복합층이 시료의 표면 위에 더 형성될 것이다. 따라서, 시료 A350이 가장 많은 양의 cyt C와 결합됨을 알 수 있다.As shown in FIG. 5, the binding of cyt C in the cyt C-calcium phosphate composite layer shown in FIG. 4 indicates dissolution of the calcium phosphate layer. When the samples (M700, A450, A350) were immersed in the DPBSC solution, the vacuum Dissolution of the calcium phosphate deposited on the heated sample A350 was dissolved more readily on the heated sample A450 in air. Thus, it can be seen that dissolution and precipitation occur simultaneously in solution. Once the deposited calcium phosphate is dissolved, calcium phosphate precipitates on the surface of the sample. The easier dissolution occurs, the more calcium and phosphate ions will be in solution and the more cyt C-calcium phosphate composite layer will form on the surface of the sample. Thus, it can be seen that Sample A350 is combined with the largest amount of cyt C.
상기 결과에 의해, cyt C와 유사한 분자량 및 등전위점을 갖는 다른 생리활성 단백질 분자, 특히 bFGF, FGF-2, 펩타이드 및 라미닌이 본 발명의 방법과 유사한 방법으로 기질과 결합될 수 있을 것으로 생각되었다.Based on the above results, it was contemplated that other bioactive protein molecules, particularly bFGF, FGF-2, peptides and laminin, having a molecular weight and isoelectric point similar to cyt C could be bound to the substrate in a manner similar to the method of the present invention.
실시예Example 2 2 : : bFGFbFGF -칼슘 -calcium 포스페이트Phosphate 복합층의Composite 제조 Produce
1. 칼슘 Calcium 포스페이트Phosphate 박막의 제조 Manufacture of thin film
양극처리된 표면을 가진 상업적으로 순수한 티타늄과, 전자 빔 증착을 통해 형성된 칼슘 포스페이트 박막으로 코팅된 양극처리된 표면을 가진 티타늄이 제조되었다. 500 nm 두께의 칼슘 포스페이트를 가진 디스크-타입의 시료(10 mm의 직경 및 2 mm의 두께)를 시험관 내 테스트에 사용하였다. 그리고 150 nm 두께의 칼슘 포스페이트 박막을 가지고 있는 것과 가지고 있지 않은 스크류-타입의 양극처리된 치과용 임플란트(10 mm의 길이 및 3.4 mm의 직경, Implantium®, 서울, 한국)를 동물 모델에 사용하였다. 본 발명에서 양극처리 과정과 증착은 문헌에 기재되어 있는 방법을 사용하였다([1] Lee IS et al., Mater . Sci . Eng . C 2002;22:15-20; [2] Choi JM et al., Biomaterials 2000;21:469-73; [3] Li LH et al., J. Biomed . Mater . Res. A 2005;73A:48-54). Commercially pure titanium with anodized surfaces and titanium with anodized surfaces coated with a thin film of calcium phosphate formed through electron beam deposition were prepared. Disc-type samples (10 mm diameter and 2 mm thickness) with 500 nm thick calcium phosphate were used for in vitro testing. A screw-type anodized dental implant (10 mm long and 3.4 mm diameter, Implantium ® , Seoul, Korea) with and without a 150 nm thick calcium phosphate thin film was used in the animal model. In the present invention, the anodization process and deposition were performed using the method described in the literature (1) Lee IS et al., Mater . Sci . Eng . C 2002; 22: 15-20; [2] Choi JM et al. ., Biomaterials 2000; 21: 469-73; [3] Li LH et al., J. Biomed . Mater . Res. A 2005; 73A: 48-54.
즉, 먼저 시료들을 펄스 파워(660 Hz, 10% 효율(duty))를 이용하여 270 V에서 3분 동안 양극처리 하였다. 전해질 용액은 0.15 M 칼슘 아세테이트와 0.02 M 칼슘 글리세로포스페이트를 함유하였다. 칼슘 포스페이트의 증발재료(evaporants)는 CaO(Cerac, USA)와 하이드록시아파타이트(Alfa, USA)의 혼합 분말을 공기 중에서 2 시간 동안 1200 ℃의 온도로 소결시킴으로써 제조되었다. 증착을 위하여, 8.5 kV 및 대략 0.1 A의 전자 빔 증착기(Telemark, USA)와, 130 V 및 1.0 A의 엔드-홀 타입 이온 건(end-hall type ion gun)(Commonwealth Scientific, USA)을 이용하였다. 코팅된 시료들을 위하여, 증착 후 3 mm 토르의 진공 하에서 350 ℃의 온도로 열처리를 수행하였다. 증착된 칼슘 포스페이트 층의 두께를 박막 두께 측정기(surface profiler)(Model P-10, Tencor, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.In other words, the samples were first anodized at 270 V for 3 minutes using pulse power (660 Hz, 10% efficiency). The electrolyte solution contained 0.15 M calcium acetate and 0.02 M calcium glycerophosphate. Evaporants of calcium phosphate were prepared by sintering a mixed powder of CaO (Cerac, USA) and hydroxyapatite (Alfa, USA) at a temperature of 1200 ° C. for 2 hours in air. For deposition, 8.5 kV and approximately 0.1 A electron beam evaporators (Telemark, USA) and 130 V and 1.0 A end-hall type ion guns (Commonwealth Scientific, USA) were used. . For the coated samples, heat treatment was performed at a temperature of 350 ° C. under vacuum of 3 mm Torr after deposition. The thickness of the deposited calcium phosphate layer was measured using a surface profiler (Model P-10, Tencor, Santa Clara, Calif., USA).
