KR100945018B1 - The method for screening inhibitors on the binding of DDR proteins to collagens - Google Patents

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Abstract

본 발명은 디스코이딘 도메인 리셉터(Discoidin Domain Receptor, DDR)와 콜라겐 결합 저해물질을 검색하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 DDR의 세포외 도메인과 세포막 통과 도메인을 포함하는 단백질을 곤충세포에서 발현시 세포막에 올바른 방향성으로 존재하며 DDR의 세포외 부위와 배양 접시 표면에 코팅된 콜라겐 단백질이 결합하는 특성을 이용하여 이들 결합을 저해하는 물질을 세포차원에서 검색하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 검색법은 간편하여 짧은 시간 내에 많은 물질을 탐색할 수 있고 DDR 단백질의 과잉 활성에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다. The present invention relates to a method for detecting a discoidin domain receptor (Discoidin Domain Receptor, DDR) and collagen binding inhibitors, and more specifically, when expressing a protein comprising an extracellular domain and a cell membrane transmissive domain of DDR in insect cells The present invention relates to a method for cell-based screening of substances that inhibit these binding by using the properties of the collagen protein coated on the surface of the culture plate and the extracellular site of DDR in the right direction. The screening method of the present invention is simple and can search a large number of substances in a short time and can be usefully used for the development of a prophylactic and therapeutic agent for diseases caused by the excessive activity of the DDR protein.

DDR, 곤충세포, 티로신 키나아제, 콜라겐 DDR, insect cells, tyrosine kinases, collagen

Description

DDR과 콜라겐 결합 저해물질을 검색하는 방법{The method for screening inhibitors on the binding of DDR proteins to collagens}The method for screening inhibitors on the binding of DDR proteins to collagens}

본 발명은 디스코이딘 도메인 리셉터(Discoidin Domain Receptor, 이하 'DDR'이라 칭함)와 콜라겐 결합 저해물질을 검색하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 DDR의 세포외 도메인과 세포막 통과 도메인을 포함하는 단백질을 곤충세포에서 발현시 세포막에 올바른 방향성으로 존재하며 DDR의 세포외 부위와 배양 접시 표면에 코팅된 콜라겐 단백질이 결합하는 특성을 이용하여 이들 결합을 저해하는 물질을 세포차원에서 검색하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for detecting a discoidin domain receptor (DDR) and a collagen binding inhibitor, and more specifically, a protein comprising an extracellular domain and a membrane transmembrane domain of DDR. When expressed in insect cells, the present invention relates to a method for cell-based screening of substances that exist in the right direction in the cell membrane and inhibits the binding by using the properties of the collagen protein coated on the extracellular site of the DDR and the surface of the culture dish.

일반적으로 외부의 자극을 세포가 인지하는 방법 중의 하나는 세포막에 있는 수용체인 티로신 키나아제 단백질류를 통한 인지이다. 수용체 티로신 키나아제는 N-말단의 세포 밖에 노출된 세포외 도메인, 세포막 통과 도메인 및 C-말단 쪽의 세포 내 사이토졸에 노출되는 티로신 키나아제 활성을 가지는 도메인으로 구성되어 있다. 세포외 도메인은 특정 리간드가 결합하는 부분이며 세포 내 도메인은 세포 외 도메인에 특정 리간드가 결합하면 그 티로신 키나아제 효소 활성이 활성화되면서 c-말단 부위에 티로신을 인산화하며 세포 내로 신호를 전달하게 된다. 이러한 기작을 가지고 세포외 자극을 세포 내로 전달하는 티로신 키나아제 활성을 갖는 수용체는 많이 알려져 있다. 대표적인 예로서 EGFR, PDGFR, IR, IGFR, c-fms, VEGFR 등을 들 수 있다.In general, one of the ways cells recognize external stimuli is through tyrosine kinase proteins, receptors on cell membranes. Receptor tyrosine kinases consist of an extracellular domain exposed to the N-terminal extracellular domain, a membrane transmembrane domain and a domain having tyrosine kinase activity exposed to the intracellular cytosol on the C-terminal side. The extracellular domain is a portion to which a specific ligand binds. The intracellular domain binds tyrosine to the c-terminal region by activating its tyrosine kinase enzyme activity when the specific ligand binds to the extracellular domain and transmits a signal into the cell. Many receptors have tyrosine kinase activity that transfer extracellular stimuli into cells with this mechanism. Representative examples include EGFR, PDGFR, IR, IGFR, c-fms, VEGFR and the like.

DDR 패밀리 수용체류 단백질도 이러한 수용체 티로신 키나아제류 중의 하나이다. DDR은 디스코이딘 도메인 리셉터(Discoidin Domain Receptor)의 약어로서 미생물에서 발견된 렉틴에 부착되는 단백질인 디스코이딘과 그 세포외 부위가 유사성이 있는 관계로 그러한 명명이 이루어졌다. 인간 등 동물의 경우 DDR1 형과 DDR2 형의 아미노산 서열상 서로 유사성을 가진 단백질이 각각 다른 유전자에 의해 코딩되면서 존재하는 것으로 알려져 있다. DDR 단백질에 대한 연구는 1997년 그 리간드가 파이버 콜라겐이라는 사실이 처음 밝혀져 주목을 끌기 시작하면서 본격화되고 있다.DDR family receptor proteins are also one of these receptor tyrosine kinases. DDR is an abbreviation for Discidin Domain Receptor, and the name was given because of its similarity to the extracellular site of Discidine, a protein attached to lectins found in microorganisms. In animals such as humans, proteins having similarities in amino acid sequences of DDR1 type and DDR2 type are known to exist while being encoded by different genes. The study of DDR proteins began in earnest in 1997, when it first became known that the ligand was fiber collagen.

한편, DDR의 필요 이상의 활성화는 여러 인간 질환과 관련이 있는 것으로 발표되고 있다. DDR1이나 DDR2의 과잉발현이 뇌암, 전이성 유방암 등에서 발견되었다. 또한 DDR2 수용체 키나아제의 이상성이 난치성 인간 질병인 간경화증, 류마티즘, 관절염 및 동맥경화 등과 연관이 있음이 증명되었다. 현재 간경화 증상 유발의 주원인으로 지목되는 간 조직 내의 간 성상 세포가 활성화되는 과정에서 DDR2의 발현이 증가한다는 결과가 발표되었다. 이는 DDR2의 발현증가가 간 성상 세포의 활성화에 주요 역할을 하며 간 경화의 주요 발병 인자임이 제안되었다. 류마티즘 이나 관절염에서 특정 Matrix Metallo Protease(MMP)류 단백질의 증가된 발현으로 제 2형 콜라겐으로 주로 이루어진 연골 조직을 파괴하는 것으로 알려져 있는데 이때 이들 MMP류 단백질의 발현증가에 DDR2의 발현증가가 기여함이 알려져 있다. 동맥경화의 주요 원인인 혈관에 있는 평활근 세포의 증식과 주위 콜라겐 축적에 DDR 패밀리 단백질이 관여함도 알려져 있다.On the other hand, more than necessary activation of DDR is reported to be associated with various human diseases. Overexpression of DDR1 or DDR2 has been found in brain cancer and metastatic breast cancer. In addition, the ideality of DDR2 receptor kinase has been shown to be associated with refractory human diseases such as cirrhosis, rheumatism, arthritis and arteriosclerosis. It is reported that the expression of DDR2 is increased in the process of activating hepatic stellate cells in liver tissue, which is currently considered to be the cause of cirrhosis of the liver. This suggests that increased expression of DDR2 plays a major role in the activation of hepatic stellate cells and is a major pathogenesis factor of liver cirrhosis. Increased expression of certain Matrix Metallo Protease (MMP) proteins in rheumatism or arthritis is known to destroy cartilage tissue, which is composed primarily of type 2 collagen, in which increased expression of DDR2 contributes to increased expression of these MMP proteins. Known. It is also known that DDR family proteins are involved in the proliferation of smooth muscle cells in blood vessels and the accumulation of surrounding collagen, a major cause of atherosclerosis.

상기 기재된 사실로부터 특이적으로 DDR 패밀리 활성을 저해하는 물질은 암, 간경화, 관절염 및 동맥경화의 치료제 등으로 유용하게 활용될 수 있다고 유추된다. From the above-described facts, it is inferred that substances which specifically inhibit DDR family activity can be usefully used as therapeutic agents for cancer, cirrhosis, arthritis and arteriosclerosis.

이에 본 발명자는 DDR이 동물세포에서와 같이 곤충세포에서도 세포막에 올바른 방향으로 존재하며, 세포외 도메인은 리간드인 콜라겐과 결합하는 것을 밝힘으로써 DDR 과잉 활성에 의한 암, 간경화, 류마티스 질환 또는 동맥경화를 치료할 수 있는 물질을 검색하는 방법을 완성하였다. Accordingly, the present inventors found that DDR exists in the right direction in the cell membrane in insect cells as in animal cells, and the extracellular domain binds to the collagen ligand, a ligand, thereby preventing cancer, liver cirrhosis, rheumatic disease or atherosclerosis caused by DDR excess activity. The method of searching for a curable substance was completed.

본 발명의 목적은 DDR 패밀리 단백질의 과잉 활성을 저해하는 물질을 검색하는 방법을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a method for screening substances that inhibit the excess activity of DDR family proteins.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 곤충세포 발현법을 이용하여 DDR 단백질과 콜라겐 상호작용 정량분석법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a quantitative analysis of collagen interaction with DDR proteins using insect cell expression.

또한, 본 발명은 곤충세포 발현법을 이용하여 DDR 단백질과 콜라겐 결합 저해물질을 검색하는 방법을 제공한다. The present invention also provides a method for searching for DDR protein and collagen binding inhibitors using insect cell expression.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 곤충세포 발현법을 이용하여 DDR 단백질과 콜라겐 상호작용을 정량적으로 분석하는 방법을 제공한다.The present invention provides a method for quantitatively analyzing collagen interactions with DDR proteins using insect cell expression.

인간 DDR2 단백질의 경우 아미노산 1번에서 399번까지는 주로 세포외로 표출되는 부위와 막 통과 부위(22개의 아미노산(ILIGCLVAIIFILLAIIVIILW))를 구성하며 그 다음부터 c-말단 부위는 사이토졸에 표출된 티로신 키나아제 활성을 가지는 부위로 구성된다. 동물세포가 아닌 곤충세포에서 인간 DDR2 단백질을 발현했을 때 발현된 DDR2 단백질이 동물세포에서와 같이 세포막에 존재하며 세포외 부분은 세포외로 표출되어 위치하는지 알아보고자 하였다. In the case of human DDR2 protein, amino acids 1 to 399 constitute the extracellularly expressed site and the membrane transmembrane site (22 amino acids (ILIGCLVAIIFILLAIIVIILW)), and the c-terminal site then forms the tyrosine kinase activity expressed on the cytosol. Branches consist of sites. When human DDR2 protein was expressed in non-animal cells, we wanted to find out whether the expressed DDR2 protein exists in the cell membrane as in animal cells and the extracellular part is expressed extracellularly.

먼저 인간 DDR2를 코딩하는 유전자를 클론텍사에서 구입한 pBacPAk8 바큐로바이러스 발현 벡터에 통상적인 유전자 재조합 기술을 이용하여 클로닝한 후 이를 클론텍사가 제공한 방법을 이용하여 배큘로 바이러스로 만든 후 이 재조합 바이러스를 이용하여 배큘로 바이러스를 이용한 단백질 발현에 통상적으로 사용하는 sf9 ,sf21 또는 Hi-five 등의 곤충세포에서 발현하였다. 곤충세포에서 발현된 DDR2는 HEK293 동물세포에서 발현 시와 같이 약 130 킬로 달톤의 분자량을 보여주었다(도 1참조). First, a gene encoding human DDR2 was cloned into pBacPAk8 baculovirus expression vector purchased from Clonetech Co., Ltd. using conventional gene recombination technology, and then made into a baculovirus using the method provided by Clonetech Co., Ltd. It was expressed in insect cells, such as sf9, sf21 or Hi-five commonly used for protein expression using baculovirus. DDR2 expressed in insect cells showed a molecular weight of about 130 kilo Daltons as expressed in HEK293 animal cells (see Figure 1).

또한, 발현된 DDR2 단백질이 세포막 부위에 존재하는지 알아보고자 DDR2를 발현하는 바큐로바이러스를 이틀간 감염시킨 곤충세포를 배양접시 표면에 고정시킨 후 DDR2의 N-말단 부위의 세포외 도출 부위를 특이적으로 인식하는 항체와 FITC 형광물질이 부착된 2차 항체를 차례로 처리하여 발현된 DDR2를 형광 표식 후 콘포칼 형광 현미경을 이용하여 세포 내 DDR2의 위치를 확인한 결과 발현된 대부분의 DDR2가 세포막에 존재함을 확인하였다. 이때 DDR2의 N-말단 부위의 세포외 도출 부위를 특이적으로 인식하는 항체를 처리하기 전 세포를 0.25% 트리톤 용액으로 처리 여부에 관계없이 이 항체에 의해 염색되는 세포막에 존재하는 DDR2의 신호는 차이가 없었다. 다시 말해 0.25% 트리톤 X-100 용액 처리는 통상적으로 항체를 처리하기 전 세포막 안에 존재하는 단백질을 인식시키기 위해 처리하는 항체에 세포막 투과성을 증진시키는 목적으로 사용하는 방법인 바, 본 발명에서 0.25 % 트리톤 용액 처리 유무에 관계없이 DDR2의 N-말단을 인식하는 항체에 의해 같은 세기의 영상 신호를 주었다(도 2 참조). 이는 항체에 의해 인식되는 DDR2의 N-밀단 세포외 부분이 곤충세포에서 발현 시에도 세포 밖에 존재함을 의미한다. 따라서 곤충세포에서 발현된 DDR2가 동물세포의 경우와 같이 세포막에 올바른 방향성으로 존재함을 증명한다.In addition, in order to determine whether the expressed DDR2 protein is present in the cell membrane region, the insect cells infected with the baculovirus expressing DDR2 for two days were immobilized on the surface of the culture plate, and then the extracellular derivation site of the N-terminal region of DDR2 was specifically identified. DDR2 expressed by treatment of a recognized antibody followed by a secondary antibody with FITC fluorescent material was fluorescently labeled, and then the location of intracellular DDR2 was confirmed by confocal fluorescence microscopy. Confirmed. In this case, the signal of DDR2 present in the cell membrane stained by this antibody was different regardless of whether the cells were treated with 0.25% Triton solution before treating the antibody that specifically recognized the extracellular derivation site of the N-terminal part of DDR2. There was no. In other words, the 0.25% Triton X-100 solution treatment is a method used to enhance cell membrane permeability to an antibody to be treated to recognize proteins present in the cell membrane before the antibody is treated. In the present invention, 0.25% Triton Image signals of the same intensity were given by antibodies recognizing the N-terminus of DDR2 with or without solution treatment (see FIG. 2). This means that the N-secret extracellular portion of DDR2 recognized by the antibody is extracellular even when expressed in insect cells. Therefore, it is proved that DDR2 expressed in insect cells exists in the right direction in the cell membrane as in the case of animal cells.

