KR100954887B1 - Dendritic cells matured by uncarinic acid c, compositions for immunotherapy containing the dendritic cells, and methods for preparing mature dendritic cells using uncarinic acid c - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 세포 면역치료(cellular immunotherapy)에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유효성분으로서, 운카린산 C(uncarinic acid C)에 의해 성숙화된 수지상세포(dendrictic cells), 이를 함유하는 면역치료용 조성물, 및 운카린산 C를 이용한 성숙 수지상세포의 제조 방법에 관한 것이다.The present invention relates to cellular immunotherapy, and more particularly, as an active ingredient, dendrictic cells matured by uncarinic acid C, an immunotherapeutic composition containing the same, And it relates to a method for producing mature dendritic cells using Uncaric acid C.
수지상세포(DC; dendritic cells)는 주요 항원제시 세포(APC; antigen presenting cells)로 여겨지고 있으며, 그의 주된 기능은 미생물 구조를 확인하고 림프절에서 이들을 숫 T 세포(naive T cells)에게 제시하는 것이다. DC는 숫 CD4 T 세포의 Th1, Th2, Treg 세포 및 Th17 세포와 같은 헬퍼 T 세포로의 분화를 자극함으로써 다양한 면역반응을 지휘한다. 초기 T 세포 자극 시 DC에 의해 분비되는 사이토카인(cytokines)은 잇따른 효과기 T 세포의 분화에서 중요한 역할을 한다. Th1 세포는, 인터페론 감마(IFN-γ) 생산을 통해, 항원 제시 및 세포내 병원체에 대한 면역성을 조절하며, Th2 세포는 IL-4 및 IL-13을 생산하여 특정 체액성 반응 및 기생체에 대한 면역성을 매개한다. Th17 세포는 자가면역 및 조직 염증에서 전염증성 역할을 하는 최근에 확인된 Th-세포 계통을 포함한다. 비록 상이한 DC 서브셋이 Th1, Th2, Treg 세포 또는 Th17 세포를 우세하게 유도하는 어느 정도 내재적인 잠재력을 가질 수 있지만, DC는 또한 미생물 및 국소적 미세환경으로부터의 신호에 반응하여 상당한 기능적 유연성을 나타낸다.Dendritic cells (DCs) are thought to be major antigen presenting cells (APCs), whose main function is to identify microbial structures and present them to naive T cells in lymph nodes. DCs direct various immune responses by stimulating differentiation of male CD4 T cells into helper T cells such as Th1, Th2, Treg cells and Th17 cells. Cytokines secreted by DC during initial T cell stimulation play an important role in the differentiation of subsequent effector T cells. Th1 cells, via interferon gamma (IFN-γ) production, regulate antigen presentation and immunity to intracellular pathogens, and Th2 cells produce IL-4 and IL-13 to produce specific humoral responses and parasites. Mediates immunity. Th17 cells include a recently identified Th-cell lineage that plays a proinflammatory role in autoimmune and tissue inflammation. Although different DC subsets may have some inherent potential to predominantly induce Th1, Th2, Treg cells or Th17 cells, DCs also exhibit significant functional flexibility in response to signals from microorganisms and local microenvironments.
DC 성숙을 유도하는 여러 물질이 보고되어 있으며 알려진 DC 성숙 자극제는 CD40 리간드(CD40-L), LPS(lipopolysaccharide) 및 TNF-α를 포함한다. 생체 내 및 시험관 내 모두에서 면역반응 동안 존재하는 사이토카인이 Th1, Th2, Treg 세포 또는 Th17 세포에 대한 반응을 지시하는데 중요한 요소임이 잘 알려져 있다. 일부 보고는 기생체에 의해 생산된 지질과 같은 외부 인자가 숙주 면역성을 기피하기 위한 목적으로 DC 기능을 조절할 수 있음을 입증하였다.Several substances that induce DC maturation have been reported and known DC maturation stimulants include CD40 ligand (CD40-L), lipopolysaccharide (LPS) and TNF-α. It is well known that cytokines present during immune responses both in vivo and in vitro are important factors in directing responses to Th1, Th2, Treg cells or Th17 cells. Some reports have demonstrated that external factors, such as lipids produced by parasites, can modulate DC function for the purpose of avoiding host immunity.
DC 연구의 중요한 목적은 종양, 감염성 물질 또는 자가면역 질환에 대한 면역반응을 증진시키기 위한 DC-기초한 전략의 개발이다. 최근에, DC는 종양을 치료하기 위한 많은 임상적 면역치료 프로토콜에서 사용되어 오고 있다. 지금까지, DC를 이용한 임상시험에 따르면 아주 강한 임상적 효과는 아닐지라도 임상 면역치료에서 DC가 병증의 진전에 기여하는 것으로 보인다. 따라서, DC의 분화, 성숙 및 기능에 영향을 미칠 수 있는 인자를 확인하는 것이 중요하다.An important goal of DC research is the development of DC-based strategies for enhancing immune responses to tumors, infectious agents or autoimmune diseases. Recently, DC has been used in many clinical immunotherapy protocols for treating tumors. To date, clinical trials using DC appear to contribute to the development of the condition in clinical immunotherapy, although not a very strong clinical effect. Therefore, it is important to identify factors that may affect the differentiation, maturation and function of DC.
본 발명자들은 최근에 일부 터펜(terpenes)이 인간 단구세포(monocytes)로부 터 DC를 유도하고 Th1, Th2 또는 IL-10-생산 Treg 세포를 유도하는 것을 보고하였다(Takei, M. et al. (2005) Epicubenol and Ferruginol induce DC from human monocytes and differentiate IL-10-producing regulatory T cells in vitro. Biochem. Biophy. Res. Commun. 337, 730-738; Takei, M. et al. (2006) T-cadinol and calamenene induce dendritic cells from human monoctytes and drive Th1 polarization. Eur. J. Pharmacol. 537, 190-199; Takei, M. et al. (2007) Diterpenes inhibit IL-12 production by DC and enhance Th2 cells polarization. Biochem. Biophy. Res. Commun. 355, 603-610; Takei, M. et al. (2008) Diterpene, 16-phyllocladanol enhances Th1 polarization induced by LPS-primed DC, but not TNF-α-primed DC. Biochem. Biophy. Res. Commun. 370, 6-10).We have recently reported that some terpenes induce DC from human monocytes and induce Th1, Th2 or IL-10-producing Treg cells (Takei, M. et al. (2005) ) Epicubenol and Ferruginol induce DC from human monocytes and differentiate IL-10-producing regulatory T cells in vitro.Biochem.Biophy.Res.Commun.337, 730-738; Takei, M. et al. (2006) T-cadinol and calamenene induce dendritic cells from human monoctytes and drive Th1 polarization.Eur. J. Pharmacol. 537, 190-199; Takei, M. et al. (2007) Diterpenes inhibit IL-12 production by DC and enhance Th2 cells polarization.Biochem. Res. Commun. 355, 603-610; Takei, M. et al. (2008) Diterpene, 16-phyllocladanol enhances Th1 polarization induced by LPS-primed DC, but not TNF-α-primed DC.Biochem. Res. Commun. 370, 6-10).
