KR100980196B1

KR100980196B1 - 생체유리 입자 분사법에 의한 티타늄 임플란트의 표면 개질방법

Info

Publication number: KR100980196B1
Application number: KR1020080024805A
Authority: KR
Inventors: 이해형; 김해원
Original assignee: 단국대학교 산학협력단
Priority date: 2008-03-18
Filing date: 2008-03-18
Publication date: 2010-09-03
Also published as: KR20090099673A

Abstract

치과 및 외과 분야에서 널리 이용되는 티타늄 임플란트의 표면에 생체활성을 부여하고 표면 조도를 증가시키기 위하여 생체활성 유리(bioactive glass; BG)를 분사 입자로서 사용한 생체유리 입자 분사법에 의한 티타늄 표면 개질 방법을 제공한다. 상기 티타늄 표면 개질 방법은 졸-겔법을 이용하여 미세한 입자 크기를 가지는 생체유리 분말을 제조하는 단계; 및 제조된 생체유리 분말을 티타늄 재질의 처리대상물 표면에 분사하여 처리대상물의 표면을 세정하고 거칠게 하는 표면처리 단계;를 포함하며, 이러한 표면 개질 방법에 의해 표면 처리된 티타늄 재질의 가공대상물 예컨대, 인공치근은 시술 후 시술부위 주변 생체조직 활성에 적합한 표면상태 및 화학적 상태를 가짐으로써, 시술 성공율를 획기적으로 향상시키는 데에 기여할 수 있다.

생체유리(BG), 분사, 티타늄, 표면 개질

Description

생체유리 입자 분사법에 의한 티타늄 임플란트의 표면 개질 방법{Surface modification of titanium implant by blasting with bioactive glass particles using the same}

본 발명은 생체유리 입자 분사법에 의한 티타늄 임플란트의 표면개질방법에 관한 것으로, 상세하게는 임플란트로 사용되는 티타늄 재질의 표면에 생체활성을 부여하고 표면 조도를 증가시키기 위하여 생체활성 유리(bioactive glass; BG)를 분사 입자로서 사용한 티타늄 임플란트의 표면 개질 방법에 관한 것이다.

임플란트(Implant)는 원래 인체조직이 상실되었을 때 회복시켜 주는 대치물을 의미하지만, 신경외과 및 정형외과에서는 척추 및 관절 대체용으로, 치과에서는 인공으로 만든 치아를 이식하는 것을 말한다.

일반 보철물이나 틀니의 경우에, 착용 중에 이물감을 심하게 느끼게 하거나 접합 불량 등으로 인하여 조직에 심한 통증을 유발하여 잇몸이 붓는 등의 부작용이 있는 것에 반해, 임플란트의 경우에는 손실된 치아 주변의 인접 치아 또는 주위의 조직(tissue)을 손상시키지 않고 손실된 부분에만 시술이 가능하며, 골조직을 지지하여 골조직의 흡수 속도를 지연시키고, 자연 치아와 동일한 저작력을 제공할 수 있는 장점이 있다.

치과 임플란트 시술을 수행함에 있어서는 일반적으로 인체에 거부반응이 없는 티타늄(titanium)을 소재로 한 인공치근이 이용되고 있다. 또한 신경외과, 정형외과 등 외과분야의 척추 및 관절 대체용 임플란트에서도 기존의 스텐레스 재질보다 인체 적합성이 더 좋은 티타늄 금속이 이용되고 있다.

그러나 티타늄 소재의 임플란트에 있어서 임상가들은 때때로 규명되지 않은 원인으로 인하여 골융착 실패를 겪고 있다. 이러한 골융착 실패는 티타늄 또는 티타늄 합금 소재로 된 인공치근의 표면특성이 크게 관여하고 있는 것으로 보고되고 있으며, 따라서 주변생체 조직과의 적합한 유착성을 가지도록 티타늄의 표면을 개질하는 것은 임플란트의 성공율을 높이는 데에 있어 가장 중요한 요소라 볼 수 있다.

