KR100964026B1 - A glucose sensor comprising glucose oxidase variant - Google Patents

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Abstract

본 발명은 글루코즈를 기질로 이용하는 효소 변형체를 이용한 혈당 센서에 관한 것으로, 혈당 센서의 효소인 글루코즈 옥시다제와 같은 효소에 유전공학적 방법으로 양전하 또는 음전하를 띄는 펩타이드 또는 단백질이 태그된 효소 변형체를제조한 뒤 이를 금, 은 또는 구리 박막에 형성된 상기 양전하 또는 음전하와 반대 전하를 띄는 자기조립단분자층에 결합시킴으로써 극히 소량의 효소로도 혈당센서의 민감도가 향상되고 빠른 검출속도를 제공하는 혈당 측정용 스트립 센서 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a blood glucose sensor using an enzyme variant using glucose as a substrate, wherein an enzyme variant tagged with a peptide or protein that is positively or negatively charged by an enzyme such as glucose oxidase, an enzyme of a blood glucose sensor, is genetically engineered. And a blood glucose measurement strip sensor that combines the self-assembled monolayer having a charge opposite to that of the positive or negative charge formed on the thin film of gold, silver or copper, thereby improving the sensitivity of the blood glucose sensor and providing a fast detection rate even with a very small amount of enzyme. It relates to a production method thereof.

혈당, 혈당 센서, 글루코즈 옥시다제, 자기조립단분자막 Blood sugar, blood sugar sensor, glucose oxidase, self-assembled monolayer

Description

글루코즈 옥시다제 변형체를 이용한 혈당 센서{A glucose sensor comprising glucose oxidase variant}A glucose sensor comprising glucose oxidase variant

본 발명은 글루코즈를 기질로 이용하는 효소 변형체를 이용한 혈당 센서에 관한 것으로, 혈당 센서의 효소인 글루코즈 옥시다제와 같은 효소에 유전공학적 방법으로 양전하 또는 음전하를 띄는 펩타이드 또는 단백질이 태그된 효소 변형체를제조한 뒤 이를 금, 은 또는 구리 박막에 형성된 상기 양전하 또는 음전하와 반대 전하를 띄는 자기조립단분자층에 결합시킴으로써 극히 소량의 효소로도 혈당센서의 민감도가 향상되고 빠른 검출속도를 제공하는 혈당 측정용 스트립 센서 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a blood glucose sensor using an enzyme variant using glucose as a substrate, wherein an enzyme variant tagged with a peptide or protein that is positively or negatively charged by an enzyme such as glucose oxidase, an enzyme of a blood glucose sensor, is genetically engineered. And a blood glucose measurement strip sensor that combines the self-assembled monolayer having a charge opposite to that of the positive or negative charge formed on the thin film of gold, silver or copper, thereby improving the sensitivity of the blood glucose sensor and providing a fast detection rate even with a very small amount of enzyme. It relates to a production method thereof.

바이오센서는 포도당을 측정하기 위해 만든 글루코즈 센서를 개발한 이래로 여러 분야에서 응용되기 시작하면서 연구 개발이 집중되어 왔다. 현재 의료분야 시장의 대부분을 차지하고 있는 것은 혈당 측정용 바이오센서인데 연구 개발에 있어 국내뿐만 아니라 해외 시장에서도 꾸준히 많은 관심을 보이고 있다. Biosensors have been focused on research and development since they began to be applied in various fields since the development of glucose sensors made to measure glucose. Currently, the majority of the medical market is a biosensor for blood glucose measurement, and has been showing a lot of attention not only in domestic and overseas markets but also in research and development.

현재 시판되고 있는 혈당 센서의 스트립은 탄소 전극 혹은 탄소와 은의 다층 박막으로 된 전극이 대부분인데 탄소전극은 제작이 단순하고 제작 단가가 낮은 장 점이 있어 널리 사용되고 있지만 낮은 전도특성과 탄소 페이스트의 친유성에 의한 효소의 안정성을 고려해야 하는 단점이 있다. Most commercially available strips of blood glucose sensors are either carbon electrodes or electrodes made of multilayer thin films of carbon and silver. Carbon electrodes are widely used due to their simplicity and low manufacturing cost, but they have low conductivity and lipophilic properties. There is a disadvantage to consider the stability of the enzyme.

한편, 종래 혈당 센서의 경우 반응부 위에 배합된 기질과 효소가 과량의 덩어리로 건조되어져 있어 하나의 스트립 센서에 들어가는 기질과 효소에 대해 큰 손실을 가져오며 덩어리로 건조되어 있어 혈액이 주입되었을 때 기질과 효소가 녹는데 시간이 걸려 측정시간이 길어지기 때문에 효소 분산제를 추가로 첨가해야 하는 문제점이 있었다. On the other hand, in the case of the conventional blood glucose sensor, the substrate and the enzyme blended on the reaction part are dried in an excessive mass, which causes a great loss for the substrate and the enzyme that enters a single strip sensor. And because it takes a long time to melt the enzyme and the measurement time is long, there was a problem that an additional enzyme dispersant has to be added.

따라서, 혈당 측정용 바이오센서는 혈액 시료의 양을 최소화하는 연구 외에도 높은 감도와 측정 시간의 단축을 위한 방법 중의 하나로 스트립 상에 효소를 고정화하는 연구가 진행되고 있다(Jun-Min Qian et al., Clinical Biochemistry, Vol. 37, p 155, 2004). Therefore, in addition to the study of minimizing the amount of blood samples, the blood glucose measurement biosensor is being researched to immobilize the enzyme on the strip as one of the methods for high sensitivity and shortening the measurement time (Jun-Min Qian et al., Clinical Biochemistry , Vol. 37, p 155, 2004).

이에 본 발명자는 상기와 같은 점을 고려하여 연구하던 중 탄소 전극이 갖고 있는 단점을 최소화하고 향상된 성능의 혈당 측정을 위해 금, 은 또는 구리 박막 전극을 이용하고 일반적으로 사용하고 있는 효소에 양전하 또는 음전하 아미노산을 태그한 글루코즈 옥시다제 변형체를 제작하여 전극의 반응부에 높은 밀도로 고정화시킴으로써 기존의 탄소나 팔라듐으로 만든 전극에 비해 전기적인 신호의 정확성이 뛰어나며 금, 은 또는 구리 박막 표면의 화학적 처리를 통해 다양한 관능기를 부여할 수 있어 물리적 결합이 아닌 화학적 공유결합으로 효소를 고정화할 수 있는 글루코즈 옥시다제 변형체를 이용한 혈당 센서를 제공할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have used gold, silver or copper thin film electrodes for minimizing the disadvantages of carbon electrodes and improving blood glucose measurement while studying in consideration of the above points, and positively or negatively charged to enzymes commonly used. Amino acid-tagged glucose oxidase variant was prepared and immobilized in the reaction part of the electrode with high density, so that the electrical signal accuracy is higher than that of the electrode made of carbon or palladium and chemical treatment of the surface of gold, silver or copper thin film The present invention was completed by confirming that a blood glucose sensor using a glucose oxidase variant capable of imparting various functional groups and immobilizing enzymes by chemical covalent bonds rather than physical bonds can be provided.

본 발명의 목적은 글루코즈를 기질로 하는 효소의 변형체를 이용하여 기존의 혈당 측정용 센서보다 높은 감도를 갖고 측정시간을 단축시킬 수 있는 혈당 측정용 스트립 센서를 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a blood glucose measurement strip sensor that can reduce the measurement time with a higher sensitivity than the conventional blood glucose measurement sensor using a variant of the enzyme based on glucose.

본 발명의 다른 목적은 상기 효소 변형체를 이용하여 기존의 혈당 측정용 센서보다 높은 감도를 갖고 측정시간을 단축시킬 수 있는 혈당 측정용 스트립 센서를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for manufacturing a blood glucose measurement strip sensor having a higher sensitivity than the conventional blood glucose measurement sensor and shortening the measurement time using the enzyme variant.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 혈당 측정용 스트립 센서에 사용되는 글루코즈 옥시다제에 양전하 또는 음전하를 띄는 펩타이드로 태그된 글루코즈 옥시다제 변형체 및 그 제조 방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a glucose oxidase variant tagged with a peptide having a positive or negative charge on glucose oxidase which is used in the blood glucose measurement strip sensor, and a method of manufacturing the same.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 첫 번째 양태로서, In order to achieve the above object, the present invention provides a first aspect,

비전도성 기판과, Non-conductive substrate,

표면에 음전하 또는 양전하를 띄는 자기조립단분자막이 형성되어 있고 상기 자기조립단분자막과 반대전하를 가지는 펩타이드 또는 단백질로 태그(tag)된 글루코즈를 기질로 이용하는 효소 및 상기 효소와 반응하여 전자를 발생시키는 전자 전달 매개체를 구비하는 반응부와, Self-assembled monolayers with negative or positive charges are formed on the surface, and enzymes using glucose tagged with peptides or proteins having opposite charges to the self-assembled monolayers as substrates and electrons react with the enzymes to generate electrons. A reaction unit having a medium;

작동 전극 및 기준 전극을 구비하고 각각의 일단이 상기 반응부에 연결되는 전극부를 포함하는 혈당 측정용 스트립 센서를 제공한다.The present invention provides a blood glucose measurement strip sensor including an electrode unit having a working electrode and a reference electrode, each end of which is connected to the reaction unit.