하기 화학식 1의, 3β-하이드록시-27-(E)-페룰로일옥시우르스-12-엔-28-오산(3β-Hydroxy-27-(E)-feruloyloxyurs-12-en-28-oic acid), 즉 운카린산 C(uncarinic acid C)는 운카리아 린코필라(Uncaria rhynchophylla)로부터 분리되며 식물화학적으로 트리터펜(triterpenes)으로 분류된다.3β-Hydroxy-27- (E) -feruloyloxyurs-12-en-28-oic acid of
트리터펜은 다양한 생물학적 활성을 갖는 독특한 클래스의 천연산물로 확인되었다. 많은 알칼로이드가 운카리아 속으로부터의 항고혈압 주성분으로 보고되어 있다. 운카린산 C는 포스포리파제 Cγ1(PLCγ1)에 대해 강력한 억제 활성을 나타내고 고용량에서 암세포의 성장을 억제하는 것으로 보고되었다(Lee, J. S., Kim, J., Kim, B. Y., Lrr, H. S., Ahn, J. S., Chang, Y. S. (2000) Inhibition of phospholipase Cγ1 and cancer cell proliferation by triterpene esters from Uncaria rhynchophylla. J. Nat. Prod. 63, 753-756.). 그러나 운카린산 C가 수지상세포의 분화 및 기능에 미치는 영향에 대해서는 기재되거나 암시되지 않았다.Triterpenes have been identified as a unique class of natural products with various biological activities. Many alkaloids have been reported as antihypertensive active ingredients from the genus Uncaria. Uncarinic acid C has been shown to exhibit potent inhibitory activity against phospholipase Cγ1 (PLCγ1) and to inhibit cancer cell growth at high doses (Lee, JS, Kim, J., Kim, BY, Lrr, HS, Ahn, JS, Chang, YS (2000) Inhibition of phospholipase Cγ1 and cancer cell proliferation by triterpene esters from Uncaria rhynchophylla. J. Nat. Prod. 63, 753-756.). However, the effects of uncarinic acid C on the differentiation and function of dendritic cells are not described or implied.
상기한 바와 같이, 비록 일부 터펜 화합물이 약리 활성을 가질 수 있는 것으로 보고되어 있었으나, 운카린산 C가 T 세포에 대해 고도로 전문적인 APC인 수지상세포의 분화 및 기능에 영향을 미칠 수 있음에 대해서는 전혀 알려져 있지 않았다.As mentioned above, although some terpene compounds have been reported to have pharmacological activity, there is no indication that uncarinic acid C may affect the differentiation and function of dendritic cells, a highly specialized APC for T cells. Not known.
본 발명자들은 수지상세포가 운카린산 C에 대한 잠재적 표적일 수 있음에 착안하고, 인간 DC 분화 및 기능에 대한 운카린산 C의 능력에 대한 연구를 행하였다. 그 결과, 운카린산 C가 수지상세포의 분화 및 기능에 영향을 미침을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.The inventors have noted that dendritic cells may be potential targets for uncarinic acid C and have studied the ability of uncarinic acid C to human DC differentiation and function. As a result, it was confirmed that Uncarinic acid C affects the differentiation and function of dendritic cells, and came to complete the present invention.
따라서, 본 발명의 목적은 운카린산 C에 의해 성숙화되어, 숫 T 세포의 Th1 세포로의 분화를 증진시키고 항원 특이적 세포독성 T 세포를 발달시켜 표적세포 특이적인 반응을 유도하는, 수지상세포를 제공하기 위한 것이다.Therefore, it is an object of the present invention to mature dendritic cells, which promote the differentiation of male T cells into Th1 cells and develop antigen specific cytotoxic T cells to induce target cell specific responses. It is to provide.
본 발명의 다른 목적은 상기 수지상세포, 이에 의해 분화된 T 세포, 또는 이에 의해 생산된 사이토카인을 함유하는 면역치료용, 특히 종양, 감염성 질환 또는 자가면역 질환을 예방 또는 치료하기 위한 면역치료용 조성물을 제공하기 위한 것이다.Another object of the present invention is an immunotherapeutic composition containing the dendritic cells, thereby differentiated T cells, or cytokines produced therein, in particular for immunotherapy compositions for preventing or treating tumors, infectious diseases or autoimmune diseases. It is to provide.
본 발명의 또 다른 목적은 미성숙 수지상세포에 운카린산 C를 가하여 성숙 수지상세포를 제조하는 방법을 제공하기 위한 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method for preparing mature dendritic cells by adding uncarinic acid C to immature dendritic cells.
본 발명의 제1면은 운카린산 C에 의해 성숙화되어, 숫 T 세포의 Th1 세포로의 분화를 증진시키고 항원 특이적 세포독성 T 세포를 발달시켜 표적세포 특이적인 반응을 유도하는, 수지상세포에 관한 것이다. 운카린산 C에 의해 성숙화된 수지상세포는 미성숙 수지상세포에 운카린산 C를 가한 후 배양하여 얻어질 수 있다. 운카린산 C는 0.01 내지 10 μM의 농도로 가하는 것이 바람직하다.The first aspect of the present invention is directed to dendritic cells, which are matured by uncarinic acid C, which promote differentiation of male T cells into Th1 cells and develop antigen specific cytotoxic T cells to induce target cell specific responses. It is about. Dendritic cells matured by uncarinic acid C can be obtained by adding uncarinic acid C to immature dendritic cells and then culturing. Uncarinic acid C is preferably added at a concentration of 0.01 to 10 μM.
본 발명의 제2면은 유효성분으로서, 상기 수지상세포, 이에 의해 분화된 T 세포 또는 이에 의해 생산된 사이토카인을 함유하는, 면역치료용 조성물에 관한 것이다. 본 조성물은 종양, 감염성 질환 또는 자가면역 질환을 예방 또는 치료하기 위한 것일 수 있다. The second aspect of the present invention relates to an immunotherapeutic composition containing the dendritic cells, thereby differentiated T cells or cytokines produced by the active ingredient. The composition may be for preventing or treating a tumor, infectious disease or autoimmune disease.
본 발명의 제3면은The third aspect of the present invention
미성숙 수지상세포에 운카린산 C를 가하고;Adding uncarinic acid C to immature dendritic cells;
상기 세포를 배양하는:Incubating the cells:
단계를 포함하는, 성숙 수지상세포의 제조 방법에 관한 것이다. 운카린산 C 는 0.01 내지 10 μM의 농도로 가하는 것이 바람직하다.It relates to a method for producing mature dendritic cells, comprising the step. Uncarinic acid C is preferably added at a concentration of 0.01 to 10 µM.
본 발명에서는 운카린산 C가 GM-CSF 및 IL-4와 함께 인간 단구세포로부터 미성숙 DC의 성숙 DC로 분화를 조절하고 숫 T 세포의 Th1 타입으로의 분화를 증진시키는 한편, 항원 특이적 세포독성 T 세포를 발달시켜 표적세포 특이적인 반응을 유도함을 입증하였다. 비록 DC 기능에 대한 운카린산 C의 영향을 초래하는 분자적 현상은 규명되어야 하겠지만, DC는 운카린산 C의 잠재적 표적이다. 운카린산 C에 의해 성숙화된 DC는 항종양 면역치료 등의 세포 면역치료제로서 사용하기 위한, 잠재적 후보가 될 수 있다.Uncarinic acid C, together with GM-CSF and IL-4, regulates the differentiation of immature DCs from mature monocytes to mature DCs and enhances the differentiation of male T cells into Th1 type, while antigen-specific cytotoxicity. It was demonstrated that T cells were developed to induce target cell specific responses. Although the molecular phenomena that lead to the effect of Uncarinic Acid C on DC function must be identified, DC is a potential target of Uncaric Acid C. DCs matured by uncarinic acid C may be potential candidates for use as cellular immunotherapeutic agents, such as antitumor immunotherapy.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
운카린산 C는 운카리아 린코필라(Uncaria rhynchophylla)로부터 분리된 트리터펜으로 약리학적 활성 물질이다. 수지상 세포(dendritic cells, DC)는 숫 T 세포에게 항원을 제시하고, Th1/Th2/Th3/Treg 균형을 조절하고, 수많은 조절성 사이토카인 및 케모카인을 생산하고, 생존 면역 효과기를 조절함으로써 면역반응을 조절하는데 중추적인 역할을 한다. 운카린산 C는 표현형 및 기능적 성숙, 및 변형된 사이토카인 생산에 의해 나타나는 바와 같이 인간 DC를 활성화시키는 것으로 입증되었다. 운카린산 C에 의해 성숙화된 DC에 대한 평균 형광 강도(MFI)에 의해 표현되는 CD1a, CD80, CD83, CD86, HLA-DR 및 CCR7의 발현수준은 증가하였다. CD40 리간드(ligand)를 발현하는 J558로 자극한 후 운카린산 C에 의해 성숙화된 DC에 의한 IL-12p40 및 IL-12p70의 생산은 미성숙 DC 또는 TNF-α에 의해 성숙화된 DC의 것에 비해 높았다. 1:1 DC/T 세포 비율로 동종이계(allogenic) 운카린산 C-성숙화 DC와 공동-배양된 숫 T 세포는 IL-12 분비에 의존하여 대량의 인터페론-감마(IFN-γ)를 생산하고 소량의 IL-4 및 IL-13을 방출하는 Th1 세포로 전환하였다. CTL 분석에서, 운카린산 C-성숙화된 DC에 대한 DNA 단편화 및 51Cr 방출은 미성숙 DC 또는 TNF-α-성숙화된 DC의 것에 비해 보다 강화되었다. 운카린산 C-성숙화된 DC는 CCL19를 향해 이동하였다. 이들 결과는 운카린산 C가 Th1 세포 편향화(polarization)를 선호하는 방식으로 인간 DC 기능을 조절하며 생산된 DC가 세포독성 T 세포의 표적세포 특이적인 반응을 유도한다는 것을 의미하는 것이다.Uncaric acid C is a triterpene isolated from Uncaria rhynchophylla and is a pharmacologically active substance. Dendritic cells (DC) respond to immune responses by presenting antigens to male T cells, regulating Th1 / Th2 / Th3 / Treg balance, producing numerous regulatory cytokines and chemokines, and regulating survival immune effectors. It plays a pivotal role in regulation. Uncarinic acid C has been demonstrated to activate human DCs as indicated by phenotypic and functional maturation, and modified cytokine production. The expression levels of CDla, CD80, CD83, CD86, HLA-DR and CCR7, expressed by mean fluorescence intensity (MFI) against DCs matured by uncarinic acid C, increased. Production of IL-12p40 and IL-12p70 by DCs matured by Uncarinic Acid C after stimulation with J558 expressing CD40 ligand was higher than that of immature DCs or DCs matured by TNF-α. Male T cells co-cultured with allogenic uncarinic acid C-matured DC at a 1: 1 DC / T cell ratio produce large amounts of interferon-gamma (IFN-γ) depending on IL-12 secretion. Switched to Th1 cells releasing small amounts of IL-4 and IL-13. In CTL analysis, DNA fragmentation and 51 Cr release for uncarinic acid C-matured DCs were more potent compared to that of immature DCs or TNF-α-matured DCs. Uncarinic acid C-matured DCs migrated towards CCL19. These results indicate that Uncarinic Acid C regulates human DC function in a manner that favors Th1 cell polarization and that the produced DCs induce target cell specific responses of cytotoxic T cells.