2. 칼슘 2. Calcium 포스페이트Phosphate 박막과 Thin film and bFGFbFGF 의 결합Combination of
둘베코 인산염 완충 식염수(Calcium/Magnesium free, Gibco-brl Life Technologies, USA)와 시약급 CaCl2(100 mg/L)를 초순수에 용해시켜 DPBS 용액을 제조하였다. bFGF(Sigma Chemicals, USA, 10 ㎍/ml)를 상기 DPBS 용액에 첨가하여 bFGF를 함유한 DPBS 용액(DPBSF)을 제조하였다. 각각의 시료를 37℃에서 최대한 24 시간 동안 2.0 ml의 DPBS 용액에 담그고, 25℃(bFGF의 변성을 방지하기 위하여)에서 24 시간 동안 2.0 ml의 DPBSF 용액에 담갔다. 모든 용액은 사용하기 전에 0.22 ㎛ 크기의 기공을 가지는 막을 이용하여 여과시킴으로써 멸균시켰다.Dulbecco's phosphate buffered saline (Calcium / Magnesium free, Gibco-brl Life Technologies, USA) and reagent grade CaCl 2 (100 mg / L) were dissolved in ultrapure water to prepare a DPBS solution. bFGF (Sigma Chemicals, USA, 10 μg / ml) was added to the DPBS solution to prepare a DPBS solution containing bFGF (DPBSF). Each sample was immersed in 2.0 ml of DPBS solution at 37 ° C. for up to 24 hours and in 2.0 ml of DPBSF solution for 24 hours at 25 ° C. (to prevent degeneration of bFGF). All solutions were sterilized by filtration using membranes having pores of 0.22 μm size prior to use.
실험예Experimental Example 4 4 : 전자 빔 증착을 통해 형성된 칼슘 : Calcium Formed by Electron Beam Deposition 포스페이트Phosphate 박막의 표면 분석 Surface Analysis of Thin Films
1. 주사전사현미경(1. Scanning microscope SEMSEM ) 관찰) observe
상기 실시예 2에서 준비한 각각의 시료의 표면을 주사 전자 현미경(SEM, S-4200, Hitachi, Japan)을 이용하여 관찰한 뒤 각각의 시료의 표면 구조를 평가하였다.The surface of each sample prepared in Example 2 was observed using a scanning electron microscope (SEM, S-4200, Hitachi, Japan) and the surface structure of each sample was evaluated.
그 결과, 도 6과 같이 각 시료들의 SEM 사진을 얻었다. 도 6에서, (a) 및 (c)는 양극처리된 Ti을, (b) 및 (d)는 코팅된 Ti을 나타낸다. 도 6을 통해 알 수 있는 바와 같이, 양극처리된 Ti 표면에 다공성 산화물 층이 나타났다. 이를 통해 500 nm 두께의 칼슘 포스페이트 증착 후에도, 형태학적으로 명백한 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in Figure 6 SEM images of each sample was obtained. In FIG. 6, (a) and (c) represent Ti anodized, and (b) and (d) denote Ti coated. As can be seen from FIG. 6, a porous oxide layer appeared on the anodized Ti surface. As a result, even after 500 nm thick calcium phosphate deposition, it was confirmed that there is no obvious morphological difference.
2. X-선 2. X-ray 회절분석Diffraction analysis
상기 실시예 2에서 준비한 각각의 시료의 표면을 Cu K 선을 이용한 X-선 회절분석(XRD, Rigaku, Tokyo)으로 관찰하였다.The surface of each sample prepared in Example 2 was observed by X-ray diffraction analysis (XRD, Rigaku, Tokyo) using Cu K-rays.
XRD 패턴은 시료 표면의 결정 구조를 보여주었다(도 7). 티타늄(T) 기판의 피크는 모든 XRD 패턴 상에서 나타났다. Ti-대조구를 제외한, 다른 두 시료들은 산화물 박막의 결정 구조의 특징을 보여주었다. 양극처리된 Ti과 코팅된 Ti 모두 25.3° 부근에서 강한 피크를 보였고, 아나타제(anatase)(A)의 반사에 상응하는 48 °, 53.8° 및 55.2° 부근에서 보다 약한 피크를 보였다. 증착된 박막은 심지어 350℃에서 열처리를 한 후에도 어떠한 새로운 결정 회절 피크도 만들지 않는 것으로 나타났다.XRD pattern showed the crystal structure of the sample surface (FIG. 7). Peaks of the titanium (T) substrate were seen on all XRD patterns. Except for the Ti-control, the other two samples showed the crystal structure of the oxide thin film. Both anodized Ti and coated Ti showed strong peaks around 25.3 ° and weaker peaks around 48 °, 53.8 ° and 55.2 ° corresponding to the reflection of anatase (A). The deposited thin film did not appear to produce any new crystal diffraction peaks even after heat treatment at 350 ° C.