본 발명에서는 표면 부착 상태에서 배양한 sf9과 같은 곤충세포에 장기간 바람직하게는 3일 이상 배큘로 바이러스를 감염시키면 세포는 배양 접시 표면에 부착되는 성질을 잃어버림을 관찰하고 곤충세포에 DDR2를 발현하면 곤충세포가 콜라겐 이 코팅된 표면에 부착되는 성질을 띠게 하는지를 조사하였다. 이를 위해 DDR2 또는 대조군으로 DDR2의 세포질 도메인만을 발현하는 배큘로 바이러스를 곤충세포에 3일간 감염시켜 세포를 배양접시 표면에서 떨어지게 한 후 이 세포를 수집하여 바이오틴으로 세포벽을 코팅한 후 아비딘이 코팅된 Q-dot 형광 물질을 연이어 부착하여 형광 표식 후 다시 배양미디어에 서스펜션 하였다. 이를 제 1형 콜라겐으로 코팅된 배양접시 표면에 플레이팅하고 간단히 흔들어 세포의 부착을 유도한 후 부착하지 않은 세포를 PBS 용액으로 가볍게 세척하여 씻어낸 후 콜라겐 표면에 부착된 세포를 형광 현미경하에서 관찰한 결과 DDR2를 발현하는 곤충세포가 DDR2의 세포질 도메인만을 발현하는 곤충세포에 비해 월등히 많이 콜라겐 표면에 부착되어 있음을 관찰할 수 있었다(도 3 참조). 또한, DDR2의 세포외 도출 부위와 막 통과 부위를 인슐린 수용체의 c-말단 세포질에 도출된 티로신 키나아제 부위에 융합한 키메라 단백질을 곤충세포에서 발현 후 콜라겐에 코팅된 표면에 부착되는 성질을 조사한 결과, 정상적인 DDR2를 발현하는 경우와 거의 동일한 부착성을 보여 주었다(도 3 참조). 상기 결과는 곤충세포에 콜라겐에 부착되는 성질을 주는 것은 DDR2에서 세포 밖에 노출된 부위임을 반증한다. In the present invention, when infecting insect cells, such as sf9, cultured on the surface of the bacterium for a long time, preferably 3 days or more, the cells lose their adherence to the culture dish surface and express DDR2 in the insect cells. We investigated whether insect cells have the property of adhering to the collagen-coated surface. To this end, infecting insect cells with a baculovirus expressing only the cytoplasmic domain of DDR2 as a DDR2 or a control group for 3 days to insulate the cells from the surface of the culture dish, collect the cells, coat the cell wall with biotin, and then coat the avidin-coated Q. -dot fluorescent material was subsequently attached and then suspended again in culture media after fluorescent labeling. Plate it on the culture plate surface coated with collagen type 1, and simply shake to induce cell adhesion. Then, lightly wash the unattached cells with PBS solution, and then observe the cells attached to the collagen surface under a fluorescence microscope. As a result, it was observed that insect cells expressing DDR2 are much more attached to the collagen surface than insect cells expressing only the cytoplasmic domain of DDR2 (see FIG. 3). In addition, the chimeric protein obtained by fusion of the extracellular derivation site and the transmembrane site of the DDR2 to the tyrosine kinase site derived from the c-terminal cytoplasm of the insulin receptor was expressed in insect cells and then attached to the surface coated with collagen. It showed almost the same adhesion as when expressing normal DDR2 (see FIG. 3). The results prove that giving insect cells the property of attaching to collagen is a site exposed outside of cells in DDR2.

또한, 본 발명에서는 DDR2를 발현하는 배큘로 바이러스를 곤충세포에 3일간 감염시킨 sf9 곤충세포를 제 1형 콜라겐으로 코팅된 배양접시에 넣은 후 10분에서 1시간 정도 방치 후 같은 부피의 포르말린 용액을 가하여 약 10분 이상 방치하면 처음 넣은 세포의 상당량이 콜라겐으로 코팅된 배양접시 표면에 고정되는 것을 확인할 수 있었다. 반면에 대조군으로 DDR2의 세포질 도메인만을 발현하는 배큘로 바이러스를 3일간 감염시킨 세포는 7배 이상 적은 수만 고정되었다. 또한, DDR2 세포외 부분과 인슐린 수용체의 세포질 티로신 키나아제 부위를 융합시킨 키메라 단백질을 발현한 경우도 DDR2를 발현한 세포와 같은 정도로 콜라겐으로 코팅된 배양접시 표면에 고정되었다. 이것은 DDR2의 세포외 부분이 배양접시 표면에 코팅된 콜라겐과 포르말린에 의해 분자적 결합을 이룸을 의미한다. 고정된 세포는 세포를 염색하는 다이중에 하나인 sulforhodamine B (SRB)로 염색하여 광학현미경으로 쉽게 알 수 있었다(도 4 참조). 또한 부착되어 고정된 세포의 상대적인 숫자는 세포에 염색된 SRB 다이를 용매로 추출 후 520 nM에서 흡광도를 측정하여 손쉽게 정량할 수 있었다(도 5 참조). 이때 흡광도는 고정된 세포의 수에 정비례한다. In the present invention, the sf9 insect cells infected with the baculovirus expressing DDR2 for 3 days were placed in a culture dish coated with collagen type 1, and then left for 10 minutes to 1 hour. When left for about 10 minutes or more, a significant amount of the first cells added was confirmed to be fixed on the surface of the culture plate coated with collagen. On the other hand, cells infected with baculovirus that express only the cytoplasmic domain of DDR2 for 3 days were fixed only 7 times or less. In addition, the expression of the chimeric protein in which the extracellular DDR2 and cytosolic tyrosine kinase sites of the insulin receptor were expressed was also fixed to the surface of the collagen-coated culture plate to the same extent as the cells expressing the DDR2. This means that the extracellular portion of DDR2 is molecularly bonded by collagen and formalin coated on the culture plate surface. Fixed cells were easily identified by optical microscopy by staining with sulforhodamine B (SRB), one of the dies for staining the cells (see FIG. 4). In addition, the relative number of fixed and fixed cells could be easily quantified by measuring the absorbance at 520 nM after extracting the SRB die stained with the cells with a solvent (see FIG. 5). The absorbance is then directly proportional to the number of fixed cells.

상기 결과는 DDR2를 발현하는 곤충세포가 DDR2의 세포외 부위와 코팅된 콜라겐과의 분자적 결합을 통하여 부착됨을 의미한다. 이를 더욱 증명해주는 결과로 배양접시에 파이브로넥틴, 라미닌, 젤라틴 및 콜라겐과 같은 여러가지 형태의 세포외 기질 단백질을 코팅 후 DDR2를 발현하는 곤충세포가 부착되는 정도를 측정한 결과, DDR2의 리간드 단백질로 알려진 세포외 기질 단백질인 제 1형, 제 2형, 제 3형 콜라겐만이 DDR2를 발현하는 곤충세포가 부착되는 것을 유의성있게 유도한다는 사실을 확인하였다(도 6 참조).The results indicate that the insect cells expressing DDR2 are attached through molecular binding of the extracellular site of DDR2 and the coated collagen. As a result of further proof of this, after coating various types of extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, gelatin and collagen in the culture dish, the degree of attachment of insect cells expressing DDR2 was measured. It was confirmed that only known extracellular matrix proteins type 1, type 2 and type 3 collagen significantly induced the attachment of insect cells expressing DDR2 (see FIG. 6).

본 발명에서 확인한 DDR2의 N-말단 세포외 도메인과 막통과 도메인을 포함하는 단백질을 발현하는 곤충세포가 파이버형 콜라겐이 코팅된 표면에 부착하는 현상을 바탕으로 세포를 형광과 같은 특정 신호를 내는 물질로 표식하거나 부착된 세포를 포르말린 등 고정 용액으로 고정시킨 후 이를 SRB와 같이 세포를 특이적으로 염 색하는 물질로 염색 후 염색된 정도를 정량하여 부착된 세포수를 정량할 수 있다. Substances that generate specific signals, such as fluorescence, based on the phenomenon that the insect cells expressing proteins including the N-terminal extracellular domain and the transmembrane domain of DDR2 identified in the present invention adhere to the surface coated with the fiber-type collagen The cells labeled or attached may be fixed with a fixed solution such as formalin, and then stained with a material that specifically stains cells, such as SRB, followed by quantification of staining to quantify the number of cells attached.

바람직하게는 곤충세포 발현법을 이용하여 DDR 단백질과 콜라겐 상호작용을 정량적으로 분석하는 방법은Preferably, the method of quantitatively analyzing the interaction between DDR protein and collagen using insect cell expression method

ⅰ) 세포 배양 접시 또는 단백질을 잘 부착시키는 성질을 가진 표면에 콜라겐을 코팅하는 단계;Iii) coating collagen on a cell culture dish or surface having a property of adhering proteins well;

ⅱ) DDR 단백질의 세포외 도메인을 세포 표면에 발현하는 형질전환 곤충세포를 콜라겐으로 코팅된 배양 접시에 가하여 반응시키는 단계;Ii) reacting transgenic insect cells expressing the extracellular domain of DDR protein on the cell surface by adding them to a culture dish coated with collagen;

ⅲ) 배양접시에 부착된 곤충세포를 고정시킨 후 염색하는 단계; 및Iii) fixing the insect cells attached to the culture dish and staining them; And

ⅳ) 흡광도를 측정하여 고정된 세포수를 정량하는 단계를 포함한다. Iii) quantifying the fixed cell number by measuring absorbance.

상기 DDR 단백질은 포유류에서 유래한 것이며, 바람직하게는 포유류는 식충목, 피익목, 박쥐목, 영장목, 빈치목, 토끼목, 식육목, 고래목, 관치목, 장비목, 바위너구리목, 바다소목, 말목, 소목, 쥐목 등이 있으며, 더욱 구체적으로는 두더양, 물개, 펭귄, 원숭이, 개, 원숭이, 고래, 고릴라, 고슴도치, 고양이, 곰, 말, 족제비, 기린, 오소리, 박쥐, 나무늘보, 낙타, 다람쥐, 날쥐, 너구리, 노루,토끼, 낙타, 당나귀, 돼지, 슴, 두더지, 사자, 바다표범, 호랑이, 여우, 비버, 노루, 생쥐, 소, 수달, 스라소니, 스컹크, 염소, 들소, 이리, 족제비, 쥐, 캥거루, 치타, 캥거루, 코끼리, 코뿔소, 코알라, 코요테, 표범, 하마 및 사람 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The DDR protein is derived from a mammal, preferably the mammal is carnivorous, pistil, bat, primate, larva, hare, carnivorous, whale, ornamental, equipment, rock raccoon, marine, Horses, cattle, rats, more specifically moles, seals, penguins, monkeys, dogs, monkeys, whales, gorillas, hedgehogs, cats, bears, horses, weasels, giraffes, badgers, bats, sloths, camels , Squirrel, mouse, raccoon, roe deer, rabbit, camel, donkey, pig, ox, mole, lion, seal, tiger, fox, beaver, roe deer, mouse, cow, otter, lynx, skunk, goat, bison, wolf, Weasels, rats, kangaroos, cheetahs, kangaroos, elephants, rhinos, koalas, coyotes, leopards, hippos and humans, but are not limited thereto.

또한, 본 발명은 곤충세포 발현법을 이용하여 DDR 단백질과 콜라겐 결합 저해물질을 검색하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for searching for DDR protein and collagen binding inhibitors using insect cell expression.

바람직하게는 상기 방법은 ⅰ) 세포 배양 접시 또는 단백질을 잘 부착시키는 성질을 가진 표면에 콜라겐을 코팅하는 단계;Preferably the method comprises the steps of: i) coating collagen on a cell culture dish or surface having a property of adhering proteins well;

ⅱ) DDR 단백질의 세포외 도메인을 세포 표면에 발현하는 형질전환 곤충세포 및 검색 후보물질을 콜라겐으로 코팅된 배양 접시에 가하여 반응시키는 단계; 및Ii) reacting the transgenic insect cells expressing the extracellular domain of the DDR protein on the cell surface with a search candidate to a collagen-coated culture dish; And

ⅲ) 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 DDR 단백질과 콜라겐 결합을 유의하게 저해하는 후보물질을 선별하는 단계를 포함한다. Iii) screening candidates that significantly inhibit DDR protein and collagen binding as compared to the control group that did not receive the candidates.

상기 단계 ⅱ)의 후보 물질로는 예를 들면, 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 또는 혈장 등이 있고 이러한 화합물들은 신규 화합물이어도 되고, 널리 알려진 화합물이어도 된다. 이러한 후보 물질은 염을 형성하고 있어도 된다. 후보 물질의 염으로는 생리학적으로 허용되는 산(예, 무기산 등)이나 염기(예, 유기산 등) 등의 염이 있고 이 중에서 생리학적으로 허용되는 산첨가염이 바람직하다. 이와 같은 염으로는 예를 들면, 무기산(예를 들면, 염산, 인산, 취화수소산 또는 황산 등)의 염 또는 유기산(예를 들면, 초산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 안식향산, 메탄술폰산 또는 벤젠술폰산 등)의 염 등이 이용된다.Candidates of step ii) include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts or plasma, and these compounds may be novel compounds, A well-known compound may be sufficient. Such a candidate substance may form a salt. Salts of candidate substances include salts such as physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids) and bases (eg, organic acids, etc.), and among these, physiologically acceptable acid addition salts are preferable. Such salts include, for example, salts of inorganic acids (e.g. hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid or sulfuric acid) or organic acids (e.g. acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid). , Malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid or benzenesulfonic acid).