운카린산 C-성숙화된 수지상세포는 수지상세포를 이용한 면역치료 등 공지의 방법에 따라 환자의 생체 내로 주입될 수 있는데, 바람직하게는 피하 또는 정맥 주사 등의 방법으로 적용될 수 있다. 또한, 종양 주위 또는 종양 내로 직접 주사하는 방법도 시도될 수 있다.Uncarinic acid C-matured dendritic cells may be injected into a patient's body according to a known method such as immunotherapy using dendritic cells, preferably by subcutaneous or intravenous injection. In addition, methods of injecting directly into or around the tumor may also be attempted.
이러한 세포 치료법은 환자의 자가 세포 또는 동종이계로부터 세포를 추출하고 대량 배양하여 강력한 면역 증강 효과가 있는 수지상세포로 만든 후 이 세포가 항원을 탐식할 수 있는 기회를 준다. 상기 과정에서 수지상세포의 면역 증강력을 높이기 위해 방사선 조사 또는 자외선 조사로 약화시킨 암세포 또는 기 확립된 동종이계 세포주를 직접 수지상세포와 함께 배양하거나, 항암제와 같은 세포 독성 물질이나 반복적인 냉동-해동 과정을 통해 암세포를 사멸시킨 후 이 분해물(lysate) 을 수지상세포에 처리하여 감작(pulse)시킬 수도 있다. 그 외의 방법으로 암세포의 DNA, RNA, 단백질 또는 펩타이드를 수지상세포의 감작을 위한 항원으로 사용할 수 있다. 이와 같이 항원으로 감작된 수지상세포는 이를 환자에게 직접 주사하거나, 상기 수지상세포를 환자의 혈액에서 추출한 T 세포와 반응시켜 직접 암 살해 세포를 만든 후 활성화된 T 세포를 환자에게 주사할 수도 있다.These cell therapies extract cells from the patient's autologous cells or allogeneic cells and mass cultivate them into dendritic cells with potent immune enhancing effects, giving them the opportunity to phagocytize antigens. In this process, cancer cells or previously established allogeneic cell lines weakened by irradiation or UV irradiation may be directly incubated with dendritic cells, or cytotoxic substances such as anticancer agents or repeated freeze-thaw processes to increase the immune-enhancing capacity of the dendritic cells. After killing the cancer cells through this lysate (lysate) may be treated by dendritic cells (pulse). Alternatively, DNA, RNA, proteins or peptides of cancer cells can be used as antigens for sensitization of dendritic cells. The dendritic cells sensitized with the antigen may be injected directly into the patient, or the dendritic cells may be directly reacted with T cells extracted from the patient's blood to make cancer killing cells and then injected into the patient with activated T cells.
특히, 환자 자신의 말초혈액 단구세포를 분리하여 이로부터 강력한 면역 반응 유발능을 갖는 수지상세포를 대량으로 증식 분화시킨 후, 이를 다시 환자의 체내로 주입하여 면역 반응을 일으키는 경우, 면역 거부 반응 등의 문제점을 해결할 수 있다. 또한, 반복적인 주사를 요하는 사이토카인에 의한 치료와는 달리 세포 자체를 주입하여 계속적으로 사이토카인을 생산할 수 있다는 장점을 갖는다. 나아가 수지상세포를 공지의 유전 공학적 방법을 통해 면역 거부 반응을 최소화하거나 성장 인자 유전자를 도입하여 과발현시키는 등의 조작을 수행할 수도 있다.In particular, when the patient's own peripheral blood mononuclear cells are isolated and proliferated and differentiated in large quantities from dendritic cells having a strong immune response-inducing ability, and then injected into the body of the patient to cause an immune response, The problem can be solved. In addition, unlike treatment with cytokines, which require repeated injections, cells have the advantage of continuously producing cytokines by injecting the cells themselves. Furthermore, dendritic cells may be manipulated by minimizing immune rejection or overexpressing a growth factor gene through known genetic engineering methods.
본 발명에 따른 면역치료용 조성물은 T 세포 증식 유도 활성으로 인해 일반적인 면역 증강 효과는 물론 특정 항원으로 인한 질병에 대하여 강력한 세포성 면역 반응을 유도할 수 있으며, IFN-γ를 대량생산하므로 항암 및 항바이러스 치료에도 효과적으로 적용될 수 있다.The immunotherapeutic composition according to the present invention can induce a strong cellular immune response against diseases caused by specific antigens as well as general immune enhancing effects due to T cell proliferation inducing activity, and because it mass-produces IFN-γ anticancer and anti It can also be applied effectively to viral treatment.
본 발명에 있어서, 운카린산 C-성숙화된 수지상세포의 1회 투여량은 1×106 내지 1×107, 특히 3×106 세포수인 것이 바람직하지만, 이는 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여 경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자를 고려하여 증감할 수 있다.In the present invention, the single dose of uncarinic acid C-matured dendritic cells is preferably 1 × 10 6 to 1 × 10 7 , in particular 3 × 10 6 cells, but this may be due to the disease, Various related factors such as severity, route of administration, patient's weight, age and gender may be taken into consideration.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하나, 이들은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 식으로든지 제한하고자 하는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples, but these are merely to aid the understanding of the present invention and are not intended to limit the scope of the present invention in any way.