3. 투과전자현미경(3. Transmission electron microscope TEMTEM ) 및 ) And 제한시야회절Restricted viewing party (( SADSAD ) 관찰) observe
상기 실시예 2에서 준비한 각각의 시료의 표면을 투과전자현미경(TEM, JEOL JEM 4010)과 제한시야회절(Selected Area Diffraction, SAD)을 이용하여 관찰하고 각 시료의 표면 구조를 평가하였다. TEM 분석을 위하여, 시료의 다른 끝부분부터 간 뒤 이온 밀링(ion milling)으로 마무리함으로써 보존된 최외곽의 칼슘 포스페이트 박막을 검사하였다.The surface of each sample prepared in Example 2 was observed using a transmission electron microscope (TEM, JEOL JEM 4010) and a limited area diffraction (SAD), and the surface structure of each sample was evaluated. For TEM analysis, the outermost calcium phosphate thin films were preserved by going from the other end of the sample and finishing with ion milling.
도 8은 350℃에서 열처리를 하기 전과 후의 코팅된 박막의 TEM 마이크로그래프와 SAD 패턴을 보여준다. 나노미터의 입자들이 보였다. 열처리 후에, 입자들은 더욱 크게 성장하였다. SAD 패턴의 위치(location)는 별표로 표시하였다. 두 패턴들은 코팅된 박막의 결정 구조를 나타냈으나, 결정상(crystalline structure)은 열처리 후에 변화되었다. 열처리 전에 박막은 HA, β-TCP 및 산화칼슘(CaO)으로 이루어졌으나 열처리 후에는 단지 HA만이 검출되었다.8 shows TEM micrographs and SAD patterns of coated thin films before and after heat treatment at 350 ° C. FIG. Nanometer particles were seen. After the heat treatment, the particles grew larger. The location of the SAD pattern is indicated by an asterisk. Both patterns showed the crystal structure of the coated thin film, but the crystalline structure changed after the heat treatment. The thin film was composed of HA, β-TCP and calcium oxide (CaO) before heat treatment, but only HA was detected after heat treatment.
실험예Experimental Example 5 5 : 칼슘 : calcium 포스페이트Phosphate 박막의 Thin film DPBSDPBS 용액 내에서의 아파타이트 형성 능력 조사 Investigation of the ability to form apatite in solution
상기 실시예 2에서 각각의 시료를 DPBS 용액에 담구어 37℃에서 정해진 시간 동안 배양한 다음, 시료들을 초순수로 두 번 세척하고, 실온에서 자연적으로 건조시킨 다음, SEM과 Cu K 선을 이용한 X-선 회절분석(XRD, Rigaku, Tokyo)으로 각각 관찰하였다.In Example 2, each sample was immersed in DPBS solution, incubated at 37 ° C. for a predetermined time, the samples were washed twice with ultrapure water, dried naturally at room temperature, and then subjected to X- using SEM and Cu K-rays. Observations were made by line diffraction analysis (XRD, Rigaku, Tokyo), respectively.
그 결과, 코팅되지 않은 마이크로-아크 산화 표면상에서는 형태학적인 변화가 없는 것으로 나타난 반면, 전자 빔 증착을 통해 형성된 칼슘 포스페이트 박막으로 코팅된 표면은 도 9와 같은 아파타이트 형성을 나타내었다. DPBS 용액 내에서 단지 1 시간 동안 배양한 후에 코팅된 표면상에서 새롭게 형성된 균질층이 관찰되었으며, 24 시간 배양 후에는 더욱 커진 플레이크-형상(flake-like)의 결정이 형성되었다. XRD 패턴은 또한 뼈와 같은(bone-like) 아파타이트에 관한 새로운 피크를 나타내었다(도 10).As a result, there was no morphological change on the uncoated micro-arc oxide surface, whereas the surface coated with the thin film of calcium phosphate formed through electron beam deposition showed apatite formation as shown in FIG. 9. After only one hour of incubation in DPBS solution, a newly formed homogeneous layer was observed on the coated surface, and after 24 hours of incubation, larger flake-like crystals formed. The XRD pattern also showed new peaks for bone-like apatite (FIG. 10).
실험예Experimental Example 6 6 : : bFGFbFGF -칼슘 -calcium 포스페이트Phosphate 복합층의Composite 표면 분석 Surface analysis
상기 실시예 2에서 시료를 DPBSF 용액에 담근 후, 시료들을 초순수로 두 번 세척하고, 실온에서 자연적으로 건조시킨 다음, SEM으로 관찰하였다. After dipping the sample in the DPBSF solution in Example 2, the samples were washed twice with ultrapure water, naturally dried at room temperature, and observed by SEM.
그 결과, DPBSF 용액 내에서 24 시간 동안 담근 후에, 도 11에서 보여주는 바와 같이 코팅된 표면상에 균질한 층이 새롭게 형성됨을 확인할 수 있었다. 실온에서 1 일 동안 시료를 담근 후, DPBSF 용액 내에서 bFGF의 농도는 감소하였다. 용액 내 bFGF의 감소분은 시료에 완전히 결합된 것으로 생각되었다. 하나의 시료에 결합된 bFGF의 양은 평균적으로 2.76 ㎍이었다.As a result, after soaking for 24 hours in the DPBSF solution, it was confirmed that a homogeneous layer was newly formed on the coated surface as shown in FIG. After soaking the sample at room temperature for 1 day, the concentration of bFGF in the DPBSF solution decreased. The decrease in bFGF in the solution was considered to be fully bound to the sample. The amount of bFGF bound to one sample was 2.76 μg on average.