티타늄에 대한 생체분자들의 부착과 세포반응을 조절하여 생체내에서 골형성을 촉진하고 골유착성을 증진시키기 위하여, 최근에는 다양한 공학적 표면 처리 기법을 이용하여 티타늄 소재의 표면 처리를 수행하고 있다. 지금까지 알려진 표면 처리 방법으로는 크게 물리적, 화학적, 생화학적 표면 개질로 구분되는 데, 구체적인 예로서는, 입자 분사법, 산부식, 칼슘 포스페이트 코팅, 양극산화법, 이온 주입법 및 생체고분자 처리법 등이 사용되고 있다.

이 가운데 입자 분사법은 단단한 세라믹 입자를 사용하여 금속 표면을 세정 하고 표면을 거칠게 하여 세포 부착이 용이할 정도의 적합한 표면 형상을 갖도록 한 방법으로, 분사를 위한 세라믹 입자로는 일반적으로 알루미나(Al₂O₃)가 널리 채택되고 있다. 알루미나 입자는 매우 단단하며 여러 가지 크기를 가져서, 티타늄 표면과의 충격 시 그 표면에 적절한 거칠기를 생성시키기에 적합한 장점을 가진다.

알루미나 입자를 이용한 분사법을 이용하여 티타늄의 포면 처리를 수행함에 있어서는, 입자 충격에 의한 거칠기의 정도에 따라 임플란트 시술 후 인체 조골세포의 반응과 골과의 결합정도가 조절될 수 있다.

이처럼 알루미나 입자를 이용한 분사법은 입자 충격에 의해 가공대상물인 티타늄 소재의 인공치근 표면에 거칠기를 형성함에 있어 유리한 가공 방법이지만, 표면 처리 후 가공대상물 표면에 많은 양의 입자가 잔존하는 단점이 있으며, 잔존한 알루미나 입자들로부터는 신경독소 물질로 알려진 알루미늄 이온이 유출되어 생체 내 세포 대사와 세포 독성학적 효과에 대하여 많은 우려가 지적되고 있다.

상기한 문제를 해결하기 위한 대체 분사 재료로서 최근 수산화인회석(Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂) 분말이 사용되고 있으나, 수산화인회석 분말의 경우에는 경도가 낮아 분사를 수행한다 하더라도 티타늄 표면의 거칠기를 증가시키기가 어렵다는 문제가 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는, 티타늄 재질의 처리대상물에 대한 생체활성 표면처리를 위해 분사 재료로서 생체유리(bioactive glass; BG)를 사용함으로써, 처리대상물의 표면이 시술부위 주변생체 조직과의 유착에 적합한 표면 형상을 가지면서 골형성에 유익한 성분을 포함하도록 티타늄 재질의 처리대상물의 표면을 개질시키는 생체유리 입자 분사법에 의한 티타늄 표면 개질 방법을 제공하는 데에 있다.

상기한 기술적 과제를 해결하기 위한 수단으로서 본 발명은, 졸-겔법을 이용하여 미세한 입자 크기를 가지는 생체유리 분말을 제조하는 단계; 및 제조된 생체유리 분말을 티타늄 재질의 처리대상물 표면에 분사하여 처리대상물의 표면을 세정하고 거칠게 하는 표면처리 단계;를 포함하는 생체유리 입자 분사법 의한 티타늄 표면 개질 방법을 제공한다.

여기서, 졸-겔법을 이용한 상기 생체유리 분말을 제조하는 단계에서는, 70SiO₂·25CaO·5P₂O₅의 화학조성을 가지도록, 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS), 질산 칼슘(calcium nitrate), 트리에틸 포스페이트(triethyl phosphate)를 0.7:0.25:0.05 비율로 혼합하고, 상기 혼합에 의한 혼합물을 HCL(1 N) 성분을 포함 하는 산성용액에 첨가하여 가수분해 반응을 통해 졸 혼합물이 생성되도록 하며, 상기 졸 혼합물을 6 ~ 24시간 동안 교반기에서 교반시킨 후 40℃ ~ 70℃의 온도조건을 유지하는 건조기에서 12 ~ 48시간 동안 숙성/건조시켜 겔(gel) 상태가 되도록 하고, 건조된 상기 겔 상태의 혼합물을 분쇄기를 통해 잘게 분쇄한 뒤 잘게 분쇄된 분말을 600℃ ~ 700℃의 온도조건을 유지하는 챔버에서 4 ~ 6시간동안 열처리하며, 열처리된 분말을 마노절구에서 재차 분쇄한 후 100 ~ 120㎛의 눈금 크기를 가진 선별망을 이용해 분리 선별하여 120㎛ 이하의 입자 크기를 가진 셍체유리 분말을 획득할 수 있도록 함이 바람직하다.