배양 배지, 시약 및 단클론 항체Culture medium, reagents and monoclonal antibodies
본 실시예에서 사용된 배양 배지는 10% FBS(Fetal Bovine Serum) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640(Gibco-BRL)이었다. 재조합 인간 IL-4(IL-4), 재조합 인간 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF)는 R&D systems(미네소타)로부터 구입하였다. 플로우 사이토메트리(flow cytometry)를 위하여, 하기 항원에 대한 단클론 항체(mAbs)를 Becton-Dickinson(캘리포니아)으로부터 구입하였다: 항-CD14-FITC(형광 이소티오시아네이트), 항-CD1a-PE(피코에리쓰린), 항-CD40-FITC, 항-CD54-PE, 항-80-PE, 항-CD83-PE, 항-CD86-PE, 항-HLA-DR-FI, 및 항-CCR-7. 모든 물질에서 내독소 수준은 1.0 EU/㎖ 미만이었다.The culture medium used in this example was RPMI 1640 (Gibco-BRL) containing 10% Fetal Bovine Serum (FBS) and 1% penicillin-streptomycin. Recombinant human IL-4 (IL-4), recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) were purchased from R & D systems (Minnesota). For flow cytometry, monoclonal antibodies (mAbs) against the following antigens were purchased from Becton-Dickinson (California): anti-CD14-FITC (fluorescent isothiocyanate), anti-CD1a-PE ( Phycoerythrin), anti-CD40-FITC, anti-CD54-PE, anti-80-PE, anti-CD83-PE, anti-CD86-PE, anti-HLA-DR-FI, and anti-CCR-7. Endotoxin levels in all materials were below 1.0 EU / ml.
통계학적 분석Statistical analysis
결과의 통계학적 분석은 ANOVA에 의해 수행하였다. 차이는 p값이 0.05 미만일 때 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다.Statistical analysis of the results was performed by ANOVA. The difference was considered statistically significant when the p value was less than 0.05.
실시예 1: 운카리아 린코필라로부터 운카린산 C의 분리Example 1 Separation of Uncarinic Acid C from Uncaria Lincopila
운카린산 C를 문헌 [Lee, J. S. et al. (2000) Inhibition of phospholipase Cγ1 and cancer cell proliferation by triterpene esters from Uncaria rhynchophylla. J. Nat. Prod. 63, 753-756]에 기재된 바와 같이 준비하였다. 운카린산 C의 순도는 >99%였다. 운카린산 C를 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹였다. 배양배지에서 디메틸설폭사이드의 농도는 0.1%였으며, 이것은 본 실시예에서 사용된 조건 하에서 배양 및 사이토카인의 생산에 영향을 미치지 않는다. 운카린산 C의 내독소는 엔드 트랩 5/1(End Trap 5/1)(Profos AG, 독일)을 사용하여 제거하였다. LPS 농도는 분석의 검출한계(<0.05 EU/㎖) 미만이었다.Uncarinic acid C is described by Lee, JS et al. (2000) Inhibition of phospholipase Cγ1 and cancer cell proliferation by triterpene esters from Uncaria rhynchophylla. J. Nat. Prod. 63, 753-756. Uncarinic acid C had a purity of> 99%. Uncarinic acid C was dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO). The concentration of dimethylsulfoxide in the culture medium was 0.1%, which did not affect the culture and production of cytokines under the conditions used in this example. Endotoxin of uncarinic acid C was removed using
실시예 2: 단구세포에서 유래된 DC의 생성Example 2: Generation of DCs Derived from Monocytes
모든 세포들은 정상적인 건강한 공여자의 인간 말초혈액으로부터 분리하였다. 먼저 말초혈액 단핵구세포(PBMC)를 피콜-하이팩(Ficoll-Hypaque)(1.077 g/㎖)(Pharmacia, 독일) 밀도 구배 원심분리(465 g, 30 분, 22 ℃)에 의해 헤파린 처리된 전혈로부터 분리하였다. PBMC를 제조자의 지시(Miltenyi Biotec, 캘리포니아)에 따라 자기 활성화 세포 분류기(MACS)를 이용하여 CD14+ 단구세포로 분리하였다. CD14+ 단구세포의 순도는 임상적으로 이용이 허용된 순수도인 90%를 항상 초과하였다. 단구세포를 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640에서 6 일간 GM-CSF(50 ng/㎖) 및 IL-4(25 ng/㎖)와 함께 배양하였다. 매 2 일마다 배지에 사이토카인을 공급하였다. 미성숙 DC를 다양한 농도의 운카린산 C 및 TNF-α(50 ng/㎖)와 함께 추가 2 일 동안 GM-CSF 및 IL-4를 함유하는 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 함유 RPMI 1640에서 자극함으로써 DC를 생성시켰다. 모든 후속 시험은 8 일째에 세포를 수획하고 강한 세척에 의해 GM-CSF, IL-4, 운카린산 C 또는 TNF-α를 제거한 후 수행하였다. 운카린산 C- 또는 TNF-α-성숙화된 DC에 의한 IL-6, IL-10, IL-12p40 및 IL-12p70의 생산을 측정하기 위하여, DC(2×104 세포/웰)를 24 시간 동안 CD40 리간드를 발현하는 J558 세포(5×104 세포/웰)로 자극하였다. 무세포 상등액을 모으고 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 이용하여 사이토카인을 측정할 때까지 -20 ℃에서 동결하였다.All cells were isolated from human peripheral blood of normal healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were first isolated from heparinized whole blood by Ficoll-Hypaque (1.077 g / ml) (Pharmacia, Germany) density gradient centrifugation (465 g, 30 minutes, 22 ° C.). It was. PBMCs were isolated into CD14 + monocytes using a magnetic activated cell sorter (MACS) according to the manufacturer's instructions (Miltenyi Biotec, Calif.). The purity of CD14 + monocytes was always above 90%, which is clinically acceptable purity. Monocytes were incubated with GM-CSF (50 ng / ml) and IL-4 (25 ng / ml) for 6 days in RPMI 1640 containing 10% FBS and 1% penicillin-streptomycin. Cytokines were fed to the medium every 2 days. Immature DCs with RPMC 1640 containing 10% FBS and 1% penicillin-streptomycin containing GM-CSF and IL-4 for an additional 2 days with various concentrations of uncarinic acid C and TNF-α (50 ng / ml) DC was generated by stimulation. All subsequent tests were performed after 8 days of cell harvest and removal of GM-CSF, IL-4, Uncarinic Acid C or TNF-α by strong washing. To measure production of IL-6, IL-10, IL-12p40 and IL-12p70 by uncarinic acid C- or TNF-α-matured DCs, DC (2 × 10 4 cells / well) was added for 24 hours. Stimulated with J558 cells (5 × 10 4 cells / well) expressing CD40 ligand. Cell-free supernatants were pooled and frozen at −20 ° C. until cytokines were measured using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
실시예 3: 면역표현형 연구Example 3: Immunophenotyping Studies
이중-색상 면역형광 플로우 사이토메트리를 하기 패널의 단클론 항체를 이용하여 수행하였다: PE-포접된 항인간 CD1a, FITC-포접된 항인간 CD14, FITC-포접된 항인간 CD40, PE-포접된 항인간 CD54, PE-항인간 CD80, PE-항인간 CD83, PE-항인간 CD86, FITC-HLA-DR 및 FITC-CCR-7. 음성 대조군(negative control)은 관련이 없는 단클론 항체(Becton-Dickinson)와 이소타입 매치하였다. 세포를 PBS 및 0.1% NaN3를 함유하는 염색 배지에 재현탁한 후 1.0% 파라포름알데히드로 고정하였다. 이소타입 대조군을 병행하여 시험하였다. 세포 찌꺼기를 포워드 앤드 사이드 스캐터 게이팅(forward and side scatter gating)에 의해 제거하였다. 샘플을 셀퀘스트 소프트웨어(CellQuest software) (Becton-Dickinson)를 구비한 팩스칼리버 (FACSCalibur)(Becton-Dickinson)에서 분석하였다. 샘플당 만개의 세포를 분석하였다. 결과를 평균 형광 강도(MFI)로 나타내었다.Dual-color immunofluorescence flow cytometry was performed using the following panels of monoclonal antibodies: PE-enveloped antihuman CD1a, FITC-enveloped antihuman CD14, FITC-enveloped antihuman CD40, PE-enveloped anti Human CD54, PE-antihuman CD80, PE-antihuman CD83, PE-antihuman CD86, FITC-HLA-DR and FITC-CCR-7. Negative control isotype matched with an unrelated monoclonal antibody (Becton-Dickinson). The cells were resuspended in staining medium containing PBS and 0.1% NaN 3 and fixed with 1.0% paraformaldehyde. Isotype control was tested in parallel. Cell debris was removed by forward and side scatter gating. Samples were analyzed on a FACSCalibur (Becton-Dickinson) with CellQuest software (Becton-Dickinson). Ten thousand cells were analyzed per sample. The results are expressed as mean fluorescence intensity (MFI).
