KR101033440B1 - 바이러스 감염 오이 종자의 비침습적 선별 방법 및 장치 - Google Patents

바이러스 감염 오이 종자의 비침습적 선별 방법 및 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바이러스 감염 오이 종자의 비침습적 선별 방법 및 장치에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 선별대상 오이 종자의 단층 이미지를 얻는 단계; 상기 단층 이미지로부터 종자의 종피와 배유 간의 거리를 조사하는 단계; 및 상기 조사된 종자의 종피와 배유 간의 거리가 소정 거리 이상이면 건전 종자로 판단하고 소정 거리 이하이면 바이러스 감염 종자로 판단하는 단계를 포함하는 건전 오이 종자 또는 바이러스 감염 오이 종자의 선별방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 선별 대상이 되는 오이 종자의 단층 이미지 상에서, 종피와 배유 간의 거리를 조사하여 우량 종자 및 바이러스 감염 종자를 확인할 수 있다. 상기 종피와 배유 간의 거리는 오이 종자의 광 단층 이미지의 영상 처리 및 신호 분석을 통하여 건전과 비 건전 오이 종자의 구분이 가능하며, 추가적인 신호처리 과정을 거쳐서 종피와 배유 간의 거리를 수치적으로 확인이 가능하다.

Description

바이러스 감염 오이 종자의 비침습적 선별 방법 및 장치 {Non invasive methods and apparatus for detection of cucumber seeds contaminated with virus}
본 발명은 바이러스 감염 오이 종자의 비침습적 선별 방법 및 장치에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 선별대상 오이 종자의 단층 이미지를 얻는 단계; 상기 단층 이미지로부터 종자의 종피와 배유 간의 거리를 조사하는 단계; 및 상기 조사된 종자의 종피와 배유 간의 거리가 소정 거리 이상이면 건전 오이 종자로 판단하고 소정 거리 이하이면 바이러스 감염 오이 종자로 판단하는 단계를 포함하는 건전 오이 종자 또는 바이러스 감염 오이 종자의 선별방법에 관한 것이다.
오이녹반모자이크 바이러스(Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV)에 감염된 병든 오이종자는 발아되지 않는 것이 대부분이며, 발아되더라도 인접 식물에 전염되어 미결실 또는 미숙과 등의 원인이 되며, 생산성에 막대한 손실을 입히고 있다. 건전한 종자의 신속·정확한 선별 방법과 병든 종자의 조기진단은 농업생산 분야에 있어 절실히 요구되는 기술이며, 또한 국내외로 수입 및 수출되는 종자의 식물검역에 있어서도 매우 중요한 과제이다.
현재까지 전세계의 대부분의 종묘회사나 식물 검역기관에서의 CGMMV 검사방법은 파종에 의한 생물학적 진단법, 항혈청을 이용한 혈청학적 진단법을 주로 사용하고 있다. 하지만, 이러한 방법은 검출한계가 있어 바이러스 진단이 용이하지 않기 때문에, RT-PCR 에 의한 분자생물학적 진단법이 많이 이용되고 있다. 하지만, 이러한 진단방법은 검사기간이 길고 값비싼 시약과 고가의 장비를 사용할 뿐만 아니라 검사 후 종자의 재활용이 불가능하다. 또한 검출감도가 일정하지 못하여 신뢰도도 상당히 떨어지고 있고, 게다가 시간적인 제한으로 인해 대량의 종자에 대한 전수검사는 불가능하다.
1) 생물학적 진단법: 파종에 의한 진단으로 종자를 기른 후 일정 시간 이상이 되어야 우량종자 여부를 판단할 수 있다. 너무 많은 시간이 걸리며, 대량의 종자에 대하여 적용이 불가능하다.
2) 혈청학적 진단법: 항혈청을 이용하여 진단하는 방법으로 시간이 많이 걸리고, 우량종자 여부 판단을 위하여 종자를 파괴하여 진단 항혈청과 희석시켜서 사용한다. 가격이 비싸며, 많은 종자에 대하여 적용이 불가능하다. 따라서 특정 그룹에서 임의로 선별하여 분별한다.
3) RT-PCT 분자생물학적 진단: 현재 가장 많이 사용되는 방법으로서 보통의 종자 검출 방법으로 간편하게 사용되고 있으나, 결과가 나오는데 하루 정도 시간이 걸리며, RNA 정보를 추출을 위하여 종자를 파괴하여야 하며, 특히나 오이 종자의 경우 2회에 걸친 동일한 검사를 하여야지만, 우량종자 여부를 판단할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 비침습적으로 식물종자의 단층 이미지 촬영하여 오이 종자 바이러스가 잠복 감염된 종자와 건전한 종자의 단층 이미지를 비교함으로써 신속하고 정확하게 건전한 종자를 선별할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 바이러스 감염된 오이 종자를 비침습적으로 선별해내기 위한 것으로, 식물 종자의 단층 이미지로부터 종자의 종피와 배유 간의 거리를 조사하여 바이러스에 감염된 병든 오이 종자와 건전한 오이 종자를 간편히 구분할 수 있는, 건전 종자 또는 바이러스 감염 종자의 선별방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법을 이용한 건전 오이 종자 또는 바이러스 감염 오이 종자의 선별장치를 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 건전 오이 종자 또는 바이러스 감염 오이 종자의 선별방법을 제공한다:
a) 선별대상 오이 종자의 단층 이미지를 얻는 단계;
b) 상기 단층 이미지로부터 종자의 종피와 배유 간의 거리를 조사하는 단계; 및
c) 상기 조사된 종자의 종피와 배유 간의 거리가 소정 거리 이상이면 건전 종자로 판단하고 소정 거리 이하이면 바이러스 감염 종자로 판단하는 단계.