본 발명에 따른 상기 혈당 측정용 스트립 센서의 자기조립단분자막은 말단에 음전하 또는 양전하 관능기가 있는 화합물을 코팅하여 형성될 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 상기 자기조립단분자막은 말단에 음전하 또는 양전하 관능기가 있는 화합물과 함께 말단에 수산화기를 포함하는 화합물을 혼합 코팅하여 형성되는 것을 특징으로 한다. The self-assembled monomolecular film of the blood glucose measurement strip sensor according to the present invention may be formed by coating a compound having a negatively charged or positively charged functional group at its end, and more preferably, the self-assembled monolayer has a negatively charged or positively charged functional group at its end. It is formed by mixing and coating a compound containing a hydroxyl group at the end with the compound.

본 발명에 있어서, 상기 말단에 아민기를 작용기로서 포함하는 화합물로는 머켑토알킬아민(mercaptoalkylamine)을 들 수 있으며, 이때 알킬기는 탄소수가 2 내지 11인 것이 바람직하나 본 발명은 이에 제한되지 않는다.In the present invention, a compound including an amine group at the terminal as a functional group includes mercaptoalkylamine, wherein the alkyl group preferably has 2 to 11 carbon atoms, but the present invention is not limited thereto.

본 발명에 있어서, 상기 말단에 아미딘기를 작용기로서 포함하는 화합물로는 머켑토알킬아미딘(mercaptoalkylamidine)을 들 수 있으며, 이때 알킬기는 탄소수가 2 내지 11인 것이 바람직하나 본 발명은 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the compound including an amidine group at the terminal as a functional group may include mercaptoalkylamidine, wherein the alkyl group is preferably 2 to 11 carbon atoms, but the present invention is not limited thereto. .

본 발명에 있어서, 상기 말단에 구아니딘기를 작용기로서 포함하는 화합물로는 머켑토알킬구아니딘(mercaptoalkylguanidine)을 들 수 있으며, 이때 알킬기는 탄소수가 2 내지 11인 것이 바람직하나 본 발명은 이제 제한되지 않는다.In the present invention, the compound including a guanidine group at the terminal as a functional group includes mercaptoalkylguanidine, wherein the alkyl group preferably has 2 to 11 carbon atoms, but the present invention is not limited thereto.

상기 말단에 수산화기(-OH)를 포함하는 화합물은 그것의 말단에 수산화기(-OH)를 가지고 있으므로 알기닌과 반응하지 않는다. 상기 수산화기(-OH)를 포함하는 것으로는 4-멀캅토에탄올(4-Mercaptoethanol), 4-멀캅토페놀(4-Mercaptophenol), 3-멀캅토프로판올(4-Mercaptopropanol), 4-멀캅토부탄올(4-Mercaptobutanol) 또는 4-멀캅토헥산올(4-Mercaptohexanol) 등을 사용할 수 있으며 이들에 제한되지 않는 다. 이들 화합물 중 가장 바람직한 화합물은 4-멀캅토 에탄올이다.The compound containing a hydroxyl group (-OH) at the terminal does not react with arginine because it has a hydroxyl group (-OH) at its terminal. Examples of the hydroxyl group (-OH) include 4-mercaptoethanol, 4-mercaptophenol, 4-mercaptophenol, 4-mercaptopropanol, and 4-mercaptobutanol. 4-Mercaptobutanol) or 4-mercaptohexanol and the like can be used, but are not limited thereto. The most preferred of these compounds is 4-mercapto ethanol.

본 발명에 있어서, 자기조립단분자막을 형성하기 위한 가장 바람직한 화합물은 11-멀캅토 운데카노산과 4-멀캅토 에탄올의 혼합물이다.In the present invention, the most preferred compound for forming the self-assembled monolayer is a mixture of 11-mercapto undecanoic acid and 4-mercapto ethanol.

바람직한 양태로서, 상기 말단에 음전하 관능기가 있는 화합물은 말단에 카르복실기(-COOH), 인산기(-PO3H2) 또는 설폰산기(-SO3H)를 가지는 화합물일 수 있으며, 상기 말단에 양전하 관능기가 있는 화합물은 말단에 아민기(amine)(-NR1R2R3), 아미딘기(amidine)[-C(NR1)(NR2R3)], 또는 구아니딘기(guanidine) [(R1R2N)(R3R4N)C=N-R5]를 가지는 화합물일 수 있다. In a preferred embodiment, the compound having a negatively charged functional group at the terminal may be a compound having a carboxyl group (-COOH), a phosphoric acid group (-PO 3 H 2 ) or a sulfonic acid group (-SO 3 H) at the terminal, a positively charged functional group at the terminal Compounds with an amine group (-NR 1 R 2 R 3 ), amidine [-C (NR 1 ) (NR 2 R 3 )], or guanidine group [(R 1 R 2 N) (R 3 R 4 N) C═NR 5 ].

상기 말단에 카르복실기를 가지는 화합물은 11-멀캅토 운데카노산, 4-멀캅토 페닐아세트산, 4-멀캅토 벤조산, 4-멀캅토 프로파노산, 2-티오말릭 에시드, 2-티올락트산 또는 12-멀캅토 도데카노산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 이들로 제한되지 않는다. The compound having a carboxyl group at the terminal is 11-mercapto undecanoic acid, 4-mercapto phenylacetic acid, 4-mercapto benzoic acid, 4-mercapto propanoic acid, 2-thiomaleic acid, 2-thiolactic acid or 12- Mercapto dodecanoic acid or mixtures thereof, but is not limited thereto.

상기 말단에 인산기가 있는 화합물은 (아미노메틸)포스폰산, 2-아미노에틸포스폰산 또는 3-아미노프로필포스폰산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 이들로 제한되지 않는다. The compound having a phosphoric acid group at the terminal may be, but is not limited to, (aminomethyl) phosphonic acid, 2-aminoethylphosphonic acid or 3-aminopropylphosphonic acid or mixtures thereof.

상기 말단에 설폰산기가 있는 화합물은 아미노메탄 설폰산, 아미노에탄 설폰산 또는 3-아미노벤젠 설폰산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 이들로 제한되지 않는다. The compound having a sulfonic acid group at the terminal may be, but is not limited to, aminomethane sulfonic acid, aminoethane sulfonic acid or 3-aminobenzene sulfonic acid or mixtures thereof.

상기 말단에 아민기를 포함하는 화합물은 머켑토알킬아민(mercaptoalkylamine)일 수 있으며, 상기 말단에 아미딘기를 포함하는 화합물은 머켑토알킬아미딘(mercaptoalkylamidine)일 수 있고, 상기 말단에 구아니딘기를 포함하는 화합물은 머켑토알킬구아니딘(mercaptoalkylguanidine)일 수 있으며, 본 발명은 이들로 제한되지 않는다. The compound containing an amine group at the terminal may be a mercaptoalkylamine, the compound containing an amidine group at the terminal may be a mercaptoalkylamidine, the compound containing a guanidine group at the terminal May be mercaptoalkylguanidine, and the present invention is not limited thereto.

또한, 상기 말단에 수산화기를 포함하는 화합물은 4-멀캅토에탄올, 4-멀캅토페놀, 3-멀캅토프로판올, 4-멀캅토부탄올 또는 4-멀캅토헥산올이거나 이들의 혼합물일 수 있으며, 이들로 제한되지 않는다. 가장 바람직하게는, 상기 말단에 수산화기를 포함하는 화합물은 4-멀캅토에탄올이며, 더욱 바람직하게 상기 자기조립단분자막은 11-멀캅토 운데카노산과 4-멀캅토에탄올의 혼합물로써 코팅될 수 있다. In addition, the compound containing a hydroxyl group at the terminal may be 4-mercaptoethanol, 4-mercaptophenol, 3-mercaptopropanol, 4-mercaptobutanol or 4-mercaptohexanol, or a mixture thereof, and It is not limited to. Most preferably, the compound containing a hydroxyl group at the terminal is 4-mercaptoethanol, more preferably the self-assembled monolayer may be coated with a mixture of 11-mercapto undecanoic acid and 4-mercaptoethanol.

상기 자기조립단분자막과 반대 전하를 띄는 펩타이드 또는 단백질 태그된 효소는 바람직하게 염기성 또는 산성의 아미노산 3 내지 100 개를 조합하여 이루어질 수 있으며, 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 상기 효소는 글루코즈 옥시다제일 수 있으나, 본 발명은 이에 제한되지 않고 콜레스테롤 옥시다제, 글루타믹 옥살아세틱 트랜스미나아제(Glutamic Oxaloacetic Transaminase; GOT) 또는 글루타믹 피루빅 트랜스미나아제(Glutamic Pyruvic Transaminase; GPT) 등과 같이 혈액 내 글루코즈를 기질로 하는 효소라면 어떤 것이라도 사용하여 본 발명에 따른 혈당 측정용 스트립 센서를 제조할 수 있다.Peptide or protein-tagged enzyme having a reverse charge with the self-assembled monolayer may be made of a combination of 3 to 100 amino acids of the basic or acid, the present invention is not limited thereto. Preferably, the enzyme may be glucose oxidase, but the present invention is not limited thereto, and cholesterol oxidase, glutamic oxalacetic transaminase (GOT) or glutamic pyruvic transminase (GOT) Any enzyme that uses glucose in the blood as a substrate, such as Glutamic Pyruvic Transaminase (GPT), can be used to manufacture the blood glucose measurement strip sensor according to the present invention.

바람직하게, 상기 염기성 아미노산은 알기닌, 라이신, 히스티딘 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있으며, 특히 바람직하게 상기 염기성 아미노산은 3 내지 10 개의 알기닌일 수 있다. Preferably, the basic amino acid may be selected from arginine, lysine, histidine or a combination thereof, particularly preferably the basic amino acid may be 3 to 10 arginine.

바람직하게, 상기 산성 아미노산은 아스파르트산, 글루탐산, 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.Preferably, the acidic amino acid may be selected from aspartic acid, glutamic acid, or a combination thereof.