그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 운카린산 C에 대한 MFI에 의해 나타내어지는 CD1a, CD40, CD54, CD80, CD83, CD86 및 HLA-DR의 발현수준은 용량-의존적 방식으로 증가하였다. 0.001 μM 및 100 μM의 운카린산 C에서 세포의 생존도는 각각 90% 및 55%였다. 이들 결과로부터, 후속 실험을 위해 운카린산 C의 농도를 0.01-10 μM로 사용하였다. 양성 대조군(positive control)으로서, 인간 단구세포를 6 일간 GM-CSF 및 IL-4와 함께, 이어서 또다른 2 일간 TNF-α 존재 하에 배양하였다. TNF-α는 공지의 DC 성숙-증진 인자이다. TNF-α(25 ng/㎖)-성숙화된 DC에 대한 MFI에 의해 나타내어지는 CD1a, CD40, CD54, CD80, CD83, CD86 및 HLA-DR의 발현수준은 운카린산 C-성숙화된 DC 보다 높았다. 이 양상은 운카린산 C-성숙화된 DC의 것과 동일하였다. 한편, 운카린산 C-성숙화된 DC에 대한 MFI에 의해 나타내어지는 CCR-7의 발현수준은 미성숙 DC 및 TNF-α-성숙화된 DC에 비해 증가되었다. 대조로서, 인간 단구세포를 8 일간 GM-CSF 및 IL-4와 함께 배양함으로써 미성숙 DC(배지로)를 생성시켰다. 8 일에 MFI에 의해 나타내어지는 CD14의 발현수준은 낮거나 검출 불가능하였다.The results are shown in FIG. As shown in FIG. 1, the expression levels of CD1a, CD40, CD54, CD80, CD83, CD86 and HLA-DR represented by MFI for uncarinic acid C were increased in a dose-dependent manner. The viability of the cells at 0.001 μM and 100 μM uncarinic acid C was 90% and 55%, respectively. From these results, the concentration of uncarinic acid C was used at 0.01-10 μM for subsequent experiments. As a positive control, human monocytes were incubated with GM-CSF and IL-4 for 6 days, followed by another 2 days in the presence of TNF-α. TNF-α is a known DC maturation-promoting factor. The expression levels of CD1a, CD40, CD54, CD80, CD83, CD86 and HLA-DR represented by MFI for TNF-α (25 ng / ml) -matured DCs were higher than uncarinic acid C-matured DCs. This aspect was identical to that of the uncarinic acid C-matured DCs. On the other hand, the expression level of CCR-7, represented by MFI for uncarinic acid C-matured DCs, was increased compared to immature DCs and TNF-α-matured DCs. As a control, immature DCs (in medium) were generated by incubating human monocytes with GM-CSF and IL-4 for 8 days. At 8 days, the expression level of CD14 represented by MFI was low or undetectable.
실시예 4: 운카린산 C-성숙화된 DC가 IL-6, IL-10, IL-12p40 및 IL-12p70의 생산에 미치는 영향Example 4 Effect of Uncarinic Acid C-Matured DC on Production of IL-6, IL-10, IL-12p40 and IL-12p70
DC는 전문적이고 효과적인 APC이고 그들의 면역조절성 및 전염증성 사이토카 인 분비는 T 세포 성숙화 동안 결정적 역할을 하므로, 인간 단구세포-유래 DC에 의한 사이토카인 생산이 운카린산 C에 의해 영향을 받는지 여부를 조사하였다. IL-6는 전염증 및 면역 반응의 유도에서 결정적 역할을 하는 광범위한 생물학적 활성의 중요한 매개자이다. IL-10은 DC의 보조적 기능에 대해 저해 효과를 나타내는 것으로 알려져 있는 다면발현성 사이토카인이고, 다양한 세팅에서 지나치게 병리적인 Th1 또는 Th2 반응을 방지하는데 중심적 역할을 하는 것으로 보인다. 반대로, 숫 T 세포의 활성화 동안 골수 DC에 의한 IL-12 생산 수준은 Th1 세포의 발생을 유도하는 주요 인자이다. 따라서, 본 실시예에서는 24 시간 동안 CD40 리간드를 발현하는 J558에 의한 자극 후 미성숙 DC(배지로) 및 상기 인자 존재 하에 2 일간 성숙된 DC에서 IL-6, IL-10, IL-12p40 및 IL-12p70 생산을 조사하였다.DC is a professional and effective APC and their immunoregulatory and proinflammatory cytokine secretion plays a decisive role during T cell maturation, so whether cytokine production by human monocyte-derived DCs is affected by uncarinic acid C Was investigated. IL-6 is an important mediator of a wide range of biological activities that play a decisive role in the induction of pro-inflammatory and immune responses. IL-10 is a pleiotropic cytokine known to have an inhibitory effect on the adjuvant function of DC and appears to play a central role in preventing too pathological Th1 or Th2 responses in various settings. In contrast, the level of IL-12 production by bone marrow DCs during activation of male T cells is a major factor inducing the development of Th1 cells. Thus, in this Example, IL-6, IL-10, IL-12p40 and IL- in immature DCs (in medium) and DCs matured for 2 days in the presence of the factor after stimulation with J558 expressing CD40 ligand for 24 hours. 12p70 production was investigated.
미성숙 DC를 TNF-α(50 ng/㎖), 운카린산 C(0.01-10 μM)로 자극하여 DC를 생성시켰다. 세포(4×104 세포/웰)를 CD40 리간드를 발현하는 J558 세포로 24 시간 동안 자극하였다. 24 시간 후, 배양 상등액에서 IL-12p40, IL-12p70, IL-10 및 IL-6를 ELISA에 의해 측정하였다.Immature DCs were stimulated with TNF-α (50 ng / ml) and uncarinic acid C (0.01-10 μM) to generate DCs. Cells (4 × 10 4 cells / well) were stimulated for 24 hours with J558 cells expressing CD40 ligand. After 24 hours, IL-12p40, IL-12p70, IL-10 and IL-6 in culture supernatants were measured by ELISA.
그 결과를 도 2a 내지 도 2d(2a: IL-12p40, 2b: IL-12p70, 2c: IL-10, 2d: IL-6)에 나타내었다. 대조 조건(J558과 공동배양하지 않은 배지) 하에서 DC는 자발적으로 낮은 수준의 IL-6(46±9.1 pg/㎖), IL-10(3.1±0.9 pg/㎖), IL-12p40(85.6±6.8 pg/㎖) 및 IL-12p70(24.2±4.8 pg/㎖)을 생산하였다. CD40 리간드를 발현하는 J558으로 자극시, 미성숙 DC 및 TNF-α-성숙화된 DC에 비교하였을 때, IL-12p40 및 p70 생산은 0.1 μM의 운카린산 C에서 주요하게 증가 하였다(도 2a 및 b). 한편, 미성숙 DC 및 TNF-α-성숙화된 DC에서, CD40 리간드를 발현하는 J558로의 자극 후 IL-6, IL-10, IL-12p40 및 IL-12p70의 생산은 0.1 μM의 운카린산 C에 의해 성숙화된 DC와 비교되었을 때 더 낮거나 단지 검출 가능할 뿐이었다(도 2a, 2b, 2c 및 2d).The results are shown in Figures 2a to 2d (2a: IL-12p40, 2b: IL-12p70, 2c: IL-10, 2d: IL-6). Under control conditions (medium not co-cultured with J558), DCs spontaneously showed low levels of IL-6 (46 ± 9.1 pg / ml), IL-10 (3.1 ± 0.9 pg / ml), IL-12p40 (85.6 ± 6.8 pg / ml) and IL-12p70 (24.2 ± 4.8 pg / ml). Upon stimulation with J558 expressing CD40 ligand, IL-12p40 and p70 production were significantly increased at 0.1 μM of uncarinic acid C as compared to immature DCs and TNF-α-matured DCs (FIGS. 2A and B). . On the other hand, in immature DCs and TNF-α-matured DCs, production of IL-6, IL-10, IL-12p40 and IL-12p70 after stimulation with J558 expressing CD40 ligand was induced by 0.1 μM uncarinic acid C. It was lower or only detectable when compared to matured DC (FIGS. 2A, 2B, 2C and 2D).