상술한 곤충세포 발현법을 이용하여 DDR 단백질과 콜라겐 상호작용을 정량적으로 분석하는 방법은 DDR과 콜라겐의 결합을 방해 또는 증진하는 물질의 검색에 이용할 수 있다. DDR과 콜라겐의 결합을 방해하는 물질이 존재하면 DDR을 발현하는 곤충세포가 콜라겐이 코팅된 표면에 부착하는 양이 줄어들며 본 발명에서 제시한 방법으로 이를 쉽게 측정할 수 있기 때문이다.The method of quantitatively analyzing the interaction between the DDR protein and collagen using the insect cell expression method described above can be used to search for substances that interfere with or enhance the binding of DDR and collagen. If there is a substance that interferes with the binding of DDR and collagen, the amount of insect cells expressing DDR is reduced to adhere to the collagen-coated surface because it can be easily measured by the method proposed in the present invention.

본 발명의 실시예에서는 1,500개의 약물을 모아놓은 화합물 라이브러리를 본 발명에서 제시한 DDR2와 콜라겐의 결합을 방해하는 물질의 검색법을 이용하여 검색하였다. 먼저 제 1형 콜라겐으로 코팅된 96웰 배양접시나 ELISA 플레이트를 100 ul의 세포 배양액에 있는 100만개의 DDR2를 발현하는 배큘로 바이러스로 3일간 감염시킨 sf9 세포를 200 uM의 라이브러리 화합물과 같이 동시에 가한 후 이 배양접시를 약 1시간 정도 약하게 흔들어 준다. 여기에 100 ul의 포르말린 용액을 가하여 세포를 고정한다. 부착되지 않은 세포와 배양액을 물로 씻어낸 후 부착된 세포를 SRB로 염색하고 염색된 SRB를 용출하여 흡광도를 측정하여 부착된 세포의 양을 정량하여 부착된 세포의 양을 줄이는 후보 화합물을 선별하였다. 이 선별된 화합물이 실지로 DDR2와 콜라겐과의 결합 저해에 특이적으로 작용하는지를 확인하기 위하여 바이러스를 감염시키지 않아서 배양접시 표면에 잘 부착되는 성질을 가지고 있는 sf9 세포에 이 화합물 처리 시 배양접시 표면에 부착되는 성질의 변화가 생기는지를 관찰하여 바이러스를 감염하지 않은 sf9 세포가 배양접시표면에 부착되는 것을 저해하지 않는 화합물을 다시 선별하였다. 이러한 검색방법으로 본 발명에서는 악티노마이신 D(actinomycin D) 화합물을 발굴하였다. 악티노마이신 D는 DDR2를 발현하는 곤충세포의 콜라겐으로 코팅된 표면에 부착은 IC50 = 20 uM 정도로 저 해하였지만 대조군으로 DDR2와 유사한 단백질 서열을 가지고 있고 같은 패밀리에 속하는 단백질인 DDR1b를 발현하는 곤충세포의 제 1형 콜라겐으로 코팅된 표면에의 부착은 거의 저해하지 않았고 동시에 바이러스를 감염하지 않은 sf9 세포가 배양접시 표면에 부착되는 것도 저해하지 않았다(도 7 참조). In an embodiment of the present invention, a compound library of 1,500 drugs was searched using a screening method for a substance that interferes with the binding of collagen with DDR2. First, sf9 cells infected with 100 million DDR2 expressing 1 million DDR2 cells in 100 ul of cell culture medium coated with 96-well culture plates or ELISA plates were added simultaneously with 200 uM of library compounds. Then shake the culture dish gently for about 1 hour. 100 ul of formalin solution is added thereto to fix the cells. After washing out the cells and the culture medium with no adherence, the attached cells were stained with SRB and the stained SRB was eluted to measure the absorbance to quantify the amount of adhered cells to select candidate compounds that reduce the amount of adhered cells. In order to confirm whether the selected compound actually acts specifically to inhibit the binding of DDR2 and collagen, it adheres to the surface of the culture plate when the compound is treated to sf9 cells that do not infect the virus and adhere well to the surface of the culture plate. By observing the change in the properties, the compounds which did not inhibit the virus-infected sf9 cells from adhering to the culture plate surface were reselected. In this invention, the actinomycin D (actinomycin D) compound was discovered by this search method. Dactinomycin D is attached to the surface coated with collagen in the insect cells expressing the DDR2 is but low haeha so IC 50 = 20 uM insect expressing a protein DDR1b belonging to families, such as with a similar protein sequences and DDR2 as a control, and The adhesion of the cells to the surface coated with collagen type 1 hardly inhibited and at the same time did not inhibit the virus-infected sf9 cells from adhering to the culture dish surface (see FIG. 7).

실지로 본 발명에서 기술한 검색법으로 발굴한 악티노마이신 D가 제 1형 콜라겐에 의한 DDR2 활성화를 동물세포에서도 저해하는지 알기 위하여 DDR2를 발현하는 HEK293 세포를 제 1형 콜라겐이 코팅된 배양접시에 플레이팅 한 후 악티노마이신 D를 농도를 바꾸어가며 처리하여 DDR2가 활성화되면서 증가하는 티로신 인산화가 감소하는지를 살펴 본 결과, 악티노마이신 D 농도 20 uM 정도에서 약 50% 정도 그 인산화 증가를 저해하였다(도 8 참조). 반면에 악티노마이신 D는 또 다른 수용체 티로신 키나아제인 EGFR이나 인슐린 수용체의 리간드에 의한 활성화에는 100 uM의 고 농도 처리에도 영향을 미치지 않았다(도 9 및 10 참조). 이 사실은 동물세포에서도 본 검색법에 의해 발굴된 DDR2-콜라겐 결합 저해제인 악티노마이신 D가 특이적으로 리간드 콜라겐에 의한 DDR2 활성화를 저해함을 증명한다. 따라서 상기 본 발명에서 제시한 DDR2와 콜라겐 결합을 억제하는 물질의 검색법에 의해 발굴된 악티노마이신 D 화합물의 분석 결과는 본 발명의 검색법이 유용하다는 것을 증명한다.In fact, in order to know whether actinomycin D discovered by the screening method described in the present invention inhibits DDR2 activation by type 1 collagen in animal cells, we also play HEK293 cells expressing type 2 collagen in a culture plate coated with type 1 collagen. After treatment, actinomycin D was treated at varying concentrations to see if the increased tyrosine phosphorylation decreased as DDR2 was activated, which inhibited the increase in phosphorylation by about 50% at 20 uM of actinomycin D concentration. 8). Actinomycin D, on the other hand, did not affect the high concentration treatment of 100 uM for activation by ligands of another receptor tyrosine kinase, EGFR or insulin receptor (see FIGS. 9 and 10). This fact demonstrates that even in animal cells, actinomycin D, a DDR2-collagen binding inhibitor discovered by this screening method, specifically inhibits DDR2 activation by ligand collagen. Therefore, the analysis result of the actinomycin D compound discovered by the screening method of the substance inhibiting collagen binding with DDR2 presented in the present invention proves that the screening method of the present invention is useful.

본 발명의 곤충세포 발현법을 이용하여 DDR 단백질과 콜라겐 결합 저해 물질 을 검색하는 방법은 발현된 DDR2가 곤충세포의 막에 안착된 상태로 검색에 이용되기 때문에 DDR2 단백질은 안정화되어 검색하는 환경에 크게 영향을 받지 않을 수 있으며, 전체 DDR2 단백질을 모두 이용하기 때문에 DDR2에 내재된 모든 활성을 가장 잘 나타내는 상태로 검색에 이용될 뿐 아니라 DDR2와 콜라겐 부착 정도를 부착되는 곤충세포를 염색하여 측정하므로 측정이 간단하고 재현성이 높고 정확하다는 장점이 있다. In the method of searching for DDR protein and collagen binding inhibitor by using the insect cell expression method of the present invention, since the expressed DDR2 is used for the detection in the state of being seated on the membrane of the insect cell, the DDR2 protein is stabilized and greatly searched for the environment. It can be unaffected, and because it uses all the DDR2 protein, it is used for searching in the state that best shows all the activities inherent in DDR2, and the degree of DDR2 and collagen adhesion is measured by staining insect cells to be attached. The advantage is simple, reproducible and accurate.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.

<실시예 1> 세포 배양Example 1 Cell Culture

곤충세포 Spodoptera frugoperda SF9 세포(클론텍사)는 TNM-FH 곤충세포배지(시그마 사)에 10% FBS, 50 ug/ml 겐타마이신 및 2 mM 글루타민을 첨가하여 27℃에서 배양접시 표면에 부착된 상태로 배양하였다. HEK293 세포 (ATCC에서 구입)는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's Medium) 동물세포 배양배지에 10% FBS 및 150 ug/ml 페니실린-스트렙토마이신(Gibco-BRL)을 첨가 후 5% 이산화탄소상에서 37℃에서 동물세포 배양기에서 배양하였다. DDR2, 인슐린 수용체 또는 EGFR을 발현하는 HEK 293 세포는 각각의 전장 c-DNA를 인비트로젠사에서 구입한 pcDNA 3.1 벡터에 클로닝한 발현 벡터를 트랜스펙션하여 안정적으로 발현하는 콜로니를 선별하여 만든 세포주를 사용하였으며 이들 세포배양은 HEK293 세포와 동일하게 배양하였다. Insect Cells Spodoptera frugoperda SF9 cells (Clontech) were attached to TNM-FH insect cell medium (Sigma) with 10% FBS, 50 ug / ml gentamycin and 2 mM glutamine attached to the culture plate surface at 27 ° C. Incubated. HEK293 cells (purchased from ATCC) were added to DMEM (Dulbecco's modified Eagle's Medium) animal cell culture medium with 10% FBS and 150 ug / ml penicillin-streptomycin (Gibco-BRL) followed by animal cell incubator at 37 ° C. on 5% carbon dioxide. Incubated at. HEK 293 cells expressing DDR2, insulin receptor, or EGFR are cell lines made by transfecting an expression vector cloned with a full-length c-DNA from pcDNA 3.1 vector, purchased from Invitrogen, to select stably expressing colonies. Were cultured in the same manner as HEK293 cells.

<< 실시예Example 2>  2> 배큘로Baculo 바이러스 발현 벡터 및  Viral expression vectors and 배큘로Baculo 바이러스 제조 Virus manufacturing

배큘로 바이러스 발현 벡터는 pBacPAK8 벡터(클론텍사)를 이용하였다. 전장 인간 DDR2 cDNA(NCBI Gene Bank accession number: BC 052998, 서열번호 1)를 포함하는 5'-말단이 XhoⅠ 제한효소 절단부위이고 3' 말단이 EcoRⅠ 제한효소 절단부위를 가진 DNA 조각을 pBacPAK8 벡터의 멀티플 클로닝 사이트에 클로닝하였다. As the baculovirus expression vector, a pBacPAK8 vector (Clontech) was used. DNA fragments containing the full-length human DDR2 cDNA (NCBI Gene Bank accession number: BC 052998, SEQ ID NO: 1) at the 5'-terminus of the XhoI restriction enzyme and the 3 'end of the EcoRI restriction enzyme cleavage site were multiplexed to the pBacPAK8 vector. Cloning to cloning site.

DDR2의 세포외 부위 및 세포막 통과 부위를 포함하는 도메인(아미노산 1-440, 서열번호 2)과 인슐린 수용체의 세포질 노출 부위인 티로신 키나아제 부위를 포함하는 도메인(서열번호 3)을 융합한 키메라 단백질의 곤충세포 발현벡터는 인간 인슐린 수용체 유전자 중 세포질에 노출된 티로신 키나아제 활성 도메인를 포함하는 유전자 절편을 주형으로하여 5′ 프라이머: GGCCATGGGTGTTTCCATGCTCTGTG(서열번호 5) 및 3' 프라이머: GGGAATTCTTAGGAAGGATTGGACCG(서열번호 6)를 이용하여 5' 쪽에 NcoⅠ, 3′쪽에 EcoRⅠ 제한효소 절단 부위를 가지는 DNA 절편을 100℃ 1분, 48℃ 1분, 63℃ 1분의 조건으로 30 사이클로 PCR 증폭 후 이를 Nco I, Eco RⅠ 제한 효소로 동시에 절단한 후 이를 상기에 언급한 pBacPAK8 벡터에 전장 DDR2 c-DNA를 클로닝한 벡터에서 DDR2 cDNA의 3' 말단에 있는 NcoI과 EcoRⅠ으로 잘리는 DNA 절단 조각을 제거하고 여기에 대신 삽입하여 클로닝하였다. Insects of the chimeric protein that fused a domain containing the extracellular and the cell membrane transit sites of DDR2 (amino acids 1-440, SEQ ID NO: 2) and a domain containing the tyrosine kinase site, which is a cytoplasmic exposure site of the insulin receptor (SEQ ID NO: 3). The cell expression vector was constructed using a gene fragment containing a tyrosine kinase active domain exposed to the cytoplasm of the human insulin receptor gene as a template. DNA fragments with Nco I on the 'side and EcoRⅠ restriction enzyme cleavage site on the 3' side were amplified by 30 cycles of PCR at 100 ° C for 1 minute, 48 ° C for 1 minute, and 63 ° C for 1 minute, and then simultaneously digested with Nco I and Eco RⅠ restriction enzymes. This was then cut to NcoI and EcoR I at the 3 'end of the DDR2 cDNA in a vector cloned full-length DDR2 c-DNA into the pBacPAK8 vector mentioned above. Remove the cut pieces of DNA, and cloned by inserting here instead.