본 발명에 있어서, 상기 산성 또는 염기성 아미노산으로 이루어지는 펩타이드 또는 단백질 태그는, 바람직하게 유전공학적 방법을 이용하여 효소의 N-말단 또는 C-말단에 결합시켜 제조할 수 있다.In the present invention, the peptide or protein tag consisting of the acidic or basic amino acid can be prepared by binding to the N-terminus or C-terminus of the enzyme, preferably using genetic engineering methods.

상기 효소 변형체와 반응하는 전자 전달 매개체(mediator)로는 종래에 사용된 페로센(ferrocene), 페로센 유도체, 퀴논(quinones), 퀴논 유도체, 유기 전도성 염(organic conducting salt) 또는 비오로겐(viologen) 등을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 포타슘핵사시아노페레이트(Ⅲ)(Potassium hexacyanoferrate Ⅲ), 포타슘페리시아나이드(potassium ferricyanide), 포타슘페로시아나이드(potassium ferrocyanide) 또는 염화헥사아민루세늄(Ⅲ)(hexaammineruthenium Ⅲ) 등을 사용할 수 있다. Examples of electron transfer mediators that react with the enzyme variants include ferrocene, ferrocene derivatives, quinones, quinone derivatives, organic conducting salts, and viologens. More preferably, potassium hexacyanoferrate (III), potassium ferricyanide, potassium ferrocyanide or hexaaminerucenium chloride (III) (potassium hexacyanoferrate III) hexaammineruthenium III) and the like can be used.

전자전달 매개체는 대사물질과 반응하여 환원된 효소와 산화환원반응함으로써 환원되며, 환원상태의 전자전달 매개체는 전극표면까지 확산되어 전극표면에 산화전위를 인가시키고 전류를 발생시키는 역할을 수행한다.The electron transport mediator is reduced by redox reaction with the reduced enzyme in reaction with metabolites, and the electron transport mediator in the reduced state diffuses to the electrode surface to apply an oxidation potential to the electrode surface and generate a current.

또 다른 양태로서, 본 발명은 In another aspect, the present invention

(a) 글루코즈를 기질로 이용하는 효소에 염기성 아미노산으로 이루어진 펩타 이드 또는 단백질 태그를 결합시킨 효소 변형체를 제조하는 단계; (a) preparing an enzyme variant in which a peptide or protein tag consisting of a basic amino acid is bound to an enzyme using glucose as a substrate;

(b) 센서의 반응부를 말단에 음전하 작용기를 가지는 화합물로 처리함으로써 반응부에 상기 효소의 태그가 공유결합하기 위한 음전하 작용기를 가지는 자기조립단분자막을 형성하는 단계; 및 (b) treating the reaction part of the sensor with a compound having a negatively charged functional group at the end to form a self-assembled monolayer having negatively charged functional groups for covalent bonding of the tag of the enzyme to the reaction part; And

(c) 상기 자기조립단분자막이 형성된 반응부에 효소 변형체를 고정화시키는 단계를 포함하는 혈당 측정용 스트립 센서의 제조 방법을 제공한다.(c) providing a method for manufacturing a blood glucose measurement strip sensor comprising the step of immobilizing an enzyme variant on a reaction part in which the self-assembled monolayer is formed.

본 발명은 또한,The present invention also provides

(a) 글루코즈를 기질로 이용하는 효소에 산성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 또는 단백질 태그를 결합시킨 효소 변형체를 제조하는 단계; (a) preparing an enzyme variant in which a peptide or protein tag consisting of an acidic amino acid is bound to an enzyme using glucose as a substrate;

(b) 센서의 반응부를 말단에 양전하 작용기를 가지는 화합물로 처리함으로써 반응부에 상기 효소의 태그가 공유결합하기 위한 양전하 작용기를 가지는 자기조립단분자막을 형성하는 단계; 및 (b) treating the reaction part of the sensor with a compound having a positively charged functional group at the end to form a self-assembled monolayer having a positively charged functional group for covalent bonding of the tag of the enzyme to the reaction part; And

(c) 상기 자기조립단분자막이 형성된 반응부에 효소 변형체를 고정화시키는 단계를 포함하는 혈당 측정용 스트립 센서의 제조 방법을 제공한다.(c) providing a method for manufacturing a blood glucose measurement strip sensor comprising the step of immobilizing an enzyme variant on a reaction part in which the self-assembled monolayer is formed.

상기와 같이 제조된 혈당 측정용 스트립 센서를 사용하여 혈당을 측정하는 방법은 (a) 반응부에 기질을 처리하는 단계; 및 (b) 작동 전극과 기준 전극 사이에 소정의 전압을 인가하여 반응부에서 순환반응(Cycling reaction)을 일으킨 후 정상전류 값을 읽는 단계를 포함할 수 있다. Method for measuring blood glucose using the blood glucose measurement strip sensor prepared as described above comprises the steps of (a) treating the substrate on the reaction unit; And (b) applying a predetermined voltage between the working electrode and the reference electrode to cause a cycling reaction in the reaction unit, and then reading the normal current value.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 상기 혈당 측정용 스트립 센서에 사용되는 효소 변이체로서, 유전공학적인 방법을 이용하여 6개의 알기닌이 태그된 글루코즈 옥시다제를 코딩하는 유전자를 발현벡터에 삽입하고, 상기 발현벡터를 효모 또는 대장균에서 발현시키는 방법을 통해 제조되었다. 알기닌이 태그된 글루코즈 옥시다제는 글루코즈 옥시다제를 코딩하는 유전자의 C-말단에 알기닌을 코딩하는 염기서열을 결합시켜 제조될 수 있으며, 바람직하게 상기 알기닌이 태그된 글루코즈 옥시다제 단백질의 분리 및 정제를 용이하게 하기 위하여 상기 글루코즈 옥시다제를 코딩하는 유전자의 N-말단에 아스퍼질러스 나이거의 알파-아밀레이즈 시그널 서열을 결합시켜 생성된 재조합 단백질이 효모 또는 대장균 세포 밖으로 분비되도록 하였다. In a specific embodiment of the present invention, as an enzyme variant used in the blood glucose measurement strip sensor, a gene encoding six arginine tagged glucose oxidase is inserted into an expression vector using genetic engineering method, and the expression is performed. The vector was produced by the method of expressing in yeast or E. coli. Arginine-tagged glucose oxidase may be prepared by binding the nucleotide sequence encoding arginine to the C-terminus of the gene encoding glucose oxidase, and is preferably used to isolate and purify the glucose oxidase protein tagged with the arginine. For ease of binding the alpha-amylase signal sequence of Aspergillus niger to the N-terminus of the gene encoding the glucose oxidase to allow the resulting recombinant protein to be secreted out of yeast or E. coli cells.

본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 알기닌이 태그된 글루코즈 옥시다제를 발현하기 위해서 GAL10 프로모터와 GAL7 터미네이터의 조절을 받는 발현 벡터인 pGAL10 벡터를 이용할 수 있다. In a specific embodiment of the present invention, pGAL10 vector, which is an expression vector regulated by a GAL10 promoter and a GAL7 terminator, may be used to express an arginine tagged glucose oxidase.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 N-말단에는 α-amylase 시그널 서열이 연결되고, C-말단에는 6개의 알기닌이 태그된 글루코즈 옥시다제 변형체를 코딩하는 유전자가 연결된 유전자 단편을 상기한 pGAL10 벡터에 삽입하여 제작한 발현 벡터 pGAL10-α-amylase-GOD-6R를 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에 형질 전환시켜 알기닌이 태그된 글루코즈 옥시다제 생산용 재조합 균주 사카로마이세스 세레비지에/pGAL10-α-amylase-GOD-6R을 제조하였으며, 상기 재조합 균주를 2007년 10월 24일자로 대전지 유성구 어은동 52번지에 소재하는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 KCTC 11225BP의 기탁번호로 기탁하였다.In a preferred embodiment of the present invention, by inserting a gene fragment linked to the α-amylase signal sequence at the N-terminus and a gene encoding a glucose oxidase variant tagged with 6 arginine at the C-terminus, is inserted into the pGAL10 vector. The produced expression vector pGAL10-α-amylase-GOD-6R was transformed into Saccharomyces cerevisiae and the recombinant strain Saccharomyces cerevisiae / pGAL10- for producing glucose oxidase tagged with arginine. α-amylase-GOD-6R was prepared, and the recombinant strain was deposited with a deposit number of KCTC 11225BP at the Korea Institute of Bioscience and Biotechnology, Biotechnology Center, 52, Eeun-dong, Yuseong-gu, Daejeon, on October 24, 2007.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기와 같이 제작된 6개의 알기닌이 태그된 글루코즈 옥시다제 변형체의 발현 벡터 pGAL10-α-amylase-GOD-6R를 에셰리키아 콜리(Escherichia coli) DH5에 형질 전환시켜 알기닌이 태그된 글루코즈 옥시다제 생산용 재조합 균주 에셰리키아 콜리 DH5α/pGAL10-α-amylase-GOD-6R을 제조하였으며, 이를 2007년 10월 24일자로 KCTC 11224BP의 기탁번호로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다.In another embodiment of the present invention, the expression vector pGAL10-α-amylase-GOD-6R of the six arginine tagged glucose oxidase variants prepared as described above was used as Escherichia coli. coli ) was transformed into DH5 to prepare a recombinant strain Escherichia coli DH5α / pGAL10-α-amylase-GOD-6R for producing glucose oxidase tagged with arginine, which was deposited on October 24, 2007 with KCTC 11224BP. It was deposited with the Korea Institute of Bioscience and Biotechnology.