더 나아가, DPBSF 용액에 담그기 전과 후의 시료의 표면을 Al Kα X-선을 이 용하여 X-선 광전자 분광기(XPS, PHI 5700)로 분석하였다. 광전자의 이륙각(take-off angle)은 45°로 조정하였다.Furthermore, the surface of the sample before and after immersion in DPBSF solution was analyzed by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS, PHI 5700) using Al Kα X-rays. The take-off angle of the photoelectrons was adjusted to 45 °.
시료로 침지한 후 DPBSF 용액의 bFGF 농도는 BCA 법(Micro BCATM protein assay kit, Pierce Biotechnology Inc., USA)을 이용하여 측정하였다. bFGF의 감소된 양은 시료 없이 배양한 DPBSF 용액의 bFGF 농도에 의해 계산되었다.After immersion in the sample, the bFGF concentration of the DPBSF solution was measured using the BCA method (Micro BCATM protein assay kit, Pierce Biotechnology Inc., USA). The reduced amount of bFGF was calculated by the bFGF concentration of the DPBSF solution incubated without sample.
도 12에 bFGF를 함유한 DPBS 용액에 담그기 전과 후의 코팅된 Ti 표면에 대한 XPS 스펙트럼을 나타내었다. 본 실험에서 사용한 시약 중 bFGF에서만 나오는 질소가 담근 후에 검출되었다. BCA 법과 SEM 분석에 근거한 단백질 정량 분석(protein quantitative assay)을 통해, 코팅된 Ti 상에 bFGF와 결합한 얇은 새로운 아파타이트 층이 형성되었음을 확인하였다.12 shows the XPS spectra for the coated Ti surface before and after immersion in DPBS solution containing bFGF. Of the reagents used in this experiment, nitrogen from bFGF was detected after soaking. Protein quantitative assay based on BCA method and SEM analysis confirmed the formation of a thin new apatite layer bound to bFGF on the coated Ti.
실험예Experimental Example 7 7 : : 시험관내In vitro 테스트를 통한 Through testing bFGFbFGF -칼슘 -calcium 포스페이트Phosphate 복합층의Composite 생체적합성 조사 Biocompatibility Investigation
생물학적 환경을 자극하여서 임플란트가 인체에 삽입될 때 일어나는 변화를 조사하기 위하여 DPBS 및 DPBSF의 두 종류 용액을 상기 실시예 2에서와 같이 제조하였다. 전자 빔 증착에 의한 칼슘 포스페이트 박막이 코팅된 Ti(a)과, 칼슘 포스페이트 박막내에 bFGF가 결합되어진 코팅된 Ti(b)과, 대조구(positive control)로서 폴리스티렌 플레이트 웰(polystyrene plate wells)을 준비하였다. 상기 각각의 Ti과 폴리스티렌 판 상에서 MC3T3 세포를 각각 1일, 3일, 및 5일 동안 배양한 다음 포르마잔 흡광도(formazan absorbance)를 측정함으로써 MTT assay를 수행하였다. 또한, 상기 각각의 Ti 상에서 5일 동안 배양한 후의 표면을 SEM으로 분석하였다.Two solutions of DPBS and DPBSF were prepared as in Example 2 above to investigate the changes that occur when the implant is inserted into the human body by stimulating the biological environment. Ti (a) coated with calcium phosphate thin film by electron beam deposition, coated Ti (b) bonded with bFGF in calcium phosphate thin film, and polystyrene plate wells as positive control were prepared. . MTT assay was performed by incubating MC3T3 cells on each of Ti and polystyrene plates for 1 day, 3 days, and 5 days, respectively, and then measuring formazan absorbance. In addition, the surface after incubation for 5 days on each Ti was analyzed by SEM.
MTT assay 분석 결과를 도 13에 나타내고, SEM 분석 사진을 도 14에 나타내었다. 접종된 MC3T3의 분열증식은 배양 3일 및 5일 후에 코팅된 Ti 상에서보다 bFGF와 결합된 코팅된 Ti 상에서 더욱 현저하게 높았다(도 13). 세포들은 배양 5일 후에 양쪽 시료의 표면상에 잘 부착되었다(도 14). MTT assay analysis results are shown in FIG. 13, and SEM analysis pictures are shown in FIG. 14. Cleavage of MC3T3 inoculated was significantly higher on coated Ti bound with bFGF than on coated Ti after 3 and 5 days of culture (FIG. 13). Cells adhered well to the surfaces of both samples after 5 days of culture (FIG. 14).
생체재료가 체내로 이식되어질 때, 그것의 표면은 혈액과 혈청 단백질로 즉각적으로 덮인다. 더 많은 부착 단백질을 흡착하는 재료는 임플란트에 결합하는 조골세포 전구체를 위한 더 많은 위치를 제공할 수 있고, 이에 따라 더욱 빠른 뼈의 성장(in-growth)과 임플란트의 안정화를 유도할 수 있다. DPBSF 용액이 사용되어졌을 때, bFGF가 코팅된 박막과 함께 결합되어지게 되고, 결합된 bFGF는 그것의 생체 반응성(bioactivity)을 유지하였다. 이를 통해 상기 MTT assay 결과와 같이 MC3T3의 분열증식이 강화되었다. 상기와 같은 시험관내 결과를 통해 전자 빔 증착에 의해 마이크로-아크 산화물 Ti 상에 코팅된 칼슘 포스페이트 박막이 생체반응성을 가짐을 알 수 있었다. When biomaterials are implanted into the body, their surfaces are immediately covered with blood and serum proteins. Materials adsorbing more adherent proteins can provide more location for osteoblast precursors that bind to the implant, thus leading to faster bone in-growth and stabilization of the implant. When DPBSF solution was used, bFGF was bound together with the coated thin film, and the bound bFGF maintained its bioactivity. This enhanced MC3T3 fission proliferation as the MTT assay results. The in vitro results described above showed that the calcium phosphate thin film coated on the micro-arc oxide Ti by electron beam deposition had bioreactivity.
