KR100958184B1 - 금 나노 입자를 이용하여 응집된 단백질을 검출하기 위한바이오센서 - Google Patents

금 나노 입자를 이용하여 응집된 단백질을 검출하기 위한바이오센서 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질과 같은 생체 분자의 응집 상태를 검출하기 위한 바이오 센서(sensor)에 관한 관한 것이다. 보다 상세하게는 단백질과 같은 생체 분자의 응집 상태를 검출하기 위한 센서 (sensor)에 관한 것으로, 특히 금속 나노 입자에서 발생하는 국소 표면 플라즈몬(Localized surface plasmon, 이하 LSP이라 한다.)의 공명 흡수를 이용하는 바이오센서에 관한 것이다. 본 발명의 바이오센서는, 측정하고자 하는 시료와 특이적 결합을 유도하는 기능기를 포함하고 국소 표면 플라즈몬 공명(localized surface plasmon) 흡수 현상을 유도하는 나노 입자를 포함하는 용액이며, 상기 나노 입자 용액으로 대상 시료를 측정할 때, 국소 표면 플라즈몬 공명 흡수 현상의 변화된 광 특성을 검출하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따르면 나노 입자의 국소 표면 플라즈몬 현상을 이용하여 대상 생체분자 시료의 응집 현상을 눈으로 바로 확인할 수 있는 바이오센서(색 센서)를 제공할 수 있는 효과를 가진다.
국소 표면 플라즈몬(localized surface plasmon), 나노 입자(nanoparticle),바이오센서(biosensor), 생체분자(biomolecule), 응집체(aggregate)

Description

금 나노 입자를 이용하여 응집된 단백질을 검출하기 위한 바이오센서 {BIOSENSOR FOR THE DETECTION OF AGGREGATED PROTEIN USING GOLD NANOPARTICLE}
본 발명은 단백질과 같은 생체 분자의 응집 상태를 검출하기 위한 바이오 센서(sensor)에 관한 것이다. 보다 상세하게는 금속 나노 입자에서 발생하는 국소 표면 플라즈몬(Localized surface plasmon, 이하 LSP이라 한다.)의 공명 흡수를 이용하는 바이오센서에 관한 것이다.
표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance, 이하 SPR이라 한다.) 현상이란 금속 박막 표면에서 일어나는 전자들의 집단적 진동에 의하여 발생한 표면 플라즈몬 파(surface plasmon wave)가 금속과 이에 인접한 유전물질의 경계 면을 따라 진행하는 표면전자기파로 여기 되어 공명 흡수 효과가 일어나는 현상이다.
이는 금속 표면에서 발생하는 유전체(dielectric constant)의 물리적 변화, 즉 농도, 두께 굴절률 변화를 정밀하게 측정할 수 있기 때문에 나노 수준의 계면 현상을 분석하는 신호변환기법의 일환으로 물질을 정량적으로 분석하기 위한 다양한 센서들이 고안되고 있다.
특히 이러한 표면 플라즈몬 파가 금속 나노 입자에서 발생할 경우 나노 입자 표면에서 국소 표면 플라즈몬 파로 나타나며, 이러한 현상에 의하여 나노 입자 용액이 가시광선 하에서 특이한 색을 나타내므로, 대상 물질 측정에 의한 표면의 미세한 변화를 색 변화로 쉽게 검출 할 수 있기 때문에 표식자(labeling)없이 바이오센서 또는 화학센서로 활용될 것으로 알려지고 있다.
최근에는 대상 물질을 실시간으로 매우 민감하게 측정할 수 있는 다양한 소재의 바이오센서가 개발되고 있다. 광 발광성 물질을 사용하는 바이오센서로서 대한민국 공개특허 제 2003-40520호, 2004-46386호에 개시되어 있으며, 전도성 탄소 나노 튜브를 이용한 바이오센서로서 대한민국 공개특허 제 2004-107225호, 제 2003-14997호 등이 개시되어 있다. 특히 표면 플라즈몬 공명현상을 이용하여 금속 기판을 사용하는 바이오센서로서 대한민국 공개특허 제 2004-39553호, 대한민국 특허 제 673835호에 개시되어 있다.
상기 발명들은 다양한 디바이스를 제작, 이용하여 나노 수준의 현상들을 측정하고자 하였으나, 센서의 제작 과정이 단순하지 않으며, 비교적 높은 농도의 많은 시료를 요구하는 경우가 있고, 검출하는 장비를 필요로 하는 번거로움이 있었다.
