KR100935029B1 - Novel synthetic antimicrobial hinge peptide derived from Ribosomal Protein L1 of Helicobacter pylori and composition therefrom - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 HPA3의 9번째 아미노산인 글루타민산을 프롤린으로 치환시킴으로써 접힘 구조를 갖는 서열번호 3으로 기재된 항생 펩타이드 및 그를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 균의 리보좀 단백질 L1 (ribosomal protein L1, RPL1) 아미노말단 부위에서, 양친화성 (amphipathic)과 항생 활성을 갖는 HP(2-20) 펩타이드의 소수성 부위를 증가시킨 HPA3로부터, 글루타민산을 프롤린으로 치환시킴으로써 세포의 막에 잘 결합하도록 하는 접힘 구조를 갖게 된 항생 펩타이드 및 그를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항생 펩타이드 및 조성물은 탁월한 항균 및 항진균 활성을 나타내고 세포 독성이 없으므로 인체에 안전한 항생제로 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to an antibiotic peptide set forth in SEQ ID NO: 3 having a folded structure by replacing glutamic acid, which is the ninth amino acid of HPA3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, with proline, and specifically, a composition comprising the helicobacter pylori ( Helicobacter Glutamic acid is substituted for proline from HPA3, which increases the hydrophobic region of the HP (2-20) peptide with amphipathic and antibiotic activity at the ribonsomal protein L1 (RPL1) amino-terminal region of the pylori ) bacterium. The present invention relates to an antibiotic peptide having a folded structure that allows a cell to bind to a cell membrane and a composition comprising the same. Antibiotic peptides and compositions of the present invention exhibit excellent antibacterial and antifungal activity and have no cytotoxicity, so they can be usefully used as antibiotics safe for humans.
헬리코박터 파일로리균, 리보좀 단백질 L1, 항생 펩타이드, 접힘 구조 Helicobacter pylori, ribosomal protein L1, antibiotic peptide, folded structure
Description
도 1은 본 발명의 리보좀 단백질 L1(Ribosomal Protein L1) 유래의 새로운 접힘 구조를 갖는 항생 펩타이드를 설계한 도해를 나타낸 것이고,Figure 1 shows a schematic of an antibiotic peptide having a novel folding structure derived from Ribosomal Protein L1 of the present invention,
A : 서열번호 1: HP (2-20)A: SEQ ID NO 1: HP (2-20)
B : 서열번호 2: HPA3B: SEQ ID NO 2: HPA3
C : 서열번호 3: HPA3-ProC: SEQ ID NO: 3: HPA3-Pro
도 2는 본 발명의 접힘 구조를 갖는 항생 펩타이드를 인간 적혈구 세포에 처리하여 세포 독성을 확인한 전자현미경 사진이고,Figure 2 is an electron micrograph showing the cytotoxicity by treating the antibiotic peptide having a folded structure of the present invention to human erythrocytes,
A : 음성 대조군 (무처리군)A: negative control group (untreated group)
B : 서열번호 3: HPA3-ProB: SEQ ID NO: 3: HPA3-Pro
C : 서열번호 4: 멜리틴C: SEQ ID NO: 4: melittin
도 3과 4는 본 발명의 접힘 구조를 갖는 항생 펩타이드를 NMR 구조분석법으로 3차원적 입체구조를 살펴봄으로써, 본 발명의 펩타이드의 중앙 부분의 접힘 구 조를 확인한 사진이다.3 and 4 are photographs confirming the folding structure of the central portion of the peptide of the present invention by examining the three-dimensional conformation of the antibiotic peptide having the folded structure of the present invention by NMR structural analysis.
본 발명은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 HPA3의 9번째 아미노산인 글루타민산을 프롤린으로 치환시킴으로써 접힘 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 서열번호 3으로 기재된 항생 펩타이드 및 그를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 균의 리보좀 단백질 L1 (ribosomal protein L1; 이하, RPL1) 아미노말단 부위에서, 양친화성 (amphipathic)과 항생 활성을 갖는 HP(2-20) 펩타이드의 소수성 부위를 증가시킨 HPA3로부터, 글루타민산을 프롤린으로 치환시킴으로써 세포의 막에 잘 결합하도록 하는 접힘 구조를 갖게 된 항생 펩타이드 및 그를 포함하는 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to an antibiotic peptide as set forth in SEQ ID NO: 3, and a composition comprising the same, wherein the glutamic acid, which is the ninth amino acid of HPA3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, has a folding structure. By Helicobacter pylori ( Helicobacter Glutamic acid was prolined from HPA3 which increased the hydrophobic region of the HP (2-20) peptide with amphipathic and antibiotic activity at the ribosomal protein L1 (hereinafter referred to as RPL1) amino terminal region of the pylori ) bacterium. The present invention relates to an antibiotic peptide having a folded structure that binds to the membrane of a cell by replacing with an antibody and a composition comprising the same.