본 발명은 바이러스에 감염된 병든 오이 종자와 건전한 오이 종자를 간편히 구분할 수 있는 기술로서, 단 1회의 단층 이미지 촬영에 의해 바이러스에 감염된 병든 오이 종자와 건전한 오이 종자를 간편히 구분할 수 있음을 처음으로 확인하였다.
본 발명에서, 상기 “단층 이미지”는 선별 대상이 되는 오이 종자의 단층 이미지를 물리적 절단 없이 비침습식으로 촬영하여 획득된 이미지로서, 공지의 광 단층 촬영기인, 예컨대 Time-domain OCT, Spectral-domain OCT, Swep source OCT 와 같은 광 단층 촬영기(Optical coherence tomography: OCT) 또는 다중 광산란 특성을 이용한 광 단층 촬영 기법(DOT: Diffuse Optical Tomography) 등을 사용하여 본 발명의 단층 이미지를 얻을 수 있다.
상기 광 단층 촬영기 또는 광 간섭 단층 촬영기 (이하, ‘OCT’라고 함)는 저가간섭의 빛을 사용하여 생체조직을 비침식적 방법으로 고해상도의 단면 영상을 획득하는 새로운 기술이다. OCT 시스템은 1987년에 개발된 Optical Coherence Domain Reflectometry(OCDR)를 확장 응용한 것으로, 1991년 M.I.T의 David Huang에 의해서 처음 개발되었다. OCDR은 마이켈슨 저간섭계를 이용하여 샘플의 깊이에 따라 역산란(Backscattering)되는 빛의 세기를 일차원적으로 얻는 시스템이다. OCT는 이런 OCDR 시스템에서 횡방향스캐닝(Transverse Scanning)을 추가함으로써 이차원 영상을 획득하는 방법이며 초음파 영상의 B-mode 스캐닝 방식에 해당한다.
광 간섭 단층 촬영기는 간섭신호를 얻는 방법에 따라서 크게 시간 영역에 대한 광학 단층 촬영기 (Time-domain OCT, 이하 TD-OCT)와 주파수 영역 광학 단층 촬영기 (Fourier-Domain OCT, 이하 FD-OCT)기술로 나누어진다. TD-OCT기술은 마이겔슨 간섭계의 기준단 거리를 스캔함으로서 샘플단에 존재하는 반사체와 서로 거리가 일치할 때 얻어지는 간섭신호를 포락선검파하고 이의 피크로부터 경과시간을 추출함으로써 거리 정보를 얻는 방식이다. 반면에 기준단이 고정되어 있는 FD-OCT는 1990년대 중반에 처음 소개되었다. 이 방식에서는 기준단과 샘플단 내에 존재하는 반사체간의 거리차를
Figure 112010082352285-pat00001
이라 할 때 간섭신호는
Figure 112010082352285-pat00002
상에서 주기가
Figure 112010082352285-pat00003
인 정현파가 된다. 여기서
Figure 112010082352285-pat00004
는 optical wavenumber이다. 통신에서
Figure 112010082352285-pat00005
와
Figure 112010082352285-pat00006
가 Fourier Transform pair 관계에 있는 것처럼
Figure 112010082352285-pat00007
와
Figure 112010082352285-pat00008
도 서로 Fourier Transform pair 관계에 있다. 따라서 FD-OCT 시스템에서는 간섭신호를
Figure 112010082352285-pat00009
상에서 바로 얻기가 어렵다. 일반적으로 FD-OCT에서는 Spectrometer 구조를 사용하므로 파장 도메인(
Figure 112010082352285-pat00010
)상에서 간섭신호가 얻어진다. 따라서 rescaling 계산과정을 통하여 이를
Figure 112010082352285-pat00011
상에서의 간섭신호로 바꾸어야 한다. 만일 샘플단상에 여러개의 반사체가 있다면 각 반사체에 대하여 각각 다른 형태의 간섭신호가 서로 중첩된 형태로 파장 도메인상에서 존재한다. 이를 위하여 설명한 것처럼
Figure 112010082352285-pat00012
상으로 다시 rescaling 하면 각 반사체에 대하여 각각 다른 주기의 정현파 간섭신호가 중첩된 형태로 존재한다. 이를 inverse Fourier Transform(IFFT)하게 되면 각 반사체에 대한 거리 정보를 얻을 수 있다.
상기 광 단층 촬영기(OCT)의 구조는 도 3과 같은 TD-OCT, 및 도 4와 같은 FD-OCT의 종류인 Swept-Source OCT(이하 SS-OCT), 그리고 도 5와 같은 Specral domain OCT (이하 SD-OCT)로 나누어진다.
기본적으로 OCT는 광대역 광원을 가진다. 광대역 광원의 반치폭(FWHM)이 넓을수록 이미지의 종축 방향의 해상도(Axial resolution)가 높아진다. 광원으로부터 나온 빛은 광분배기를 거쳐서 기준단과 샘플단으로 나누어지게 되고, 각각의 기준단과 샘플단의 광경로가 같은 경우 샘플단의 단층 간섭 신호가 생성되게 된다. 생성된 간섭 신호는 다시 광분배기로 돌아가서 수신단인 광검출기로 들어가서 신호를 획득하게 된다.