따라서 상기와 같은 단점을 보완하고 더욱 빠르고 정밀하게 대상 물질을 검출할 수 있는 장비 개발의 필요성이 요구되었다.
이러한 단점을 보완하고 더욱 빠르고 정밀하게 검출할 수 있는 간편한 측정 방법이 요구된다. 따라서 종래 기술의 문제점을 해결하고 상기 과제를 이루기 위한 본 발명에서는, 나노 입자의 국소 표면 플라즈몬 현상을 이용하여 대상 단백질의 응집 현상을 눈으로 바로 확인할 수 있는 바이오센서(색 센서)를 제작하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 바이오센서는 나노 미터 크기를 가지며, 일정한 크기로 용액에 분산되어 있고 상호 간에 동일한 형태를 가지고, 측정하고자 하는 시료와 특이적 결합을 유도하는 기능기를 포함하고, 국소 표면 플라즈몬 공명(localized surface plasmon) 흡수 현상을 유도하는 복수의 나노 입자를 포함하는 용액이며, 상기 나노 입자 용액으로 대상 시료를 측정할 때, 국소 표면 플라즈몬 공명 흡수 현상의 변화된 광 특성을 검출하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 측정하고자 하는 시료는 생체 내에서 응집 현상(aggregation)을 유발하는 단백질이며, 상기 기능기를 포함하는 나노 입자는 측정하고자 하는 시료와 동일한 단백질의 단량체(monomer)와 접합(conjugation)되어 상기 시료와 특이적 결합(specific interaction)을 유도할 수 있다.
또한, 상기 단백질의 단량체(monomer)는 Amyloid β(Aβ), Superoxide dismutase(SOD), α-synuclein, Prion 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되어진 하 나의 종으로써, 상기 나노 입자에 접합시켜 선택된 종과 동일한 단백질의 응집체(aggregates)를 측정할 수 있다.
또한, 상기 나노 입자는 국소 표면 플라즈몬 공명 흡수 현상을 유도하는 금, 은, 구리 및 알루미늄으로 이루어진 그룹에서 선택 되어진 물질로 형성될 수 있다.
본 발명에 의하면 측정하고자 하는 시료와 특이적 결합을 유도하는 기능기를 포함하고, 국소 표면 플라즈몬 공명(localized surface plasmon) 흡수 현상을 유도하는 복수의 나노 입자를 포함하는 용액으로서, 병의 발병과 관련 있는 생체 분자의 응집 정도를 매우 간편하고 정밀하게 측정 가능한 효과를 가진다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부된 도면들을 참조하여 상세히 설명한다. 우선 각 도면의 구성 요소들에 참조 부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성 요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다. 또한, 이하에서 본 발명의 바람직한 실시예를 설명할 것이나, 본 발명의 기술적 사상은 이에 한정하거나 제한되지 않고 당업자에 의해 변형되어 다양하게 실시될 수 있음은 물론이다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 바이오센서의 제조방법과 대상 시료 제조 방법을 나타내는 개략도이다. 구체적으로 (A) 단계는 SOD 단백질의 응집체 를 유도하는 과정이다. 즉 문헌에 잘 알려진 약 산의 조건(weak acidic condition, HCl 사용)에서 2, 2, 2 Tri-fluoroethanol(이하 TFE라 한다.)를 이용하여 단백질 응집체를 유도하였다. 이렇게 유도된 응집체를 주수(2주, 3주, 4주) 별로 체취(sampling)하여 본 발명의 바이오센서 검출에 대상 시료로써 활용하였다.
이때, 나노 입자를 이용하여 국소 표면 플라즈몬 공명 흡수 현상을 유도한다면, 가시광선 하에서 나노 입자는 특유의 색을 가지고 있고 특정 시료를 측정하면서 발생하는 특이적 결합으로 나노 입자의 자체의 응집을 유발하기 때문에, 나노 입자 용액의 색이 적색 전이(red-shift) 또는 청색 전이(blue-shift)를 유발하며 변화하게 된다.
본 발명에서는 대상 시료와의 특이적 결합이 있을 때 나타나는 나노 입자 용액 자체의 색 변화를 이용하여 특별한 분석 장비 없이 눈으로 대상 시료를 측정할 수 있는 색 센서(colorimetric sensor)를 개발하고자 하였다.