세균의 감염은 인간의 질병에서 가장 흔하고 치명적인 원인 중의 하나인데, 불행하게도 항생제의 남용으로 인하여 세균의 항생제 저항성(resistance)이 야기되었다. 실제로, 세균이 새로운 항생제에 저항성을 나타내는 속도는 새로운 항생제의 유사체가 개발되는 속도보다 훨씬 더 빠르다. 예를 들면, 생명에 위협을 가할 수 있는 엔테로코쿠스 패칼리스 (Enterococcus faecalis ), 마이코박테리움 투버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis ) 및 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 등의 세균 종들은 지금까지 알려진 모든 항생제에 대한 저항력을 키워왔다 (Stuart B. Levy, Scientific American, 46-53, 1998).Bacterial infections are one of the most common and fatal causes of human disease. Unfortunately, the abuse of antibiotics has resulted in antibiotic resistance of bacteria. Indeed, the rate at which bacteria are resistant to new antibiotics is much faster than the rate at which new antibiotic analogs are developed. For example, which may pose a threat to life, Enterococcus faecalis kusu nose (Enterococcus faecalis), Mycobacterium-to M. tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis) and bacterial species such as Pseudomonas her rugi Labor (Pseudomonas aeruginosa) have raised resistance to all antibiotics known so far (Stuart B. Levy, Scientific American , 46-53, 1998).
항생제에 대한 내성 (tolerance)은 항생제에 대한 저항성 (resistance)과는 구별되는 현상인데, 1970년대에 뉴모코커스 (Pneumococcus sp .)에서 최초로 발견이 되었으며 페니실린의 작용 기작에 대한 중요한 단서를 제공하였다 (Tomasz et al., Nature, 227, 138-140, 1970). 내성을 보이는 종은 통상적인 농도의 항생제 존재하에서는 성장을 멈추지만 결과적으로 죽지는 않는다. 내성은 항생제가 세포벽 합성 효소를 저해할 때 오토라이신 (autolysin)과 같은 세균의 자가분해 (autolytic) 효소의 활성이 일어나지 않기 때문에 생기는데, 페니실린의 경우에 있어서 내인성 가수분해 효소 (endogenous hydrolytic enzymes)를 활성화함으로써 세균을 죽이지만, 또한 세균이 이 효소의 활성을 억제하여 항생제 치료 시에도 생존하는 결과를 나타내게 된다.Tolerance to antibiotics is a distinct phenomenon from resistance to antibiotics. In the 1970s, Pneumococcus sp . Was first discovered and provided important clues to the mechanism of action of penicillin (Tomasz et al., Nature , 227, 138-140, 1970). Tolerant species stop growing in the presence of the usual concentration of antibiotics but do not die as a result. Resistance is due to the absence of the activity of bacterial autolytic enzymes such as autolysin when antibiotics inhibit cell wall synthase, which in the case of penicillin activates endogenous hydrolytic enzymes. This kills the bacteria, but also inhibits the activity of the enzyme, resulting in survival during antibiotic treatment.
세균이 항생제에 대한 내성을 가지는 것은 임상적으로 대단히 중요한데, 이는 내성 세균을 박멸하는 것이 불가능하게 되면 임상적인 감염에서 항생제 치료의 효용이 떨어지기 때문이다 (Handwerger and Tomasz, Rev . Infec . Dis ., 7, 368-386, 1985). 아울러, 내성은 항생제에 대한 세균의 저항성이 발생할 선행조건이라고 간주하는데, 이것은 항생제 치료에도 살아남는 균주가 생기기 때문이다. 이러한 균주는 항생제에 저항성을 가지는 새로운 유전 요소를 획득해서 항생제의 존재하에서도 계속 성장하게 된다. 실제로 항생제에 대한 저항성을 보이는 모든 세균들은 그 항생제에 대한 내성도 있는 것으로 알려져 있으므로 (Liu and Tomasz, J. Infect. Dis ., 152, 365-372, 1985), 항생제 저항성을 가지는 세균을 죽일 수 있는 신규한 항생제의 개발이 필요하다.It is important for extremely clinically, this is because when it becomes impossible to kill the resistant bacteria The effectiveness of antibiotic therapy in clinical infections dropped (Handwerger and Tomasz, Rev. Infec . Dis. The bacteria having a resistance to antibiotics, 7, 368-386, 1985). In addition, resistance is regarded as a prerequisite for bacterial resistance to antibiotics, because strains survive even antibiotic treatment. These strains acquire new genetic elements that are resistant to antibiotics and continue to grow even in the presence of antibiotics. Indeed, all bacteria that are resistant to antibiotics are known to be resistant to the antibiotics (Liu and Tomasz, J. Infect. Dis . , 152, 365-372, 1985), which can kill bacteria that are antibiotic resistant. There is a need for the development of new antibiotics.