또한, 사람의 DDR2 cDNA 중 아미노산 441부터 855에 해당되는 부분(서열번호 4)을 상기 전장 인간 DDR2 cDNA를 주형으로 하여 5' 프라이머; GG GGATCCACAGTCAGCCTTTCCCTG(서열번호 7) 및 3' 프라이머: GGGAATTCTCACTCGTCGCCTTGTT(서열번호 8)을 이용하여 100℃ 1분, 48℃ 1분, 63℃ 1분의 조건으로 30 사이클로 PCR 증폭하여 이를 Bam HⅠ, Eco RⅠ 제한효소로 동시 절단 후 이를 곤충세포 발현 벡터인 pBacPak8에 이미 클로닝된 글루타치온-S-전이효소(GST) 유전자 3′부위의 Bam HⅠ 사이트에 융합시켜 GST에 융합된 DDR2의 c-말단 세포질 노출 티로신 키나아제 도메인을 발현하는 벡터를 클로닝하였다. 이들 발현벡터 DNA를 이용하여 배큘로 바이러스 제조키트(클론텍사)를 사용하여 배큘로 바이러스를 제조하였다. In addition, a portion corresponding to amino acids 441 to 855 (SEQ ID NO: 4) in the human DDR2 cDNA using the full-length human DDR2 cDNA as a template, 5 'primer; GG GGATCCACAGTCAGCCTTTCCCTG (SEQ ID NO: 7) and 3 'Primer: GGGAATTCTCACTCGTCGCCTTGTT (SEQ ID NO: 8) PCR amplified in 30 cycles at 100 ° C for 1 minute, 48 ° C for 1 minute, and 63 ° C for 1 minute to limit Bam HI and Eco RI C-terminal cytoplasmic exposed tyrosine kinase domain of DDR2 fused to GST by fusion with GST fused to Gam fusion site 3 ′ region of glutathione-S-transferase (GST) gene already cloned into insect cell expression vector pBacPak8 Vectors expressing were cloned. Baculoviruses were prepared using the baculovirus preparation kit (Clontech) using these expression vector DNAs.

<< 실시예Example 3>  3> 배큘로Baculo 바이러스 감염 및 단백질 발현 Viral infection and protein expression

배큘로 바이러스 타이터가 CFU(colony forming unit) 값이 108/ml 이상이 되도록 배큘로 바이러스를 sf9 세포에 연속 감염하여 증폭하여 사용한다. 배큘로 바이러스를 sf9 곤충세포에서 MOI 10으로 감염시켜 단백질을 발현한다. sf9 곤충세포는 실시예 1에서와 같이 배양접시에 부착된 상태로 배양한다. 배큘로 바이러스 감염 후 하루나 이틀까지는 배양접시에 붙어있지만 2-3일 후에는 배양 접시에서 떨어진다. Baculo virus titer is amplified by continuously infecting the baculovirus to sf9 cells so that the CFU (colony forming unit) value of 10 8 / ml or more. Baculoviruses are infected with MOI 10 in sf9 insect cells to express proteins. sf9 insect cells are cultured in a state of being attached to a culture dish as in Example 1. One or two days after the baculovirus infection, they are attached to the petri dish, but after 2-3 days they are removed from the petri dish.

<실시예 4> 항체 및 웨스턴 블롯팅Example 4 Antibody and Western Blotting

곤충세포에서 발현된 DDR2 단백질을 인식하는 항체는 세포외 도메인에 위치한 아미노산 292-399 부위를 인식하는 항체인 폴리크로날 항-DDR2 토끼 IgG 항체인 H-108 항체(산타크루즈사)를 사용하였다. HEK293 세포에서 발현된 DDR2를 인식하기 위해서는 R&D systems사에서 구매한 인간 DDR2의 세포외 도메인을 인식하는 항-DDR2 염소 IgG 항체를 사용하였다. 인슐린 수용체를 인식하는 항체는 산타크루즈사에서 구입한 인슐린 수용체 c-말단을 인식하는 항체인 모노크로날 항-인슐린 수용체 마우스 IgG 항체인 CT-3 항체를 사용하였다. EGFR을 인식하는 항체는 산타크루즈사에서 구입한 인간 EGFR의 c-말단을 인식하는 폴리크로날 항-EGFR 염소 IgG 항체를 사용하였다. 인산화된 티로신을 인식하는 항체는 셀 시그날링 테크놀로지사에서 구입한 단백질내의 인산화된 티로신을 인식하는 모노크로날 항-포스포 티로신 마우스 IgG 항체인 P-Tyr-100 항체를 사용하였다. 단백질이 발현된 세포를 1×램리 용액에서 2분간 끓여서 세포 파쇄액을 만든다. 이를 10% SDS-폴리 아크릴 아마이드 젤에서 전기 영동하여 분리 후 분리된 단백질을 Immobilon-P 멤브레인(밀리포어사)에 옮긴다. 멤브레인을 10% 스킨 밀크를 넣은 1×TBS 용액에서 1 시간 이상 담근 후 여기에 각 항체를 1:1000으로 묽힌 상태에서 처리 후 1시간 더 적당히 흔들어 주면서 방치한다. 이 후에 1×TBS 용액으로 5번 세척 후 HRP가 붙어있는 2차 항체인 항 염소 IgG 혹은 항 마우스 IgG, 혹은 항 토끼 IgG(시그마사)를 사용한 1차 항체를 만든 숙주 동물의 종류에 맞게 각각 1시간 처리하고 이를 다시 세척 후 케미루미니슨스 방법으로 멤브레인에 부착된 항체의 신호를 확인한다. As an antibody that recognizes a DDR2 protein expressed in insect cells, a polyclonal anti-DDR2 rabbit IgG antibody H-108 antibody (Santa Cruz Co., Ltd.), which recognizes an amino acid 292-399 site located in the extracellular domain, was used. To recognize DDR2 expressed in HEK293 cells, an anti-DDR2 goat IgG antibody that recognizes the extracellular domain of human DDR2 purchased from R & D systems was used. As an antibody that recognizes the insulin receptor, a CT-3 antibody, a monoclonal anti-insulin receptor mouse IgG antibody, which is an antibody that recognizes the insulin receptor c-terminus purchased from Santa Cruz, was used. As an antibody that recognizes EGFR, a polyclonal anti-EGFR goat IgG antibody that recognizes the c-terminus of human EGFR purchased from Santa Cruz was used. As an antibody that recognizes phosphorylated tyrosine, a P-Tyr-100 antibody, which is a monoclonal anti-phosphotyrosine mouse IgG antibody that recognizes phosphorylated tyrosine in a protein purchased from Cell Signaling Technology, was used. Protein-expressed cells are boiled in 1 × Lamley solution for 2 minutes to form cell disruption solution. It is electrophoresed on a 10% SDS-polyacrylamide gel, after which the separated protein is transferred to an Immobilon-P membrane (Millipore). After immersing the membrane in 1 × TBS solution containing 10% skin milk for at least 1 hour, each antibody is diluted 1: 1000 and left for 1 hour after shaking. After washing 5 times with 1 × TBS solution, 1 was prepared according to the type of host animal that made the primary antibody using HRP-attached secondary antibody, anti goat IgG or anti mouse IgG, or anti rabbit IgG (Sigma). After time treatment and washing it again, the chemiluminescence method confirms the signal of the antibody attached to the membrane.

도 1에서 보는 바와 같이 DDR2 혹은 DDR2의 c-말단 세포질 노출 도메 인(DDR2-C)만을 발현하는 sf9 곤충세포 파쇄액과 DDR2를 발현하는 HEK293 세포의 파쇄액을 각각 SDS-폴리아크릴아마이드젤에서 전기영동 후 DDR2의 N-말단 부위를 인식하는 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅한 결과, 곤충세포에서 발현되는 DDR2와 동물세포에서 발현한 DDR2가 서로 분자량에 차이가 없음을 확인하였다. As shown in FIG. 1, sf9 insect cell lysate expressing only the c-terminal cytoplasmic exposure domain (DDR2-C) of DDR2 or DDR2 and lysate of HEK293 cells expressing DDR2 were respectively transferred from SDS-polyacrylamide gel. As a result of Western blotting using an antibody recognizing the N-terminal region of DDR2 after the electrophoresis, it was confirmed that DDR2 expressed in insect cells and DDR2 expressed in animal cells did not differ in molecular weight from each other.

<실시예 5> 발현된 단백질의 세포내 위치Example 5 Intracellular Location of Expressed Protein

DDR2, DDR2의 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 c-말단 세포질 노출 도메인(DDR2-C) 또는 DDR2의 세포외 도메인과 인슐린 수용체의 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 c-말단을 융합한 키메라 단백질(DDR2-E/IR-C)이 발현하도록 코딩된 배큘로 바이러스를 하루나 이틀간 sf9 세포에 감염시킨 후 감염된 sf9 세포가 여전히 배양 슬라이드에 부착되어 있을 때 1% 포르말린으로 고정시킨 후 PBS에 녹인 0.25%의 트리톤 X-100 용액을 30분간 처리하여 세포막을 통과성을 가지게 하거나 혹은 처리하지 않은 상태에서 PBS에 녹인 1% BSA 용액을 처리하여 곤충세포가 고정된 배양 슬라이드를 3 시간 블록킹한 후 상기에 언급한 DDR2의 N-말단을 인식하는 항체인 H-108 항체를(산타크루주사)를 1 시간 처리하였다. 이를 PBS로 3번 씻어낸 후 산타크루즈사에서 구입한 FITC가 융합된 토끼 IgG을 인식하는 항-IgG1 염소 IgG 항체를 45분간 처리한다. 마지막으로 시료를 PBS로 씻어낸 후 발현된 단백질의 세포내 위치를 콘포칼 형광 현미경으로 영상화하였다. DDR2, c-terminal cytoplasmic exposure domain (DDR2-C) containing the tyrosine kinase domain of DDR2 or chimeric protein (DDR2-E / fusion of the extracellular domain of DDR2 and the c-terminus containing the tyrosine kinase domain of the insulin receptor Infected sf9 cells with one or two days of baculovirus encoded to express IR-C), fixed with 1% formalin when infected sf9 cells are still attached to the culture slide, and then dissolved in PBS 0.25% Triton X-100 The solution was treated for 30 minutes to allow cell membranes to pass through or after treatment with 1% BSA solution dissolved in PBS for 3 hours of blocking the culture slide to which insect cells were fixed. The H-108 antibody (Santa Cruz injection), which is a terminal recognition antibody, was treated for 1 hour. This was washed three times with PBS, and then treated with anti-IgG1 goat IgG antibody for 45 minutes to recognize rabbit IgG fused with FITC purchased from Santa Cruz. Finally, the sample was washed with PBS and the intracellular location of the expressed protein was imaged with a confocal fluorescence microscope.

그 결과 세포막 통과성을 가지게 하거나 혹은 그렇지 않은 경우에 차이가 없이 DDR2의 N-말단을 인식하는 항체가 발현된 DDR2 혹은 DDR2-E/IR-C를 세포막에서 같은 세기로 표식하는 것을 확인하였으며 이는 발현된 DDR2 혹은 DDR2-E/IR-C가 세포막에 존재하고 N-말단이 세포 밖으로 나오게끔 위치함을 보여주는 것이다(도 2). As a result, it was confirmed that DDR2 or DDR2-E / IR-C expressing the antibody which recognizes the N-terminus of DDR2 with or without cell membrane permeability was expressed at the same intensity on the cell membrane. DDR2 or DDR2-E / IR-C is present in the cell membrane and the N-terminus is located out of the cell (Fig. 2).

<실시예 6> DDR2 발현 곤충세포의 콜라겐 코팅 표면 결합 에세이Example 6 Collagen Coating Surface Binding Assay of DDR2 Expressing Insect Cells

세포 배양용 96 웰 플레이트나 ELISA 용으로 단백질 부착이 잘 되도록 표면을 개질한 96 웰 플레이트의 각 웰에 100-200 ug/ml 정도로 제 1형 콜라겐이나 다른 세포외 기질 단백질을 녹인 용액을 1시간 정도 가한 후 이를 PBS로 2번 세척하여 표면을 세포외 기질 단백질로 코팅한다. 콜라겐류 단백질은 0.01N 아세트산 용액에, 나머지 세포외 기질 단백질은 PBS에 녹여서 사용한다. 배양접시 바닥에 붙어 자라거나 서스펜션 배양중인 sf9 세포에 발현하고자하는 단백질을 코딩하는 배큘로 바이러스를 MOI 10으로 3일 정도 감염한다. 이때 sf9 세포는 감염된 배큘로 바이러스가 코딩하는 단백질을 발현하면서 동시에 배양접시에 붙는 성질을 잃어버린다. 감염된 sf9 곤충 세포를 형광물질로 표식하고자 표면에 바이오틴을 붙이기 위해 약 천 만개의 세포를 5 ml의 PBS 용액에 현탁시킨 후 2 mM 농도로 sulfo-NHS-biotinin(피어스사)을 넣었다. 이를 30 분간 실온에서 반응한 후 세포를 1,500 rpm에서 5분간 원심분리하여 수집 후 100 mM 글리신을 포함하는 PBS를 가하여 원심 분리하면서 세척하여 반응하지 않은 sulfo-NHS-biotinin을 제거하였다. 세척된 세포를 5 ml PBS에 현탁시킨 후 아비딘(Quantum dot corporation)으로 코팅된 Q dot 655 용액 20 ul를 가하여 상온에서 30분간 방치하였다. 이 후 세포를 다시 원심분리하고 PBS로 3번 이상 세척하여 반응하지 않은 Q dot 655를 제거한 후 10% FBS를 포함하는 5 ml TMN-FH 배지에 세포를 현탁시킨다. 이렇게 Q-dot으로 형광 표식된 sf9 세포 100 ul를 세포외 기질 단백질로 코팅된 96 웰 플레이트에 가하여 1 시간을 방치한 후 코팅된 웰에 부착되지 않은 sf9 세포를 조심스럽게 피펫팅으로 제거 후 웰을 3번 부드럽게 PBS로 세척한다. 코팅된 표면에 부착된 세포를 형광 현미경으로 관찰하면서 부착된 세포 사진을 찍는다. In a well of 96-well plate for cell culture or 96-well plate whose surface is modified for good protein adhesion for ELISA, a solution of collagen type 1 or other extracellular matrix protein is dissolved at about 100-200 ug / ml for about 1 hour. After addition it is washed twice with PBS to coat the surface with extracellular matrix protein. Collagen proteins are dissolved in 0.01 N acetic acid solution and the remaining extracellular matrix protein is dissolved in PBS. Baculoviruses encoding proteins to be expressed on sf9 cells growing on the bottom of the culture dish or in suspension culture are infected with MOI 10 for about 3 days. At this time, sf9 cells express the protein encoded by the infected baculovirus and at the same time lose their attachment to the culture dish. In order to label the infected sf9 insect cells with fluorescent material, about 10 million cells were suspended in 5 ml of PBS solution in order to attach biotin to the surface, and sulfo-NHS-biotinin (Pierce) was added at a concentration of 2 mM. After reacting for 30 minutes at room temperature, the cells were collected by centrifugation at 1,500 rpm for 5 minutes, and then PBS containing 100 mM glycine was added and washed by centrifugation to remove unreacted sulfo-NHS-biotinin. The washed cells were suspended in 5 ml PBS, and 20 ul of a Q dot 655 solution coated with avidin (Quantum dot corporation) was added thereto and left at room temperature for 30 minutes. Thereafter, the cells are centrifuged again and washed three times or more with PBS to remove unreacted Q dot 655, and the cells are suspended in 5 ml TMN-FH medium containing 10% FBS. Thus, 100 ul of fluorescently labeled sf9 cells with Q-dot were added to a 96 well plate coated with extracellular matrix protein, and left for 1 hour, after which sf9 cells not attached to the coated well were carefully pipetted and then the wells were removed. Wash gently with PBS three times. The attached cells are photographed while observing the cells attached to the coated surface with a fluorescence microscope.