실시예 5: 동종이계 혼합 림프구 반응(Allogenic Mixed Lymphocytes Reaction; Allo MLR)Example 5: Allogenic Mixed Lymphocytes Reaction (Allo MLR)
동종이계 혼합 림프구 반응 분석을 위해 CD3+ T 세포를 자기 세포 분류 및 생분자 분리(MACS) 비드(Miltenyi Biotec)를 이용하여 동종이계 PBMC로부터 얻었다. 분리된 세포의 순도는 팩스칼리버를 이용한 플로우 사이토메트리에 의해 측정 시 CD3+ T 세포 >95%였다. 동종이계 CD3+ T 세포(2×104 세포/웰)를 등급화된 용량(2×102 내지 2×104)의 방사선 조사된(25 Gy) DC와 함께 96-웰 환저 배양 플레이트에서 공동배양하였다. 5일 후, 세포를 18 시간 동안 웰당 1 μCi [3H]-메틸티미딘으로 펄스한 후, 수획하여 액체섬광계수기에서 분석하였다.CD3 + T cells were obtained from allogeneic PBMCs using magnetic cell sorting and biomolecule separation (MACS) beads (Miltenyi Biotec) for allogeneic mixed lymphocyte response analysis. Purity of the isolated cells was determined by flow cytometry using a faxcaliber CD3 + T cells> 95%. Allogeneic CD3 + T cells (2 × 10 4 cells / well) were co-cultured in 96-well round bottom culture plates with graded doses (2 × 10 2 to 2 × 10 4 ) of irradiated (25 Gy) DC It was. After 5 days, cells were pulsed with 1 μCi [ 3 H] -methylthymidine per well for 18 hours, then harvested and analyzed in a liquid scintillation counter.
그 결과를 도 3에 나타내었다. 동종이계 T 세포 증식을 유도하는 능력은 시험관 내에서 DC의 기능적 특징이다. 동종이계 MLR에서 DC의 동종이계 자극 능력을 분석할 때, 표면 마커 발현 변화가 또한 기능적 수준에서 반영되었다. 운카린산 C-성숙화된 DC와 함께 T 세포의 공동-배양은 T 세포 증식을 증진시켰다. 운카린산 C-성숙화된 DC에 대한 동종이계 MLR에서의 효율은 용량-의존적 방식으로 증가하였다(0.01-0.1 μM). 운카린산 C-성숙화된 DC는 동종이계 MLR에서 미성숙 DC 및 TNF-α-성숙화된 DC에 비해 더 높은 자극 효율을 나타내었다. T 세포의 운카린산 C-성숙화된 DC와의 공동배양은 또한 T 세포 증식을 증가시키며, 이것은 운카린산 C가 동종이계 MLR에서 DC의 항원-제시 활성을 강화시킴을 시사한다.The results are shown in FIG. The ability to induce allogeneic T cell proliferation is a functional feature of DC in vitro. When analyzing the allogeneic stimulating ability of DC in allogeneic MLR, surface marker expression changes were also reflected at the functional level. Co-culture of T cells with uncarinic acid C-matured DCs enhanced T cell proliferation. The efficiency in allogeneic MLR for uncarinic acid C-matured DCs increased in a dose-dependent manner (0.01-0.1 μM). Uncarinic acid C-matured DCs showed higher stimulation efficiency in allogeneic MLR compared to immature DCs and TNF-α-matured DCs. Co-culture of T cells with uncarinic acid C-matured DCs also increases T cell proliferation, suggesting that uncarinic acid C enhances antigen-presenting activity of DCs in allogeneic MLR.
실시예 6: 운카린산 C-성숙화된 DC가 숫 T 세포의 Th1 세포로의 분화에 미치는 영향Example 6 Effect of Uncarinic Acid C-Matured DC on Differentiation of Male T Cells into Th1 Cells
다음으로 상이한 조건 하에서 성숙된 DC에 의한 Th 효과기 세포 분화 유도를 평가하였다. 이 목적을 위하여, 문헌 [Takei, M. et al. (2006) T-cadinol and calamenene induce dendritic cells from human monoctytes and drive Th1 polarization. Eur. J. Pharmacol. 537, 190-199]에 기재된 바와 같이, DC에 의한 숫 T 세포 편향화의 측정을 수행하였다. 간략하게는, 숫 CD4+ CD45RA+ CD45RO- T 세포를 MACS 비드(Miltenyi Biotec)를 이용하여 동종이계 PBMC로부터 분리하였다. 팩스캘리버를 이용한 플로우 사이토메트리에 의해 측정된 바, 분리된 세포의 순도는 CD4+ CD45RA+ CD45RO- T 세포 >95%였다. DC를 96-웰 U-바닥 조직 배양 플레이트에서 1:1 DC/T 세포 비율에서 숫 T 세포(2×104 세포/200 ㎕)와 공동배양하였다. 5일째에, 세포를 완전히 세정하고 3 ng/㎖ rIL-2(R&D Systems)를 함유하는 신선한 배지로 확장시켰다. 100 ㎕의 배양 상등액을 매 3 일마다 동일한 농도의 신선한 배지로 교체하였다. 8-10 일째에, 세포를 세척하고, 계수하여 T 세포를 24 시간 동안 다이나비즈 CD3/CD28 T 세포 익스팬더(Dynabeads CD3/CD28 T cell expander)(1 ㎕; Invitrogen)로 재자극하였다. 무세포 상등액을 모으고 ELISA를 이용하여 사이토카인을 측정할 때까지 -20 ℃에서 동결하였다. 대조군으로, 미성숙 DC를 사용하였다. 배양 상등액에서 IFN-γ, IL-4, IL-13 및 IL-10을 ELISA에 의해 측정하였다.Next, the induction of Th effector cell differentiation by mature DC under different conditions was evaluated. For this purpose, Takei, M. et al. (2006) T-cadinol and calamenene induce dendritic cells from human monoctytes and drive Th1 polarization. Eur. J. Pharmacol. 537, 190-199, measurement of male T cell bias by DC was performed. Briefly, male CD4 + CD45RA + CD45RO- T cells were isolated from allogeneic PBMCs using MACS beads (Miltenyi Biotec). Purity of the isolated cells was> 95% CD4 + CD45RA + CD45RO− T cells, as measured by flow cytometry using a faxcaliber. DCs were co-cultured with male T cells (2 × 10 4 cells / 200 μl) at a ratio of 1: 1 DC / T cells in 96-well U-bottom tissue culture plates. On
한편, 문헌 [Takei, M. et al. (2005) Epicubenol and Ferruginol induce DC from human monocytes and differentiate IL-10-producing regulatory T cells in vitro. Biochem. Biophy. Res. Commun. 337, 730-738]에 기재된 방법에 따라, 수획된 T 세포의 세포 내 사이토카인 농도를 FACS 분석에 의해 측정하였다. 간략하게는, T 세포(106/㎖)를 37 ℃, 5% CO2에서 5 시간 동안 포볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)(10 ng/㎖) 및 아이오노마이신(1 ㎍/㎖)으로 자극하였다. 인큐베이션의 마지막 2 시간 동안 브레펠딘 A(10 ㎍/㎖)를 가하여 사이토카인 분비를 방해하였다. 세포를 모으고, 1% 파라포름알데히드로 고정하고, 상업적 용액(Beckman Coulter)으로 투과화시켜 FITC-표지 항-IFN-γ 및 PE-표지 항-IL-4 mAbs로 염색하였다.Meanwhile, Takei, M. et al. (2005) Epicubenol and Ferruginol induce DC from human monocytes and differentiate IL-10-producing regulatory T cells in vitro. Biochem. Biophy. Res. Commun. 337, 730-738, intracellular cytokine concentrations of harvested T cells were measured by FACS analysis. Briefly, T cells (10 6 / ml) were stimulated with pobol myristate acetate (PMA) (10 ng / ml) and ionomycin (1 μg / ml) for 5 hours at 37 ° C., 5% CO 2 . . Brefeldin A (10 μg / ml) was added during the last 2 hours of incubation to disrupt cytokine secretion. Cells were collected, fixed with 1% paraformaldehyde, permeabilized with a commercial solution (Beckman Coulter) and stained with FITC-labeled anti-IFN-γ and PE-labeled anti-IL-4 mAbs.