여기서 상기 나노 입자는 그 단면이 원형, 타원형, 삼각형, 사각형, 마름모형을 갖는 대칭의 모양의 통형인 것이 바람직하다. 그 이유는 측정하고자 하는 대상 시료와 특이적 결합을 하는 기능기를 나노 입자에 접합시켜야 하는데, 나노 입자 표면에 균일하게 분포하기 좋은 형태이기 때문이다. 이러한 기능기는 측정하고자 하는 대상 시료와 상호작용을 할 수 있는 물질을 선택하여 접합시키게 된다.
나노 입자에 상기 기능기를 접합시키는 방법은 공유결합(covalent binding), 전기결합(electrical binding) 등의 화학적 결합방법과 물리적 결합 방법을 시행할 수 있다. 특히 공유결합을 유도하여 자기조립 단분자층(self-assembled monolayer) 을 형성하는 방법이 바람직하다.
그 이유는 바이오센서로 사용하여 대상 시료를 측정할 때, 오랜 시간동안 매우 안정적인 상태를 유지할 수 있으며, 나노 입자 표면에 균일한 단분자층을 용이하게 형성할 수 있으므로 대상 시료를 매우 정밀하게 측정할 수 있다는 장점이 있다. 따라서 산업적으로 본 발명의 바이오센서를 이용할 때 측정하고자 하는 시료의 진단 키트로서 용이하게 활용할 수 있을 것이다.
본 발명에 포함되어 있는 나노 입자의 재질은 는 국소표면 플라즈몬 공명 흡수형상을 유도하는 금, 은, 구리 및 알루미늄으로 이루어진 그룹에서 선택되어진 하나의 물질로 형성되는 것을 특징으로 한다.
구체적으로 본 발명에서 표면 플라즈몬 파를 일으켜 국소 표면 플라즈몬 공명 흡수가 가능한 금속으로서 금(Au, 순도 99.9% 이상)을 사용하는 것이 바람직하다. 왜냐하면 금은 대상 시료를 측정하기 위하여 선택성을 지니는 유기 기능기 또는 생체분자에 대하여 자기조립 단분자층을 형성시키는데 용이하며, 바이오센서로 사용하였을 경우 화학적으로 매우 안정적이기 때문이다.
이러한 나노 입자는 본 발명의 바이오센서로 활용하기 위하여 용액 상에 고르게 분산되어 있는 것이 바람직하다. 구체적으로 그 형태는 제조 방법에 따라 구형, 아령형, 삼각형, 마름모 형, 막대기 형의 라드(rod)형태가 될 수 있으며, 용액의 상태도 수용액 또는 유기 용매일 수 있다.
그러나 나노 입자를 생체 분자와 단분자층으로 자기 조립시키기 위해서는 생체분자의 활동력(activity)과 안정성(stability)을 유지시켜야 하기 때문에 나노 입자가 분산되어 있는 용액은 수용액이 바람직하며, 그 형태도 구형이 가장 적합하다.
액상에서 금 나노 입자를 제조하는 방법에는 템플릿(templet)을 이용하지 않고 고온의 조건에서 금속염을 환원시키는 방법과, 템플릿을 이용하여 상온에서 합성하는 방법이 있다. 템플릿을 이용하지 않는 방법은 용매에 금속염을 녹인 후 끓는점 이상에서 강한 교반(stirring) 조건에서 citrate 등의 강한 환원제를 첨가하여 금속 나노 입자를 얻는다.
또 다른 방법으로 금 나노 입자 형성 시 열역학적으로 불안정한 상태를 극복하기 위해 표면 안정제나 템플릿을 사용하기도 한다. 경우에 따라 중형기공 알루미나와 실리카, 탄소 나노 튜브(CNT) 등의 하드 템플릿(hard templet)과 계면활성제(surfactant)와 같은 소프트 템플릿(soft templet)을 사용한다. 템플릿을 이용하여 나노 입자를 제조하는 방법에는 seed와 growth solution을 이용하는 seed-mediated 방법과 polyol process 등이 있다.