그리고, 상기 표면처리 단계에서는, 제조된 생체유리 분말을 공압을 발생하는 분사기에 투입한 후 티타늄 재질의 처리대상물 표면에 4 ~ 6bar 압력으로 고압공기 형태로 분사하여 표면을 처리함이 바람직하다.

상기한 본 발명에 의하면, 입자 분사 수행 후 티타늄 재질의 가공대상물 표면에 잔존하는 생체유리 분말 입자들에 의해 티타늄 표면에 대한 인체 조골세포부착 및 성장이 촉진되는 생물학적 효과가 발현됨과 함께, 처리대상물 표면에 존재하는 생체유리 입자들은 배양기간 동안 석회화 과정에서 매우 중요한 기능을 함으로써, 생체유리 분사 티타늄은 골세포 분화와 석회화에 매우 우수한 표면 상태를 가지는 것으로 볼 수 있다. 결과적으로, 생체유리 분사에 의한 티타늄 표면 개질 방법은 인체 시술 후 시술부위 주변생체 조직과의 유착에 적합한 표면 형상을 가지면 서 골형성에 유익한 성분을 포함하므로 임플란트 시술 시 성공율을 획기적으로 높이는 데에 기여할 수 있다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 티타늄 재질의 처리대상물에 대한 표면처리를 위해 입자 분사 재료로서 생체유리(bioactive glass; BG)를 사용함으로써, 처리대상물의 표면이 시술부위 주변생체 조직과의 유착에 적합한 표면 형상을 가지면서 골형성에 유익한 성분을 포함할 수 있도록 티타늄 재질의 처리대상물 표면을 개질시키는 것을 요지로 한다.

본 실시예에 있어서 「티타늄 재질의 처리대상물」은 임플란트 시술 시 이가 빠져나간 부분을 수복시키기 위해 인공으로 만든 치아를 이식함에 있어 치조골에 심어지는 대치물로서 전반적으로 작은 나사와 유사한 외형을 가진 인공치근을 의미하지만, 인체조직이 상실되었을 때 회복시켜 주는 다양한 형태을 가진 대치물 역시 적용가능하므로, 이들을 포괄하는 의미로 해석되어야 할 것이다.

본 발명에 적용된 티타늄 재질의 처리대상물 표면을 개질시키기 위한 구체적인 방법은, 졸-겔법을 이용하여 미세한 입자 크기를 가지는 생체유리 분말을 제조한 뒤, 제조된 생체유리 분말을 티타늄 재질의 처리대상물 표면에 강하게 분사하여 처리대상물의 표면에 거칠기를 부여하는 과정을 포함한다.

표면 개질을 위해 사용되는 상기 생체유리 입자로는 수십미크론 크기 이하의 입도를 가진 것이 적합하며, 생체유리를 이용한 상기 표면처리 단계에서는 제조된 생체유리 분말을 공압을 발생하는 분사 기기에 투입한 후 티타늄 재질의 처리대상물 표면에 4 ~ 6bar 압력으로 고압공기 형태로 분사하여 표면을 처리를 실시한다.

상기 졸-겔법을 이용한 상기 생체유리 분말을 제조함에 있어서는, 졸-겔 전구물질로서 테트라에틸 오르도실리케이트(tetraethyl orthosilicate; TEOS), 질산 칼슘(calcium nitrate), 트리에틸 포스페이트(triethyl phosphate)가 사용되며, 산성용액에서 가수분해 반응이 이루어질 수 있도록 상기 물질들을 적절히 혼합한 한 뒤 건조 및 열처리를 수행하여 고형화 시키고, 적절한 분쇄수단을 이용하여 표면처리에 적합한 입도를 가지도록 잘게 분쇄함으로써 제조될 수 있다.