작용 기작의 측면에서 내성은 크게 두 가지로 구분되는데, 첫 번째는 모든 세균에 있어서 성장 속도가 감소할 때 일어나는 외형적 (phenotypic) 내성이며 (Tuomanen E., Revs . Infect . Dis ., 3, S279-S291, 1986), 두 번째는 특정 세균에서 일어나는 돌연변이에 의한 유전적인 내성이다. 두 가지 경우 모두에 있어서 기본적인 현상은, 오토라이신 효소의 활성을 감소시키는 조절 (down regulation)이 일어나는 것인데, 이러한 조절은 외부자극에 대한 외형적인 내성일 경우에는 일시적이지만, 세포 용혈을 조절하는 경로의 변화를 야기하는 돌연변이가 일어난 유전적인 내성의 경우에는 영구적이다. 명백하게, 가장 간단한 유전적인 내성의 경우는 오토라이신 효소의 결손으로 생긴 경우인데, 확실하지 않은 여러 가지 이유로, 이러한 자가분해 효소의 결손에 의해 내성을 가지는 균주가 임상적으로 발견된 적은 없으며, 오히려 임상에서 발견되는 내성은 오토라이신 효소의 활성을 외형적으로 조절하는 과정으로 이루어진다 (Tuomanen et al., J. infect . Dis ., 158, 36-43, 1988).In terms of the mechanism of action, resistance is largely divided into two categories, the first being a phenotypic resistance that occurs when growth rate decreases in all bacteria (Tuomanen E., Revs . Infect . Dis . , 3, S279). -S291, 1986), the second is genetic resistance by mutations in certain bacteria. In both cases, the basic phenomenon is that down regulation occurs, which decreases the activity of the autolysine enzyme, which is transient when externally resistant to external stimuli. Persistent cases of genetic resistance with mutations that cause changes. Obviously, the simplest case of genetic resistance is due to a deficiency of the autolysine enzyme, for which there is no clinically found strain resistant to this deficiency of this autolytic enzyme for a variety of reasons. Tolerance found in is a process that modulates the activity of autolysine enzymes (Tuomanen et al ., J. infect . Dis . , 158, 36-43, 1988).
상기에서 살펴본 바와 같이, 항생제에 대한 저항성을 나타내는 세균을 제거하기 위하여 새로운 항생제의 개발이 필요하며, 오토라이신 효소의 활성과는 독립적으로 작용하는 새로운 항생제의 개발이 필요하다. As described above, in order to remove bacteria showing resistance to antibiotics, the development of new antibiotics is needed, and the development of new antibiotics that act independently of the activity of the autolysine enzyme is necessary.
한편, 세균은 박테리오신 (bacteriocin)이라는 펩타이드나 작은 유기물 분자들을 합성해서 이웃하는 세균을 죽일 수 있는데, 이러한 박테리오신들은 구조적 특 징에 따라 세 가지로 구분된다. 첫 번째는 란티바이오틱스 (lantibiotics)이며 두 번째는 비(非)란티바이오틱스 (nonlantibiotics)이고, 세 번째는 신호 펩타이드 (signal peptide)에 의해 분비되는 것들이다 (Cintas et al ., J. Bad ., 180, 1988-1994, 1998). 곤충을 포함하여, 동물 역시 펩타이드 항생제를 자체적으로 생산할 수 있는데 (Bevins et al., Ann . Rev . Biochem ., 59, 395-414, 1990), 구조에 따라 세 개의 그룹으로 나눌 수 있다. 첫 번째는 시스테인이 풍부한 (cysteine-rich) β-쉬트(sheet) 펩타이드이고, 두 번째는 α-회전형 (helical)의 양친화성 펩타이드 분자이며, 세 번째는 프롤린이 풍부한 (proline-rich) 펩타이드이다 (Mayasaki et al., Int . J. Antimicrob . Agents, 9, 269-280, 1998). 이들 항균 펩타이드들은 숙주 방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다 (Boman, H. G., Cell, 65:205, 1991; Boman, H. G., Annu . Rev . Microbiol ., 13:61, 1995). 또한, 상기 항균 펩타이드들은 아미노산 서열에 따라 다양한 구조를 갖는데, 이들 구조 중 가장 흔한 것은 곤충에서 발견된 항균 펩타이드인 세크로핀 (cecropin)과 같이 시스테인 (cysteine) 잔기가 없고 양친화성 알파 나선형을 형성하는 구조이다.Bacteria can kill neighboring bacteria by synthesizing peptides or small organic molecules called bacteriocins. These bacteriocins are classified into three types according to their structural characteristics. The first is lantibiotics, the second is nonlantibiotics, and the third is secreted by signal peptides (Cintas et. al ., J. Bad . , 180, 1988-1994, 1998). Animals, including insects, can also produce their own peptide antibiotics (Bevins et al ., Ann . Rev. Biochem . , 59, 395-414, 1990), which can be divided into three groups. The first is a cysteine-rich β-sheet peptide, the second is an α-helical amphiphilic peptide molecule, and the third is a proline-rich peptide. (Mayasaki et al ., Int . J. Antimicrob . Agents , 9, 269-280, 1998). These antimicrobial peptides are known to play important roles in host defense and the innate immune system (Boman, HG, Cell , 65: 205, 1991; Boman, HG, Annu . Rev. Microbiol . , 13:61, 1995). In addition, the antimicrobial peptides have various structures according to amino acid sequences. The most common of these structures are cysteine residues such as cecropin, an antimicrobial peptide found in insects, and form an amphiphilic alpha helical. Structure.