DDR2, DDR2의 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 c-말단 세포질 노출 부위(DDR2-C) 또는 DDR2 세포외 노출 부위와 인슐린 수용체의 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 c-말단을 융합한 키메라 단백질(DDR2-E/IR-C)을 발현하는 곤충세포의 표면을 Q dot으로 표식 후 제 1형 콜라겐으로 코팅한 배양플레이트에 넣고 부착시킨 후 부착되지 않은 세포를 세척 후 형광현미경으로 영상화하였다. DDR2, a c-terminal cytoplasmic exposure site (DDR2-C) containing the tyrosine kinase domain of DDR2 or a chimeric protein (DDR2-E / fused to a c-terminus containing the tyrosine kinase domain of the insulin receptor with a DDR2 extracellular exposure site) The surface of the insect cells expressing IR-C) was marked with Q dot, and then placed in a culture plate coated with collagen type 1, and then attached, and the unattached cells were washed and imaged with a fluorescence microscope.

그 결과 DDR2와 DDR2 세포외 노출 부위와 인슐린 수용체의 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 c-말단을 융합한 키메라 단백질(DDR2-E/IR-C)과 같이 콜라겐과 결합할 수 있는 DDR2의 N-말단 도메인을 가진 단백질이 곤충세포의 세포막에 발현되면 콜라겐이 코팅된 표면에 부착되는 성질을 가짐을 확인하였다(도 3). As a result, the N-terminal domain of DDR2 capable of binding collagen, such as a chimeric protein (DDR2-E / IR-C) fused with c-terminus containing the DDR2 and DDR2 extracellular exposure sites and the tyrosine kinase domain of the insulin receptor. When the protein with the expression of the cell membrane of the insect cell was confirmed to have the property to adhere to the collagen coated surface (Fig. 3).

또 다른 에세이 방법으로 배큘로 바이러스로 3일간 감염시킨 곤충세포를 형광물질 등으로 표식하지 않고 곧 바로 세포외 기질로 코팅된 96 웰 플레이트에 가하여 1시간을 방치한 후 동일한 부피의 포르말린 용액을 가하여 코팅된 표면에 부착된 세포를 고정한다. 이때 부착되지 않은 세포는 파괴된다. 세포가 고정된 웰을 물로 여러 번 씻은 후 1% 아세트산 용액에 녹인 0.1 % SRB(sulfo-rhodamine B, 시그마사) 용액을 가하여 세포를 염색 후 1% 아세트산 용액으로 씻어낸 후 말린다. SRB로 염색된 세포를 광학현미경 하에서 사진을 찍는다. 세포에 침착된 SRB를 각 96 웰 플레이트의 각 웰에 100 ul의 0.1M Tris-HCl(pH 8.0) 용액을 가하여 10분간 흔들어 우려낸 후 520 nM에서 흡광도를 측정하여 정량한다. 이때 흡광도는 고정된 세포 수에 비례한다. In another assay method, insect cells infected with baculovirus for 3 days were immediately added to a 96-well plate coated with an extracellular matrix without being labeled with fluorescent material, and left for 1 hour, followed by coating with an equal volume of formalin solution. Fix the cells attached to the surface. Unattached cells are then destroyed. The wells in which the cells are fixed are washed several times with water, and then 0.1% SRB (sulfo-rhodamine B, Sigma) solution dissolved in 1% acetic acid solution is added, the cells are stained, washed with 1% acetic acid solution and dried. Cells stained with SRB are photographed under an optical microscope. SRB deposited on the cells was quantitated by shaking for 10 minutes by adding 100 ul of 0.1M Tris-HCl (pH 8.0) solution to each well of each 96 well plate and measuring absorbance at 520 nM. The absorbance is then proportional to the fixed number of cells.

도 4는 상기 에세이 방법으로 DDR2와 DDR2 세포외 노출 부위와 인슐린 수용체의 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 c-말단을 융합한 키메라 단백질(DDR2-E/IR-C)과 같이 콜라겐과 결합할 수 있는 DDR2의 N-말단 도메인을 가진 단백질을 발현하는 곤충세포가 콜라겐이 코팅된 표면에 부착되고 포르말린으로 콜라겐이 코팅된 표면에 고정할 수 있음을 확인한 결과이다. Figure 4 is a method for assaying DDR2 and DDR2 can be combined with collagen, such as a chimeric protein (DDR2-E / IR-C) fused c-terminus containing the DDR2 extracellular exposure site and the tyrosine kinase domain of the insulin receptor Insect cells expressing the protein with the N-terminal domain of the result was confirmed that the surface can be attached to the collagen-coated surface and fixed to the collagen-coated surface with formalin.

도 5는 상기 에세이 방법으로 세포에 염색된 SRB를 1% 아세트산 용액으로 추출하여 520 nM에서 흡광도를 측정하여 부착된 세포의 상대적인 숫자를 정량한 결과를 나타내는 것이다. 평균값과 표준 편차를 막대그래프로 표시하였으며 흰색막대는 제 1형 콜라겐이 코팅된 표면에 세포가 부착된 것이며 검은 색 막대는 코팅되지 않은 표면에 세포를 부착시킨 것으로 DDR2의 N-말단 도메인을 가진 단백질을 발현하는 곤충세포가 콜라겐이 코팅된 표면에 부착되는 것을 확인할 수 있다.Figure 5 shows the result of quantifying the relative number of the cells attached by extracting the SRB stained in the cells by the above assay method with 1% acetic acid solution and absorbance at 520 nM. The mean value and standard deviation are shown in a bar graph. The white bar shows the cells attached to the collagen-coated surface, and the black bar shows the cells attached to the uncoated surface. It can be seen that the insect cells expressing adhered to the collagen-coated surface.

<실시예 7> 세포외 기질 단백질과 DDR2 단백질과의 결합 측정Example 7 Measurement of Binding of Extracellular Matrix Protein and DDR2 Protein

젤라틴, 파이브로넥틴, 라미닌 및 제 1형, 제 2형, 제 3형 콜라겐과 같은 세포외 기질 단백질을 배양접시 표면에 코팅 후 DDR2를 발현하거나 혹은 DDR2의 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 c-말단 세포질 노출 부위만을 발현하는 sf9 세포를 부 착시킨 후 부착된 세포를 포르말린으로 고정하고 이를 SRB로 염색한 후 염색된 SRB를 추출하여 520 nM에서 흡광도를 측정하여 부착된 세포수를 상대적으로 측정하였다.     C-terminal cytoplasm containing gelatin, fibronectin, laminin and extracellular matrix proteins such as type 1, type 2, type 3 collagen on the surface of the culture dish and expressing DDR2 or comprising the tyrosine kinase domain of DDR2 After attaching sf9 cells expressing only the exposed site, the attached cells were fixed with formalin, stained with SRB, and then stained with SRB, and absorbance was measured at 520 nM.

그 결과 도 6에서 보는 바와 같이 DDR2의 리간드로 알려진 제 1형, 제 2형, 제 3형 콜라겐으로 코팅된 표면에만 유의성 있게 DDR2를 발현하는 sf9 곤충세포가 부착됨을 보여줌으로써 DDR2를 발현하는 sf9 세포와 콜라겐으로 코팅된 표면사이의 부착력은 DDR2의 세포외 도메인과 코팅된 콜라겐 분자 사이의 결합에 의한 것임을 확인시켜준 것이다.As a result, as shown in Fig. 6, sf9 cells expressing DDR2 by showing that sf9 insect cells expressing DDR2 significantly adhered only to surfaces coated with collagen type 1, type 2, and type 3 known as ligands of DDR2. The adhesion between and the surface coated with collagen was confirmed by the bond between the extracellular domain of DDR2 and the coated collagen molecule.

<시험예 1> DDR 단백질과 콜라겐 결합을 저해하는 화합물 검색<Test Example 1> Search for compounds that inhibit DDR protein and collagen binding

상기 실시예에서 제시한 DDR2와 콜라겐 결합을 저해하는 물질의 검색법을 이용하여 1,500개의 약물을 모아놓은 화합물 라이브러리에서 이들 결합을 저해하는 물질을 선별하였다. Substances that inhibit these bindings were selected from a compound library of 1,500 drugs using a screening method for inhibiting collagen binding with DDR2 shown in the above examples.

먼저 제 1형 콜라겐으로 코팅된 96웰 배양접시나 ELISA 플레이트를 100 ul의 세포 배양액에 있는 100만개의 DDR2를 발현하는 배큘로 바이러스로 3일간 감염시킨 sf9 세포를 200 uM의 라이브러리 화합물과 동시에 가한 후 이 배양접시를 약 1시간 정도 약하게 흔들어 준다. 여기에 100 ul의 포르말린 용액을 가하여 세포를 고정한다. 부착되지 않은 세포와 배양액을 물로 씻어낸 후 부착된 세포를 SRB로 염색하고 염색된 SRB를 용출하여 흡광도를 측정하여 부착된 세포의 양을 정량하여 부착된 세포의 양을 줄이는 후보 화합물을 선별하였다. 이 선별된 화합물이 실지로 DDR2와 콜라겐과의 결합 저해에 특이적으로 작용하는지를 확인하기 위하여 바이러스를 감염시키지 않아서 배양접시 표면에 잘 부착되는 성질을 가지고 있는 sf9 세포에 이 화합물 처리 시 배양접시 표면에 부착되는 성질의 변화가 생기는지를 관찰하여 바이러스를 감염하지 않은 sf9 세포가 배양접시표면에 부착되는 것을 저해하지 않는 화합물을 다시 선별하였다. First, sf9 cells infected with 1 million DDR2 expressing 1 million DDR2 cells in 100 ul of cell culture medium coated with a type 1 collagen or an ELISA plate were added simultaneously with 200 uM of library compounds. Shake the culture dish gently for about 1 hour. 100 ul of formalin solution is added thereto to fix the cells. After washing out the cells and the culture medium with no adherence, the attached cells were stained with SRB and the stained SRB was eluted to measure the absorbance to quantify the amount of adhered cells to select candidate compounds that reduce the amount of adhered cells. In order to confirm whether the selected compound actually acts specifically to inhibit the binding of DDR2 and collagen, it adheres to the surface of the culture plate when the compound is treated to sf9 cells that do not infect the virus and adhere well to the surface of the culture plate. By observing the change in the properties, the compounds which did not inhibit the virus-infected sf9 cells from adhering to the culture plate surface were reselected.

상기 검색방법으로 본 발명에서는 악티노마이신 D 화합물을 발굴하였다. 악티노마이신 D는 DDR2를 발현하는 곤충세포의 콜라겐으로 코팅된 표면에 부착은 IC50= 20 uM 정도로 저해하였지만 대조군으로 전장 DDR1b를 발현하도록 한 곤충세포가 제 1형 콜라겐으로 코팅된 표면에 부착되는 것은 거의 저해하지 않았고 동시에 바이러스를 감염하지 않은 sf9 세포가 배양접시 표면에 부착되는 것도 저해하지 않았다(도 7). In this invention, the actinomycin D compound was discovered by the said search method. Actinomycin D inhibited IC 50 = 20 uM adhesion to the collagen-coated surface of insect cells expressing DDR2, but insect cells that expressed full-length DDR1b as a control were attached to the surface coated with type 1 collagen. Almost no inhibition and at the same time did not inhibit the virus-infected sf9 cells adhered to the culture plate surface (FIG. 7).

실지로 본 발명에서 기술한 검색법으로 발굴한 악티노마이신 D가 제 1형 콜라겐에 의한 DDR2 활성화를 동물세포에서도 저해하는지 알기 위하여 DDR2를 발현하는 HEK293 세포를 제 1형 콜라겐이 코팅된 배양접시에 플레이팅 한 후 악티노마이신 D를 농도를 바꾸어가며 처리하여 DDR2가 콜라겐에 의해 활성화되면서 증가하는 티로신 인산화가 감소하는지를 살펴 본 결과, 악티노마이신 D 농도 20 uM 정도에서 약 50% 정도 그 인산화 증가를 저해하였다(도 8). In fact, in order to know whether actinomycin D discovered by the screening method described in the present invention inhibits DDR2 activation by type 1 collagen in animal cells, we also play HEK293 cells expressing type 2 collagen in a culture plate coated with type 1 collagen. Actinomycin D was treated with varying concentrations to determine if the increased tyrosine phosphorylation decreased as DDR2 was activated by collagen, which inhibited the increase in phosphorylation by about 50% at 20 uM of actinomycin D concentration. (FIG. 8).

반면에 악티노마이신 D는 또 다른 세포막 수용체 티로신 키나아제인 EGFR이나 인슐린 수용체가 그 리간드에 의해 활성화되는 것에는 100 uM의 고농도 처리에 도 영향을 미치지 않았다. Actinomycin D, on the other hand, did not affect the high concentration of 100 uM of activation of another cell membrane receptor tyrosine kinase, EGFR or insulin receptor.

즉, 도 9는 배양 접시에 EGFR을 발현하는 HEK293 세포를 플레이팅 후 EGF와 악티노마이신 D를 농도별로 처리한 후 세포 파쇄액을 만들어 SDS-PAGE에서 전기영동 후 인산화 티로신을 특이적으로 인식하는 항체와 EGFR을 인식하는 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅한 결과로서 EGFR이 EGF에 의해 활성화되어 티로신 인산화되는 것을 악티노마이신 D가 방해하지 않음을 보여준다.That is, FIG. 9 is to plate the HEK293 cells expressing EGFR in the culture dish, and then treated with EGF and actinomycin D by concentration to make cell disruption to specifically recognize phosphorylated tyrosine after electrophoresis on SDS-PAGE Western blotting with antibodies and antibodies that recognize EGFR show that actinomycin D does not interfere with EGFR activation by EGF and tyrosine phosphorylation.