표면처리에 적합한 입도를 가진 생체유리 분말을 제조함에 있어서의 바람직한 제조방법으로는, 먼저 70SiO₂·25CaO·5P₂O₅의 화학조성을 가지도록, 상기 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS), 질산 칼슘(calcium nitrate), 트리에틸 포스페이트(triethyl phosphate)를 0.7:0.25:0.05 비율로 혼합하는 한 후, 상기 혼합에 의한 혼합물을 HCL(1 N) 성분을 포함하는 산성용액에 첨가하여 가수분해 반응을 통해 졸 혼합물을 생성시킨다.

다음, 상기 졸 혼합물을 6 ~ 24시간 동안 교반기에서 교반시킨 후 40℃ ~ 70℃의 온도조건을 유지하는 건조기에서 12 ~ 48시간 동안 숙성/건조시켜 겔(gel) 상태가 되도록 하고, 건조된 상기 겔 상태의 혼합물을 분쇄기를 통해 잘게 분쇄한 뒤 잘게 분쇄된 분말을 600℃ ~ 700℃의 온도조건을 유지하는 챔버에서 4 ~ 6시간동안 열처리를 실시한다.

그런 다음, 상기 열처리된 분말을 마노절구와 같은 분쇄수단을 이용해 재차 분쇄한 후 100 ~ 120㎛의 눈금 크기를 가진 선별망을 이용해 120㎛ 이하의 입자 크기를 가진 생체유리 분말만을 분리 선별함으로써 티타늄 재질의 처리대상물 표면처리에 적합한 입도를 가진 생체유리 분말을 얻을 수 있는 것이다.

여기서, 유리 전구체의 조성을 0.7:0.25:0.05로 한정 한 것은 제조되어진 생체유리가 생체와의 접촉 시 생체활성에 가장 적합한 기능을 발휘할 수 있는 바람직한 혼합비율을 제시한 것으로, 상기 특정 조성에만 한정되는 것은 물론 아니며, 필요에 따라 위와 같은 조성을 크게 벗어나지 않는 범위에서 다양한 조성이 가능하다. 단, 조성을 조정함에 있어서는 실리 케이트 원료, 칼슘 원료, 그리고 포스페이트 원료가 첨가된 조성을 사용한다.

이하, 구체적인 실시예 및 실험예를 통해 본 발명의 표면 개질 방법 및 이에 따른 효과에 대해 상세히 설명한다.

실시예

- 생체유리 분말의 제조

생체유리(BG) 분말은 졸-겔법을 이용해 합성한다. 졸-겔 글라스의 전구물질로서 tetraethyl orthosilicate, calcium nitrate, 및 triethyl phosphate (Aldrich)이 사용한다. 이 물질들은 70SiO₂·25CaO·5P₂O₅의 유리 조성을 목표로 산 성용액 (1 N HCl)에서 가수분해　되도록 적절히 혼합하고 40℃에서 보관하여 겔화가 이루어지도록 한다. 응축 후 약 70℃에서 건조 후 분쇄하며 700℃에서 6시간동안 열처리를 시행한다. 열처리된 분말들은 마노유발에서 다시 분쇄하여 110 ㎛ 이하로 체거름질을 시행하여 분사 재료로 사용한다.

- 티타늄 시편와 입자 분사

티타늄(ASTM　grade 2) 시편은 원형(직경 8 ㎜ x 두께 1 ㎜)과 정사각형 (한변 20 ㎜ x 두께 1 ㎜)으로 준비한다. 분사는 치과용 분사기기(Basic classic, Renfert, Germany)를 사용하여 5 bar 압력으로 실시한다. 분사 후 시편들은 아세톤과 에탄올에서 각각 10분씩 초음파 세척을 실시한다.

비교의 목적으로 평균 크기 50 ㎛의 일반 상업용 글라스 비드(Rolloblast, Renfert)를 비생활성 재료로 티타늄에 분사재로 사용한다. 또한 입자 분사 없이 표면 연마만 시행된 티타늄 시편을 대조군으로 한다. 즉, 실험을 위하여 생체유리 분사군(이하, 'BG-Ti'라 함), 글라스 분사군(이하, 'G-Ti'라 함) 그리고 표면 연마만 실시된 티타늄군(이하, 'Ti'라 함) 등 세 군을 준비한다.