소화성 궤양이 스트레스와 위산 과다생성에 의해 발생한다는 가설이 있어왔으나, 최근에 이러한 소화성 궤양이 헬리코박터 파일로리균에 의한 것이라고 밝혀지면서 (Blaser, MJ., Trends Microbiol ., 1, 255-260, 1991) 헬리코박터 파일로리 균에 대한 관심이 집중되고 있다. 헬리코박터 파일로리균은 그람 음성균에 속하는데 성장 속도가 매우 느리고 나선형 몸체와 편모를 가지는 혐기성 미생물이다. 헬 리코박터 파일로리균이 생산하는 많은 단백질 중 RPL1이라는 단백질은 230개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 상기 단백질의 아미노말단 부위가 세크로핀과 유사한 구조를 갖는 것이 밝혀졌는데, 특히 8개의 아미노산이 세크로핀과 같은 것으로 알려져 있다. 헬리코박터 파일로리균의 RPL1 아미노말단 부위는 완벽한 양친화성 나선모양 구조를 가지는데 (Putsep, K. et al., Nature, 398, 671-672, 1999), 이러한 양친화성 펩타이드는 세포막의 지질 성분과 유사한 구조를 지니므로 미생물의 세포막 지질과 결합하여 미생물의 세포막을 파괴하거나, 세포막의 전위를 변화시켜 미생물을 파괴한다는 작용 기작이 보고되어 있다. 이 외에도 헬리코박터 파일로리균의 RPL1 단백질의 아미노말단 부위는 역시 항균활성을 가진다는 보고가 있다 (Putsep K. et al., Nature, 398, 671-672, 1999).It has been hypothesized that peptic ulcers are caused by stress and gastric overproduction, but recently it has been found that these peptic ulcers are caused by Helicobacter pylori (Blaser, MJ., Trends Microbiol . , 1, 255-260, 1991). There is a great interest in Helicobacter pylori. Helicobacter pylori is an gram-negative bacterium that grows very slowly and is an anaerobic microorganism with a spiral body and flagella. Of the many proteins produced by Helicobacter pylori, RPL1 is composed of 230 amino acids, and it has been found that the amino-terminal portion of the protein has a structure similar to that of cecropin. It is known as The RPL1 amino terminus region of Helicobacter pylori has a perfect amphiphilic helix structure (Putsep, K. et al ., Nature , 398, 671-672, 1999), since these amphiphilic peptides have a structure similar to the lipid component of the cell membrane, they bind to the cell membrane lipids of the microorganism and destroy the cell membrane of the microorganism or change the potential of the cell membrane to change the microorganism. The mechanism of action of destroying has been reported. In addition, the amino terminal region of the RPL1 protein of Helicobacter pylori also has antimicrobial activity (Putsep K. et. al ., Nature , 398, 671-672, 1999).
따라서 양친화성 펩타이드의 항균활성에 대해서 많은 연구가 이루어졌으며, 이를 이용해 세균에 대한 항생제를 개발하려는 연구들이 많이 시도되었다. 지금까지 보고된 양친화성 펩타이드로는 서열번호 1로 기재되는 HP (2-20) 펩타이드, 서열번호 4로 기재되는 멜리틴 (melittin, ME) 펩타이드 등이 있다.Therefore, many studies have been conducted on the antimicrobial activity of the amphiphilic peptides, and many studies have been attempted to develop antibiotics against bacteria using the affinity peptides. Amphiphilic peptides reported so far include HP (2-20) peptides as set out in SEQ ID NO: 1, melittin (ME) peptides as set out in SEQ ID NO: 4, and the like.
헬리코박터 파일로리 유래 RPL1 단백질의 아미노말단 부위 중 양친화성 활성을 갖고 항생 활성을 나타내는 펩타이드인 서열번호 1로 기재되는 HP (2-20) 펩타이드는 세포 독성은 없으면서 항균활성과 함께 항진균 효과가 있다고 보고되었다 (Biochem . Biophys . Res . Commun ., 2002, 291, 1006-1013, Biochim . Biophys . Acta. 2002, 1598, 185-194).The HP (2-20) peptide described in SEQ ID NO: 1, which has an affinity activity and an antibiotic activity in the amino terminal region of the Helicobacter pylori-derived RPL1 protein, has been reported to have antifungal effect with antibacterial activity without cytotoxicity ( Biochem . Biophys . Res . Commun . , 2002, 291, 1006-1013, Biochim . Biophys . Acta . 2002, 1598, 185-194).
또한, 서열번호 4로 기재되는 멜리틴 펩타이드는 벌독의 성분 중 고형분의 50% 이상을 차지하는 펩타이드로서 카르복시 말단이 아미노화 (amidation) 되어 있고, 진핵세포에 대하여 세포독성이 매우 높아 고등동물세포를 낮은 농도에서도 잘 파괴하고, 미생물인 그람 음성균 및 그람양성균에 대해서도 항균 활성이 높다고 보고되었다 (Habermann, E., Science, 177: 314, 1972; Steiner, H., et al., Nature, 292: 246, 1981; Tosteson, M. T., et al., Biochemistry, 228: 337, 1987).In addition, the melittin peptide described in SEQ ID NO: 4 is a peptide that accounts for more than 50% of the solid content of the components of bee venom, the carboxy terminal is aminated (amidation), very high cytotoxicity to eukaryotic cells to lower the higher animal cells It destroys well at concentration and has been reported to have high antibacterial activity against gram-negative and gram-positive bacteria (Habermann, E., Science , 177: 314, 1972; Steiner, H., et. al ., Nature , 292: 246, 1981; Tosteson, MT, et al ., Biochemistry , 228: 337, 1987).