본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 상기 스트립 센서는 반응부와 전극부를 포함한다. 반응부에는 혈당과 반응하는 염기성 또는 산성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 또는 단백질이 태그된 효소 및 상기 효소와 반응하여 전자를 발생시키는 전자 전달 매개체가 고정된다. 전극부는 각각의 일단이 상기 반응부에 연결되며, 상기 반응부에서 발생된 전자가 흐르는 작동 전극 및 기준 전극을 구비한다. In a preferred embodiment of the invention, the strip sensor comprises a reaction part and an electrode part. In the reaction part, an enzyme tagged with a peptide or protein consisting of basic or acidic amino acids reacting with blood sugar and an electron transfer medium for generating electrons by reacting with the enzyme are fixed. One end of the electrode part is connected to the reaction part, and includes an operation electrode and a reference electrode through which electrons generated in the reaction part flow.

상기 반응부에 있어 염기성 또는 산성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 또는 단백질로 태그된 효소를 고정화시키기 위한 전극의 재질은 금, 은 및 구리로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 전기적인 신호의 정확성을 고려할 때 가장 바람직하기로는 금 박막이 좋다.The material of the electrode for immobilizing an enzyme tagged with a peptide or protein consisting of basic or acidic amino acids in the reaction part may be selected from the group consisting of gold, silver and copper, but is most preferred in view of the accuracy of the electrical signal. Gold thin film is preferable.

본 발명에 있어서, 반응부 위에 염기성 또는 산성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 또는 단백질이 태그된 효소 및 상기 효소를 고정화하기 위해 태그와 반응할 수 있도록 반대 전하를 띄는 자기조립단분자막을 형성하도록 화학적 처리를 할 수 있다. In the present invention, a peptide or protein consisting of a basic or acidic amino acid on the reaction portion can be chemically treated to form a self-assembled monolayer having opposite charges so as to react with the tagged enzyme and the tag to immobilize the enzyme. .

본 발명에 있어서, 염기성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 또는 단백질로 태그된 효소를 고정화하는 경우에는 상기 자기조립단분자막 형성을 위한 화학적 처리는 말단에 음전하 관능기를 작용기로서 포함하는 화합물을 사용하여 수행할 수 있으며, 산성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 또는 단백질로 태그된 효소를 고정화하는 경우에는 상기 자기조립단분자막 형성을 위한 화학적 처리는 말단에 양전하 관능기를 작용기로서 포함하는 화합물을 사용하여 수행할 수 있다.In the present invention, in the case of immobilizing an enzyme tagged with a peptide or a protein consisting of a basic amino acid, the chemical treatment for forming the self-assembled monomolecular film may be performed using a compound including a negatively charged functional group as a functional group at an end thereof, and acidic In the case of immobilizing an enzyme tagged with a peptide or protein consisting of amino acids, the chemical treatment for forming the self-assembled monolayer may be performed using a compound including a positively charged functional group as a functional group at its end.

양전하 또는 음전하 관능기를 포함하는 화합물과 함께 수산화기를 포함하는 화합물을 혼합하여 처리하는 경우 자기조립단분자막의 방향성을 좋게 함으로써 음이온 또는 양이온이 태그된 효소의 고정화 정도가 더 우수하게 이루어질 수 있다. 이와 같은 화학적 처리를 통해 자기조립단분자막을 형성함으로써, 반응부에 효소의 고정화 정도를 더욱 높일 수 있고, 따라서 기존에 사용하던 효소의 양보다 훨씬 적은 양의 효소를 사용하여 혈당 센서를 제조함으로써 센서 제조비용을 줄일 수 있고 동시에 센서의 감도도 높일 수 있다.In the case where a compound containing a hydroxyl group is mixed with a compound containing a positively charged or negatively charged functional group and treated, the degree of immobilization of an anion or a cation-tagged enzyme may be improved by improving the orientation of the self-assembled monolayer. By forming a self-assembled monomolecular film through such chemical treatment, the degree of immobilization of the enzyme can be further increased in the reaction part, and thus, a blood glucose sensor is manufactured by using a much smaller amount of enzyme than the amount of enzyme used in the prior art. The cost can be reduced and the sensitivity of the sensor can be increased.

본 발명에 있어서, 상기 반응부 위에 형성된 자기조립단분자막에 염기성 또는 산성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 또는 단백질로 태그된 글루코즈 옥시다제를 반응시키기 위해서는 1~10℃에서 2~5시간 동안, 가장 바람직하기로는 4℃에서 3시간 동안, 상기 반응부와 글루코즈 옥시다제 변형체를 접촉시킴으로써 상기 효소가 반응부에 고정화 및 안정화 정도가 우수하게 결합되도록 할 수 있다.In the present invention, in order to react the glucose oxidase tagged with a peptide or protein consisting of basic or acidic amino acids to the self-assembled monolayer formed on the reaction part for 2 to 5 hours at 1 to 10 ℃, most preferably at 4 ℃ For 3 hours at, by contacting the reaction part and the glucose oxidase variant it is possible to ensure that the enzyme is immobilized and stabilized to the reaction part excellently.

본 발명은 바람직한 양태로서 글루코즈 옥시다제의 변형체를 이용한 센서만을 설명하였으나, 동일한 방법으로 콜레스테롤 옥시다제, 글루타믹 옥살아세틱 트랜스미나아제(Glutamic Oxaloacetic Transaminase; GOT) 또는 글루타믹 피루빅 트랜스미나아제(Glutamic Pyruvic Transaminase; GPT)를 변형시킨 변형체를 이용한 혈당 측정용 스트립 센서를 제공할 수도 있음을 당업자라면 충분히 이해할 수 있을 것이다.The present invention describes only a sensor using a variant of glucose oxidase as a preferred embodiment, but in the same manner cholesterol oxidase, glutamic oxalacetic transaminase (GOT) or glutamic pyruvic transminase It will be understood by those skilled in the art that it is possible to provide a strip sensor for measuring glucose levels using a modified variant of Glutamic Pyruvic Transaminase (GPT).

본 발명의 상기와 같은 목적, 특징 및 다른 장점들은 첨부도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명함으로써 더욱 명백해질 것이다. 이하 첨부도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 글루코즈 옥시다제의 변형체 제조 및 혈당 측정용 스트립 센서의 제조방법을 상세히 설명하기로 한다.The above objects, features and other advantages of the present invention will become more apparent by describing the preferred embodiments of the present invention in detail with reference to the accompanying drawings. Hereinafter, with reference to the accompanying drawings it will be described in detail a method for producing a variant of glucose oxidase and a blood glucose measurement strip sensor according to a preferred embodiment of the present invention.

본 발명에 따른 혈당 측정용 스트립 센서의 제조방법을 단계별로 설명하면 다음과 같다.Referring to the step of manufacturing a blood glucose measurement strip sensor according to the present invention as follows.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 혈당 측정용 스트립 센서의 구성도로서, 상기 스트립 센서(10)는 비전도성 기판(11)과, 반응부(12)와, 작동 전극(14) 및 기준 전극(15)을 구비하는 전극부(13)를 포함한다. 1 is a block diagram of a blood glucose measurement strip sensor according to an embodiment of the present invention, wherein the strip sensor 10 includes a nonconductive substrate 11, a reaction unit 12, a working electrode 14, and a reference. An electrode portion 13 having an electrode 15.

도 2(a)는 본 발명에 따른 알기닌이 태그된 글루코즈 옥시다제 재조합 단백질을 제조하기 위해 PCR에 의해 증폭된 유전자 단편이고, (b)는 상기 유전자 단편을 발현벡터 pGAL10에 삽입하여 제조된 재조합 발현벡터 pGAL10-α-amylase-GOD-6R의 개열지도를 나타낸다. Figure 2 (a) is a gene fragment amplified by PCR to prepare an arginine-tagged glucose oxidase recombinant protein according to the present invention, (b) is a recombinant expression prepared by inserting the gene fragment into the expression vector pGAL10 A cleavage map of the vector pGAL10-α-amylase-GOD-6R is shown.

도 3은 상기 발현벡터를 효모에 형질전환하여 생산된 단백질의 전기영동사진으로서, 도면 중 각 레인에 대한 설명은 다음과 같다; 레인 M: 단백질 크기 마커, 레인 1: 발현 전의 세포 내의 단백질, 레인 2: 발현 후의 세포 내의 단백질, 레인 3: 발현 전의 세포 밖으로 분비된 단백질, 레인 4: 발현 후의 세포 밖으로 분비된 단백질, 레인 5: 투석한 후의 세포 밖으로 분비된 단백질, 레인 6: 한외여과막(Ultrafiltration, cut-off M.W.= 10,000)으로 농축한 세포 밖으로 분비된 단백질 용액.Figure 3 is an electrophoresis picture of a protein produced by transforming the expression vector in yeast, the description of each lane in the figure is as follows; Lane M: protein size marker, lane 1: protein in cell before expression, lane 2: protein in cell after expression, lane 3: protein secreted out of cell before expression, lane 4: protein secreted out of cell after expression, lane 5: Protein secreted out of cells after dialysis, Lane 6: Protein solution secreted out of cells concentrated with ultrafiltration membrane (Ultrafiltration, cut-off MW = 10,000).