- 표면분석

사용된 분말들은 주사전자현미경(SEM, S-3000H, Hitachi, Japan)을 이용해 형상을 관찰한다. 또한 티타늄 표면의 거칠기(Ra, Ry, Rz)가 표면조도계(SJ-400, Mitutoyo, Japan)를 이용하여 측정한다. 티타늄 표면의 표면 형상과 분사에 의한 입자들은 SEM과 EDS(energy dispersive spectroscopy)에 의하여 분석한다.

실험예

- 세포 배양

murine-derived 조골세포 (MC3T-E1, ATCC)를 사용하여 상기 실시예에 의한 시편들에 대한 세포반응을 관찰하였다. 세포들은 α-modified minimum essential medium (α-MEM) supplemented with 10 % fatal calf serum (FCS), 100 units/mL penicillin G sodium, 100 μg mL-1streptomycinsulfate, 0.25 μgmL-1 amphotericin B in a humidified atmosphere(5% CO2)으로 구성된 정상 배양액을 사용하여 37 ℃ 플라스크에서 배양되었다. 세포들이 충분히 배양되었으면 트립신처리 후 원심분리를 통해 상부의 배양액을 버리고 세포 배양 팔레트는 적절한 농도로 정상 배양액에 옮겼다.

-세포 증식

세포 시험을 위하여 디스크 시편들은 70 % 에탄올에서 살균한 뒤 UV 램프가 장착된 클린벤치에서 건조한 다음 24-well 배양접시에 분리하여 옮겼다. 세포들은 각 시편에 2 x 104cells/cm2의 밀도가 되게 옮기고 조골세포 배양액(the regular culturing medium described above plus 10 mM β-glycerol phosphate and 50 μg/ml l-ascorbicacid)에서 배양하였다.

그런 다음 SEM을 이용하여 세포 성장의 양상을 관찰하였다. 이때 시편들은 glutaraldehyde (2.5 %) 로 10분간 고정 후 75, 90, 95 % 에탄올에 의하여 단계적으로 각 7분간 탈수하고 20분간 임계건조 하였다. 각 시편에서 세포들의 세포골격을 관찰하기 위하여 공초점 레이져 현미경(Confocal laser scanning microscopy; CLSM, LSM 510, Carl Zeiss, Germany)을 사용하였다.

세포들은 4% paraformaldehyde로 고정하고, 0.2% Triton X-100에 의한 처리 후 비특정 단백질과의 결합을 막기 위하여 1% bovine serum albumin (BSA)을 첨가하였다. F-actin 을 염색하기 위하여 PBS에 희석한 Alexa Fluor 546 phalloidin (invitrogen A22283) 용액이 첨가되었고, 핵 염색을 위하여 ProLong　Gold antifade reagent with DAPI (invitrogen P36935)을 사용한 다음 형광이미지를 얻었다.

- 세포 분화

초기 골생성 마커로서 세포들에 의한 ALP(alkaline phosphatase) 발현도를 측정하였다. 계대 배양된 세포들을 각 시편(20 ㎜ x 20 ㎜ x 2 ㎜)에 5 x 104cells/cm2 밀도로 주입하여 착상되도록 하고 14일 간 배양하였다. 배양후에 세포층들은 0.1 % Triton X-100 로 용해시키고 냉동 용해과정을 반복시켰다. 세포 용해물들은 DC protein assay kit (BioRad, USA). 로 측정한 총 단백질량에 대비시키고 ALP 활성도는 p-nitrophenyl phosphate substrate를 사용하여 평가하였다.

세포들에 의하여 발현된 ALP효소는 substrate를 p-nitrophenol 와 무기 인산염으로 분해시키고 p-nitrophenol 는 알카리성 조건에서 황색의 산물을 만든다. 희 석된 황색 산물의 흡수도는 410 ㎚에서 측정되고 ALP활성도는 bovine serum albumin을 사용하여 얻은 단백질 기준곡선에서 평가된다.