이러한 나노 입자 제조방법 중에서 본 발명의 바이오센서를 이용하기 위하여 템플릿을 이용하지 않는 citrate 환원방법을 이용하는 것이 바람직하다. 그 이유는 제조방법이 비교적 간단하며, 본 발명에서 활용하는 구형 나노 입자의 크기 조절이 용이하기 때문이다. 또한 제조 방법과 환경이 조악(harsh)하지 않아 변성에 민감한 생체분자와의 접합(conjugation)이 용이하기 때문이다.
또한 본 발명의 나노 입자 크기는 3 nm 내지 100 nm 이하인 것이 바람직하다. 그 이유는, 상기 범위를 벗어날 경우 제조 방법이 어려울 뿐만 아니라, 국소 표면 플라즈몬 흡수 현상이 민감하게 일어나지 않아 대상 시료를 정밀하게 검출할 수 없어 바이오센서로 활용하기에 적합하지 않은 문제점이 있기 때문이다.
한편 본 발명에서는 발명의 목적에 맞게 응집된 단백질을 검출하기 위하여 신경퇴행성 질병중의 하나인 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis, 이하 ALS라고 한다.)의 발병과 관련 있는 Superoxie dismutase(SOD)라는 생체 분자의 응집을 검출하였다.
SOD 는 생체 안에서 해로운 활성 산소를 과산화수소(H2O2)나 산소로 전환시키는 효소(enzyme)이다. 근래에 이 단백질이 루게릭 병(lou gehrig disease)을 일으키는 경로와 매우 밀접한 관계에 있는 단백질로 밝혀지면서 병으로 발전되는 다양한 경로들에 대한 가설과 실재하는 메커니즘 들이 밝혀지고 있다. 그 중에서도 특히 단백질의 응집(aggregation)은 질병과 직결되는 핵심 과정으로 판단되어, 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
그 증거로서, 첫째, 단백질의 응집(aggregation)은 SOD 의 활성 사이트(active site) 주변에 있는 2차 구조에 손상을 주어 효소의 역할을 방해하는 작용을 한다고 알려져 있으며, 둘째, 응집(aggregation)으로 인한 단백질 변형(misfolding)으로 고유의 효소 기능을 잃게 되며, 셋째, 응집(aggregation) 자체로도 해로운 물질을 발생시켜 운동 뉴런을 선택적으로 파괴한다고 알려져 있다. 따라서 본 발명의 바이오센서를 이용하여 SOD의 응집체(aggregates)를 검출하고자 하였다.
한편 본 발명의 바이오센서 제조 방법은 상기 금 나노 입자의 제조 방법에 따라 제조된, 수용액 상에서 일정한 크기를 가지고 균일하게 분포하고 있는 나노 입자에 대상 검출 시료인 SOD 단백질의 단량체(monomer)를 공유 결합을 이용하여 접합(conjugation)시켰다.
접합 시키는 방법은 SOD 단백질 monomer에는 노출된 시스테인 기(Cystein group)가 존재하며, 여기에 티올 기(-SH)로 구성되어 있기 때문에 도 1(B)단계의 1단계에서 보는 바와 같이 전 처리 과정 없이도 잘 정돈된 표면구조의 금 나노 입자 표면에 자기조립 단분자층 형성이 용이하다.
구체적으로 나노 입자에 접합시키기 위한 단백질 단량체의 농도는 0.01 내지 10 mg/ml이며, 접합 반응 시간은 2시간 내지 24시간이 바람직하다. 그 이유는, 단량체의 농도가 0.01 mg/ml 이하인 경우에는 용액 속에 분산되어 있는 단량체의 수가 너무 적기 때문에 접합이 잘 일어나지 않게 되고, 10 mg/ml 이상인 경우에는 반대로 단량체의 수가 너무 많아 나노 입자 표면에 단분자층 형성이 어렵게 되기 때문이다.
또한 접합 반응시간이 2시간 미만일 경우에는 나노 입자 표면에 자기조립을 위한 공유결합 형성 시간이 매우 부족하며, 24시간 이상으로 지연될 경우에는 단량체가 다층으로 쌓여 검출 효율이 급격하게 떨어질 우려가 있다.
이러한 접합 방법은 대부분의 생체분자 단백질에 티올 기가 포함되어 있으므로 본 발명에서 사용한 SOD 단백질뿐만 아니라, 다른 단백질과의 접합 방법에도 널리 이용할 수 있다.