도 4는 자기조립단분자막(30)이 형성된 스트립 센서(10)의 반응부(12)에 알기닌이 태그된 글루코즈 옥시다제(33)가 자기조립단분자막(30)을 구성하는 화합물 중 -COOH기를 가지는 화합물(32)의 -COOH기를 통해 결합함으로써 고정화되는 본 발명 스트립 센서의 구조를 나타낸다. 4 is a compound having a -COOH group among the compounds constituting the self-assembled monolayer 30 of the glucose oxidase 33 tagged with arginine in the reaction unit 12 of the strip sensor 10 on which the self-assembled monolayer 30 is formed. The structure of the strip sensor of the present invention which is immobilized by bonding through the -COOH group of (32) is shown.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 스트립 센서의 반응부(12)에 4-멀캅토에탄올(31)과 11-멀캅토 운데카노산(32)을 각각 에탄올에 20 mM 농도로 희석한 후 2:1 내지 6:1의 부피비로 섞은 혼합액을 도포하여 자기조립단분자막(30)을 형성하였다. 상기와 같이 혼합액을 사용하는 이유는 자기조립단분자막(30)의 방향성을 좋게 하여 알기닌이 태그된 글루코즈 옥시다제(33)의 고정화 정도를 우수하게 하기 위해서이다. In a preferred embodiment of the present invention, after diluting 4-mercaptoethanol 31 and 11-mercapto undecanoic acid 32 in ethanol at a concentration of 20 mM in the reaction part 12 of the strip sensor, respectively, 2: 1 To 6 to 1 by mixing the mixed solution in a volume ratio to form a self-assembled monolayer 30. The reason why the mixed solution is used as described above is to improve the orientation of the self-assembled monolayer 30 and to improve the degree of fixation of the glucose oxidase 33 tagged with arginine.

한편, 알기닌이 11-멀캅토 운데카노산 말단의 카르복실기와 공유결합하여 효소가 반응부(12)에 고정화되어 단층막을 형성하기 때문에 기존의 혈당 스트립에 사용되는 효소의 양보다 훨씬 적은 양의 효소를 반응시켜 혈당 스트립 제작비용을 줄 일 수 있으며, 센서의 감도를 높일 수 있는 이점이 있다.On the other hand, since arginine is covalently bound to the carboxyl group at the end of 11-mercapto undecanoic acid, the enzyme is immobilized in the reaction unit 12 to form a monolayer film, and thus a much smaller amount of enzyme is used than the amount of enzyme used in the conventional blood sugar strip. Reaction can reduce the production cost of the blood sugar strip, there is an advantage to increase the sensitivity of the sensor.

스트립 센서(10)의 반응부(12)에 자기조립단분자막(30)과 알기닌이 태그된 글루코즈 옥시다제(33)의 고정화 여부를 순환전류전압관계 그래프로 확인해 보았다. 어떠한 처리도 되어있지 않는 반응부(12)에 측정용 버퍼를 떨어뜨리고 작동 전극(14)에 0.4V의 전압을, 기준 전극(15)은 접지를 주어 초당 50mV의 속도로 전압에 대한 전류 그래프를 얻었다. 그 후 반응부(12)에 자기조립단분자막(30)을 형성하고 자기조립단분자막(30) 위에 알기닌이 태그된 글루코즈 옥시다제(33)를 고정화한 뒤 상기 방법과 동일하게 각각의 전압에 대한 전류 그래프를 얻었다. 일반적으로 효소는 작동 전극(14)과 기준 전극(15)에서 생성되는 전류의 흐름을 방해하는 특성을 띄므로, 상기 그래프로부터 알기닌이 태그된 글루코즈 옥시다제(33)가 반응부(12)의 자기조립단분자막(30) 상에 고정화되었음을 확인할 수 있었다.The circulating current voltage relationship graph confirmed whether the self-assembled monolayer 30 and the arginine-tagged glucose oxidase 33 were immobilized in the reaction unit 12 of the strip sensor 10. Drop the measuring buffer on the reaction section 12 without any treatment and apply a voltage of 0.4 V to the working electrode 14 and ground the reference electrode 15 to obtain a current graph of voltage at a rate of 50 mV per second. Got it. Thereafter, the self-assembled monolayer 30 is formed in the reaction unit 12, and the glucose oxidase 33 tagged with arginine on the self-assembled monolayer 30 is immobilized. Got. In general, since the enzyme has a characteristic of disturbing the flow of the current generated in the working electrode 14 and the reference electrode 15, the glucose oxidase 33 tagged with the arginine from the graph shows that It was confirmed that it was immobilized on the assembled monolayer 30.

그 후 상기 고정된 효소와 반응하게 될 전자 전달 매개체와, 효소 안정화를 위한 안정제를 배합한 용액을 상기 스트립 센서의 반응부(12)에 도포하였다. Then, a solution containing an electron transfer medium that will react with the immobilized enzyme and a stabilizer for enzyme stabilization was applied to the reaction unit 12 of the strip sensor.

도 5는 상기 스트립 센서의 반응부(12)에 적당량의 글루코즈를 반응시켜 글루코즈 농도에 대해 실시간으로 전류를 측정한 그래프이다. 이때 작동 전극(14)에 인가된 전압은 0.4V이고 글루코즈의 농도는 10μM에서 100mM의 범위를 포함한다. 효소와 글루코즈 그리고 전자 전달 매개체에 의한 전류값은 글루코즈 농도에 의존하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 적은 양의 효소에 대해 측정되는 글루코즈의 최소 농도가 10μM로, 본 발명에 따른 혈당 측정용 스트립 센서의 높은 감도를 확인할 수 있다. FIG. 5 is a graph in which current is measured in real time with respect to glucose concentration by reacting an appropriate amount of glucose in the reaction unit 12 of the strip sensor. At this time, the voltage applied to the working electrode 14 is 0.4V and the concentration of glucose is in the range of 10 μM to 100 mM. It was found that the current values by enzymes, glucose and electron transfer mediators depend on the glucose concentration. In addition, the minimum concentration of glucose measured for a small amount of the enzyme is 10 μM, it can confirm the high sensitivity of the strip sensor for measuring blood glucose according to the present invention.

도 5에서 얻어진 그래프를 통해 전류와 글루코즈 농도에 대한 상관관계를 나타낸 결과, 글루코즈의 농도를 10μM에서 100mM까지 반응시킨 결과에 대해 높은 신뢰도를 얻었다. As a result of the correlation between the current and glucose concentration through the graph obtained in Figure 5, a high reliability was obtained for the result of reacting the glucose concentration from 10μM to 100mM.

상기 전류와 글루코즈 농도에 대한 상관관계를 나타낸 결과를 통해, 선형 영역의 데이터를 얻을 수 있었으며, 글루코즈의 농도를 1mM에서 8mM까지 반응시키되 1mM의 간격에 따라 실시간으로 전류를 측정한 뒤 적절한 측정 시간을 확인하는 그래프로서 나타내보았다. 이를 통해 혈당 측정은 3초에서도 가능하며 5초일 때 신뢰도가 높음을 알 수 있다.Through the results of the correlation between the current and the glucose concentration, data of a linear region was obtained, and the glucose concentration was reacted from 1mM to 8mM, but the current was measured in real time according to the interval of 1mM, and then the appropriate measurement time was determined. It was shown as a graph to confirm. Through this, blood glucose measurement can be performed in 3 seconds, and it can be seen that the reliability is high at 5 seconds.

본 발명에 따른 혈당 센서는 유전공학적 방법을 이용하여 염기성 또는 산성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 또는 단백질로 태그된 효소 변형체를 제조한 후, 이를 공유결합 등을 통해 금, 은 또는 구리 박막에 형성된 상기 태그와 반대 전하를 띄는 자기조립단분자층에 결합시킴으로써, 극히 소량의 효소로도 민감도가 향상되고 빠른 검출속도를 제공하는 매우 뛰어난 효과를 가지는 혈당 측정용 스트립 센서를 제공할 수 있다.Blood glucose sensor according to the present invention by using a genetic engineering method to prepare an enzyme variant tagged with a peptide or protein consisting of basic or acidic amino acids, and then reverse the tag formed on the gold, silver or copper thin film through covalent bonds, etc. By binding to a self-assembled monolayer of charge, it is possible to provide a blood glucose measurement strip sensor having an excellent effect of improving sensitivity and providing a fast detection rate even with a very small amount of enzyme.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the configuration and effects of the present invention through the embodiments will be described in more detail. These examples are only for illustrating the present invention, but the scope of the present invention is not limited by these examples.

실시예Example 1: 알기닌이  1: Arginine 태그된Tagged 글루코즈Glucose 옥시다제Oxidase 변형체의Deformable 유전자 제작 Gene production

N-말단에 알파-아밀라아제의 시그널 서열이 연결되고 C-말단에 6개의 알기닌이 태그된 글루코즈 옥시다제 변형체를 제조하기 위하여 서열번호 1-4로 표시되는 하기 4개의 프라이머를 제작하였다. 이들 프라이머를 이용하여 각각 PCR함으로써 알파-아밀라아제의 시그널 서열 및 C 말단에 6개의 알기닌이 태그되는 글루코즈 옥시다제를 코딩하는 PCR 산물을 얻었으며, 이들 PCR 산물을 연결하여 도 2의 (a)에서와 같은 발현벡터 삽입용 유전자 단편을 얻었다. 이 유전자 단편을 발현벡터인 pGAL10에 삽입하기 위해 N-말단의 프라이머(서열번호 1)에는 EcoRI 절단 부위를, C-말단의 프라이머(서열번호 4)에는 HindIII 제한 효소 절단 부위를 도입하였다. 상기 유전자 단편을 EcoRI 및 HindIII 제한효소로 잘린 pGAL10 벡터에 삽입하여 pGAL10-α-amylase-GOD-6R 벡터를 제작하였다(도 2). 상기 발현벡터는 N-말단에 Met를 발현하였다.In order to prepare a glucose oxidase variant in which the signal sequence of alpha-amylase was linked to the N-terminus and 6 arginine tagged to the C-terminus, the following four primers represented by SEQ ID NOs: 1-4 were prepared. PCR was performed using these primers respectively to obtain a PCR product encoding a signal sequence of alpha-amylase and a glucose oxidase tagged with 6 arginine at the C terminus, and these PCR products were linked to each other in (a) of FIG. Gene fragments for insertion of the same expression vector were obtained. In order to insert this gene fragment into pGAL10, an expression vector, an EcoRI cleavage site was introduced into the N-terminal primer (SEQ ID NO: 1), and a HindIII restriction enzyme cleavage site was introduced into the C-terminal primer (SEQ ID NO: 4). The gene fragment was inserted into a pGAL10 vector cut with EcoRI and HindIII restriction enzymes to construct a pGAL10-α-amylase-GOD-6R vector (FIG. 2). The expression vector expressed Met at the N-terminus.