그 결과를 도 4에 나타내었다(4a: IFN-γ, 4b: IL-13, 4c: IL-4, 4d: IL-10). 1:1 DC/T 세포 비율로 공동-배양된 동종이계 운카린산 C- 또는 TNF-α-성숙화된 DC는 측정가능한 양의 IFN-γ를 분비하지만, IL-4와 IL-13은 거의 분비하지 않았다. DC는 공동배양된 0.1 mM의 운카린산 C로 분화되고 숫 T 세포는 다량의 IFN-γ를 생산하는 전형적인 Th1 세포로 전환되었다. 한편, 미성숙 DC와 함께 공동-배양된 숫 T 세포에 의한 IFN-γ, IL-4 및 IL-10 생산은 더 낮았다.The results are shown in FIG. 4 (4a: IFN-γ, 4b: IL-13, 4c: IL-4, 4d: IL-10). Allogeneic uncarinic acid C- or TNF-α-matured DCs co-cultured at a 1: 1 DC / T cell ratio secrete measurable amounts of IFN-γ, while IL-4 and IL-13 secrete almost Did not do it. DCs were differentiated into co-cultured 0.1 mM uncarinic acid C and male T cells were converted to typical Th1 cells producing large amounts of IFN-γ. On the other hand, IFN-γ, IL-4 and IL-10 production by lower T cells co-cultured with immature DCs was lower.
운카린산 C- 및 TNF-α-성숙화된 DC는 DC/T 세포(1:1)에서 숫 T 세포의 Th1 반응으로의 분화를 유도하였다. 사이토카인(IFN-γ 및 IL-4)에서 6-8 일 확장시킨 후, PMA 및 아이오노마이신(ionomycin)으로 5 시간 재자극한 후 농도를 측정하였다. 그 결과를 도 4e에 나타내었다. 도 4e에 나타난 바와 같이, 운카린산 C-성숙화된 DC는 IL-4 보다 더 많은 IFN-γ 생산 세포를 유도하였다.Uncarinic acid C- and TNF-α-matured DCs induced differentiation of male T cells into Th1 responses in DC / T cells (1: 1). After expansion for 6-8 days in cytokines (IFN-γ and IL-4), concentrations were measured after 5 hours restimulation with PMA and ionomycin. The results are shown in Figure 4e. As shown in FIG. 4E, uncarinic acid C-matured DC induced more IFN-γ producing cells than IL-4.
실시예 7: 세포독성 T-림프구(CTL), DNA 단편화 및 Example 7: Cytotoxic T-lymphocytes (CTL), DNA Fragmentation and 5151 Cr 방출 분석Cr emission analysis
(1) CTL 유도 (1) CTL derivation
문헌 [Takei, M. et al. (2004) Dendritic cells maturation promoted by M1 and M4, end products of steroidal ginseng saponins metabolized in digestive tracts, drive a potent Th1 polarization. Biochemi. Pharmacol. 68, 441-452]에 기재된 방법에 따라, CTL 분석을 수행하였다. 간략하게는, HLA-A0201+ 공여자의 단구세포로부터 배양된 DC(2×105)에 37 ℃ 5% CO2에서 2 시간 동안 20 ㎍/㎖ WT-1 펩티드를 로딩하였다. WT-1 펩티드는 HLA-A0201에 결합할 수 있다. 24 웰 플레이트에서, 자가 CD8+ T 세포를 10 ng/㎖ IL-2 및 5 ng/㎖ IL-7을 함유하는 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 함유 배지(RPMI1640:AIM-V=1:1) 2 ㎖에서 10 일간 DC와 5:1로 공동배양하였다. 10 일 후, CD8+ T 세포를 WT-1 펩티드가 로딩된 방사선조사된(25 Gy) 자가 단구세포(2:1)로 재자극한 후 세포를 10 ng/㎖ IL-2 및 5 ng/㎖ IL-7을 함유하는 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 함유 배지 2 ㎖에서 추가로 10 일간 배양하였다. T2 세포(HLA-A0201+)를 표적 세포로 이용하고, T2 세포에 5×105 세포/㎖ 농도로 20 ㎍/㎖의 WT-1 펩티드 또는 HIV-1 펩티드를 로딩하고 37 ℃ 5% CO2에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다.Takei, M. et al. (2004) Dendritic cells maturation promoted by M1 and M4, end products of steroidal ginseng saponins metabolized in digestive tracts, drive a potent Th1 polarization. Biochemi. Pharmacol. 68, 441-452, according to the method described in the CTL analysis. Briefly, DC (2 × 10 5 ) cultured from monocytes of HLA-A0201 + donors were loaded with 20 μg / ml WT-1 peptide for 2 hours at 37 ° C. 5% CO 2 . The WT-1 peptide may bind to HLA-A0201. In 24-well plates, autologous CD8 + T cells were cultured with 10% FBS and 1% penicillin-streptomycin containing 10 ng / ml IL-2 and 5 ng / ml IL-7 (RPMI1640: AIM-V = 1: 1 ) Was incubated with DC at 5: 1 for 10 days in 2 ml. After 10 days, CD8 + T cells were re-stimulated with irradiated (25 Gy) autologous monocytes (2: 1) loaded with WT-1 peptide and the cells were then 10 ng / ml IL-2 and 5 ng / ml IL Incubated for 10 additional days in 2 ml of 10% FBS containing -7 and 1% penicillin-streptomycin-containing medium. Using T2 cells (HLA-A0201 +) as target cells, T2 cells were loaded with 20 μg / ml WT-1 peptide or HIV-1 peptide at a concentration of 5 × 10 5 cells / ml and loaded at 37 ° C. 5% CO 2 . Incubate for 2 hours.
(2) DNA 단편화 분석 (2) DNA fragmentation analysis
표적-유도된 CTL 세포사멸(apoptosis)을 분석하기 위하여, 8 h [3H]-메틸티미딘 DNA 단편화(JAM) 분석을 수행하였다. CTL을 IL-2 부재 하에 분석 18 시간 전에 106 세포당 5 μCi의 [3H]-메틸티미딘으로 표지하고 종양 세포에 대한 표적으로 사용하였다. CTL(3×104 세포/웰)을 다양한 종양 대 CTL 비율로 8 시간 동안 37 ℃ 5% CO2에서 종양 세포(T2)와 공동배양한 후 수획하고 액체섬광계수기(Beckman)에서 분석하였다. 결과는 하기 식을 이용하여 무처리 대조와 비교한 cpm에 있어서의 퍼센트 감소에 기초한 DNA 단편화의 퍼센트로서 나타내었다:To analyze target-induced CTL apoptosis, an 8 h [ 3 H] -methylthymidine DNA fragmentation (JAM) assay was performed. CTLs were labeled with 5 μCi [ 3 H] -methylthymidine per 10 6 cells 18 hours prior to analysis in the absence of IL-2 and used as targets for tumor cells. CTLs (3 × 10 4 cells / well) were harvested and co-cultured with tumor cells (T2) at 37 ° C. 5% CO 2 for 8 hours at various tumor-to-CTL ratios and analyzed in a liquid scintillation counter (Beckman). Results are expressed as percent of DNA fragmentation based on percent reduction in cpm compared to untreated control using the following formula:
% DNA 단편화 = (대조 cpm - 샘플 cpm/대조 cpm) ×100.% DNA fragmentation = (control cpm-sample cpm / control cpm) × 100.
분석을 3회 수행하였다.The analysis was performed three times.