도 3의 TD-OCT와 도 4의 SS-OCT는 수신단에 광검출기를 사용한다. 하지만, 도 5의 SD-OCT의 경우는 수신단에 Spectrometer를 설치하여 파장별 신호의 간섭 정보를 획득한다. 도 3의 TD-OCT와 도 4의 SS-OCT의 경우도, 구조상으로는 같아 보이나, TD-OCT 경우 기준단에서 물리적으로 광경로를 빠르게 이동시켜서 간섭신호를 생성하며, SS-OCT의 경우 물리적인 움직임 없이, Swept Source가 좁은 대역의 광신호가 넓은 대역을 빠르게 스캔함으로써 TD-OCT가 기준단을 빠르게 움직여서 간섭신호를 생성하는 것과 같은 효과를 낸다. 일반적으로 TD-OCT의 경우 깊이 방향의 스캔 속도가 기준단의 물리적인 광경로의 변화 속에 의존하기 한계가 있으나, SS-OCT는 얼마나 빠르게 Swept-Source가 움직이느냐에 따라서 속도가 좌우되게 때문에 최대 400 kHz 이상의 속도가 학회에 보고가 되고 있다. SD-OCT의 경우 Spectrometer에서 사용되는 Scan camera의 Linerate에 의해서 속도가 결정된다. 현재 140kHz의 카메라가 사용되고 있으며, 컴퓨터 성능에 의해서 제한을 받고 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 단층 이미지는 Time-domain OCT를 사용하여 얻은 오이 종자의 단층 이미지이다.
본 발명에서, 오이 종자의 경우 종피와 배유의 거리가 약 80μm 내외의 간격을 두고 있기 때문에 OCT가 아닌 다른 장비로는 판별이 불가능하다. 유사한 기술로서 CT/MRI/초음파 등의 경우 깊이 방향 해상도가 100 μm 이상으로서 80 μm 내외의 차이를 분별하는 이미지를 만들어 내는 것은 불가능하다.
본 발명에서, 상기 “종피”는 종자식물의 밑씨에 있는 주피가 발달한 것으로 보통 종자의 주위를 덮는 피막을 의미하고, 상기 “배유”는 배(胚)와 함께 존재하며 종자를 구성하는 하나의 조직으로서 발아에 있어서 배의 영양원이 되는 부분을 지칭한다.
본 발명에서, 상기 “소정 거리”는 상기 본 발명에 따른 식물 종자의 단층 이미지에서 종피와 배유의 각 층 사이의 거리로서, 이미 알려진 다수의 건전 종자 또는 비건전 종자를 대상으로 측정된 종피와 배유 간의 거리값들로부터 평균값을 계산하거나, 확률분포를 통해 90% 또는 95% 신뢰도를 갖는 구간 값을 계산하여 얻을 수 있다.
본 발명에서, 상기 “건전 종자”는 식물 종자를 감염시켜 종자의 발아에 영향을 주는 어떠한 식물 바이러스에 감염되지 않은, 정상적인 종자를 지칭한다. 또한, 이와 대비되는 개념으로서 “비건전 종자”는 상기 식물 바이러스에 감염되어 발아되지 않는 종자를 지칭한다.
본 발명의 방법에서, 상기 바이러스는 오이녹반모자이크 바이러스(Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV)인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시예에서는, 오이 종자를 이용하여 건전 및 비건전 종자의 광 단층 촬영 이미지를 확인하였으며, 단층 이미지에서 종자의 종피와 배유의 간격을 확인한 결과, 바이러스 감염된 종자에서 상대적으로 종피와 배유의 간격이 더 좁게 나타나는 것을 확인하였다 (도 1 참조).
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 OCT에 의해 건전 오이 종자를 촬영하면 종자의 표면 부위에 이격한 층 구조가 관찰되지만, 오이녹반모자이크 바이러스 감염 오이종자의 경우에는 건전 오이종자와 달리 층 구조가 관찰되지 않거나 매우 조밀한 층이 나타난다 (도 1 참조). 이러한 촬영 이미지상의 차이에 의해 건전 종자와 병든 종자의 구별이 가능하다.
본 발명의 방법에서, 상기 a)단계에서 단층 이미지는 광학 단층 촬영기법(OCT: Optical Coherence Tomography)을 이용하여 얻는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 상기 단층 이미지는 Time-domain OCT, Spectral-domain OCT, Swep source OCT를 포함한 모든 영역의 광 단층 촬영장치를 이용하여 얻을 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 Time-domain OCT를 이용하여 단층 이미지를 얻었다.
본 발명의 방법에서, 상기 b)단계에서 종자의 종피와 배유 간의 거리는 종자의 단층 이미지 상의 거리를 공지의 방법을 이용하여 스테이지상에서 직접 측정할 수 있다. 본 실시예에서는, 샘플(오이 종자)의 위치(단층 화면의 가로축 거리)를 정밀한 x축 또는 y축 스테이지를 사용하여 직접 화면상에서 이동거리와 스테이지 이동 거리를 비교하여 단층 이미지 상의 거리를 정확하게 측정하였다. 아울러 단층 화면상의 세로축 거리의 거리 또한 Z축 스테이지를 사용하여 직접 이동 거리를 측정하였다. 바람직하게는 종자의 종피와 배유 간의 거리는 A-Scan의 인텐서티 크기를 깊이별 분석방식을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 한다.