프라이머 1: α-amylase 센스 (서열번호 1) Primer 1: α-amylase sense (SEQ ID NO: 1)

5- GGC GGC GAA TTC AAA AAT GGT CGC GTG GTG GTC T-35- GGC GGC GAA TTC AAA A AT G GT CGC GTG GTG GTC T-3

프라이머 6: α-amylase 안티센스 (서열번호 2)Primer 6: α-amylase Antisense (SEQ ID NO: 2)

5-GGC CAA AGC AGG TGC CGC GAC CTG-35-GGC CAA AGC AGG TGC CGC GAC CTG-3

프라이머 1: GOD-6R 센스 (서열번호 3) Primer 1: GOD-6R Sense (SEQ ID NO: 3)

5- AGC AAT GGC ATT GAA GCC AGC CTC-35- AGC AAT GGC ATT GAA GCC AGC CTC-3

프라이머 6: GOD-6R 안티센스 (서열번호 4)Primer 6: GOD-6R Antisense (SEQ ID NO: 4)

5-GGT ATC GAT AAG CTT TCA GCG GCG GCG GCG GCG GCG CTG CAT GGA AGC ATA ATC-35-GGT ATC GAT AAG CTT TCA GCG GCG GCG GCG GCG GCG CTG CAT GGA AGC ATA ATC-3

실시예Example 2: 알기닌이  2: arginine 태그된Tagged 글루코즈Glucose 옥시다제Oxidase 변형체의Deformable 발현 Expression

상기 실시예 1에서 제작된 pGAL10-α-amylase-GOD-6R 벡터는 리튬 아세테이트(lithium acetate) 방법(Gietz et al 1995)에 따라 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) L3262Δpmr1에 형질 전환하였다. 형질 전환된 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) 균주는 2007년 10월 24일자로 기탁번호를 KCTC 11225BP로 하여 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다.The pGAL10-α-amylase-GOD-6R vector prepared in Example 1 was transformed into S. cerevisiae L3262Δpmr1 according to the lithium acetate method (Gietz et al 1995). . The transformed S. cerevisiae strain was deposited on October 24, 2007 with KCTC 11225BP and deposited at the Korea Institute of Bioscience and Biotechnology.

pGAL10-α-amylase-GOD-6R 벡터에 의해 형질 전환된 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) L3262Δpmr1의 단백질 발현을 유도하기 위해서 단백질 발현 유도 배지인 YPDG 배지(1% Yeast extract, 2% peptone, 1% glucose, 1% galactose)에서 30℃, 48시간 동안 배양하였다. To induce protein expression of S. cerevisiae L3262Δpmr1 transformed with pGAL10-α-amylase-GOD-6R vector, YPDG medium (1% Yeast extract, 2%) peptone, 1% glucose, 1% galactose) was incubated at 30 ℃ for 48 hours.

48시간 후, 원심 분리하여 세포와 배지를 얻어 세포 밖으로 분비된 단백질 용액을 얻었다. 배지는 완충 용액(10mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 투석한 후 한외여과막(Ultrafiltration, cut-off M.W.= 10,000)으로 단백질을 농축한 다음 동결 건조하여 고농축된 세포 밖으로 분비된 단백질 용액을 얻었다. 세포는 효모 세포벽의 분해를 돕는 효소(lysozyme과 zymolase)를 첨가한 후에 초음파(Branson, Sonifier450, 3 KHz, 3 W, 5 min)로 파쇄한 후 원심 분리하여 세포 내에 단백질 용액을 얻었다. After 48 hours, centrifugation was performed to obtain cells and medium to obtain a protein solution secreted out of the cells. The medium was dialyzed with a buffer solution (10 mM Tris-HCl, pH 8.0), the protein was concentrated by ultrafiltration membrane (Ultrafiltration, cut-off M.W. = 10,000), and then lyophilized to obtain a protein solution secreted out of highly concentrated cells. After the addition of enzymes (lysozyme and zymolase) to help break down the yeast cell wall, the cells were disrupted by ultrasonication (Branson, Sonifier450, 3 KHz, 3 W, 5 min) and centrifuged to obtain protein solution in the cells.

위에서 얻어진 각각의 단백질 용액은 완충액(12 mM Tris-Cl, pH 6.8, 5% 글리세롤, 2.88 mM 머캅토에탄올, 0.4% SDS, 0.02% 브롬화페놀 블루)과 혼합하여 100℃에서 5분간 가열 후 1㎜ 두께의 12% 분리 젤(pH 8.8, 가로 20 cm, 세로 10 cm) 위에 5% 저장 젤 (pH 6.8, 가로 10 ㎝, 세로 12.0 ㎝)을 덮은 폴리아크릴아마이드 젤에 로딩한 후 200-100 V, 25 ㎃로 1시간 동안 전기영동하고 쿠마시 염색액으로 염색하여 재조합 단백질을 확인하였다.Each protein solution obtained above was mixed with buffer (12 mM Tris-Cl, pH 6.8, 5% glycerol, 2.88 mM mercaptoethanol, 0.4% SDS, 0.02% phenol bromide blue) and heated at 100 ° C. for 5 minutes, then 1 mm. 200-100 V, loaded on a polyacrylamide gel covered with a 5% storage gel (pH 6.8, 10 cm, 12.0 cm) on a 12% thick separation gel (pH 8.8, 20 cm, 10 cm). Electrophoresis was performed for 1 hour at 25 kPa and stained with Coomassie stain to confirm the recombinant protein.

그 결과, 도 3과 같은 전기영동 사진을 얻었다. 도 3에서 레인 M은 단백질 크기 마커, 레인 1은 발현 전의 세포 내의 단백질, 레인 2는 발현 후의 세포 내의 단백질, 레인 3은 발현 전의 세포 밖으로 분비된 단백질, 레인 4는 발현 후의 세포 밖으로 분비된 단백질, 레인 5는 투석한 후의 세포 밖으로 분비된 단백질, 레인 6은 한외여과막(Ultrafiltration, cut-off M.W.= 10,000)으로 농축한 세포 밖으로 분비된 단백질 용액을 나타낸다.As a result, an electrophoretic photograph as shown in FIG. 3 was obtained. In FIG. 3, lane M is a protein size marker, lane 1 is a protein in a cell before expression, lane 2 is a protein in a cell after expression, lane 3 is a protein secreted out of the cell before expression, lane 4 is a protein secreted out of the cell after expression, Lane 5 represents the protein secreted out of the cell after dialysis, lane 6 represents the protein solution secreted out of the cell concentrated by ultrafiltration membrane (Ultrafiltration, cut-off MW = 10,000).

실시예Example 3:  3: 자기조립단분자막Self-assembled monolayer 형성과 효소 고정화를 통한 본 발명 혈당 센서 제조 Preparation of the Invention Blood Glucose Sensor by Formation and Enzyme Immobilization

혈당 측정용 금 박막 스트립을 에탄올에서 10분간 초음파로 세척한 후 새로운 에탄올로 3회 씻어낸 다음 건조시켰다. The gold thin film strip for blood glucose measurement was ultrasonically washed in ethanol for 10 minutes, washed three times with fresh ethanol and dried.

4-멀캅토 에탄올과 11-멀캅토 운데카노산을 각각 에탄올에 20mM 농도로 희석시킨 후 부피비 4:1로 섞어 혼합액을 제조하였다. 4-mercapto ethanol and 11-mercapto undecanoic acid were each diluted in ethanol at a concentration of 20 mM, and then mixed at a volume ratio of 4: 1 to prepare a mixed solution.

세척된 스트립 센서는 각 일면만을 반응시키기 위하여 2개를 한 세트로 포개어 1㎖ 튜브에 넣었다. 상기에서 준비한 혼합액 300㎕를 스트립 센서의 반응부로 사용되는 면에만 처리하도록 상기 튜브에 넣어 20시간 동안 반응시켰다. 자기조립단분자막이 형성된 스트립 센서는 새로운 에탄올로 5회 세척한 후 건조시켰다. 트리스 버퍼(Tris buffer, 50 mM, pH 8.0)에 알기닌이 태그된 글루코즈 옥시다제를 5㎎/㎖ 농도로 희석시킨 다음, 이를 건조시킨 스트립 센서의 반응부에 5㎕씩 스팟팅하여 4℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 상기 반응을 통해 알기닌은 11-멀캅토 운데카노산의 카르복실기와 공유결합을 하여 금 박막 위에 단층막을 형성하였다. 반응이 끝난 후 증류수로 5회 세척한 후 질소 가스로 건조시킴으로써 본 발명 혈당 센서를 제조하였다.The cleaned strip sensors were stacked in sets of two and placed in a 1 ml tube to react only one side of each. 300 μl of the mixed solution prepared above was added to the tube to be treated only on the surface used as a reaction part of the strip sensor, and reacted for 20 hours. The strip sensor on which the self-assembled monolayer was formed was washed five times with fresh ethanol and dried. Dilute arginine-tagged glucose oxidase to 5 mg / ml in Tris buffer (50 mM, pH 8.0), and then spot 5 μl of the reaction strip of the dried strip sensor at 4 ° C. The reaction was carried out for a time. Through the reaction, arginine covalently bonded with the carboxyl group of 11-mercapto undecanoic acid to form a monolayer film on the gold thin film. After the reaction, the blood glucose sensor of the present invention was prepared by washing with distilled water five times and then drying with nitrogen gas.