(3) 51 Cr 방출 분석 (3) 51 Cr emission analysis
문헌 [Nakano, M. et al. (1998) A gene encoding antigen peptides of human sequamous cell carcinoma recognized by cytotoxic T lymphocytes. J. Exp. Med. 187, 277-283]에 기재된 방법에 따라, 51Cr 방출 분석을 수행하였다. 간략하게는, 효과기 세포를 다양한 효과기 대 표적 세포 비율로 6 시간 동안 51Cr 표지된 표적 세포(1×104)와 함께 배양한 후, 상등액을 수획하여 자동 감마 계수기를 이용하여 방사성을 측정하였다. 이 분석은 3회 수행하였다.Nakano, M. et al. (1998) A gene encoding antigen peptides of human sequamous cell carcinoma recognized by cytotoxic T lymphocytes. J. Exp. Med. 51 Cr release assay was performed according to the method described in 187, 277-283. Briefly, effector cells were incubated with 51 Cr labeled target cells (1 × 10 4 ) for 6 hours at various effector to target cell ratios, followed by harvesting the supernatant and measuring radioactivity using an automatic gamma counter. This analysis was performed three times.
(4) 결과 (4) results
운카린산 C(0.1 μM) 또는 TNF-α로 분화된 DC에 의해 나타나는 자가 CD8+ T 세포의 CTL 반응을 비교하였다. 그 결과를 도 5a 내지 5c에 나타내었다(5a: 미성숙 DC, 5b: TNF-α-성숙화된 DC, 5c: 운카린산 C-성숙화된 DC). 종양 세포에 의한 CTL 세포사멸을 측정하는 8 h JAM 분석에서, WT-1 펩티드로 로딩된 T2 세포는 WT-1 펩티드로 펄스된 운카린산 C-성숙화된 DC로 생성된 CTL의 DNA 단편화를 강력하게 유도하였다. DNA 단편화 백분율은 증가된 수의 CTL 세포에 의존적이었다. 유사한 결과가 표적 세포의 용해를 측정하는 51Cr 방출 분석으로 얻어졌다(도 6a 내지 6c, 6a: 미성숙 DC, 6b: TNF-α-성숙화된 DC, 6c: 운카린산 C-성숙화된 DC). 한편, JAM 분석에서의 DNA 단편화 백분율 및 51Cr 방출은 HIV-1 펩티드(무관련 펩티드) 및 펩티드가 없는 T2를 표적 세포로 하였을 때(음성 대조군) 낮거나 검출 불가능하였다. The CTL responses of autologous CD8 + T cells exhibited by DC differentiated with uncarinic acid C (0.1 μM) or TNF-α were compared. The results are shown in FIGS. 5A-5C (5a: immature DC, 5b: TNF-α-matured DC, 5c: uncarinic acid C-matured DC). In an 8 h JAM assay measuring CTL apoptosis by tumor cells, T2 cells loaded with WT-1 peptides potentiated DNA fragmentation of CTLs generated with uncarinic acid C-matured DC pulsed with WT-1 peptides. Induced. The percentage of DNA fragmentation was dependent on the increased number of CTL cells. Similar results were obtained with a 51 Cr release assay measuring lysis of target cells (FIGS. 6A-6C, 6A: immature DC, 6b: TNF-α-matured DC, 6c: uncarinic acid C-matured DC). On the other hand, DNA fragmentation percentage and 51 Cr release in JAM analysis were low or undetectable when using HIV-1 peptide (unrelated peptide) and peptide-free T2 as target cells (negative control).
실시예 8: 화학주성Example 8: Chemotaxis
케모카인 수용체의 발현과 특이적 화학주성 자극에 반응하여 이동하는 능력은 DC의 활성화/분화 동안 차등적으로 조절되고 그들 기능의 이용에서 중요한 역할을 한다는 것이 잘 보고되어 있다. 따라서 운카린산 C-프라임된 DC의 발현이 CCR7 리간드 CCL19에 반응하여 이동하는 그들의 능력과 상호관련되어 있는지 여부를 조사하였다.It is well reported that the expression of chemokine receptors and the ability to migrate in response to specific chemotactic stimuli are differentially regulated during activation / differentiation of DC and play an important role in the use of their function. Therefore, it was investigated whether the expression of uncarinic acid C-primed DCs correlated with their ability to migrate in response to the CCR7 ligand CCL19.
문헌 [Takei, M. et al. (2006) T-cadinol and calamenene induce dendritic cells from human monoctytes and drive Th1 polarization. Eur. J. Pharmacol. 537, 190-199]에 기재된 바와 같이, DC 이동을 24-웰 트랜스웰 세포 배양 챔버(5-㎛ 포어; Costar)에서 수행하였다. 간략하게는, 105 세포를 세척하고, 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지에 현탁하고 상부 챔버 구획에 로딩하였다. CCL4(0.5 ㎍/㎖; Peprotech), CCL19(0.5 ㎍/㎖; Peprotech) 또는 케모카인 없는 음성대조군은 하부 구획에 첨가하였다. 37 ℃에서 4 시간 인큐베이션한 후, 8 ㎛ 포어 크기 폴리카보네이트 필터를 통해 하부 구획으로 이동한 세포를 모으고 계수하였다.Takei, M. et al. (2006) T-cadinol and calamenene induce dendritic cells from human monoctytes and drive Th1 polarization. Eur. J. Pharmacol. 537, 190-199, DC migration was performed in a 24-well transwell cell culture chamber (5-μm pore; Costar). Briefly, 10 5 cells were washed, suspended in RPMI 1640 medium containing 10% FBS and loaded into the upper chamber compartment. CCL4 (0.5 μg / ml; Peprotech), CCL19 (0.5 μg / ml; Peprotech) or chemokine free negative control was added to the lower compartment. After 4 hours incubation at 37 ° C., the cells migrated to the lower compartment through an 8 μm pore size polycarbonate filter were collected and counted.
그 결과를 표 1에 나타내었다.The results are shown in Table 1.
예상한 바와 같이, 운카린산 C-프라임된 DC는 CCL19 쪽으로 이동하였고 TNF-α-프라임된 DC 보다 더 높은 이동 반응을 나타내었다. As expected, uncarinic acid C-primed DCs migrated towards CCL19 and showed a higher migration response than TNF-α-primed DCs.
도 1은 TNF-α 또는 운카린산 C로 분화된 DC의 표현형을 나타낸 도면(적색: 이소타입 대조 mAb로의 배경신호, 백색: 각각의 세포 표면 마커로의 특이적 신호)이고;1 is a diagram showing the phenotype of DC differentiated with TNF-α or uncarinic acid C (red: background signal to isotype control mAb, white: specific signal to each cell surface marker);
도 2a 내지 2d는 CD40 리간드를 발현하는 J558에 의해 자극된 DC에 의한 사이토카인 생산을 보여주는 그래프이며;2A-2D are graphs showing cytokine production by DCs stimulated by J558 expressing CD40 ligands;
도 3는 운카린산 C 또는 TNF-α로 성숙화된 DC의 동종이계 T 세포 자극 능력을 보여주는 그래프이고;FIG. 3 is a graph showing allogeneic T cell stimulating ability of DCs matured with Uncarinic Acid C or TNF-α;
도 4a 내지 4e는 TNF-α- 또는 운카린산 C(0.01-10 μM)-성숙화된 DC에 의해 자극된 숫 T 세포의 상등액에서 ELISA에 의한 IFN-γ, IL-4, IL-13 및 IL-10 측정결과를 나타낸 그래프이며;4A-4E show IFN-γ, IL-4, IL-13 and IL by ELISA in supernatants of male T cells stimulated by TNF-α- or uncarinic acid C (0.01-10 μM) -matured DCs. -10 is a graph showing the measurement results;
도 5a 내지 5c는 DNA 단편화 분석 결과를 나타낸 그래프이고;5a to 5c are graphs showing the results of DNA fragmentation analysis;
도 6a 내지 6c는 51Cr 방출 분석 결과를 나타낸 그래프이다.6A to 6C are graphs showing the results of 51 Cr emission analysis.
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- 2009-06-10 KR KR1020090051422A patent/KR100954887B1/en not_active IP Right Cessation
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J. Exp. Med., Vol.195, pp.1279-1288.* |
논문2;Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters |
논문3;J. Nat. Prod |
논문4;Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters |
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