A-scan은 오이 종자의 깊이별 간섭 정보를 나타내는 것으로서, A-scan 정보가 있어야지 단층 이미지를 만들 수가 있다. OCT는 샘플단에서 B-mode 스캐이닝(빔이 한축으로 이동)하는 방법을 통하여 빔이 스캔하는 지역의 깊이 별 간섭 정보를 획득하게 된다. 본 발명의 실시예에서는 오이 종자의 평균적인 깊이별 간섭 정보를 A-scan analysis 방법을 통하여, 종피의 가장 높게 뜨는 신호를 중심으로 깊이 별 같은 위치의 값들을 평균적인 값들을 구하였다. 따라서, 본 발명의 실시예에서 확인된 A-scan 값은 샘플 오이 종자가 가지고 있는 고유의 깊이별 간섭 신호 정보라고 할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 c)단계에서 건전 종자로 판단하는 소정 거리 또는 바이러스 감염 종자로 판단하는 소정 거리는 기지(旣知) 건전 종자들의 종피와 배유 간의 거리의 DB(database) 또는 기지 바이러스 감염 종자들의 종피와 배유 간의 거리의 DB로부터 통계적으로 계산되는 것을 특징으로 한다.
상기 DB는 이미 알려진 다수의 건전 종자 또는 비건전 종자를 대상으로 단층 이미지의 A-scan 분석을 통해 측정된 종피와 배유 간의 거리값들을 저장한 DB를 의미한다. 상기 각 DB에 들어 있는 거리값들로부터 평균값을 계산하거나, 확률분포를 통해 90% 또는 95% 신뢰도를 갖는 구간 값을 계산하여, 이를 상기 소정 거리로 이용한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 건전 종자로 판단하는 소정 거리는 기지 건전 종자들의 정규 확률 분포 그래프에서 90% 구간 (82 ~ 96 μm; 도 8a 참조)의 하한 거리이고, 바이러스 감염 종자로 판단하는 소정 거리는 기지 바이러스 감염 종자들의 정규 확률 분포 그래프에서 90% 구간 (63 ~ 72 μm; 도 8b 참조)의 상한 거리일 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 선별대상 식물 종자의 단층을 촬영하기 위한 광학적 단층 촬영부; 상기 광학적 단층 촬영부로부터 선별대상 식물 종자의 단층 이미지 데이터를 획득하는 신호 처리부; 및 상기 신호 처리부에서 획득한 이미지 데이터를 분석하여, 선별대상 식물 종자의 바이러스 감염 여부를 결정하는 데이터 분석부;를 포함하고, 상기 데이터 분석부는 신호 처리부에서 획득한 이미지 데이터 분석을 통해 식물 종자의 종피와 배유 간의 거리를 조사하여, 종자의 종피와 배유 간의 거리가 소정 거리 이상이면 건전 종자로 판단하고, 소정 거리 이하이면 바이러스 감염 종자로 판단하는 것을 특징으로 하는 건전 식물 종자 또는 바이러스 감염 식물 종자의 선별장치를 제공한다.
본 발명의 건전 식물 종자 또는 바이러스 감염 식물 종자의 선별장치에 있어서, 상기 광학적 단층 촬영부는, 단층 이미지 촬영을 위한 광대역 광원을 발생하는 광대역 광원; 제1~4 단자를 포함하고, 제1 단자를 통해 상기 광원으로부터 발생된 광을 입력받아, 두 개의 광으로 분배하여 제2 및 제3 단자로 출력하고, 상기 제2 및 제3 단자로부터 입력되는 광을 결합하여 제4 단자로 출력하는 광분배기; 상기 광분배기의 제2 단자에 연결되어, 상기 광분배기를 통해 전달된 상기 광원을 그대로 반사시키는 기준단; 상기 광분배기의 제3 단자에 연결되어, 상기 광분배기를 통해 전달된 상기 광원을 선별대상 식물 종자에 조사하여, 상기 선별대상 식물 종자에서 반사된 반사광을 출력하는 샘플단; 상기 광분배기의 제4 단자에 연결되어, 상기 광분배기에서 결합된 기준단의 반사광과 샘플단의 반사광의 결합 신호를 입력받아, 상기 두 반사광의 간섭 신호를 검출하여 전기 신호로 변환하여 출력하도록 + 입력단과 - 입력단을 갖는 평형 검출기로 구현되는 광검출기; 및 상기 광분배기에서 상기 광대역 광원으로 되돌아가는 광을 상기 광검출기의 - 입력단으로 전달하는 광서큘레이터;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 설명된 광학 단층 촬영 장치는 시간 영역 광학 단층 촬영 장치에 대한 설명이자 동시에 본 발명의 구현예에서 사용된 광학 단층 촬영 장치의 설명이다. 시간 영역 광 단층 촬영기 이외에 주파수 영역 광단층 촬영장치 또한 동일한 성능을 나타낸다.
이하, 본 발명의 건전 식물 종자 또는 바이러스 감염 식물 종자의 선별장치를 첨부된 도면을 참조하여 보다 구체적으로 설명한다.
도 6은 본 발명에 따른 건전 식물 종자 또는 바이러스 감염 식물 종자의 선별장치의 구성을 보인 블록도이다.