실험예Experimental Example 8 8 : : 생체내In vivo 임플란트 테스트를 통한 Through implant testing bFGFbFGF -칼슘 -calcium 포스페이트Phosphate 복합층의Composite 생체적합성 조사 Biocompatibility Investigation
18-24 월령의 35-40 kg 정도의 체중이 나가는 네 마리의 수컷 미니 돼지(Prestige World Genetics, Korea)를 준비하였다. 동물들은 손상되지 않은 치열과 치주조직을 가졌다. 동물의 선택 및 관리, 외과 프로토콜, 및 준비는 대한민국 서울시 연세대 메디컬 센터의 실험동물위원회(the Animal Care and Use Committee)에 의해 인증받은 절차를 따랐다. Four male mini-pigs (Prestige World Genetics, Korea) weighing 35-40 kg, aged 18-24 months, were prepared. Animals had intact dentitions and periodontal tissue. Selection and management of animals, surgical protocols, and preparations followed procedures certified by the Animal Care and Use Committee of Yonsei University Medical Center, Seoul, Korea.
아래턱의 작은 어금니를 실험 시작 8주 전에 뽑아냈다. 임플란트 배치시, 치조정 절개(crestal incision)를 하고, 점막석 골막판 판막(mucoperiosteal flaps)을 양방향으로 세웠다. 나선형의 드릴과 탭(tap)으로 임플란트 위치를 제작한 후에 상부턱 후부의 각 측면 상에 무치조능(edentulous ridge)을 조심스럽게 평평하게 하였다. 임플란트의 두 그룹 즉, 양극처리된 Ti과 코팅된 Ti을 각각의 측면에 제각기 배치하였다. 상처는 봉합하였고, 봉합사는 7-10일 후에 제거하였다. 실험기간 내내 연식(soft diet)을 공급하였다. 본 실험에서 사용한 외과적인 조건은 이전에 문헌에 개시된 방법을 사용하였다(Jung UW et al., Clin . Oral Implan . Res . 2007;18:171-8).A small molar in the lower jaw was extracted eight weeks before the experiment. At implant placement, a crystal incision was made and the mucoperiosteal flaps were raised in both directions. After making the implant position with a spiral drill and tap, the edentulous ridge was carefully flattened on each side of the upper jaw rear. Two groups of implants, anodized Ti and coated Ti, were placed on each side, respectively. The wound was closed and the suture was removed after 7-10 days. A soft diet was fed throughout the experiment. Surgical conditions used in this experiment used the methods previously disclosed in the literature (Jung UW et al., Clin . Oral Implan . Res . 2007; 18: 171-8).
치료 8주 후, 미니 돼지를 희생시켜 하악골의 방사선 사진을 찍었다. 임플란트가 있는 단편을 포함하는 블록 섹션(block section)을 보존하여 10% 중성완충포르말린으로 고정하였다. 표본을 에탄올에서 탈수시키고, 메타크릴레이트에 넣은 다음, 다이아몬드 톱(Exakt®)을 이용하여 근원심면(mesio-distal plane)으로 절개하였다. 각각의 임플란트 위치로부터, 중심 단면(central section)을 대략 20 ㎛의 최종 두께로 감소시키도록 커팅-그라인딩 장비(Exakt®)를 사용하여 마이크로그라인딩하고 마멸시켰다. 상기 단면을 헤마톡실린-에오신으로 착색시켰다. 입체경과 현미경을 이용하여 전반적인 조직학적인 조사를 수행하였다.After 8 weeks of treatment, mini pigs were sacrificed and radiographs of the mandibles were taken. Block sections containing implanted fragments were preserved and fixed with 10% neutral buffered formalin. Samples were dehydrated in ethanol, placed in methacrylate and then cut into the mesio-distal plane using a diamond saw (Exakt ® ). From each implant position, microgrinding and abrasion was performed using a cutting-grinding equipment (Exakt ® ) to reduce the central section to a final thickness of approximately 20 μm. The cross section was colored with hematoxylin-eosin. Overall histological examination was performed using a stereoscopic microscope.
모든 동물은 실험 과정 처음부터 끝까지 건강하였고 모든 과정을 잘 견디었다. 상처는 합병증 없이 잘 치료되었다. 부검시, 비정상적인 조사 결과가 육안으로 관찰되지 않았다. 동물을 희생시킨 후 즉시 각각의 하악골에 대한 방사선 사진을 찍어 임플란트의 위치를 알아내는 데 사용하였다. 도 15에 대표적인 방사선 사진 결과를 보여주었다. 임플란트는 숙주골(host bone)에 단단히 접촉되었다.All animals were healthy from the beginning to the end of the experiment and tolerated all processes well. The wound healed well without complications. At necropsy, no abnormal findings were observed visually. Immediately after the sacrifice of the animals, radiographs of each mandible were used to locate the implant. 15 shows representative radiographic results. The implant was firmly in contact with the host bone.