그 이외 HP (2-20)과 유사한 아미노산 서열이 있는 세크로핀 계열의 양친화성 펩타이드는 초파리에게서 처음 발견되었고, 그 후 누에 번데기 및 돼지의 작은창자에서도 발견되었는데, 이 중 세크로핀 A (cecropin A, CA)는 항균활성은 높으나 항진균 및 항암활성은 미미한 것으로 보고되었다 (Boman, H. G. and Hultmark, D., Annu . Rev . Microbiol., 41: 103, 1987).In addition, the secropin family of amphiphilic peptides with an amino acid sequence similar to HP (2-20) was first discovered in Drosophila, and later in silkworm pupa and small intestine of pigs, including A, CA) is high but the antimicrobial activity of antifungal and anti-cancer activity has been reported to be negligible (Boman, HG and Hultmark, D. , Annu Rev Microbiol, 41:... 103, 1987).
또한 상기 양친화성 펩타이드의 활성에 관한 연구와 더불어, 그들이 갖는 아미노산 서열 및 단백질 구조 등의 특성을 살펴보면, 그 서열상의 특성이 항균 활성과 매우 밀접한 관련이 있음을 확인할 수 있다. 따라서 상기 양친화성 펩타이드의 아미노산 서열을 이용하여 그 서열의 특정부위에서 유사한 아미노산으로 치환하거나, 일부 서열들을 재조합하여 접합 펩타이드 (conjugation peptide)를 제조하고, 펩타이드 서열의 일부 기능 부위를 서로 도치시킴으로써 항균, 항진균 또는 항암 활성이 탁월한 새로운 합성 펩타이드를 제조할 수 있다 (Chan, H. C., et al., FEBS Lett., 259: 103, 1989; Wade, D., et al., Int . J. Pept . Prot . Res ., 40: 429, 1992).In addition to the research on the activity of the amphiphilic peptides, the characteristics of the amino acid sequence and protein structure, such as having, it can be seen that the characteristics on the sequence is very closely related to the antimicrobial activity. Therefore, the amino acid sequence of the amphiphilic peptide is replaced with a similar amino acid at a specific portion of the sequence, or some sequences are recombined to prepare a conjugate peptide (conjugation peptide), and by inverting some functional sites of the peptide sequence to each other, New synthetic peptides with excellent antifungal or anticancer activity can be prepared (Chan, HC, et. al ., FEBS Lett ., 259: 103, 1989; Wade, D., et al ., Int . J. Pept . Prot . Res . , 40: 429, 1992).
실제로 상기의 양친화성 펩타이드를 응용하여 항암효과가 있는 합성 펩타이드 mag A 및 mag G 등이 제조되었고, 그 효능이 보고된 바 있다 (Ohsaki, et al ., Cancer Res., 52: 3534, 1992). 그 외에도, 마가이닌 2 및 멜리틴 펩타이드들의 양친화성 부위, 유연성 부위 및 소수성 부위 등의 아미노산을 상호 결합시켜 항진균 활성을 나타내는 합성 펩타이드들이 개발되었으며, 이들은 특히 박테리아 및 곰팡이 속 균주에 작용함이 특허 등록된 바 있다 (대한민국 특허등록 제0204501호). 또한 본 발명자들은 기존의 HP (2-20) 펩타이드의 특정 아미노산을 트립토판으로 치환하여 소수성을 증가(서열번호 2)시킴으로써 항생효과가 증진됨을 확인하여 항생 펩타이드로써 특허 등록된 바 있다 (대한민국 특허등록 제0459808호).In fact, synthetic peptides mag A and mag G, etc., having anticancer effects, have been prepared by applying the amphiphilic peptides, and their efficacy has been reported (Ohsaki, et. al . , Cancer Res ., 52: 3534, 1992). In addition, synthetic peptides have been developed that show antifungal activity by binding amino acids such as affinity sites, flexible sites and hydrophobic sites of margarine 2 and melittin peptides, and they are particularly patented on bacterial and fungal strains. (Korean Patent Registration No.0204501). In addition, the present inventors have been patented as an antibiotic peptide by confirming that the antibiotic effect is enhanced by replacing specific amino acids of the existing HP (2-20) peptide with tryptophan to increase hydrophobicity (SEQ ID NO: 2). 0459808).
항생 펩타이드 구조의 대부분은 일직선상의 나선 구조로 구성되어 있음으로써 세포의 막을 공격하는 특징을 갖는데, 이때 일직선상의 나선구조의 적절한 부위에 접힘 구조를 줌으로써 세포의 막에 더욱더 잘 결합하도록 조절하는 것이 가능해진다. 즉 세균이나 곰팡이의 막 표면의 소수성 또는 전하를 이용하여 이들의 막에서 w＼결합을 더욱 잘하도록 유도하는 것이다.Most of the antibiotic peptide structure is composed of a straight spiral structure, which is characterized by attacking the membrane of the cell, whereby it is possible to control the binding to the cell membrane by giving a folded structure to an appropriate portion of the straight spiral structure. . In other words, by using the hydrophobicity or charge of the membrane surface of bacteria or fungi to induce better binding of the w 에서 in these membranes.