이렇게 형성된 본 발명의 바이오센서를 이용하여 단백질 응집체를 검출한다면, 단백질 응집체가 금 나노 입자 표면에 고정되어 있는 단량체와 만나면서 특이한 상호작용(specific interaction)을 하여 또 다른 응집 단계를 유발하므로, 도 1(B)의 2단계에서 보는바와 같이 단백질 응집체를 중심으로 단량체가 고정된 금 나노 입자가 서로 가까이 모이게 되고, 금 나노 입자의 응집(aggregation)이 유도된다.
금 나노 입자의 응집으로 나노 입자 사이의 간격이 가까워지므로, 이는 나노 입자 표면의 유전률의 변화를 유발하며, 결국 국소 표면 플라즈몬(LSP) 흡수 조건이 바뀌게 되어 가시광선 하에서 나노 입자 용액 자체의 색이 변하게 된다. 즉 나노 입자의 간격이 가까워지면서 광의 흡수 파장이 적색 전이(red-shift)가 발생하여 원래의 붉은 색에서 반응이 진행됨에 따라 점점 푸른색으로 변하게 된다.
이러한 바이오센서 용액의 색변화는 단백질 응집체가 클수록, 즉 오랜 주수동안 응집을 유도한 시료일수록 보라색을 거쳐 완전한 푸른색으로 변하게 된다. 이러한 색 변화는 사람의 눈으로도 명확히 구별되므로, 별도의 분석 장치 없이도 단백질의 응집체를 검출할 수 있으며, 정량적인 분석을 위해서는 UV-visible 장치(spectroscopy)를 통하여 쉽게 측정할 수 있다.
본 발명의 바이오센서는 SOD 단백질 이외에도 생체 내에서 질병을 유발시키는 경로(pathology)와 관련된 다른 종들의 응집체 검출에도 활용이 가능하다. 아밀로이드 형태로 변화되어 질병을 유발하는 단백질에는 SOD 이외에도 Amyloid β(Aβ), α-synuclein, prion 등이 있으며, 이들 중에서 선택된 하나의 종을 나노 입 자에 접합(conjugation)시켜 동일한 종의 단백질 응집체(aggregates)를 검출하는 데 이용할 수 있다.
따라서 본 발명의 바이오센서를 이용한다면, SOD 단백질뿐만 아니라 생체 내에서 단백질 응집으로 질병을 유발시키는 다른 생체 분자에 대해서도 그 단량체를 나노 입자에 접합시켜 적용이 가능하므로, 단순하고 쉬운 방법으로 진단을 위한 그 활용이 매우 높을 것이다.
이하 바람직한 제조 예와 실시 예를 들어 도면과 함께 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 하기 제조 예와 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지, 이들만으로 한정하는 것은 아니다.
[제조예 1]
20 nm 크기의 구형 금 나노 입자 용액 150 ml를 제조하기 위하여, 전구체 hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate (HAuCl4 ,3H2O, Aldrich) 와 환원제 sodium citrate (Na3C6H5O7,2H2O, Mallinckrodt) 의 stock solution 을 초순수를 용매로 하여 각각 0.05 g/㎖ 와 0.01 g/㎖ 의 농도로 준비하였다.
준비된 HAuCl4 의 stock solution 0.2 ㎖ 를 200 ㎖ 초순수에 희석시켜 질량비율 0.005% 의 HAuCl4 수용액을 준비한 후, 환류냉각기에 연결된 플라스크에서 150℃로 가열하면서 강하게 교반(stirring)시켰다. 수용액이 끓기 시작하면 준비된 sodium citrate 의 stock solution 1.53 ㎖를 첨가하여 가열 및 교반(stirring)을 계속 해주고, 수분 뒤 용액의 색이 옅은 노란색에서 회색으로 변하기 시작하면 가 열을 중지하고 상온에서 하루 동안 냉각시켰다.
[제조예 2]
검출하고자 하는 대상 시료 샘플을 만들기 위하여, 미리 정제된 human wild type SOD 단백질을 phosphate-buffered silane(이하 PBS라고 한다.) 버퍼(buffer, pH=5.4)용액에 0.1 mg/ml의 농도로 10 ml 준비하였다. 이 용액에 TFE용액을 2 ml 첨가하여 한 달 동안 상온에서 보관한 후 2주, 3주, 4주 간격으로 각각 채취하여 대상 시료로 사용하였다.