임플란트와 주위 조직을 포함하는 전형적인 단면을 도 16에서 보여주었다. 병렬의 뼈 형성은 양극처리된 임플란트와 코팅된 임플란트 모두의 표면 주위에서 발생하였으며, 기부(bottom)에서 더욱 두드러지는 것으로 보였다. 양극처리된 임플란트와 비교했을 때, 코팅된 임플란트는, 8주 내 강한 뼈 형성과 리모델링의 기초로서 뼈 층을 가진 임플란트 표면의 적용 범위에서, 정점의 부분과 중앙 부분 모두에서 연골 내 접촉 골형성 면에서 향상된 특성을 가진다. 새롭게 형성된 뼈는 미숙하였고 섬유주(trabecular) 패턴을 나타냈다. 정점의 부분에서, 조직은 대부분 직골(woven bone)로 구성되고 소량만이 이전에 존재하던 층판골(lamellar bone)로 구성되었다. 코팅된 임플란트에서, 칼슘 포스페이트 코팅은 임플란트 표면으로부터 분리되지 않았다.A typical cross section including an implant and surrounding tissue is shown in FIG. 16. Parallel bone formation occurred around the surface of both anodized and coated implants and appeared to be more pronounced at the bottom. Compared with anodized implants, the coated implants are in contact with the cartilage contact surfaces in the cartilage at both the apical and central portions, within the coverage of the implant surface with the bone layer as a basis for strong bone formation and remodeling within eight weeks. Has improved characteristics. The newly formed bone was immature and showed a trabecular pattern. At the apex, the tissue consists mostly of woven bones and only a small amount of the lamellar bones that previously existed. In the coated implant, the calcium phosphate coating did not separate from the implant surface.
본 발명에 따른 생체고분자/아파타이트 나노 복합체는 전자빔 증착에 의해 형성된 칼슘 포스페이트 박막에 생체고분자를 결합함으로써 골 형성을 촉진하고, 벌크한 물질 대신 칼슘 포스페이트 박막을 사용함으로써 다양한 용도에 적용할 수 있다. 생체고분자로는 cyt C, 및 cyt C와 유사한 분자량 및 등전위점을 갖는 생리 활성 단백질을 칼슘 포스페이트 박막에 결합하여 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 생체고분자/아파타이트 나노 복합체는 치과 및 정형외과 임플란트 등과 같이 골접합을 필요로 하는 생체 이식 재료로 유용하게 사용할 수 있다.The biopolymer / apatite nanocomposite according to the present invention promotes bone formation by combining biopolymers with calcium phosphate thin films formed by electron beam deposition, and can be applied to various applications by using calcium phosphate thin films instead of bulk materials. As the biopolymer, cyt C and a bioactive protein having a molecular weight and isoelectric point similar to that of cyt C may be used in combination with the calcium phosphate thin film. Therefore, the biopolymer / apatite nanocomposite according to the present invention can be usefully used as a biograft material requiring bone bonding, such as dental and orthopedic implants.
도 1은 cyt C-칼슘 포스페이트 복합층에 고정화된 시토크롬 C의 양을 나타낸 도이다.1 is a diagram showing the amount of cytochrome C immobilized on a cyt C-calcium phosphate composite layer.
도 2는 시료(M700, A450, A350)를 37℃에서 2일 동안 DPBSC 용액에 담그기 전 및 후에 시료의 표면 형태를 주사전사현미경으로 관찰한 도이다 [(a) 담그기 전 M700, (b) 및 (c) 담근 후 M700, (d) 담그기 전 A450, (e) 및 (f) 담근 후 A450, (g) 담그기 전 A350, (h) 및 (i) 담근 후 A350. (a), (b), (c), (d), (e), (g) 및 (h)의 규모는 30㎛의 길이, (c), (f) 및 (i)에서는 3㎛의 길이].Figure 2 is a diagram of the surface morphology of the sample before and after immersing the sample (M700, A450, A350) in DPBSC solution for 2 days at 37 ℃ [(a) M700, (b) and before immersion (c) M700 after dipping, (d) A450 before dipping, (e) and (f) A450 after dipping, (g) A350 before dipping, (h) and (i) A350 after dipping. The scales of (a), (b), (c), (d), (e), (g) and (h) have a length of 30 μm, and in (c), (f) and (i) 3 μm Length].
도 3은 cyt C-칼슘 포스페이트 복합층(M700)의 표면을 광전자 분광기로 관찰한 도이다 [(a) 시료 M700을 DPBSC 용액에 담그기 전의 X-선 광전자 스펙트럼, (b) 시료 M700을 DPBSC 용액에 담근 후 X-선 광전자 스펙트럼].3 is a diagram illustrating the surface of a cyt C-calcium phosphate composite layer (M700) using an optoelectronic spectrometer [(a) X-ray photoelectron spectrum before dipping sample M700 in DPBSC solution, (b) sample M700 in DPBSC solution X-ray photoelectron spectrum after immersion].