실시예Example 4: 본 발명 혈당 센서를 이용한 혈당 측정  4: blood glucose measurement using the present invention blood glucose sensor

상기 실시예 3에서 제조한 알기닌이 태그된 글루코즈 옥시다제가 고정화된 혈당 스트립 센서를 이용하여 시간에 따른 글루코스 농도에 대한 전류 변화를 측정함으로써 본 발명 혈당 센서의 혈당 측정에 대한 민감도를 조사하였다.The sensitivity of the blood glucose sensor of the present invention was examined by measuring a change in current with respect to glucose concentration over time using a blood glucose strip sensor to which an arginine-tagged glucose oxidase prepared in Example 3 was immobilized.

혈당 측정시 효소의 안정성을 위해 쓰인 안정제로는 트리스 버퍼에 녹인 0.1㎍/㎖ 농도의 BSA(bovine serum albumin, Sigma Aldrich)를 사용하였다. 전자 전달 매개체로는 포타슘 핵사시아노페레이트(Potassium hexacyanoferrate Ⅲ, Fluka)를 트리스 버퍼에 10mM 농도로 녹여 사용하였다. As a stabilizer used for enzyme stability when measuring blood glucose, BSA (bovine serum albumin, Sigma Aldrich) concentration of 0.1 ㎍ / ㎖ dissolved in Tris buffer was used. Potassium hexacyanoferrate III (Fluka) was dissolved in Tris buffer at 10 mM concentration as an electron transfer medium.

혈당 측정을 위해 먼저, BSA 용액과 전자 전달 매개체액을 섞어 3㎕ 씩 스트립 센서의 반응부에 스팟팅 하였다. 스팟팅한 용액을 건조시키기 위해 진공 펌프를 사용하였고 20분간 건조시켰다. 건조 후 스트립 센서는 전류-전압 측정장비(KEITHLY SCS-4200)를 이용하여 시간에 따른 글루코스(D-glucose, Sigma Aldrich)의 농도에 대한 전류 변화를 측정해 보았다. 글루코스 용액은 10μM~100mM 로 트리스 버퍼에 희석시켜 사용하였으며 스트립 센서에 떨어뜨린 후 전류를 측정하였다. 이때 전압은 0.4V로 하였고 총 측정 시간은 20초였으며 검출된 시간은 5초 이내였다. 그 결과 글루코즈 농도가 증가함에 따라 전류변화도 비례함을 확인할 수 있었다(도 5). For blood glucose measurement, first, the BSA solution and the electron transfer medium solution were mixed and spotted on the reaction part of the strip sensor by 3 µl. A vacuum pump was used to dry the spotted solution and dried for 20 minutes. After drying, the strip sensor measured current change with respect to the concentration of glucose (D-glucose, Sigma Aldrich) with time using a current-voltage measuring instrument (KEITHLY SCS-4200). The glucose solution was diluted in Tris buffer at 10 μM˜100 mM and dropped on a strip sensor to measure the current. At this time, the voltage was 0.4V, the total measurement time was 20 seconds, and the detected time was within 5 seconds. As a result, as the glucose concentration increased, it was confirmed that the current change was also proportional (FIG. 5).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.The specific parts of the present invention have been described in detail above, and it is apparent to those skilled in the art that such specific descriptions are merely preferred embodiments, and thus the scope of the present invention is not limited thereto. something to do. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

이상 상기 실시예를 통해 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 혈당 센서는 양전하 또는 음전하를 띄는 혈당 센서의 반응부에 형성된 자기조립단분자막과 반대 전하를 띄는 단백질 또는 펩타이드로 태그된 효소 변형체를 사용함으로써, 상기 자 기조립단분자막과 상기 태그가 공유결합 등을 통해 결합함으로써, 극히 소량의 효소로도 혈당센서의 민감도가 향상되고 빠른 검출속도를 제공하는 혈당 측정용 스트립 센서 및 이의 제조 방법을 제공할 수 있다.As described above through the above embodiments, the blood glucose sensor according to the present invention uses an enzyme variant tagged with a protein or peptide having a reverse charge with a self-assembled monolayer formed on a reaction part of a positively or negatively charged blood glucose sensor. By combining the self-assembled monomolecular film and the tag through a covalent bond, the present invention can provide a blood glucose measurement strip sensor and a method for manufacturing the same, which improve the sensitivity of the blood glucose sensor and provide a fast detection rate even with a very small amount of enzyme.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 혈당 측정 스트립 센서의 구성도이다.1 is a block diagram of a blood glucose measurement strip sensor according to an embodiment of the present invention.

도 2는 알기닌이 태그된 글루코즈 옥시다제 재조합 단백질의 발현벡터를 제작하기 위한 도면으로서, (a)는 PCR에 의해 증폭된 알기닌이 태그된 글루코즈 옥시다제 유전자를 개략적으로 나타낸 구성도이고, (b)는 상기 유전자를 삽입한 발현벡터 pGAL10-α-AmySS-GOD-6R의 개열지도를 나타낸다.FIG. 2 is a diagram for preparing an expression vector of an arginine-tagged glucose oxidase recombinant protein, (a) is a block diagram schematically illustrating a glucose oxidase gene tagged with an arginine amplified by PCR, and (b) Shows a cleavage map of the expression vector pGAL10-α-AmySS-GOD-6R into which the gene is inserted.

도 3은 본 발명의 실시예에 따라 알기닌이 태그된 재조합 글루코즈 옥시다제 변형체의 유전자를 효모에서 발현시킨 후 단백질의 전기영동 결과를 나타낸 것이다.Figure 3 shows the results of electrophoresis of proteins after the gene of the recombinant glucose oxidase variant tagged with arginine is expressed in yeast according to an embodiment of the present invention.

도 4는 본 발명의 실시예에 따라 스트립 센서의 반응부 상에 자기조립단분자막을 형성한 후, 여기에 효소를 고정화한 것을 개략적으로 나타낸 구성도이다.Figure 4 is a schematic view showing the formation of a self-assembled monolayer on the reaction unit of the strip sensor in accordance with an embodiment of the present invention, the enzyme is immobilized therein.

도 5은 본 발명의 실시예에 따른 혈당 측정 센서의 글루코즈 농도에 대한 실시간 전류 측정 결과를 나타내는 그래프이다.5 is a graph showing a real-time current measurement results for glucose concentration of the blood glucose measurement sensor according to an embodiment of the present invention.

< 도면의 주요 부호에 대한 설명 ><Description of Major Symbols in Drawing>

10. 혈당 측정용 센서 스트립 11. 비전도성 기판10. Blood glucose sensor strip 11.Nonconductive substrate

12. 반응부 13. 전극부12. Reaction part 13. Electrode part

14. 작동 전극 15. 기준 전극14. Working electrode 15. Reference electrode

30. 자기조립단분자막 31. 4-멀캅토 에탄올30. Self-assembled monolayer 31. 4-Mercapto ethanol

32. 11-멀캅토 운데카논산32. 11-Mercapto Undecanoic Acid

33. 알기닌이 태그된 글루코즈 옥시다제33. Glucose Oxidase Tagged With Arginine

Claims (24)