이에 본 발명자들은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 HPA3의 9번째 아미노산인 글루타민산을 프롤린으로 치환시킴으로써 접힘 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 서열번호 3으로 기재된 항생 펩타이드를 합성하였으며, 상기 펩타이드의 항균 효과, 항진균 효과 및 세포독성 (용혈활성)이 없음을 확인하여 상기 펩타이드 유도체가 항생제로 이용될 수 있는 항생 펩타이드임을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors synthesized the antibiotic peptide set forth in SEQ ID NO: 3 characterized by having a folding structure by replacing glutamic acid, which is the ninth amino acid of HPA3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, with proline, and the antimicrobial effect of the peptide. By confirming that there is no antifungal effect and cytotoxicity (hemolytic activity), the present invention was completed by revealing that the peptide derivative is an antibiotic peptide that can be used as an antibiotic.
본 발명의 목적은 항생제에 저항성을 나타내는 세균을 제거하기 위한 새로운 기전의 항생제로서 세포독성이 없고 우수한 항균, 항진균 활성을 나타내는 항생 펩타이드 및 그의 유도체를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide antibiotic peptides and derivatives thereof which have no cytotoxicity and exhibit excellent antibacterial and antifungal activity as antibiotics of a novel mechanism for removing bacteria that are resistant to antibiotics.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 HPA3의 9번째 아미노산인 글루타민산을 프롤린으로 치환시킴으로써 접힘 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열을 가지는 항생 펩타이드를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention has an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 having a folding structure by replacing glutamic acid, which is the ninth amino acid of peptide HPA3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, with proline Provide antibiotic peptides.
또한, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열 중 9번째 아미노산이 프롤린으로 보존되고 상기 서열과 90% 이상의 상동성을 가지며, 항균 및 항진균 활성을 나타내는 펩타이드를 제공한다.The present invention also provides a peptide in which the 9th amino acid of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 is conserved with proline and has at least 90% homology with the sequence, and exhibits antibacterial and antifungal activity.
아울러, 본 발명은 상기 펩타이드 및 그의 유도체를 유효성분으로 포함하는 항균 및 항진균용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for antibacterial and antifungal comprising the peptide and its derivatives as an active ingredient.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 HPA3의 9번째 아미노산인 글루타민산을 프롤린으로 치환시킴으로써 접힘 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열을 가지는 항생 펩타이드를 제공한다.The present invention provides an antibiotic peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 having a folding structure by substituting proline for glutamic acid, the ninth amino acid of peptide HPA3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, with proline.
상기 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 HPA3는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 HP (2-20)의 17번째 아미노산인 글루타민과 19번째 아미노산인 아스파라긴산을 각각 소수성 아미노산인 트립토판으로 치환시킴으로써 소수성 부위가 증가한 양친화성 구조를 가진다. 상기 서열번호 1로 기재되는 아미노산은 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori)균의 리보좀 단백질 L1 (ribosomal protein L1, 이하 RPL1)의 아미노말단 부위로 양친화성을 갖고 항생 활성을 나타낸다 (표 1 및 도 1 참조).Peptide HPA3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is a hydrophobic amino acid tryptophan of the amino acid glutamine 17 and amino acid 19 of the peptide HP (2-20) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 By substitution, it has an affinity structure with an increased hydrophobic site. The amino acid represented by SEQ ID NO: 1 is Helicobacter pylori ( Helicobacter pylori) of the ribosomal protein L1 (ribosomal protein L1, less RPL1 of bacteria) has an amphiphilic amino-terminal part shows the antimicrobial activity (see Table 1 and Figure 1).
본 발명의 펩타이드는 당업계에 알려진 통상의 펩타이드 합성법에 의해 제조가 가능하며, 서열번호 2로 기재되는 펩타이드의 9번째 아미노산이 글루타민산에서 프롤린으로 치환됨에 따라 서열번호 2로 기재된 펩타이드에 비해 소수성 부위와 유연성이 증가되며, 접힘 구조를 나타낸다(도 3과 도 4 참조). 상기 접힘 구조는 항생 펩타이드가 미생물의 세포막에 결합시 결합력을 향상시킴으로서 항생 효과를 증진시킬 수 있다. 상기 세포막은 그람 양성균, 그람 음성균 및 진균으로 구성된 군으로부터 선택된 미생물의 세포막을 나타낸다.Peptides of the present invention can be prepared by conventional peptide synthesis methods known in the art, hydrophobic sites and compared to the peptide described in SEQ ID NO: 2 as the ninth amino acid of the peptide described in SEQ ID NO: 2 is substituted for proline in glutamic acid Flexibility is increased, showing a folded structure (see FIGS. 3 and 4). The folding structure may enhance the antibiotic effect by improving the binding force when the antibiotic peptide binds to the cell membrane of the microorganism. The cell membrane represents a cell membrane of a microorganism selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi.