또한, 도 10은 배양 접시에 인슐린 수용체를 발현하는 HEK293 세포를 플레이팅하고 인슐린과 악티노마이신 D를 농도별로 처리한 후 세포 파쇄액을 만들어 SDS-PAGE에서 전기영동 후 인산화 티로신을 특이적으로 인식하는 항체와 인슐린 수용체를 인식하는 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅한 결과로서 인슐린 수용체가 인슐린에 의해 활성화되어 티로신 인산화되는 것을 악티노마이신 D가 방해하지 않음을 보여준다. In addition, FIG. 10 is plated HEK293 cells expressing the insulin receptor in the culture dish, and treated with insulin and actinomycin D by concentration to make a cell disruption to specifically recognize phosphorylated tyrosine after electrophoresis on SDS-PAGE Western blotting using an antibody that recognizes the antibody and the insulin receptor shows that actinomycin D does not interfere with the activation of the insulin receptor by tyrosine phosphorylation by the insulin.

상기 결과는 동물세포에서도 본 검색법에 의해 발굴된 DDR2-콜라겐 결합 저해제인 악티노마이신 D가 특이적으로 리간드 콜라겐에 의한 DDR2 활성화를 저해함을 증명한다. 따라서 이러한 본 발명에서 제시한 DDR2와 콜라겐 결합을 억제하는 물질의 검색법에 의해 발굴된 악티노마이신 D 화합물의 분석 결과는 본 발명의 검색법이 유용하다는 것을 증명한다. The above results demonstrate that actinomycin D, a DDR2-collagen binding inhibitor discovered by this screening method, in animal cells specifically inhibits DDR2 activation by ligand collagen. Therefore, the analysis results of the actinomycin D compound discovered by the screening method of the substance inhibiting collagen binding with DDR2 presented in the present invention proves that the screening method of the present invention is useful.

도 1은 DDR2 또는 DDR2의 c-말단 세포질 노출 도메인(DDR2-C)만을 발현하는 sf9 곤충세포 파쇄액과 DDR2를 발현하는 HEK293 세포의 파쇄액을 각각 SDS-폴리아크릴아마이드젤에서 전기영동 후 웨스턴 블롯팅한 결과를 나타낸 도면이다. FIG. 1 shows Western blots of sf9 insect cell lysate expressing only c-terminal cytoplasmic exposure domain (DDR2-C) of DDR2 or DDR2 and lysate of HEK293 cells expressing DDR2 in SDS-polyacrylamide gel, respectively. It is a figure which shows the result of a lot.

도 2는 DDR2, DDR2의 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 c-말단 세포질 노출 도메인(DDR2-C) 또는 DDR2의 세포외 도메인과 인슐린 수용체의 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 c-말단을 융합한 키메라 단백질(DDR2-E/IR-C)의 sf9 세포내 위치를 콘포칼 형광 현미경으로 영상화한 결과를 나타낸 도면이다. 2 is a chimeric protein (DDR2 fused to a c-terminal cytoplasmic exposure domain (DDR2-C) comprising a tyrosine kinase domain of DDR2, or an extracellular domain of DDR2 and a c-terminus comprising a tyrosine kinase domain of an insulin receptor. -E / IR-C) shows the results of imaging the sf9 intracellular position with a confocal fluorescence microscope.

도 3은 DDR2, DDR2의 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 c-말단 세포질 노출 부위(DDR2-C) 또는 DDR2 세포외 노출 부위와 인슐린 수용체의 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 c-말단을 융합한 키메라 단백질(DDR2-E/IR-C)를 발현하는 곤충세포의 표면을 Q dot으로 표식 후 제 1형 콜라겐으로 코팅한 배양플레이트에 부착한 세포를 형광현미경으로 영상화한 결과를 나타낸 도면이다. 3 is a chimeric protein (DDR2 fused to a c-terminal cytoplasmic exposure site (DDR2-C) comprising a tyrosine kinase domain of DDR2, DDR2 or a c-terminus comprising a tyrosine kinase domain of an insulin receptor with a DDR2 extracellular exposure site; -E / IR-C) is a diagram showing the results of imaging the cells attached to the culture plate coated with collagen type 1 after marking the surface of the insect cells expressed by Q dot with a fluorescence microscope.

도 4는 발현한 곤충세포를 형광 표식 없이 바로 제 1형 콜라겐으로 코팅한 배양 플레이트에 넣고 부착된 세포를 고정하고 SRB로 염색 후 광학현미경하에서 찍은 사진을 나타내는 도면이다. FIG. 4 is a diagram showing photographs taken under an optical microscope after inserting insect cells into culture plates coated with collagen type 1 directly without fluorescent labeling, fixing cells attached thereto, and staining with SRB. FIG.

도 5는 도 4에서 고정된 세포에 염색된 SRB를 용매로 추출하여 520 nM에서 흡광도를 측정하여 부착된 세포의 상대적인 숫자를 정량한 결과로서 평균값과 표준 편차를 막대 그래프로 표시한 것이다.Figure 5 shows the average value and the standard deviation as a bar graph as a result of quantifying the relative number of the attached cells by measuring the absorbance at 520 nM by extracting the SRB stained to the fixed cells in Figure 4 with a solvent.

도 6은 여러 종류의 세포외 기질 단백질을 배양접시 표면에 코팅 후 DDR2를 발현하거나(흰색 막대) 혹은 DDR2의 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 c-말단 세포질 노출 부위만을 발현하는(검은색 막대) sf9 세포를 부착시킨 후 부착된 세포의 흡광도를 측정하여 부착된 세포수를 상대적으로 측정한 결과이다. FIG. 6 shows sf9 cells expressing DDR2 (white bars) after coating various types of extracellular matrix proteins on the surface of the plate, or expressing only c-terminal cytoplasmic exposed sites containing the tyrosine kinase domain of DDR2 (black bars). After measuring the absorbance of the attached cells is a result of measuring the relative number of attached cells.

도 7은 악티노마이신 D가 DDR2와 콜라겐 결합을 특이적으로 저해하고 있음을 보여주는 도면이다. 7 shows that actinomycin D specifically inhibits DDR2 and collagen binding.

도 8은 DDR2가 콜라겐에 의해 활성화되어 티로신 인산화되는 것을 악티노마이신 D가 방해하는 것을 보여주는 도면이다. 8 shows actinomycin D interfering with DDR2 activation by collagen and tyrosine phosphorylation.

도 9는 EGFR이 EGF에 의해 활성화되어 티로신 인산화되는 것을 악티노마이신 D가 방해하지 않음을 보여주는 도면이다. FIG. 9 shows that actinomycin D does not interfere with EGFR activation by EGF and tyrosine phosphorylation.

도 10은 인슐린 수용체가 인슐린에 의해 활성화되어 티로신 인산화되는 것을 악티노마이신 D가 방해하지 않음을 보여주는 도면이다. FIG. 10 shows that actinomycin D does not interfere with insulin receptor activation by insulin and tyrosine phosphorylation.