[제조예 3]
본 발명의 바이오센서를 제조하기 위하여 상기 제조예 1에서 만들어진 금 나노 입자 용액 1 ml에, human wild type SOD 단백질을 monomer 상태로 PBS 버퍼(pH=7.0)에 0.1 mg/ml 농도로 희석시킨 용액 200 μl을 첨가하여 금 나노 입자 표면에 15시간 동안 자기조립 시켰다.
[실시예 1]
상기 제조예 3에서 제조된 본 발명의 바이오센서를 이용하여 상기 제조예 2에서 제조된 2주된 대상 시료 80 μl를 첨가하여 금 나노 입자 용액의 색변화를 관찰하였으며, UV-vis 분석 장치를 이용하여 10분 간격으로 50분 동안 파장의 변이를 실시간으로 측정하였다. 그 결과는 도 2와 같다.
[실시예 2]
상기 제조예 2에서 3주된 대상 시료를 검출 용액으로 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 같은 방법으로 실시하였으며, 그 결과는 도 3과 같다.
[실시예 3]
상기 제조예 2에서 4주된 대상 시료를 검출 용액으로 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 같은 방법으로 실시하였으며, 그 결과는 도 4와 같다.
도 2는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 바이오센서를 사용하여 2주 된 대상 시료를 10분 간격으로 50분간 측정한 결과를 나타내는 실시간 그래프, 도 3은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 바이오센서를 사용하여 3주 된 대상 시료를 10분 간격으로 50분간 측정한 결과를 나타내는 실시간 그래프, 및 도 4는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 바이오센서를 사용하여 4주 된 대상 시료를 10분 간격으로 50분간 측정한 결과를 나타내는 실시간 그래프이다.
도 2 내지 4에서 도시된 바와 같이, 본 발명의 바이오센서를 사용하여 SOD 응집체(aggregates)를 검출하였을 때, 530 nm 근처에서 나타나는 금 나노 입자의 표면 플라즈몬 픽(SP peak)이 변화됨을 알 수 있다. 즉 530 nm 근처에서 나타나는 SP 픽이 점차 낮아지면서, 680 nm 근처에서 새로운 픽이 형성되고 있다.
구체적으로, 샘플링(sampling)한 SOD 응집체(aggregates)샘플의 주수가 오래 될수록 표면 플라즈몬 픽(SP peak)은 점차 넓어지면서(broadening) 사라지고, 대신 680nm 근처에서 longitudinal SP 픽(peak)이 새롭게 생성됨을 보이고 있다.
이는 본 발명의 바이오센서 용액의 색이 SOD 응집체(aggregates)와 특이한 상호작용을 갖고 반응하면서 붉은 색에서 점차 푸른색으로 변화됨을 나타내고 있다. 그 이유는 금 나노 입자를 포함하는 본 바이오센서가 대상 시료와 반응하면서 서로 모여 용액 상의 금 나노 입자의 간격이 가까워져 라드(rod) 형태로 군 집(cluster)을 이루기 때문이다.
또한 그 반응 시간은 50분 동안 평형에 도달하였으며, 동일한 반응 시간동안 각각 다른 날짜의 샘플을 검출하였을 때, longitudinal SP 픽(peak)이 서로 다른 진행 정도를 나타내므로, SOD 응집체가 자라나는 정도를 소량의 샘플링(sampling)으로 빠르고 쉽게 측정할 수 있었다.
이러한 표면 플라즈몬 픽의 변화(530 nm 파장에서의 Extinction 변화)를 대상 시료인 SOD 응집체 샘플 별로 정량적으로 나타내면 하기 표 1과 같다.
[표 1]
Figure 112008022680550-pat00001
상기 표 1에서 보는 바와 같이, 본 발명의 바이오센서를 이용하여 각각의 대상 시료 별로 표면 플라즈몬 픽의 변화를 정량화 할 수 있으며, 이러한 결과를 바탕으로 단백질의 응집체가 어느 정도 또는 어느 시간동안 자라고 있는지에 대하여 구조적 진화 상태를 측정할 수 있게 된다.
도 5는 본래의 나노 입자 용액(1)과, 본 발명의 바이오센서를 사용하여 2주(2), 3주(3), 4주(4)된 대상 시료를 50분간 검출한 후 변화된 나노 입자 용액의 색변화를 나타낸 사진이다.