도 6을 참조하면, 본 발명에 따른 건전 식물 종자 또는 바이러스 감염 식물 종자의 선별장치는, 광학적 단층 촬영부, 신호 처리부 및 데이터 분석부를 포함하여 이루어진다.
상기 광학적 단층 촬영부는, 선별 대상이 되는 식물 종자의 단층 이미지를 물리적 절단 없이 비침습식으로 촬영하기 위한 것으로, 선별 대상이 되는 식물 종자로 광대역의 광원을 조사하여, 상기 선별 대상이 되는 식물 종자의 단층 이미지를 획득할 수 있는 마이켈슨 간섭계에 의한 간섭 신호를 출력한다. 더 구체적으로, 상기 광학적 단층촬영부는 OCT(Optical coherence tomography)로 구현되며, Time-domain OCT, Spectral-Doamin OCT, Swept source OCT 등 어떠한 종류의 OCT라도 사용가능하다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 광학적 단층 촬영부는 Time-domain OCT로 구현된다.
또한 상기 신호 처리부는 상기 광학적 단층 촬영부로부터 출력되는 간섭신호를 신호 처리하여 선별 대상이 되는 식물 종자의 단층 이미지 데이터를 획득한다. 더 구체적으로, 상기 신호 처리부는 상기 간섭 신호에 대하여 DC 성분의 필터링, 포락선 검파(Envelope Detecting), 및 디지털 변환(A/D Convertor)을 수행하여, 단층 이미지 데이터를 출력한다.
상기 데이터 분석부는, 상기 신호 처리부로부터 제공된 단층 이미지 데이터를 통해 상기 선별 대상이 되는 식물 종자의 단층 이미지를 분석하여, 식물 바이러스 감염의 여부를 판단한다. 더 구체적으로, 본 발명에서, 상기 데이터 분석부는 신호 처리부에서 획득한 이미지 데이터 분석을 통해 식물 종자의 종피와 배유 간의 거리를 조사하여, 종자의 종피와 배유 간의 거리가 소정 거리 이상이면 건전 종자로 판단하고, 소정 거리 이하이면 바이러스 감염 종자로 판단할 수 있다. 상기 소정 거리는 기지 건전 종자들의 종피와 배유 간의 거리의 DB(database), 또는 기지 바이러스 감염 종자들의 종피와 배유 간의 거리의 DB로부터 통계적으로 계산될 수 있다.
상기 데이터 분석부는, 신호 처리부에서 획득한 이미지 데이터로부터 식물종자의 종피와 배유간의 거리를 측정하기 위한 프로그램과, 상기 측정된 거리와 건전종자 또는 비건전 종자 판단 소정거리를 비교하여 식물종자의 바이러스 감염여부를 판단하기 위한 프로그램을 포함하며, 이들 프로그램은 퍼스널 컴퓨터(PC)에 설치되어 구현될 수 있다.
다음으로, 도 7을 참조하여 본 발명에 따른 건전 식물 종자 또는 바이러스 감염 식물 종자의 선별장치의 시스템 구성도를 설명한다. 광 단층 촬영장치는 기본적으로 광대역 광원, 광 분배기, 기준단, 샘플단, 광검출기 및 광서큘레이터를 포함한다.
먼저 본 발명의 선별장치의 구성도에서 사용된 광 대역 광원은 중심 파장이 1310 nm에 150 nm의 반치폭 (FWHM)을 가지는 SLED (Super Luminescent Emitted Diode)를 사용한다. 일반적인 광 단층 촬영장치의 경우 광대역 광원 (Broadband Source)을 사용하여 축 방향 해상도를 향상시킨다 (시간영역 광단층 촬영 장치와 주파수 영역의 Spectral-domain OCT의 경우 광대역 광원을 사용하며, Swept-Source OCT의 경우 좁은 대역의 파장선이 광대역으로 조사할 수 있는 광원을 사용하여 같은 효과를 낸다).
상기 광원에서 나온 광 에너지는 셔큘레이터(Circulator)를 거쳐서 50:50 광 분배기(Fiber coupler)를 거쳐서 샘플단과 기준단으로 나누어지게 된다. 셔큘레이터는 광에너지가 입사하는 광 분배기를 통하여 샘플단과 기준단에서 반사되어 다시 광 분배기를 거쳐서 돌아오는 광에너지 중에 광원 쪽으로 돌아가는 광 에너지를 다른 방향으로 보내는 역할을 한다. 광 분배기는 광 간섭현상을 만들기 위해서 사용되며, 광원에서 나온 광 에너지를 샘플단과 기준단에 동일하게 분배하여 진행시킨다. 본 발명에 따른 시스템은 광섬유를 이용하여 제작하였기 때문에 광 분배기를 광 커플러를 사용하였다.
상기 기준단은 RSOD (Rapidly Scanning Optical Delayline)을 사용하였다. 구성은 상용화된 회절격자와 300 Hz의 속도로 움직이는 갈보 스캐너를 구동시켜서 구성하였다. RSOD에서 기준단의 길이를 미세하게 변화시켜 광경로를 변화시킨다 (주파수 영역의 광 단층 촬영기의 경우 물리적인 광경로 이동이 필요 없기 때문에 기준단이 고정되어 있다)
상기 샘플단은 갈보스캐너를 이용하여 B-mode 스캐닝이 가능하게 제작을 하였으며, 콜레메이션되어 입사되는 빔을 빔 포커싱 시키기 위하여 30mm의 초점거리를 가지고 있는 대물렌즈를 사용하였다. 기준단의 갈보스캐너가 미세하게 움직임로써 광경로를 변화시켜서 샘플단의 광경로가 간섭거리에 있는 경우 간섭신호가 생성이 된다. 생성된 간섭신호는 다시 광분배기를 거쳐서 광수신부로 들어가게 된다 (하지만 주파수 영역 광 단층 촬영기의 경우는 기준단의 고정된 상태에서 샘플단과 가간섭거리 안에서의 위치만 조정을 한다).