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> The method for screening inhibitors on the binding of DDR proteins to collagens <130> 7p-10-03 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2567 <212> DNA <213> DDR2 cDNA <400> 1 atgatcctga ttcccagaat gctcttggtg ctgttcctgc tgctgcctat cttgagttct 60 gcaaaagctc aggttaatcc agctatatgc cgctatcctc tgggcatgtc aggaggccag 120 attccagatg aggacatcac agcttccagt cagtggtcag agtccacagc tgccaaatat 180 ggaaggctgg actcagaaga aggggatgga gcctggtgcc ctgagattcc agtggaacct 240 gatgacctga aggagtttct gcagattgac ttgcacaccc tccattttat cactctggtg 300 gggacccagg ggcgccatgc aggaggtcat ggcatcgagt ttgcccccat gtacaagatc 360 aattacagtc gggatggcac tcgctggatc tcttggcgga accgtcatgg gaaacaggtg 420 ctggatggaa atagtaaccc ctatgacatt ttcctaaagg acttggagcc gcccattgta 480 gccagatttg tccggttcat tccagtcacc gaccactcca tgaatgtgtg tatgagagtg 540 gagctttacg gctgtgtctg gctagatggc ttggtgtctt acaatgctcc agctgggcag 600 cagtttgtac tccctggagg ttccatcatt tatctgaatg attctgtcta tgatggagct 660 gttggataca gcatgacaga agggctaggc caattgaccg atggtgtgtc tggcctggac 720 gatttcaccc agacccatga ataccacgtg tggcccggct atgactatgt gggctggcgg 780 aacgagagtg ccaccaatgg ctacattgag atcatgtttg aatttgaccg catcaggaat 840 ttcactacca tgaaggtcca ctgcaacaac atgtttgcta aaggtgtgaa gatctttaag 900 gaggtacagt gctacttccg ctctgaagcc agtgagtggg aacctaatgc catttccttc 960 ccccttgtcc tggatgacgt caaccccagt gctcggtttg tcacggtgcc tctccaccac 1020 cgaatggcca gtgccatcaa gtgtcaatac cattttgcag atacctggat gatgttcagt 1080 gagatcacct tccaatcaga tgctgcaatg tacaacaact ctgaagccct gcccacctct 1140 cctatggcac ccacaaccta tgatccaatg cttaaagttg atgacagcaa cactcggatc 1200 ctgattggct gcttggtggc catcatcttt atcctcctgg ccatcattgt catcatcctc 1260 tggaggcagt tctggcagaa aatgctggag aaggcttctc ggaggatgct ggatgatgaa 1320 atgacagtca gcctttccct gccaagtgat tctagcatgt tcaacaataa ccgctcctca 1380 tcacctagtg aacaagggtc caactcgact tacgatcgca tctttcccct tcgccctgac 1440 taccaggagc catccaggct gatacgaaaa ctcccagaat ttgctccagg ggaggaggag 1500 tcaggctgca gcggtgttgt gaagccagtc cagcccagtg gccctgaggg ggtgccccac 1560 tatgcagagg ctgacatagt gaacctccaa ggagtgacag gaggcaacac atactcagtg 1620 cctgccgtca ccatggacct gctctcagga aaagatgtgg ctgtggagga gttccccagg 1680 aaactcctaa ctttcaaaga gaagctggga gaaggacagt ttggggaggt tcatctctgt 1740 gaagtggagg gaatggaaaa attcaaagac aaagattttg ccctagatgt cagtgccaac 1800 cagcctgtcc tggtggctgt gaaaatgctc cgagcagatg ccaacaagaa tgccaggaat 1860 gattttctta aggagataaa gatcatgtct cggctcaagg acccaaacat catccatcta 1920 ttagctgtgt gtatcactga tgaccctctc tgtatgatca ctgaatacat ggagaatgga 1980 gatctcaatc agtttctttc ccgccacgag ccccctaatt cttcctccag cgatgtacgc 2040 actgtcagtt acaccaatct gaagtttatg gctacccaaa ttgcctctgg catgaagtac 2100 ctttcctctc ttaattttgt tcaccgagat ctggccacac gaaactgttt agtgggtaag 2160 aactacacaa tcaagatagc tgactttgga atgagcagga acctgtacag tggtgactat 2220 taccggatcc agggccgggc agtgctccct atccgctgga tgtcttggga gagtatcttg 2280 ctgggcaagt tcactacagc aagtgatgtg tgggcctttg gggttacttt gtgggagact 2340 ttcacctttt gtcaagaaca gccctattcc cagctgtcag atgaacaggt tattgagaat 2400 actggagagt tcttccgaga ccaagggagg cagacttacc tccctcaacc agccatttgt 2460 cctgactctg tgtataagct gatgctcagc tgctggagaa gagatacgaa gaaccgtccc 2520 tcattccaag aaatccacct tctgctcctt caacaaggcg acgagtg 2567 <210> 2 <211> 440 <212> PRT <213> Domain containing extracellular and transmembrane region of DDR2 <400> 2 Met Ile Leu Ile Pro Arg Met Leu Leu Val Leu Phe Leu Leu Leu Pro 1 5 10 15 Ile Leu Ser Ser Ala Lys Ala Gln Val Asn Pro Ala Ile Cys Arg Tyr 20 25 30 Pro Leu Gly Met Ser Gly Gly Gln Ile Pro Asp Glu Asp Ile Thr Ala 35 40 45 Ser Ser Gln Trp Ser Glu Ser Thr Ala Ala Lys Tyr Gly Arg Leu Asp 50 55 60 Ser Glu Glu Gly Asp Gly Ala Trp Cys Pro Glu Ile Pro Val Glu Pro 65 70 75 80 Asp Asp Leu Lys Glu Phe Leu Gln Ile Asp Leu His Thr Leu His Phe 85 90 95 Ile Thr Leu Val Gly Thr Gln Gly Arg His Ala Gly Gly His Gly Ile 100 105 110 Glu Phe Ala Pro Met Tyr Lys Ile Asn Tyr Ser Arg Asp Gly Thr Arg 115 120 125 Trp Ile Ser Trp Arg Asn Arg His Gly Lys Gln Val Leu Asp Gly Asn 130 135 140 Ser Asn Pro Tyr Asp Ile Phe Leu Lys Asp Leu Glu Pro Pro Ile Val 145 150 155 160 Ala Arg Phe Val Arg Phe Ile Pro Val Thr Asp His Ser Met Asn Val 165 170 175 Cys Met Arg Val Glu Leu Tyr Gly Cys Val Trp Leu Asp Gly Leu Val 180 185 190 Ser Tyr Asn Ala Pro Ala Gly Gln Gln Phe Val Leu Pro Gly Gly Ser 195 200 205 Ile Ile Tyr Leu Asn Asp Ser Val Tyr Asp Gly Ala Val Gly Tyr Ser 210 215 220 Met Thr Glu Gly Leu Gly Gln Leu Thr Asp Gly Val Ser Gly Leu Asp 225 230 235 240 Asp Phe Thr Gln Thr His Glu Tyr His Val Trp Pro Gly Tyr Asp Tyr 245 250 255 Val Gly Trp Arg Asn Glu Ser Ala Thr Asn Gly Tyr Ile Glu Ile Met 260 265 270 Phe Glu Phe Asp Arg Ile Arg Asn Phe Thr Thr Met Lys Val His Cys 275 280 285 Asn Asn Met Phe Ala Lys Gly Val Lys Ile Phe Lys Glu Val Gln Cys 290 295 300 Tyr Phe Arg Ser Glu Ala Ser Glu Trp Glu Pro Asn Ala Ile Ser Phe 305 310 315 320 Pro Leu Val Leu Asp Asp Val Asn Pro Ser Ala Arg Phe Val Thr Val 325 330 335 Pro Leu His His Arg Met Ala Ser Ala Ile Lys Cys Gln Tyr His Phe 340 345 350 Ala Asp Thr Trp Met Met Phe Ser Glu Ile Thr Phe Gln Ser Asp Ala 355 360 365 Ala Met Tyr Asn Asn Ser Glu Ala Leu Pro Thr Ser Pro Met Ala Pro 370 375 380 Thr Thr Tyr Asp Pro Met Leu Lys Val Asp Asp Ser Asn Thr Arg Ile 385 390 395 400 Leu Ile Gly Cys Leu Val Ala Ile Ile Phe Ile Leu Leu Ala Ile Ile 405 410 415 Val Ile Ile Leu Trp Arg Gln Phe Trp Gln Lys Met Leu Glu Lys Ala 420 425 430 Ser Arg Arg Met Leu Asp Asp Glu 435 440 <210> 3 <211> 378 <212> PRT <213> Tyrosine kinase activation domain of Insuline Receptor <400> 3 Val Phe Pro Cys Ser Val Tyr Val Pro Asp Glu Trp Glu Val Ser Arg 1 5 10 15 Glu Lys Ile Thr Leu Leu Arg Glu Leu Gly Gln Gly Ser Phe Gly Met 20 25 30 Val Tyr Glu Gly Asn Ala Arg Asp Ile Ile Lys Gly Glu Ala Glu Thr 35 40 45 Arg Val Ala Val Lys Thr Val Asn Glu Ser Ala Ser Leu Arg Glu Arg 50 55 60 Ile Glu Phe Leu Asn Glu Ala Ser Val Met Lys Gly Phe Thr Cys His 65 70 75 80 His Val Val Arg Leu Leu Gly Val Val Ser Lys Gly Gln Pro Thr Leu 85 90 95 Val Val Met Glu Leu Met Ala His Gly Asp Leu Lys Ser Tyr Leu Arg 100 105 110 Ser Leu Arg Pro Glu Ala Glu Asn Asn Pro Gly Arg Pro Pro Pro Thr 115 120 125 Leu Gln Glu Met Ile Gln Met Ala Ala Glu Ile Ala Asp Gly Met Ala 130 135 140 Tyr Leu Asn Ala Lys Lys Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn 145 150 155 160 Cys Met Val Ala His Asp Phe Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met 165 170 175 Thr Arg Asp Ile Tyr Glu Thr Asp Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly Lys Gly 180 185 190 Leu Leu Pro Val Arg Trp Met Ala Pro Glu Ser Leu Lys Asp Gly Val 195 200 205 Phe Thr Thr Ser Ser Asp Met Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp Glu 210 215 220 Ile Thr Ser Leu Ala Glu Gln Pro Tyr Gln Gly Leu Ser Asn Glu Gln 225 230 235 240 Val Leu Lys Phe Val Met Asp Gly Gly Tyr Leu Asp Gln Pro Asp Asn 245 250 255 Cys Pro Glu Arg Val Thr Asp Leu Met Arg Met Cys Trp Gln Phe Asn 260 265 270 Pro Lys Met Arg Pro Thr Phe Leu Glu Ile Val Asn Leu Leu Lys Asp 275 280 285 Asp Leu His Pro Ser Phe Pro Glu Val Ser Phe Phe His Ser Glu Glu 290 295 300 Asn Lys Ala Pro Glu Ser Glu Glu Leu Glu Met Glu Phe Glu Asp Met 305 310 315 320 Glu Asn Val Pro Leu Asp Arg Ser Ser His Cys Gln Arg Glu Glu Ala 325 330 335 Gly Gly Arg Asp Gly Gly Ser Ser Leu Gly Phe Lys Arg Ser Tyr Glu 340 345 350 Glu His Ile Pro Tyr Thr His Met Asn Gly Gly Lys Lys Asn Gly Arg 355 360 365 Ile Leu Thr Leu Pro Arg Ser Asn Pro Ser 370 375 <210> 4 <211> 415 <212> PRT <213> Tyrosine kinase activation domain of DDR2 <400> 4 Met Thr Val Ser Leu Ser Leu Pro Ser Asp Ser Ser Met Phe Asn Asn 1 5 10 15 Asn Arg Ser Ser Ser Pro Ser Glu Gln Gly Ser Asn Ser Thr Tyr Asp 20 25 30 Arg Ile Phe Pro Leu Arg Pro Asp Tyr Gln Glu Pro Ser Arg Leu Ile 35 40 45 Arg Lys Leu Pro Glu Phe Ala Pro Gly Glu Glu Glu Ser Gly Cys Ser 50 55 60 Gly Val Val Lys Pro Val Gln Pro Ser Gly Pro Glu Gly Val Pro His 65 70 75 80 Tyr Ala Glu Ala Asp Ile Val Asn Leu Gln Gly Val Thr Gly Gly Asn 85 90 95 Thr Tyr Ser Val Pro Ala Val Thr Met Asp Leu Leu Ser Gly Lys Asp 100 105 110 Val Ala Val Glu Glu Phe Pro Arg Lys Leu Leu 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Ala Phe Gly Val Thr 325 330 335 Leu Trp Glu Thr Phe Thr Phe Cys Gln Glu Gln Pro Tyr Ser Gln Leu 340 345 350 Ser Asp Glu Gln Val Ile Glu Asn Thr Gly Glu Phe Phe Arg Asp Gln 355 360 365 Gly Arg Gln Thr Tyr Leu Pro Gln Pro Ala Ile Cys Pro Asp Ser Val 370 375 380 Tyr Lys Leu Met Leu Ser Cys Trp Arg Arg Asp Thr Lys Asn Arg Pro 385 390 395 400 Ser Phe Gln Glu Ile His Leu Leu Leu Leu Gln Gln Gly Asp Glu 405 410 415 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for tyrosine kinase activation domain of Insuline Receptor <400> 5 ggccatgggt gtttccatgc tctgtg 26 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for tyronie kinase activation domain of Insuline Receptor <400> 6 gggaattctt aggaaggatt ggaccg 26 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for tyrosine kinase activation domain of DDR2 <400> 7 ggggatccac agtcagcctt tccctg 26 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for tyrosine kinase activation domain of DDR2 <400> 8 gggaattctc actcgtcgcc ttgtt 25 <110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> The method for screening inhibitors on the binding of DDR          proteins to collagens <130> 7p-10-03 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2567 <212> DNA <213> DDR2 cDNA <400> 1 atgatcctga ttcccagaat gctcttggtg ctgttcctgc tgctgcctat cttgagttct 60 gcaaaagctc aggttaatcc agctatatgc cgctatcctc tgggcatgtc aggaggccag 120 attccagatg aggacatcac agcttccagt cagtggtcag agtccacagc tgccaaatat 180 ggaaggctgg actcagaaga aggggatgga gcctggtgcc ctgagattcc agtggaacct 240 gatgacctga aggagtttct gcagattgac ttgcacaccc tccattttat cactctggtg 300 gggacccagg ggcgccatgc aggaggtcat ggcatcgagt ttgcccccat gtacaagatc 360 aattacagtc gggatggcac tcgctggatc tcttggcgga accgtcatgg gaaacaggtg 420 ctggatggaa atagtaaccc ctatgacatt ttcctaaagg acttggagcc gcccattgta 480 gccagatttg tccggttcat tccagtcacc gaccactcca tgaatgtgtg tatgagagtg 540 gagctttacg gctgtgtctg gctagatggc ttggtgtctt acaatgctcc agctgggcag 600 cagtttgtac tccctggagg ttccatcatt tatctgaatg attctgtcta tgatggagct 660 gttggataca gcatgacaga agggctaggc caattgaccg atggtgtgtc tggcctggac 720 gatttcaccc agacccatga ataccacgtg tggcccggct atgactatgt gggctggcgg 780 aacgagagtg ccaccaatgg ctacattgag atcatgtttg aatttgaccg catcaggaat 840 ttcactacca tgaaggtcca ctgcaacaac atgtttgcta aaggtgtgaa gatctttaag 900 gaggtacagt gctacttccg ctctgaagcc agtgagtggg aacctaatgc catttccttc 960 ccccttgtcc tggatgacgt caaccccagt gctcggtttg tcacggtgcc tctccaccac 1020 cgaatggcca gtgccatcaa gtgtcaatac cattttgcag atacctggat gatgttcagt 1080 gagatcacct tccaatcaga tgctgcaatg tacaacaact ctgaagccct gcccacctct 1140 cctatggcac ccacaaccta tgatccaatg cttaaagttg atgacagcaa cactcggatc 1200 ctgattggct gcttggtggc catcatcttt atcctcctgg ccatcattgt catcatcctc 1260 tggaggcagt tctggcagaa aatgctggag aaggcttctc ggaggatgct ggatgatgaa 1320 atgacagtca gcctttccct gccaagtgat tctagcatgt tcaacaataa ccgctcctca 1380 tcacctagtg aacaagggtc caactcgact tacgatcgca tctttcccct tcgccctgac 1440 taccaggagc catccaggct gatacgaaaa ctcccagaat ttgctccagg ggaggaggag 1500 tcaggctgca gcggtgttgt gaagccagtc cagcccagtg gccctgaggg ggtgccccac 1560 tatgcagagg ctgacatagt gaacctccaa ggagtgacag gaggcaacac atactcagtg 1620 cctgccgtca ccatggacct gctctcagga aaagatgtgg ctgtggagga gttccccagg 1680 aaactcctaa ctttcaaaga gaagctggga gaaggacagt ttggggaggt tcatctctgt 1740 gaagtggagg gaatggaaaa attcaaagac aaagattttg ccctagatgt cagtgccaac 1800 cagcctgtcc tggtggctgt gaaaatgctc cgagcagatg ccaacaagaa tgccaggaat 1860 gattttctta aggagataaa gatcatgtct cggctcaagg acccaaacat catccatcta 1920 ttagctgtgt gtatcactga tgaccctctc tgtatgatca ctgaatacat ggagaatgga 1980 gatctcaatc agtttctttc ccgccacgag ccccctaatt cttcctccag cgatgtacgc 2040 actgtcagtt acaccaatct gaagtttatg gctacccaaa ttgcctctgg catgaagtac 2100 ctttcctctc ttaattttgt tcaccgagat ctggccacac gaaactgttt agtgggtaag 2160 aactacacaa tcaagatagc tgactttgga atgagcagga acctgtacag tggtgactat 2220 taccggatcc agggccgggc agtgctccct atccgctgga tgtcttggga gagtatcttg 2280 ctgggcaagt tcactacagc aagtgatgtg tgggcctttg gggttacttt gtgggagact 2340 ttcacctttt gtcaagaaca gccctattcc cagctgtcag atgaacaggt tattgagaat 2400 actggagagt tcttccgaga ccaagggagg cagacttacc tccctcaacc agccatttgt 2460 cctgactctg tgtataagct gatgctcagc tgctggagaa gagatacgaa gaaccgtccc 2520 tcattccaag aaatccacct tctgctcctt caacaaggcg acgagtg 2567 <210> 2 <211> 440 <212> PRT <213> Domain containing extracellular and transmembrane region of DDR2 <400> 2 Met Ile Leu Ile Pro Arg Met Leu Leu Val Leu Phe Leu Leu Leu Pro   1 5 10 15 Ile Leu Ser Ser Ala Lys Ala Gln Val Asn Pro Ala Ile Cys Arg Tyr              20 25 30 Pro Leu Gly Met Ser Gly Gly Gln Ile Pro Asp Glu Asp Ile Thr Ala          35 40 45 Ser Ser Gln Trp Ser Glu Ser Thr Ala Ala Lys Tyr Gly Arg Leu Asp      50 55 60 Ser Glu Glu Gly Asp Gly Ala Trp Cys Pro Glu Ile Pro Val Glu Pro  65 70 75 80 Asp Asp Leu Lys Glu Phe Leu Gln Ile Asp Leu His Thr Leu His Phe                  85 90 95 Ile Thr Leu Val Gly Thr Gln Gly Arg His Ala Gly Gly His Gly Ile             100 105 110 Glu Phe Ala Pro Met Tyr Lys Ile Asn Tyr Ser Arg Asp Gly Thr Arg         115 120 125 Trp Ile Ser Trp Arg Asn Arg His Gly Lys Gln Val Leu Asp Gly Asn     130 135 140 Ser Asn Pro Tyr Asp Ile Phe Leu Lys Asp Leu Glu Pro Pro Ile Val 145 150 155 160 Ala Arg Phe Val Arg Phe Ile Pro Val Thr Asp His Ser Met Asn Val                 165 170 175 Cys Met Arg Val Glu Leu Tyr Gly Cys Val Trp Leu Asp Gly Leu Val             180 185 190 Ser Tyr Asn Ala Pro Ala Gly Gln Gln Phe Val Leu Pro Gly Gly Ser         195 200 205 Ile Ile Tyr Leu Asn Asp Ser Val Tyr Asp Gly Ala Val Gly Tyr Ser     210 215 220 Met Thr Glu Gly Leu Gly Gln Leu Thr Asp Gly Val Ser Gly Leu Asp 225 230 235 240 Asp Phe Thr Gln Thr His Glu Tyr His Val Trp Pro Gly Tyr Asp Tyr                 245 250 255 Val Gly Trp Arg Asn Glu Ser Ala Thr Asn Gly Tyr Ile Glu Ile Met             260 265 270 Phe Glu Phe Asp Arg Ile Arg Asn Phe Thr Thr Met Lys Val His Cys         275 280 285 Asn Asn Met Phe Ala Lys Gly Val Lys Ile Phe Lys Glu Val Gln Cys     290 295 300 Tyr Phe Arg Ser Glu Ala Ser Glu Trp Glu Pro Asn Ala Ile Ser Phe 305 310 315 320 Pro Leu Val Leu Asp Asp Val Asn Pro Ser Ala Arg Phe Val Thr Val                 325 330 335 Pro Leu His His Arg Met Ala Ser Ala Ile Lys Cys Gln Tyr His Phe             340 345 350 Ala Asp Thr Trp Met Met Phe Ser Glu Ile Thr Phe Gln Ser Asp Ala         355 360 365 Ala Met Tyr Asn Asn Ser Glu Ala Leu Pro Thr Ser Pro Met Ala Pro     370 375 380 Thr Thr Tyr Asp Pro Met Leu Lys Val Asp Asp Ser Asn Thr Arg Ile 385 390 395 400 Leu Ile Gly Cys Leu Val Ala Ile Ile Phe Ile Leu Leu Ala Ile Ile                 405 410 415 Val Ile Ile Leu Trp Arg Gln Phe Trp Gln Lys Met Leu Glu Lys Ala             420 425 430 Ser Arg Arg Met Leu Asp Asp Glu         435 440 <210> 3 <211> 378 <212> PRT <213> Tyrosine kinase activation domain of Insuline Receptor <400> 3 Val Phe Pro Cys Ser Val Tyr Val Pro Asp Glu Trp Glu Val Ser Arg   1 5 10 15 Glu Lys Ile Thr Leu Leu Arg Glu Leu Gly Gln Gly Ser Phe Gly 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Leu Trp Glu     210 215 220 Ile Thr Ser Leu Ala Glu Gln Pro Tyr Gln Gly Leu Ser Asn Glu Gln 225 230 235 240 Val Leu Lys Phe Val Met Asp Gly Gly Tyr Leu Asp Gln Pro Asp Asn                 245 250 255 Cys Pro Glu Arg Val Thr Asp Leu Met Arg Met Cys Trp Gln Phe Asn             260 265 270 Pro Lys Met Arg Pro Thr Phe Leu Glu Ile Val Asn Leu Leu Lys Asp         275 280 285 Asp Leu His Pro Ser Phe Pro Glu Val Ser Phe Phe His Ser Glu Glu     290 295 300 Asn Lys Ala Pro Glu Ser Glu Glu Leu Glu Met Glu Phe Glu Asp Met 305 310 315 320 Glu Asn Val Pro Leu Asp Arg Ser Ser His Cys Gln Arg Glu Glu Ala                 325 330 335 Gly Gly Arg Asp Gly Gly Ser Ser Leu Gly Phe Lys Arg Ser Tyr Glu             340 345 350 Glu His Ile Pro Tyr Thr His Met Asn Gly Gly Lys Lys Asn Gly Arg         355 360 365 Ile Leu Thr Leu Pro Arg Ser Asn Pro Ser     370 375 <210> 4 <211> 415 <212> PRT <213> Tyrosine kinase activation domain of DDR2 <400> 4 Met Thr Val Ser Leu Ser Leu Pro Ser Asp Ser Ser Met Phe Asn Asn   1 5 10 15 Asn Arg Ser Ser Ser Pro Ser Glu Gln Gly Ser Asn Ser Thr Tyr Asp              20 25 30 Arg Ile Phe Pro Leu Arg Pro Asp Tyr Gln Glu Pro Ser Arg Leu Ile          35 40 45 Arg Lys Leu Pro Glu Phe Ala Pro Gly Glu Glu Glu Ser Gly Cys Ser      50 55 60 Gly Val Val Lys Pro Val Gln Pro Ser Gly Pro Glu Gly Val Pro His  65 70 75 80 Tyr Ala Glu Ala Asp Ile Val Asn Leu Gln Gly Val Thr Gly Gly Asn                  85 90 95 Thr Tyr Ser Val Pro Ala Val Thr Met Asp Leu Leu Ser Gly Lys Asp             100 105 110 Val Ala Val Glu Glu Phe Pro Arg Lys Leu Leu Thr Phe Lys Glu Lys         115 120 125 Leu Gly Glu Gly Gln Phe Gly Glu Val His Leu Cys Glu Val Glu Gly     130 135 140 Met Glu Lys Phe Lys Asp Lys Asp Phe Ala Leu Asp Val Ser Ala Asn 145 150 155 160 Gln Pro Val Leu Val Ala Val Lys Met Leu Arg Ala Asp Ala Asn Lys                 165 170 175 Asn Ala Arg Asn Asp Phe Leu Lys Glu Ile Lys Ile Met Ser Arg Leu             180 185 190 Lys Asp Pro Asn Ile Ile His Leu Leu Ala Val Cys Ile Thr Asp Asp         195 200 205 Pro Leu Cys Met Ile Thr Glu Tyr Met Glu Asn Gly Asp Leu Asn Gln     210 215 220 Phe Leu Ser Arg His Glu Pro Pro Asn Ser Ser Ser Ser Asp Val Arg 225 230 235 240 Thr Val Ser Tyr Thr Asn Leu Lys Phe Met Ala Thr Gln Ile Ala Ser                 245 250 255 Gly Met Lys Tyr Leu Ser Ser Leu Asn Phe Val His Arg Asp Leu Ala             260 265 270 Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly Lys Asn Tyr Thr Ile Lys Ile Ala Asp         275 280 285 Phe Gly Met Ser Arg Asn Leu Tyr Ser Gly Asp Tyr Tyr Arg Ile Gln     290 295 300 Gly Arg Ala Val Leu Pro Ile Arg Trp Met Ser Trp Glu Ser Ile Leu 305 310 315 320 Leu Gly Lys Phe Thr Thr Ala Ser Asp Val Trp Ala Phe Gly Val Thr                 325 330 335 Leu Trp Glu Thr Phe Thr Phe Cys Gln Glu Gln Pro Tyr Ser Gln Leu             340 345 350 Ser Asp Glu Gln Val Ile Glu Asn Thr Gly Glu Phe Phe Arg Asp Gln         355 360 365 Gly Arg Gln Thr Tyr Leu Pro Gln Pro Ala Ile Cys Pro Asp Ser Val     370 375 380 Tyr Lys Leu Met Leu Ser Cys Trp Arg Arg Asp Thr Lys Asn Arg Pro 385 390 395 400 Ser Phe Gln Glu Ile His Leu Leu Leu Leu Gln Gln Gly Asp Glu                 405 410 415 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for tyrosine kinase activation domain of Insuline Receptor <400> 5 ggccatgggt gtttccatgc tctgtg 26 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for tyronie kinase activation domain of Insuline Receptor <400> 6 gggaattctt aggaaggatt ggaccg 26 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Primer for tyrosine kinase activation domain of DDR2 <400> 7 ggggatccac agtcagcctt tccctg 26 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Primer for tyrosine kinase activation domain of DDR2 <400> 8 gggaattctc actcgtcgcc ttgtt 25  