본원 발명의 펩타이드의 항생 효과를 확인하기 위하여 항균 및 항진균 활성을 측정하였다.In order to confirm the antibiotic effect of the peptide of the present invention, the antibacterial and antifungal activity was measured.
항균 활성은 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소 농도인 생육 최소저해농도(Minimal Inhibitory Concentration; 이하, MIC)를 측정하여 관찰하였다. 그람 양성균으로써 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스태필로코쿠스 에피더미디스 (Staphlococcus epidermidis) 및 스태필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)를 그람 음성균으로써 대장균 (Escherichia coli), 슈도모나스 에루기노사 (Psedomonas aeruginosa), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium) 및 프로테우스 불가리스 (Proteus vulgaris)를 그 대상으로 하였다. 서열번호 3으로 기재되는 본 발명의 접힘 구조를 갖는 펩타이드와 대조군으로 HP (2-20) 펩타이드, HPA3 펩타이드 및 멜리틴(Melittin) 펩타이드를 사용하여 각 균주의 MIC 값을 측정한 결과, 본 발명의 접힘 구조를 갖는 펩타이드는 대조군인 HP (2-20) 펩타이드에 비해 균주에 따라 32배, HPA3 펩타이드에 비해서는 4배 이상의 높은 항균 활성을 나타내었으며, 양성 대조군으로 사용한 멜리틴 펩타이드에 비해서는 균주에 따라 2배 높게 나타나거나 비슷한 항균활성을 가짐을 확인하였다(표 2 참조).Antimicrobial activity was observed by measuring the Minimum Inhibitory Concentration (MIC), which is the minimum concentration of peptides without cell division. As Gram-positive bacteria Bacillus subtilis (Bacillus subtilis ), Staphylococcus epidermidis ( Staphlococcus) epidermidis and Staphylococcus aureus as gram-negative bacteria, Escherichia coli), Pseudomonas rugi Labor (Psedomonas aeruginosa), Salmonella typhimurium (Salmonella typhimurium) and Proteus vulgaris (Proteus vulgaris ). As a result of measuring the MIC value of each strain using a peptide having a folded structure of the present invention as set forth in SEQ ID NO: 3 and an HP (2-20) peptide, HPA3 peptide and melittin peptide as a control, Peptides with a folded structure showed 32 times higher antimicrobial activity than the HP (2-20) peptide as a control and 4 times higher than the HPA3 peptide, and compared to the melittin peptide used as a positive control. It was confirmed that it appeared twice as high or had similar antimicrobial activity (see Table 2).
또한, 본원 발명의 펩타이드의 항진균 활성을 측정하기 위하여, 병원성 진균인 캔디다 알비칸스 (Candida albicans), 트리코스포론 베이겔라이 (Trichosporon beigelii) 및 사카로마이세스 세르비지애 (Saccharomyces cerevisiae)를 대상으로 각 균주의 MIC 값을 MTT 분석법으로 측정하였다. 그 결과, 본원 발명의 서열번호 3으로 기재되는 펩타이드는 대조군인 HP (2-20) 펩타이드에 비해 16배, HPA3 펩타이드에 비해서는 2배 이상의 높은 항진균 활성을 나타내었으며, 양성 대조군으로 사용한 멜리틴 펩타이드에 비해서도 곰팡이에 따라 16배 이상의 항진균 활성을 나타내었다(표 3 참조).In addition, in order to measure the antifungal activity of the peptides of the present invention, Candida albicans ( Candida) albicans ), Trichosporon beigelii ) and Saccharomyces cerevisiae were measured for MIC values of each strain by MTT assay. As a result, the peptide described in SEQ ID NO: 3 of the present invention exhibited 16 times higher antifungal activity than the HP (2-20) peptide as a control group and 2 times higher than the HPA3 peptide, and a melittin peptide used as a positive control group. Compared to the fungus showed more than 16-fold antifungal activity (see Table 3).
상기의 결과로부터, 본원 발명의 서열번호 3으로 기재되는 펩타이드는 탁월한 항균 및 항진균 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.From the above results, it was confirmed that the peptide described in SEQ ID NO: 3 of the present invention exhibits excellent antibacterial and antifungal effects.
또한, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열 중 9번째 아미노산이 프롤린으로 보존되고 상기 서열과 90% 이상의 상동성을 가지며, 항균 및 항진균 활성을 나타내는 항생 펩타이드를 제공한다. 바람직하게는, 상기 상동성은 적어도 95% 인 것을 특징으로 하는 항생 펩타이드를 제공한다.The present invention also provides an antibiotic peptide wherein the 9th amino acid of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 is conserved in proline and has at least 90% homology with the sequence and exhibits antibacterial and antifungal activity. Preferably, the homology peptide is provided, characterized in that at least 95%.