시간영역 광단층 촬영기의 경우 광수신부는 광검출기를 사용하는데, 본 발명에서는 Balanced Photo Detector를 사용하여, 신호의 SNR을 높였다. 정상적으로 기준단과 샘플단의 합해진 신호가 광검출기의 + 단자로 가며, 광원부로 돌아가는 신호가 셔큘레이터를 거쳐서 단자로 돌아가게 설계를 한다 (주파수 영역의 광단층 촬영기에서, Spectral-domain OCT의 경우는 광수신부가 CCD 및 CMOS 라인 스캔 카메라로 제작된 광 분광기(Spectrometer)에 의해서 광신호가 들어가지게 된다. Swept-source OCT의 경우 광검출기를 사용한다).
상기 광검출기를 통해서 들어온 간섭 신호는 전압으로 바뀌어서 DAQ 보드로 들어가게 된다. 여기어서 신호처리 과정을 거져서 DC 전압 성분은 필터링 시키고, Envolpe Detecting을 한 후에 디지털 신호로 변환된 후에 이미지화 되게 된다 (주파수 영역의 광 단층 촬영기의 경우, 광분광기와 광검출기를 통해서 들어온 신호는 퓨리에 변환을 거쳐서 거리 정보를 나타내는 신호로 변환 되게 되며, 이 신호들의 조합을 통해서 이미지를 구성하게 된다).
본 발명의 실시예에서는, Sampling rate 10,000,000 Hz, A-scan 수는 200개, A-scan 당 픽셀 수는 15,000개로 설정하였다. 실험의 준비 상황에서 OCT의 축방향 해상도는 4.5 μm이며 실제 공기중에서 측정시에는 6 μm로 나타났다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 선별 대상이 되는 오이 종자의 단층 이미지 상에서, 종피와 배유 간의 거리를 조사하여 우량종자 및 바이러스 감염 종자를 확인할 수 있다. 상기 종피와 배유 간의 거리는 오이 종자의 광 단층 이미지의 영상 처리 및 신호 분석을 통하여 건전과 비 건전 오이 종자의 구분이 가능하며, 추가적인 신호처리 과정을 거쳐서 종피와 배유 간의 거리를 수치적으로 확인이 가능하다.
도 1은 건전 및 비건전 오이종자의 광단층 이미지와 실제 현미경 이미지 비교한 도면이다.
도 2는 건전 오이종자(아래) 및 비건전 오이종자(위)의 A-scan 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 Time-domain 광대역 단층 촬영 장치 (TD-OCT) 구성도이다.
도 4는 Swept-Source 단층 촬영 장치 (SS-OCT) 구성도이다.
도 5는 Spectral-domain 단층 촬영장치 (SD-OCT) 구성도이다.
도 6은 본 발명에 따른 건전 오이 종자 또는 바이러스 감염 오이 종자의 선별장치의 구성을 보인 블록도이다.
도 7을 본 발명에 따른 건전 오이 종자 또는 바이러스 감염 오이 종자의 선별장치의 시스템 구성도이다.
도 8a는 건전 오이의 정규 확률 분포 그래프 90% 구간을 나타낸다.
도 8b는 비건전 오이의 정규 확률 분포 그래프 90% 구간을 나타낸다.
도 9는 건전 및 비건전 오이종자의 nested PCR 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 광 단층 촬영을 통한 종자 단층 이미지 확인
시간 영역 광 단층 촬영기 (Time Domain optical coherence tomography; 자체 제작) 기술을 이용하여, 종자 회사(농우바이오)로부터 지원을 받은 건전 오이 종자 20립과 비 건전 오이 종자 20립에 대한 단층 이미지를 확인하였다.
도 1은 본 발명에 따른 광 단층 촬영 이미지와 실제 현미경의 이미지를 비교한 도면이다. 실제 현미경(Digital microscope, Dimis, Korea) 상에서도 건전한 오이 종자의 경우 종피의 두께가 비 건전한 오이 종자에 비해서 두꺼운 것을 확인하였다 (도 1의 B와 D). 아울러 광 단층 이미지 상에서도 종피와 배유의 간격이 건전한 경우 더 넓은 것을 확인할 수 있다 (도 1의 A와 C).
추가적인 A-scan 분석을 통하여 실제 종피와 배유의 간격을 구할 수 있을 뿐만 아니라 눈으로 건전 오이 종자가 간격이 더 넓은 것이 확인 가능하다. A-scan 분석은 광 단층 이미지의 축 방향 라인 별 정보를 60, 120, 180개에 대하여 평균적인 값을 구하였다. 그 결과, 종피의 가장자리의 위치와 배유의 가장자리의 위치 사이의 간격을 종피와 배유의 간격이라고 정의한 후에, 도 2와 같은 결과를 얻었다. 평균을 내는 축방향 데이터의 개수는 조절이 가능하며, 개수가 많을수록 더 신뢰도가 높아진다.