- 석회화

세포들의 석회화를 측정하기 위하여 Alizarin Red-S (ARS) 염색을 실시하였다. ARS는 칼슘염과 선택적으로 결합하는 염료로 잘 알려져 있으며 칼륨 석회화물을 검출하기 위하여 널리 사용되고 있다. 세포 배양 시편들은 PBS로 세척하고 찬 에탄올(70 %)로 1시간동안 고정하였다. 이 후에 증류수로 세척한 후 ARS 염료(40 mM)를 첨가하여 상온에서 20분간 방치하였다. 다시 증류수로 세척한 후 염색된 상을 광학 현미경으로 관찰하였으며 10% cetylpyridinium chloride로 1시간 희석한 후 분광기로 540 ㎚ 흡수도를 측정하였다.

- 통계처리

각 데이터로부터 평균과 표준편차를 얻었으며 시험 군간의 통계적 유의성을 조사하기 위하여 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)와 Bonferroni 사후검정을 p < 0.05 수준에서 실시하였다.

- 실험결과

도 1은 분사 재료로서 졸-겔법에 의해 합성된 생체유리(BG) 입자와 일반적인 구상형의 글라스 비드의 입도분포를 관찰한 사진이다. 도시된 도면을 통해 알 수 있듯이 글라스 비드(아래 사진)에 비하여 생체유리 입자들이 뷸규칙한 형태를 갖고 있으며 상대적으로 넓은 입도분포를 가지는 것을 알 수 있다.

도 2는 대조군 시편과 본 발명에 의한 표면 개질 방법으로서 표면 처리된 시편의 표면처리후의 표면모습을 확대 관찰한 사진으로서, (a)(b)는 분사 없이 표면 연마만 시행된 대조군 티타늄 시편의 표면 사진이며, (c)(d)는 일반 상용 글라스 비드에 의해 분사가 수행된 대조군 티타늄 시편의 표면 사진이다. 그리고 (e)(f)는 본 발명에 따른 생체유리 입자에 의해 분사가 수행된 표준시편의 표면을 확대 관찰한 사진이다.

도 2를 참조하면, 분사 없이 표면 연마만 시행된 대조군 시편은 그 표면에 규칙적인 패턴의 스크래치가 형성된 양상을 보이며((a),(b)), 일반 상용 글라스 비드에 의해 분사된 시편의 표면은 매우 규칙적이면서 비드의 형상에 따라 둥글게 함몰된 양상을 보인다((c),(d)). 반면, 생체활성 유리로서 분사된 티타늄 시편들은 입자의 형태에서 따라 불규칙하고 날카로운 표면 양상을 보인다.

아래 <표 1>은 위와 같은 표면 양상을 가진 티타늄 시편들에 대한 조도를 관찰한 결과를 나타낸다.

	Ra	Ry	Rz
Ti	0.29(0.07)	3.92(1.39)	3.04(1.01)
G-Ti	1.02(0.17)	8.43(1.68)	7.01(1.26)
BG-Ti	0.74(0.03)	7.48(056)	6.38(0.27)

위 표를 통해 알 수 있듯이 거칠기 정도를 나타내는 모든 표면 조도 값들은 G-Ti > BG-Ti >> Ti의 순이며, 분사가 수행된 (G-Ti, BG-Ti)군과 분사 없이 표면 연마만 수행된 티타늄 시편(Ti)군 사이에는 통계적 유의차가 나타난 것을 알 수 있다(p,0.05).

각 시편군에 대한 생체조건 밖에서(in vitro)의 생활성도는 28일 까지 SBF에 침적하여 관찰한 결과가 도 3과 같다. 도 3은 28일 후 각 시편의 SEM상을 보여주기 위한 확대 사진으로, 도 2와 비교하여 도 3 (a) 및 (b)를 보면 Ti 및 G-Ti 시편의 표면에는 28일 후에도 주목할 만한 변화가 없는 것을 알 수 있다. 반면에 BG-Ti(도 3의 (c))군은 약간의 침착물들이 관찰되었으며, 도 3의 (d))에 나타난 확대상에서 EDS분석에 의하여 고농도의 Ca, P가 관찰되었다. 이 Ca/P ratio는 1.76-1.83이었다.