비전도성 기판과, Non-conductive substrate, 표면에 음전하 또는 양전하를 띄는 자기조립단분자막이 형성되어 있고 상기 자기조립단분자막과 반대전하를 가지는 펩타이드 또는 단백질로 태그(tag)된 글루코즈를 기질로 이용하는 효소 및 상기 효소와 반응하여 전자를 발생시키는 전자 전달 매개체를 구비하는 반응부와, Self-assembled monolayers with negative or positive charges formed on the surface, and enzymes using glucose tagged with peptides or proteins having opposite charges to the self-assembled monolayers as substrates and electrons that react with the enzymes to generate electrons A reaction unit having a medium; 작동 전극 및 기준 전극을 구비하고 각각의 일단이 상기 반응부에 연결되는 전극부를 포함하는 혈당 측정용 스트립 센서.And a working electrode and a reference electrode, each end of which includes an electrode part connected to the reaction part. 제 1 항에 있어서, 상기 자기조립단분자막은 말단에 음전하 또는 양전하 관능기가 있는 화합물을 코팅하여 형성되는 것인 혈당 측정용 스트립 센서. The blood glucose measurement strip sensor according to claim 1, wherein the self-assembled monolayer is formed by coating a compound having a negatively charged or positively charged functional group at its end. 제 2 항에 있어서, 상기 자기조립단분자막은 말단에 상기 제2항의 화합물과 함께 말단에 수산화기를 포함하는 화합물을 혼합 코팅하여 형성되는 것인 혈당 측정용 스트립 센서.The blood glucose measurement strip sensor of claim 2, wherein the self-assembled monolayer is formed by mixing and coating a compound including a hydroxyl group at a terminal together with the compound of claim 2. 제 2 항 또는 제 3항에 있어서, 상기 제2항의 화합물 중 말단에 음전하 관능기가 있는 화합물은 말단에 카르복실기(-COOH), 인산기(-PO3H2) 또는 설폰산기(-The compound according to claim 2 or 3, wherein the compound having a negatively charged functional group at the terminal of the compound of claim 2 is a carboxyl group (-COOH), a phosphoric acid group (-PO3H2) or a sulfonic acid group (- SO3H)를 가지는 화합물인 것을 특징으로 하는 혈당 측정용 스트립 센서.A strip sensor for blood glucose measurement, characterized in that the compound having SO3H). 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 제2항의 화합물 중 말단에 양전하 관능기가 있는 화합물은 말단에 아민기(amine)(-NR1R2R3), 아미딘기(amidine)[-C(NR1)(NR2R3)], 또는 구아니딘기(guanidine) [(R1R2N)(R3R4N)C=N-R5]가 있는 화합물인 것을 특징으로 하는 혈당 측정용 스트립 센서.The compound according to claim 2 or 3, wherein the compound having a positively charged functional group at the terminal includes an amine group (-NR1R2R3) and an amidine [-C (NR1) (NR2R3) terminal. ], Or a compound with guanidine [(R1R2N) (R3R4N) C = N-R5]. 제 4 항에 있어서, 상기 제2항의 화합물 중 말단에 카르복실기가 있는 화합물은 11-멀캅토 운데카노산, 4-멀캅토 페닐아세트산, 4-멀캅토 벤조산, 4-멀캅토 프로파노산, 2-티오말릭 에시드, 2-티올락트산 또는 12-멀캅토 도데카노산임을 특징으로 하는 혈당 측정용 스트립 센서.The compound according to claim 4, wherein the compound having a carboxyl group at the terminal of the compound of claim 2 is 11-mercapto undecanoic acid, 4-mercapto phenylacetic acid, 4-mercapto benzoic acid, 4-mercapto propanoic acid, 2- A strip sensor for measuring blood glucose, characterized in that it is thiomaleic acid, 2-thiolactic acid or 12-mercapto dodecanoic acid. 제 4 항에 있어서, 상기 제2항의 화합물 중 말단에 인산기가 있는 화합물은 (아미노메틸)포스폰산, 2-아미노에틸포스폰산 또는 3-아미노프로필포스폰산임을 특징으로 하는 혈당 측정용 스트립 센서.The strip sensor according to claim 4, wherein the compound having a phosphoric acid group at the terminal of the compound of claim 2 is (aminomethyl) phosphonic acid, 2-aminoethylphosphonic acid or 3-aminopropylphosphonic acid. 제 4 항에 있어서, 상기 제2항의 화합물 중 말단에 설폰산기가 있는 화합물은 아미노메탄 설폰산, 아미노에탄 설폰산 또는 3-아미노벤젠 설폰산임을 특징으로 하는 혈당 측정용 스트립 센서.The blood glucose measurement strip sensor according to claim 4, wherein the compound having a sulfonic acid group at the terminal of the compound of claim 2 is aminomethane sulfonic acid, aminoethane sulfonic acid or 3-aminobenzene sulfonic acid. 제 5항에 있어서, 상기 제2항의 화합물 중 말단에 아민기를 포함하는 화합물은 머켑토알킬아민(mercaptoalkylamine)임을 특징으로 하는 혈당 측정용 스트립 센서.The blood glucose measurement strip sensor according to claim 5, wherein the compound having an amine group at the terminal of the compound of claim 2 is mercaptoalkylamine. 제 5항에 있어서, 상기 제2항의 화합물 중 말단에 아미딘기를 포함하는 화합The compound according to claim 5, wherein the compound of claim 2 comprises an amidine group at a terminal thereof. 물은 머켑토알킬아미딘(mercaptoalkylamidine)임을 특징으로 하는 혈당 측정용 스Water is a blood glucose meter, characterized in that it is mercaptoalkylamidine. 트립 센서.Trip sensor. 제 5항에 있어서, 상기 제2항의 화합물 중 말단에 구아니딘기를 포함하는 화합물은 머켑토알킬구아니딘(mercaptoalkylguanidine)임을 특징으로 하는 혈당 측정용 스트립 센서.The blood glucose measurement strip sensor according to claim 5, wherein the compound including a guanidine group at the terminal of the compound of claim 2 is mercaptoalkylguanidine. 제 3항에 있어서, 상기 제2항의 화합물 중 말단에 수산화기를 포함하는 화합물은 4-멀캅토에탄올, 4-멀캅토페놀, 3-멀캅토프로판올, 4-멀캅토부탄올 또는 4-멀캅토헥산올임을 특징으로 하는 혈당 측정용 스트립 센서.The compound according to claim 3, wherein the compound containing a hydroxyl group at the terminal of the compound of claim 2 is 4-mercaptoethanol, 4-mercaptophenol, 3-mercaptopropanol, 4-mercaptobutanol or 4-mercaptohexanol Strip sensor for measuring blood glucose. 삭제delete 제 3항에 있어서, 상기 제2항의 화합물 중 말단에 음전하 관능기가 있는 화합물은 11-멀캅토 운데카노산이고, 상기 말단에 수산화기를 포함하는 화합물은 4-멀캅토에탄올임을 특징으로 하는 혈당 측정용 스트립 센서.The method of claim 3, wherein the compound having a negatively charged functional group at the terminal of the compound of claim 2 is 11-mercapto undecanoic acid, and the compound containing a hydroxyl group at the terminal is 4-mercaptoethanol. Strip sensor. 제 1항에 있어서, 상기 태그는 염기성 또는 산성의 아미노산 3 내지 100 개를 조합하여 이루어지는 펩타이드인 혈당 측정용 스트립 센서. The blood glucose measurement strip sensor according to claim 1, wherein the tag is a peptide formed by combining 3 to 100 basic or acidic amino acids. 제 15 항에 있어서, 상기 염기성 아미노산은 알기닌, 라이신, 히스티딘 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인 혈당 측정용 스트립 센서.The blood glucose measurement strip sensor according to claim 15, wherein the basic amino acid is selected from arginine, lysine, histidine or a combination thereof. 제 16 항에 있어서, 상기 염기성 아미노산은 3 내지 10 개의 알기닌으로 이루어진 것인 혈당 측정용 스트립 센서. The blood glucose measurement strip sensor according to claim 16, wherein the basic amino acid consists of 3 to 10 arginine. 제 15 항에 있어서, 상기 산성 아미노산은 아스파르트산 또는 글루탐산, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인 혈당 측정용 스트립 센서. The blood glucose measurement strip sensor according to claim 15, wherein the acidic amino acid is selected from aspartic acid or glutamic acid, or a combination thereof. 제 1항에 있어서, 상기 전자 전달 매개체는 포타슘핵사시아노페레이트(Ⅲ)(Potassium hexacyanoferrate Ⅲ), 포타슘페리시아나이드(potassium ferricyanide), 포타슘페로시아나이드(potassium ferrocyanide) 및 염화헥사아민루세늄(Ⅲ)(hexaammineruthenium Ⅲ)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 혈당 측정용 스트립 센서.The method of claim 1, wherein the electron transport medium is potassium hexacyanoferrate III (potassium hexacyanoferrate III), potassium ferricyanide, potassium ferrocyanide (potassium ferrocyanide) and hexaamine ruthenium chloride Strip sensor for blood glucose measurement, characterized in that selected from the group consisting of (III) (hexaammineruthenium III). 제 1항에 있어서, 상기 전극의 재질은 금, 은 또는 구리임을 특징으로 하는 혈당 측정용 스트립 센서.The blood glucose measurement strip sensor according to claim 1, wherein the electrode is made of gold, silver, or copper. 제 1항에 있어서, 상기 효소는 글루코즈 옥시다제, 콜레스테롤 옥시다제, 글루타믹 옥살아세틱 트랜스미나아제(Glutamic Oxaloacetic Transaminase; GOT) 또는 글루타믹 피루빅 트랜스미나아제(Glutamic Pyruvic Transaminase; GPT)인 혈당 측정용 스트립 센서.The method of claim 1, wherein the enzyme is glucose oxidase, cholesterol oxidase, glutamic oxalacetic transaminase (GOT) or glutamic pyruvic transaminase (GPT). Strip sensor for blood glucose measurement. N-말단에는 α-아밀라아제 시그널 서열이 연결되고 C-말단에는 6개의 알기닌이 태그된 글루코즈 옥시다제 변형체를 코딩하는 유전자가 형질전환된, 알기닌이 태그된 글루코즈 옥시다제 생산용 재조합 균주.A recombinant strain for production of an arginine-tagged glucose oxidase, in which a gene encoding a glucose oxidase variant tagged with an α-amylase signal sequence is linked to an N-terminus and a six-arginine-tagged tag is linked to an N-terminus. 제 22항에 있어서, 상기 재조합 균주는 기탁번호 KCTC 11225BP 균주인 것을 특징으로 하는 알기닌이 태그된 글루코즈 옥시다제 생산용 재조합 균주. 23. The recombinant strain according to claim 22, wherein the recombinant strain is an accession number KCTC 11225BP strain. 제 22항에 있어서, 상기 재조합 균주는 기탁번호 KCTC 11224BP인 것을 특징으로 하는 알기닌이 태그된 글루코즈 옥시다제 생산용 재조합 균주.  23. The recombinant strain according to claim 22, wherein the recombinant strain is Accession Number KCTC 11224BP.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2415863A1 (en) 2010-08-03 2012-02-08 B.R.A.I.N. Mutant glucose oxidase
JP6427110B2 (en) 2013-01-28 2018-11-21 エフ ホフマン−ラ ロッシュ アクチェン ゲゼルシャフト A novel glucose oxidase from Aspergillus niger
GB2516607A (en) * 2013-03-06 2015-02-04 Cambridge Display Tech Ltd Organic electronic device
EP2796547B1 (en) * 2013-04-24 2016-09-14 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Novel glucose oxidase variants
CN103472237B (en) * 2013-09-18 2015-02-25 四川大学华西第二医院 Bio-sensitive chip as well as preparation method and use thereof
CA3237928A1 (en) * 2021-11-19 2023-05-25 Abbott Diabetes Care Inc. Analyte sensors for sensing glutamate and methods of using the same

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5185256A (en) * 1985-06-21 1993-02-09 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Method for making a biosensor
US6287451B1 (en) * 1999-06-02 2001-09-11 Handani Winarta Disposable sensor and method of making
KR100426638B1 (en) * 2001-07-07 2004-04-08 주식회사 인포피아 Glucose strip sensor and glucose measurement method by the strip sensor

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