도 4는 cyt C-칼슘 포스페이트 복합층으로부터 방출되는 시토크롬 C의 양을 나타낸 도이다.4 is a diagram showing the amount of cytochrome C released from the cyt C-calcium phosphate composite layer.
도 5는 시료(M700, A450, A350)를 37℃에서 3일 동안 생리식염수에 담근 후 cyt C-칼슘 포스페이트 복합층의 표면형태 변화를 주사전자현미경으로 관찰한 도이다 [(a) 및 (d) M700, (b) 및 (e) A450, (c) 및 (f) A350; (a), (b) 및 (c)의 규모는 30㎛의 길이, (d), (e) 및 (f)에서는 3㎛의 길이].5 is a diagram observing the change in the surface morphology of the cyt C-calcium phosphate composite layer after immersing the samples (M700, A450, A350) in physiological saline for 3 days at 37 ℃ [(a) and (d ) M700, (b) and (e) A450, (c) and (f) A350; The scale of (a), (b) and (c) is 30 micrometers in length, (d), (e) and (f) is 3 micrometers in length].
도 6은 양극처리된 Ti과 코팅된 Ti의 표면을 주사전자현미경으로 관찰한 도이다 [(a) 및 (c) 양극처리된 Ti, (b) 및 (d) 코팅된 Ti].6 is a view of the surface of the anodized Ti and the coated Ti with a scanning electron microscope [(a) and (c) anodized Ti, (b) and (d) coated Ti].
도 7은 Ti 시료의 표면을 Cu K 선을 이용한 X-선 회절분석(XRD)으로 관찰한 도이다 [(a) Ti-대조구, (b) 양극처리된 Ti, (c) 코팅된 Ti].7 is a diagram illustrating the surface of a Ti sample by X-ray diffraction analysis (XRD) using Cu K-rays ((a) Ti-control sphere, (b) anodized Ti, (c) coated Ti].
도 8은 전자 빔 증착을 통해 칼슘 포스페이트 박막이 코팅된, 양극처리 Ti의 표면을 투과전자현미경(TEM)과 제한시야회절(SAD)을 이용하여 관찰한 도이다 [(a) 열처리 전 증착된 그대로의 모습(As-deposited), (b) 350℃에서 열처리 후의 모습(heat-treated)].8 is a diagram illustrating the surface of anodized Ti coated with a calcium phosphate thin film by electron beam deposition using a transmission electron microscope (TEM) and a limited field diffraction (SAD) [(a) As it is deposited before heat treatment As-deposited, (b) heat-treated at 350 ° C.].
도 9는 시료를 DPBS 용액에서 배양시킨 후 SEM으로 관찰한 도이다 [(a) 1 시간 배양 후의 양극처리된 Ti 시료, (b) 1 시간 배양 후의 코팅된 Ti 시료, (c) 24 시간 배양 후의 양극처리된 Ti 시료, (d) 24 시간 배양 후의 코팅된 Ti 시료].9 is a diagram observed by SEM after incubating the sample in DPBS solution [(a) anodized Ti sample after 1 hour incubation, (b) coated Ti sample after 1 hour incubation, (c) after 24 hours incubation Anodized Ti sample, (d) coated Ti sample after 24 hours incubation].
도 10은 코팅된 Ti 시료(a)와, 37℃, DPBS 용액 내에서 24 시간 동안 배양시킨 후 코팅된 Ti 시료(b)의 X-선 회절분석 패턴을 나타낸 도이다.FIG. 10 is a diagram showing an X-ray diffraction pattern of a coated Ti sample (a) and the coated Ti sample (b) after incubating for 24 hours in a 37 ° C. and DPBS solution.
도 11은 코팅된 Ti 시료를 실온에서 24 시간 동안 DPBSF 용액에 침지한 후에 주사전자현미경으로 관찰한 도이다.11 is a diagram observed by scanning electron microscopy after immersing the coated Ti sample in DPBSF solution for 24 hours at room temperature.
도 12는 코팅된 Ti 시료를 DPBSF 용액에 침지하기 전(a)과, 실온에서 24 시간 동안 침지한 후(b) X-선 광전자 분광기(XPS)로 분석한 도이다.12 is a diagram analyzed by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) before (a) and immersed for 24 hours at room temperature before immersing the coated Ti sample in DPBSF solution.
도 13은 각각의 시료 상에서 배양된 MC3T3 세포의 생존능력을 측정하기 위해 MTT assay를 통해 포르마잔 흡광도를 측정한 결과를 나타내는 도이다 [(a) 코팅된 Ti, (b) bFGF가 결합된 코팅된 Ti, (c) 대조구로서 폴리스티렌 플레이트 웰]. 이때 데이터는 평균±표준편차(n=3)로 나타내었으며, 첨자(*)는 (b)와 (a) 간에 통계학상으로 유의적 차이(p<0.05)가 있음을 나타낸다.Figure 13 is a diagram showing the result of measuring formazan absorbance through MTT assay to measure the viability of MC3T3 cells cultured on each sample [(a) coated Ti, (b) bFGF-coated Ti, (c) polystyrene plate wells as control]. The data are expressed as mean ± standard deviation (n = 3), and the subscript (*) indicates that there is a statistically significant difference (p <0.05) between (b) and (a).