Claims (17)

ⅰ) 세포 배양 접시 또는 단백질을 잘 부착시키는 성질을 가진 표면에 콜라겐을 코팅하는 단계;Iii) coating collagen on a cell culture dish or surface having a property of adhering proteins well; ⅱ) DDR 단백질의 세포외 도메인을 세포 표면에 발현하는 형질전환 곤충세포를 콜라겐으로 코팅된 배양 접시에 가하여 반응시키는 단계;Ii) reacting transgenic insect cells expressing the extracellular domain of DDR protein on the cell surface by adding them to a culture dish coated with collagen; ⅲ) 배양접시에 부착된 곤충세포를 고정시킨 후 염색하는 단계; 및Iii) fixing the insect cells attached to the culture dish and staining them; And ⅳ) 흡광도를 측정하여 고정된 세포수를 정량하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 DDR(Discoidin Domain Receptor) 단백질과 콜라겐 상호작용을 정량적으로 분석하는 방법.Iii) quantitatively analyzing the collagen interaction with DDR (Discoidin Domain Receptor) protein, characterized in that the step of measuring the absorbance to quantify the fixed cell number. 제 1항에 있어서, 곤충세포는 sf9, sf21 및 Hi-five로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 세포인 것을 특징으로 하는 DDR 단백질과 콜라겐 상호작용을 정량적으로 분석하는 방법. The method of claim 1, wherein the insect cells are any one selected from the group consisting of sf9, sf21, and Hi-five. 제 1항에 있어서, 곤충세포에서 발현된 DDR 단백질이 동물세포에서와 같이 세포막에 존재하며 세포외 부분은 세포외로 표출되는 것을 특징으로 하는 DDR 단백질과 콜라겐 상호작용을 정량적으로 분석하는 방법. The method of claim 1, wherein the DDR protein expressed in the insect cell is present in the cell membrane as in the animal cell, and the extracellular part is expressed extracellularly. 제 1항에 있어서, 콜라겐은 제 1형, 제 2형 또는 제 3형 콜라겐으로 이루어 진 군에서 선택된 어느 하나의 DDR 단백질 리간드인 것을 특징으로 하는 DDR 단백질과 콜라겐 상호작용을 정량적으로 분석하는 방법. The method of claim 1, wherein the collagen is any one of the DDR protein ligand selected from the group consisting of type 1, type 2 or type 3 collagen. 제 1항에 있어서, 상기 형질전환 곤충세포는 DDR 단백질의 N-말단 세포외 도메인과 막통과 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 배큘로 바이러스에 감염된 것을 특징으로 하는 DDR 단백질과 콜라겐 상호작용을 정량적으로 분석하는 방법. The method of claim 1, wherein the transgenic insect cells are infected with a DDR protein and collagen comprising a polynucleotide encoding a protein comprising a N-terminal extracellular domain and a transmembrane domain of the DDR protein How to quantitatively analyze interactions. 제 5항에 있어서, 상기 DDR 단백질의 N-말단 세포외 도메인과 막통과 도메인을 포함하는 단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 DDR 단백질과 콜라겐 상호작용을 정량적으로 분석하는 방법. The quantitative analysis of collagen interaction with DDR protein according to claim 5, wherein the protein comprising the N-terminal extracellular domain and the transmembrane domain of the DDR protein has an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 2 . Way. 제 1항에 있어서, 상기 단계 ⅳ)의 흡광도는 고정된 세포에 염색된 염료를 용출하여 측정하는 것을 특징으로 하는 DDR 단백질과 콜라겐 상호작용을 정량적으로 분석하는 방법. The method of claim 1, wherein the absorbance of step iii) is measured by eluting the dye stained to the immobilized cells. 제 1항에 있어서, 상기 DDR 단백질은 DDR2 단백질인 것을 특징으로 하는 DDR 단백질과 콜라겐 상호작용을 정량적으로 분석하는 방법. The method of claim 1, wherein the DDR protein is a DDR2 protein. 제 1항에 있어서, 상기 DDR 단백질은 포유류에서 유래한 것을 특징으로 하는 DDR 단백질과 콜라겐 상호작용을 정량적으로 분석하는 방법. The method of claim 1, wherein the DDR protein is derived from a mammal. 제 9항에 있어서, 상기 포유류는 식충목, 피익목, 박쥐목, 영장목, 빈치목, 토끼목, 식육목, 고래목, 관치목, 장비목, 바위너구리목, 바다소목, 말목, 소목, 쥐목으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 DDR 단백질과 콜라겐 상호작용을 정량적으로 분석하는 방법. 10. The method of claim 9, wherein the mammal is a carnivorous tree, pistil, bat tree, primate, larva, rabbit, carnivorous tree, whale tree, ornamental tree, tree tree, rock raccoon tree, sea tree, horse tree, joiner, rat tree A method for quantitatively analyzing collagen interaction with DDR proteins, characterized in that selected from the group consisting of. ⅰ) 세포 배양 접시에 콜라겐을 코팅하는 단계;Iii) coating collagen on a cell culture dish; ⅱ) DDR 단백질의 세포외 도메인을 세포 표면에 발현하는 형질전환 곤충세포 및 검색 후보물질을 콜라겐으로 코팅된 배양 접시에 가하여 반응시키는 단계; 및Ii) reacting the transgenic insect cells expressing the extracellular domain of the DDR protein on the cell surface with a search candidate to a collagen-coated culture dish; And ⅲ) 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 DDR 단백질과 콜라겐 결합을 유의하게 저해하는 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는 곤충세포 발현법을 이용하여 DDR 단백질과 콜라겐 결합 저해물질을 검색하는 방법. Iii) a method of searching for a DDR protein and collagen binding inhibitor by using an insect cell expression method comprising selecting a candidate substance that significantly inhibits the DDR protein and collagen binding as compared to a control group not receiving the candidate. 제 11항에 있어서, 상기 형질전환 곤충세포는 DDR 단백질의 N-말단 세포외 도메인과 막통과 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 배큘로 바이러스에 감염된 것을 특징으로 하는 DDR 단백질과 콜라겐 결합 저해물질을 검색하는 방법. 12. The method of claim 11, wherein the transgenic insect cells are infected with a baculovirus comprising a polynucleotide encoding a protein comprising a N-terminal extracellular domain and a transmembrane domain of the DDR protein and DDR protein and collagen How to search for binding inhibitors. 제 12항에 있어서, 상기 DDR 단백질의 N-말단 세포외 도메인과 막통과 도메 인을 포함하는 단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 DDR 단백질과 콜라겐 결합 저해물질을 검색하는 방법. The method of claim 12, wherein the N-terminal extracellular domain of the DDR protein and the protein comprising a transmembrane domain is characterized in that the search for a DDR protein and collagen binding inhibitor, characterized in that having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Way. 제 11항에 있어서, DDR 단백질과 콜라겐 결합 저해물질이 암, 간경화, 류마티스 질환 또는 동맥경화의 예방 또는 치료제로 사용되는 것을 특징으로 하는 DDR 단백질과 콜라겐 결합 저해물질을 검색하는 방법. 12. The method of claim 11, wherein the DDR protein and collagen binding inhibitor are used as a prophylactic or therapeutic agent for cancer, liver cirrhosis, rheumatic disease or arteriosclerosis. 제 11항에 있어서, 상기 단계 ⅱ)의 후보물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 DDR 단백질과 콜라겐 결합 저해물질을 검색하는 방법. 12. The method of claim 11, wherein the candidate of step ii) is a peptide, protein, non-peptidic compound, synthetic compound, fermentation product, cell extract, plant extract, animal tissue extract or plasma, characterized in that the collagen binding How to search for inhibitors. 제 11항에 있어서, 결합 저해는 IC50을 측정하는 것을 특징으로 하는 DDR 단백질과 콜라겐 결합 저해물질을 검색하는방법.12. The method of claim 11, wherein the binding inhibition measures IC 50 . 삭제delete
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