도 5에 도시된 바와 같이 상기 과정을 통하여 얻은 결과를 바탕으로 본 발명의 바이오센서 용액의 최종 색변화는 눈으로 쉽게 확인이 가능하다. 즉 단백질의 응집체의 진행 정도가 작을 때에는 본래 금 나노 입자의 용액 색인 붉은색(1)에서 약간 변화한 와인 색(2)을 띄다가 진행 정도가 3주가 되면 푸른색(3), 4주가 되면 진한 남색(4)으로 변하게 된다.
따라서 금 나노 입자를 이용한 본 발명의 바이오센서는 기존의 장비가 측정하지 못한 단백질의 응집 정도를 매우 정밀하고 빠르게 측정하여 정량화가 가능하며, 바이오센서의 용액 자체가 대상 시료를 검출함에 따라 색이 변하므로 나노 기술을 기반으로 한 의료, 보건 등의 분야에서 소규모 센서로서 간편하게 이용할 수 있는 매우 큰 장점이 있다.
본 발명에 의한 단백질 응집체 검출용 바이오센서는 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 다양한 형태로 변형, 응용이 가능하며 상기 바람직한 실시 예에 한정되지 않는다. 상술한 실시 예에서는 human wild type SOD를 예시하였으나, 본 발명의 기술적 사상의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니며, 생체 내에서 응집을 유발하는 단백질이라면 실시 예와는 달리 다양한 대상 시료에 대해서도 적응이 가능하며, 금 나노 입자의 재료나 농도, 형태, 크기의 변형도 본 발명의 단순한 변형에 지나지 않는다고 볼 것이다.
이상에서 설명한 본 발명은, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하므로 상기 실시 예 및 첨부된 도면에 한정되는 것이 아님은 물론이며, 후술하는 청구 범위뿐만 아니라 청구 범위와 균등 범위를 포함하여 판단되어야 한다.
본 발명에 의하면 측정하고자 하는 시료와 특이적 결합을 유도하는 기능기를 포함하고, 국소 표면 플라즈몬 공명(localized surface plasmon) 흡수 현상을 유도하는 복수의 나노 입자를 포함하는 용액으로서, 병의 발병과 관련 있는 생체 분자의 응집 정도를 매우 간편하고 정밀하게 측정하게 되어 의료 보건 분야에서 진단용 키트(kit)로서 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 바이오센서의 제조방법과 대상 시료 제조 방법을 나타내는 개략도,
도 2는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 바이오센서를 사용하여 2주 된 대상 시료를 10분 간격으로 50분간 측정한 결과를 나타내는 실시간 그래프,
도 3은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 바이오센서를 사용하여 3주 된 대상 시료를 10분 간격으로 50분간 측정한 결과를 나타내는 실시간 그래프,
도 4는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 바이오센서를 사용하여 4주 된 대상 시료를 10분 간격으로 50분간 측정한 결과를 나타내는 실시간 그래프, 및
도 5는 본래의 나노 입자 용액(1)과, 본 발명의 바이오센서를 사용하여 2주(2), 3주(3), 4주(4)된 대상 시료를 50분간 검출한 후 변화된 나노 입자 용액의 색변화를 나타낸 사진이다.

Claims (6)

  1. 생체 내에서 응집현상(aggregation)을 유발하는 단백질과 특이적 결합을 유도하는 동일한 단백질의 단량체(monomer)와 접합(conjugation)되고 국소 표면 플라즈몬 공명(localized surface plasmon) 흡수 현상을 유도하는 복수의 나노 입자를 포함하는 용액으로 구성되며,
    상기 응집현상을 유발하는 단백질 시료가 첨가되면 국소 표면 플라즈몬 공명현상의 광 특성이 변화되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 단백질의 단량체(monomer)는 Amyloid β(Aβ), Superoxide dismutase(SOD), α-synuclein, Prion 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되어진 하나의 종으로써, 상기 나노 입자에 접합시켜 선택된 종과 동일한 단백질의 응집체(aggregates)를 측정하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 나노 입자는 국소 표면 플라즈몬 공명 흡수 현상을 유도하는 금, 은, 구리 및 알루미늄으로 이루어진 그룹에서 선택되어진 물질로 형성되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 나노 입자는 그 크기가 3 내지 100 나노미터인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 나노 입자는 그 형태가 구형인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007304003A (ja) * 2006-05-12 2007-11-22 Canon Inc 化学センサ素子及びその製造方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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