도 14는 코팅된 Ti 시료 상에서 배양된 MC3T3(a)와, 5일 동안 bFGF와 결합된 코팅된 Ti 시료 상에서 배양된 MC3T3(b)의 모습을 주사전자현미경으로 관찰한 도이다.FIG. 14 is a diagram illustrating the appearance of MC3T3 (a) cultured on a coated Ti sample and MC3T3 (b) cultured on a coated Ti sample bound to bFGF for 5 days with a scanning electron microscope.
도 15는 동물 임플란트 테스트에서 임플란트 부위를 찍은 방사선 사진을 나타내는 도이다.15 is a view showing a radiograph of the implant site in the animal implant test.
도 16은 치료 8주 후 임플란트와 주위 조직을 포함하는 임플란트 부위의 단면 모습을 보여주는 현미경 사진(Light micrograph)이다 [(a) 양극처리된 Ti, (b) 코팅된 Ti, (Original magnification × 10)].FIG. 16 is a light micrograph showing the cross-sectional view of an implant site including implant and surrounding tissue after 8 weeks of treatment ((a) Anodized Ti, (b) Coated Ti, (Original magnification × 10) ].
Claims (11)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/KR2008/004710 WO2009069879A1 (en) | 2007-11-28 | 2008-08-13 | Biopolymer/apatite nano composite immobilized biopolymer on calcium phosphate thin film formed by electron-beam evaporation and preparation method thereof |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020070121836 | 2007-11-28 | ||
| KR20070121836 | 2007-11-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20090055460A KR20090055460A (en) | 2009-06-02 |
| KR101035375B1 true KR101035375B1 (en) | 2011-05-20 |
Family
ID=40987124
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020080079380A KR101035375B1 (en) | 2007-11-28 | 2008-08-13 | Biopolymer/apatite nano composite immobilized biopolymer on calcium phosphate thin film formed by electron-beam evaporation and preparation method thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101035375B1 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6531363B2 (en) * | 2014-09-16 | 2019-06-19 | 横浜ゴム株式会社 | Abrasion test apparatus and method |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20070063114A (en) * | 2005-12-14 | 2007-06-19 | 주식회사 덴티움 | Metal implants and manufacturing method thereof |
-
2008
- 2008-08-13 KR KR1020080079380A patent/KR101035375B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20070063114A (en) * | 2005-12-14 | 2007-06-19 | 주식회사 덴티움 | Metal implants and manufacturing method thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Yu Sogo et al., Current Applied Physics, 2005, Vol. 5, pp. 526-530* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20090055460A (en) | 2009-06-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Li et al. | The biocompatibility of nanostructured calcium phosphate coated on micro-arc oxidized titanium | |
| Huang et al. | Strontium and copper co-substituted hydroxyapatite-based coatings with improved antibacterial activity and cytocompatibility fabricated by electrodeposition | |
| Abdal-hay et al. | Hydroxyapatite-doped poly (lactic acid) porous film coating for enhanced bioactivity and corrosion behavior of AZ31 Mg alloy for orthopedic applications | |
| Liu et al. | Surface modification of titanium, titanium alloys, and related materials for biomedical applications | |
| Huang et al. | Improving the bioactivity and corrosion resistance properties of electrodeposited hydroxyapatite coating by dual doping of bivalent strontium and manganese ion | |
| Guo et al. | Effects of surface charges on dental implants: past, present, and future | |
| Rautray et al. | Surface modification of titanium and titanium alloys by ion implantation | |
| Yu et al. | Biocompatibility and osteoconduction of active porous calcium–phosphate films on a novel Ti–3Zr–2Sn–3Mo–25Nb biomedical alloy | |
| Adamopoulos et al. | Nanostructured bioceramics for maxillofacial applications | |
| AU2001237786A1 (en) | Proteinaceous coating | |
| He et al. | In Vivo Effect of Titanium Implants with Porous Zinc-Containing Coatings Prepared by Plasma Electrolytic Oxidation Method on Osseointegration in Rabbits. | |
| Mozafari et al. | Thin films for tissue engineering applications | |
| Fan et al. | Surface structural biomimetics and the osteoinduction of calcium phosphate biomaterials | |
| Sridhar | Nanobioceramic coatings for biomedical applications | |
| Oshida | Hydroxyapatite: synthesis and applications | |
| Behera et al. | Effect of TiO2 addition on adhesion and biological behavior of BCP-TiO2 composite films deposited by magnetron sputtering | |
| Kim et al. | Bioactive effect of alkali-heat treated TiO2 nanotubes by water or acid treatment | |
| Anil et al. | Bone response to calcium phosphate coatings for dental implants | |
| JP2003512895A (en) | Hard tissue repair material and method for producing the same | |
| Singh et al. | Electrophoretic deposition of bioactive glass composite coating on biomaterials and electrochemical behavior study: A review | |
| Shi et al. | Preparation of dicalcium phosphate anhydrous (monetite) biological coating on titanium by spray-drying method | |
| Shi et al. | Surface modification on biodegradable zinc alloys | |
| Jarosz et al. | Anodization of titanium alloys for biomedical applications | |
| Bansal et al. | Plasma-sprayed HA/Sr reinforced coating for improved corrosion resistance and surface properties of Ti13Nb13Zr titanium alloy for biomedical implants | |
| Regi et al. | Degradative effects of the biological environment on ceramic biomaterials |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20140304 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20150309 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20160722 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170508 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190507 Year of fee payment: 9 |