도 4는 시편들 위에서 7일간 배양된 조골세포에 대한 SEM(도 4의 (a),(c),(e)) 및 CLSM(도 4(b),(d),(f))의 관찰상이다. 도 4를 보면 모든 시편들에서 세포들은 시편 표면 전반에 걸쳐 널리 퍼져있고 잘 부착되어 있음을 알 수 있다. SEM상에서는 개별 세포들을 잘 구별하기 어려우나 CLSM상에서는 세포골격 돌기들이 잘 관찰된다.

도 5는 세포들에 의하여 발현된 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, ALP)활성도를 나타낸 그래프이다. 도시된 그래프를 통해 알 수 있듯이 배양기간 10일의 ALP 레벨은 모든 군에서 유사하였다. 그러나 14일 후의 배양기간에서는 분사한 군들에서 확실히 높게 나타났으며 BG-Ti군이 보다 높은 것을 알 수 있다 (G-Ti > Ti at p < 0.05, BG-Ti >> Ti at p < 0.001, and BG-Ti >> G-Ti at p < 0.01)

한편, 도 6은 시편들 위에서 14일과 28일 배양 후 세포들의 석회화도를 알리자닌 레드 에스 스테이닝(Alizarin Red S staining)법으로 조사한 결과를 나타낸다. 광학 염색상에서 알 수 있듯이 적색 염색은 BG-Ti에서 가장 두드려졌으며 정량적으로 유의성이 나타났다 ( p < 0.001).

이상에서 살펴 본 본 발명에 의한 시험편과 대조군 시험편의 실험 결과를 전반적으로 살펴 보면, 본 발명에서 사용된 생체유리 입자들은 수십 미크론의 크기를 가졌으며 이 입자들은 티타늄 표면의 조도(Ra = 0.74)를 증가 시켰다. 더욱이 졸겔법에 의한 생체유리 입자들은 생체 조직세포의 생체활성을 부여하는 것을 실험을 통해 증명되었다. 생체유리 입자들은 액체내에서 Ca, P와 같은 이온들을 방출하고 이것은 티타늄 표면에 골과 유사한 석회물질의 침착을 촉진하므로 골 생성 유도에 직접적인 역할을 할 것으로 기대된다.

또한, 도 3의 SBF 침적 시험에서와 같이 BG-Ti 시편들은 Ti, G-Ti와 대조적으로 28일 후 아파타이트 침착을 보인 것을 통해 생물학적 효과를 발현하고 있다고 볼 수 있다. BG-Ti 시편들의 생물학적 장점은 생체조건 밖에서(in vitro)의 세포 반응에서도 나타난다. 세포들은 BG-Ti에서 잘 부착하고 활발히 성장하는 양상을 보여주면서도 다른 실험군과는 유사한 MTS level을 보여주었다. 이것은 시편들에 있어서의 표면조도 범위(Ra = 0.29~1.02 for the three different groups)가 세포 증식에는 중요한 차이를 보이지 않는 것을 가르킨다. 또한 BG-Ti와 G-Ti가 유사한 세포 성장도과 표면조도를 보이므로 BG-Ti에서의 이온 방출에 의해서 나타날 수 있는 표면의 화학적 차이가 세포대사에 중요한 역할을 하지는 않는 것으로 보인다.

그러나 세포들의 ALP활성도는 14일 배양후 BG-Ti 군에서 다른 군에 비하여 크게 증가하였다. ALP는 골 형성의 초기 단계에서 분비되는 골의 지표로 골 세포 분화와 골형성능의 유용한 평가수단으로 사용된다. 조골세포 전구 세포인 MC3T3-E1 의 경우 ALP 발현은 in vitro에서 골생성 물질내에서 크게 자극되는 것으로 나타났다. 그러므로 유의하게 높은 ALP 레벨은 BG-Ti 군이 조골세포 분화에 능동적인 역할을 하는 것으로 볼 수 있다. 게다가 BG-Ti 시편의 세포에서 증가된 알리자린 레드 에스(Alizarin Red S) 시험은 셍체 유리의 이러한 골 생성역할을 뒷받침 하고 있다.