도 2는 건전 오이 종자와 비 건전 오이 종자의 A-scan 분석 결과이다. 도 2에서, 건전한 종자의 경우 종피와 배유간의 간격이 88 μm 간격으로 나타나는 것으로 확인하였으며 (도 2의 위), 비 건전한 오이 종자의 경우 67 μm 간격을 나타나는 것을 확인하였다 (도 2의 아래).
또한 상기 A-scan 분석에 의한 종피와 배유간의 간격은, 상기 제공된 건전 오이 종자 20립과 비 건전 오이 종자 20립에 대한 종피와 배유 간의 거리의 DB로부터 통계적으로 계산되었으며, 도 8a와 8b는 각각 건전 오이 종자 20립과 비 건전 오이 종자 20립에 대한 정규 확률 분포 그래프를 나타낸다. 도 8a는 건전 오이의 정규 확률 분포 그래프 90% 구간 (82 ~ 96 μm)을 나타내고, 도 8b는 비건전 오이의 정규 확률 분포 그래프 90% 구간 (63 ~ 72 μm)을 나타낸다.
실시예 2. 건전 종자와 비 건전 종자의 RT-PCR 검증
실시예 1에서 오이 종자의 단층 이미지를 확인한 후, PCR을 이용하여 종자의 건전과 비건전 여부를 검증하였으며, 검증 결과 각각 20립 모두 건건과 비 건전으로 확인되었다.
준비된 종자의 CGMMV 감염 여부를 확인하기 위하여 CGMMV Movement protein영역을 증폭시키는 Primer set인 CGMM-C60/CGMM-N30, CGMM-C70/CGMM-N35가 RT-PCR과 Nested PCR에 각각 이용되었다. 광 간섭 촬영 실험이 끝난 후에 촬영된 종자를 대상으로 Total RNA를 추출하고 RT-PCR 및 Nested PCR을 진행하였다. 막자사발에 실험에 이용된 종자 1립과 Trizol(Invitrogen, USA) 800 μl을 첨가하여 완전히 마쇄하였다. 마쇄액을 1.5 ml Tube에 넣고 15,000 rpm으로 10분간 원심분리 하였다. 상청액을 새로운 Tube로 옮기고 동량의 Chloroform을 첨가하여 교반한 뒤 15,000 rpm으로 10분간 원심분리 하였다. 상청액을 다시 새로운 Tube로 옮기고 동량의 2-propanol을 첨가하여 얼음 위에서 10분간 정치 후 15,000 rpm에서 원심분리 하였다. 상청액을 제거하고 침전물을 700 μl의 70% ethanol을 첨가하여 린스하였다. 침전물을 완전히 건조시킨 후 100 μl RNase free water에 용해하고 RT-PCR 주형으로 이용하였다. RT-PCR은 RT/PCR premix (Bioneer, Korea)를 이용하여 수행하였다. 종자의 Total RNA 0.5 μ와 CGMM-C60 (10 pM/μl) (5'- AAT TAA GTA AAG TCC TGA CG - 3') 및 CGMM-N30 (10 pM/μl) (5'- ATG GAA CGT ACC GGA ATC - 3')를 각각 0.5 μl를 넣고 RNase free water로 Total Volume을 20 μl로 조정하여 RT-PCR을 진행하였다. RT-PCR 조건은 42℃에서 60분간 역전사하여 cDNA를 합성하고 95℃에서 5분간 Pre-heating 후에 95℃ 45초, 55℃ 1분, 72℃ 1분 30초로 35회 증폭시켰으며, 추가로 72℃에서 5분간 반응하였다. RT-PCR 산물 중 2 μl를 0.7% agarose gel에서 전기영동하고 ethidium bromide에 염색한 후, UV transilluminator에서 검출 유무를 확인하였다. 하지만 종자 한 립에 소량으로 존재하는 CGMMV를 RT-PCR 방법으로는 검출하지 못하였다. 이에 RT-PCR product내에 소량 존재하는 CGMMV의 cDNA를 한번 더 증폭하기 위하여 Nested PCR을 수행하였다. RT-PCR product 2 μl, CGMM-C70 (10 pM/μl) (5'- TGG AGG TTT AGA ATG CCG CTT AC - 3') 및 CGMM-N35 (10pM/μl) (5'- ACC GTC CGC GAA TTC TCT - 3') 각각 0.5 μl, Taq DNA polymerase (Solgent Co., Korea)를 0.2 μl, dNTPs mixture (10 mM)를 0.4 μl, 10× Reaction Buffer(100 mM Tris-HCl, 400 mM KCl, 15 mM MgCl2, pH 9.0)를 2 μl을 넣고 멸균수로 Total Volume을 20 μl로 조정하여 Nested PCR을 진행하였다. Nested PCR 조건은 94℃에서 15분간 pre-heating 한 후, 94℃ 45초, 55℃ 1분, 72℃ 1분으로 35회 증폭시켰으며 마지막에는 72℃에서 5분간 처리하였다. Nested PCR 산물 중 2 μl를 0.7% agarose gel에서 전기영동하고 ethidium bromide로 염색한 후 UV transilluminator에서 검출 유무를 확인하였다.
도 9는 Nested PCR 산물을 전기영동한 결과이다. 도 9에서 같이, 건전 오이종자에서는 목적한 DNA 단편이 증폭되지 않았고 병든(비건전) 오이종자에서는 약 400 bp의 목적한 DNA 단편이 증폭되어 CGMMV에 감염된 것으로 확인할 수 있었다. Lane 1은 건전한 오이종자의 nested PCR 결과이다. Lane 1에서는 목적한 약 400 bp의 DNA 단편이 증폭되지 않아 CGMMV에 감염되지 않은 것을 알 수 있다. Lane 2는 CGMMV에 감염된 오이종자의 nested PCR 결과이다. 약 400 bp의 목적한 DNA 단편이 증폭되어 CGMMV에 감염된 것을 알 수 있다. Lane 3은 CGMMV에 감염되었다고 예상된 병든 참외종자에 대한 nested PCR 결과로 Lane 2와 동일한 약 400bp의 목적한 DNA 단편의 증폭을 확인할 수 있었다.
따라서 오이종자는 광 간섭 단층 촬영기를 이용하여 촬영한 직후 Total RNA를 추출하고 RT-PCR 진행 후에 얻어진 PCR산물을 이용해서 재차 nested PCR을 통하여 바이러스 감염 여부를 확인하였다.

Claims (9)

  1. 하기 단계들을 포함하는 건전 오이 종자 또는 바이러스 감염 오이 종자의 선별방법:
    a) 선별대상 오이 종자의 단층 이미지를 얻는 단계;
    b) 상기 단층 이미지로부터 종자의 종피와 배유 간의 거리를 조사하는 단계; 및
    c) 상기 조사된 종자의 종피와 배유 간의 거리가 소정 거리 이상이면 건전 종자로 판단하고 소정 거리 이하이면 바이러스 감염 종자로 판단하는 단계.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 바이러스는 오이녹반모자이크 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 a)단계에서 단층 이미지는 광학 단층 촬영기법(OCT: Optical Coherence Tomography)을 이용하여 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 b)단계에서 종자의 종피와 배유 간의 거리는 단층 이미지 상에서의 직접 측정 또는 A-Scan의 인텐서티 분석을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 c)단계에서 건전 종자로 판단하는 소정 거리 또는 바이러스 감염 종자로 판단하는 소정 거리는 기지(旣知) 건전 종자들의 종피와 배유 간의 거리의 DB 또는 기지 바이러스 감염 종자들의 종피와 배유 간의 거리의 DB로부터 통계적으로 계산되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 건전 종자로 판단하는 소정 거리는 기지 건전 종자들의 정규 확률 분포 그래프에서 90% 구간의 하한 거리이고, 바이러스 감염 종자로 판단하는 소정 거리는 기지 바이러스 감염 종자들의 정규 확률 분포 그래프에서 90% 구간의 상한 거리인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 선별대상 오이 종자의 단층을 촬영하기 위한 광학적 단층 촬영부;
    상기 광학적 단층 촬영부로부터 출력된 신호를 처리하여 상기 오이 종자의 단층 이미지 데이터를 획득하는 신호 처리부; 및
    상기 신호 처리부에서 획득한 이미지 데이터를 분석하여, 선별대상 오이 종자의 바이러스 감염 여부를 결정하는 데이터 분석부;를 포함하고,
    상기 데이터 분석부는 신호 처리부에서 획득한 이미지 데이터 분석을 통해 오이 종자의 종피와 배유 간의 거리를 조사하여, 종자의 종피와 배유 간의 거리가 소정 거리 이상이면 건전 종자로 판단하고, 소정 거리 이하이면 바이러스 감염 종자로 판단하는 것을 특징으로 하는 건전 오이 종자 또는 바이러스 감염 오이 종자의 선별장치.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 광학적 단층 촬영부는
    단층 이미지 촬영을 위한 광대역 광원을 발생하는 광대역 광원;
    제1~4 단자를 포함하고, 제1 단자를 통해 상기 광원으로부터 발생된 광을 입력받아, 두 개의 광으로 분배하여 제2 및 제3 단자로 출력하고, 상기 제2 및 제3 단자로부터 입력되는 광을 결합하여 제4 단자로 출력하는 광분배기;
    상기 광분배기의 제2 단자에 연결되어, 상기 광분배기를 통해 전달된 상기 광원을 그대로 반사시키는 기준단;
    상기 광분배기의 제3 단자에 연결되어, 상기 광분배기를 통해 전달된 상기 광원을 선별대상 오이 종자에 조사하여, 상기 선별대상 오이 종자에서 반사된 반사광을 출력하는 샘플단;
    상기 광분배기의 제4 단자에 연결되어, 상기 광분배기에서 결합된 기준단의 반사광과 샘플단의 반사광의 결합 신호를 입력받아, 상기 두 반사광의 간섭 신호를 검출하여 전기 신호로 변환하여 출력하도록 + 입력단과 - 입력단을 갖는 평형 검출기로 구현되는 광검출기; 및
    상기 광분배기에서 상기 광대역 광원으로 되돌아가는 광을 상기 광검출기의 - 입력단으로 전달하는 광서큘레이터;를 포함하는 것을 특징으로 하는 건전 오이 종자 또는 바이러스 감염 오이 종자의 선별장치.
  9. 제 7항에 있어서, 광학적 단층 촬영부는 시간 영역 광단층 촬영장치(time-domain optical coherence tomography) 또는 주파수 영역 광단층 촬영장치(spectral-domain optical coherence tomography)인 것을 특징으로 하는 건전 오이 종자 또는 바이러스 감염 오이 종자의 선별장치.
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