결과적으로, 화학적으로 유도되는 효과가 골 세포들의 증식보다 기능을 제어함에 있어 보다 크게 관여하고 있다고 볼 수 있다. Mustafa 등은 TiO₂ 입자 분사에 의한 티타늄에서 조도는 증가하였으나 골세포의 ALP 발현에는 차이를 보이지 않았다고 하였다. 이것은 TiO₂ 의 생체불활성에 기인한 것으로 보인다. 그러나 본 발명에 따른 실험에서의 생체유리는 골세포의 반응을 증가시켰으며 생체유리에서 유출된 이온들이 유전자, 단백질 합성, 골세포 분화 등 세포 기능을 직접적으로 조절하는 것으로 예측된다.

더욱이, 표면에 존재하는 생체유리 입자들은 배양기간 동안 석회화 과정에서 매우 중요한 역할을 담당하였다. 이러한 결과를 놓고 볼때, 생체유리 분사 티타늄은 골세포 분화와 석회화에 매우 우수한 표면 상태를 가지는 것으로 볼 수 있다.

도 1은 분사 재료로서 졸-겔법에 의해 합성된 생체유리(BG) 입자와 일반적인 구상형의 글라스 비드의 입도분포를 관찰한 사진.

도 2는 대조군 시편과 본 발명에 의한 표면 개질 방법으로서 표면 처리된 시편의 표면처리후의 표면모습을 확대 관찰한 사진.

도 3은 28일 후 각 시편의 SEM상을 보여주기 위한 확대 사진.

도 4는 시편들 위에서 7일간 배양된 조골세포에 대한 SEM((a),(c),(e)) 및 CLSM((b),(d),(f))의 관찰 사진.

도 5는 세포들에 의하여 발현된 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, ALP)활성도를 나타낸 그래프.

도 6은 시편들 위에서 14일과 28일 배양 후 세포들의 석회화도를 알리자닌 레드 에스 스테이닝(Alizarin Red S staining)법으로 조사한 결과를 나타낸 사진 및 이를 분석한 그래프.

Claims

졸-겔법을 이용하여 미세한 입자 크기를 가지는 생체유리 분말을 제조하는 단계; 및

제조된 생체유리 분말을 압축공기를 이용하여 티타늄 재질의 처리대상물 표면에 분사함으로써, 상기 처리대상물의 표면을 세정하고 상기 처리대상물의 표면에 거칠기를 부여하는 표면처리 단계;

를 포함하는 생체유리 입자 분사법에 의한 티타늄 표면 개질 방법.
제 1 항에 있어서,

졸-겔법을 이용한 상기 생체유리 분말을 제조하는 단계에서는,

70SiO₂·25CaO·5P₂O₅의 화학조성을 가지도록, 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS), 질산 칼슘(calcium nitrate), 트리에틸 포스페이트(triethyl phosphate)를 0.7:0.25:0.05 비율로 혼합하고,

상기 혼합에 의한 혼합물을 HCL(1 N) 성분을 포함하는 산성용액에 첨가하여 가수분해 반응을 통해 졸 혼합물이 생성되도록 하며,

상기 졸 혼합물을 6 ~ 24시간 동안 교반기에서 교반시킨 후 40℃ ~ 70℃의 온도조건을 유지하는 건조기에서 12 ~ 48시간 동안 숙성/건조시켜 겔(gel) 상태가 되도록 하고,

건조된 상기 겔 상태의 혼합물을 분쇄기를 통해 잘게 분쇄한 뒤 잘게 분쇄된 분말을 600℃ ~ 700℃의 온도조건을 유지하는 챔버에서 4 ~ 6시간동안 열처리하며,

열처리된 분말을 마노절구에서 재차 분쇄한 후 100 ~ 120㎛의 눈금 크기를 가진 선별망을 이용해 분리 선별하여 120㎛ 이하의 입자 크기를 가진 셍체유리 분말을 획득함을 특징으로 하는 생체유리 입자 분사법에 의한 티타늄 표면 개질 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 표면처리 단계에서는,

제조된 생체유리 분말을 공압을 발생하는 분사 기기에 투입한 후 티타늄 재질의 처리대상물 표면에 4 ~ 6bar 압력으로 고압공기 형태로 분사하여 표면을 처리함을 특징으로 하는 생체유리 입자 분사법에 의한 티타늄 표면 개질 방법.