본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 합성 펩타이드에서 각각의 아미노산을 구조가 유사한 다른 아미노산으로 치환하거나, 아미노 말단의 아미노기 또는 카르복시 말단의 카르복실기를 다른 기능기로 치환시킨 항균 및 항진균성 펩타이드를 포함할 수 있다. 특히, 합성된 펩타이드 중 17번째 아미노산과 19 번째 아미노산인 트립토판을 다른 소수성 아미노산으로 치환하여도 높은 항균, 항진균 활성을 나타낼 수 있다. 상기 다른 소수성 아미노산은 바람직하게는, 알라닌, 이소루이신, 메티오닌, 페닐알라진, 발린 및 루이신으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.The present invention relates to an antimicrobial and antifungal peptide in which each amino acid is substituted with another amino acid having a similar structure in a synthetic peptide having an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 3, or an amino terminal at an amino terminus or a carboxyl group at a carboxy terminus is substituted with another functional group. It may include. In particular, even when the tryptophan which is the 17th amino acid and the 19th amino acid of the synthesized peptide is substituted with other hydrophobic amino acids, it can exhibit high antibacterial and antifungal activity. The other hydrophobic amino acid may preferably be selected from the group consisting of alanine, isoleucine, methionine, phenylalazine, valine and leucine.
또한 본 발명의 9번째 아미노산인 프롤린은 '글라이신-이소루이신-글라이신'이라는 아미노산 세 개가 연결된 구조의 펩타이드로 치환될 수 있다. 본 연구자들은 상기 '글라이신-이소루이신-글라이신'의 아미노산 세 개가 연결된 구조의 펩타이드를 Cecropin A (1-8)-Magainin 2 (1-12)에 대한 접합 펩타이드의 제조시 중간 위치에 첨가하였었고, 상기 구조가 접힘 구조를 유도한 것을 확인할 수 있었다 (Oh, DH et al ., Biochemistry, 39, 11855-11864, 2000).In addition, proline, the ninth amino acid of the present invention, may be substituted with a peptide having a structure in which three amino acids called 'glycine-isoleucine-glycine' are linked to each other. The researchers added a peptide of the structure linked to three amino acids of glycine-isoleucine-glycine to an intermediate position in the preparation of a conjugated peptide for Cecropin A (1-8) -Magainin 2 (1-12). , It was confirmed that the structure induced the folded structure (Oh, DH et al ., Biochemistry , 39, 11855-11864, 2000).
아울러, 본 발명은 상기 본원 발명의 접힘 구조를 갖는 펩타이드 및 그의 유도체를 유효성분으로 포함하는 항균 및 항진균용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for antibacterial and antifungal comprising the peptide having a folded structure of the present invention and derivatives thereof as an active ingredient.
본원 발명의 펩타이드가 세포독성을 나타내는지를 확인하기 위하여 대조군으로 HP (2-20) 펩타이드, HPA3 펩타이드 및 멜리틴(Melittin) 펩타이드를 사용하여 본원 발명의 펩타이드의 적혈구 파괴능을 조사한 결과, 본원 발명의 서열번호 3으로 기재되는 펩타이드는 세포독성을 거의 나타내지 않는 반면에 양성 대조군으로 사용한 멜리틴 펩타이드는 세포독성이 매우 높게 나타남을 알 수 있었다(표 4 참조).In order to confirm whether the peptide of the present invention exhibits cytotoxicity, the erythrocyte destructive ability of the peptide of the present invention was examined using HP (2-20) peptide, HPA3 peptide, and melittin peptide as a control. The peptide described in SEQ ID NO: 3 showed little cytotoxicity, whereas the melittin peptide used as a positive control showed very high cytotoxicity (see Table 4).
상기의 결과로부터, 본원 발명의 서열번호 3으로 기재되는 펩타이드는 세포독성이 없기 때문에 인체에 안전한 항균 및 항진균제로 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.From the above results, it was confirmed that the peptide described in SEQ ID NO: 3 of the present invention can be usefully used as a safe antibacterial and antifungal agent to the human body because it is not cytotoxic.
상기 서열번호 3으로 기재되는 펩타이드는 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.The peptide described in SEQ ID NO: 3 can be administered parenterally during clinical administration and can be used in the form of a general pharmaceutical formulation.
즉, 본원 발명의 펩타이드는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.That is, the peptide of the present invention can be administered in various parenteral formulations, and when formulated, it is prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc. which are commonly used. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories. As the non-aqueous solvent and the suspension solvent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used. As a suppository base, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
또한, 상기 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.In addition, the peptide may be used in admixture with various carriers (pharmaceutically acceptable carriers) such as physiological saline or organic solvents, and carbohydrates such as glucose, sucrose or dextran (ascorbic acid) to increase stability or absorption. Antioxidants such as ascorbic acid or glutathione, chelating agents, small molecule proteins or other stabilizers can be used as medicaments.
상기 펩타이드의 유효용량은 1 내지 2 ㎎/㎏이고, 바람직하기에는 0.5 내지 1 ㎎/㎏ 이며, 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다.The effective dose of the peptide is 1 to 2 mg / kg, preferably 0.5 to 1 mg / kg, and may be administered 1 to 3 times a day.
본 발명의 약학적 조성물에서 서열번호 3으로 기재되는 펩타이드 및 그의 유도체의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 펩타이드의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 펩타이드의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.In the pharmaceutical composition of the present invention, the total effective amount of the peptide described in SEQ ID NO: 3 and its derivatives may be administered to the patient in a single dose by bolus form or by infusion for a relatively short period of time. Multiple doses may be administered by a fractionated treatment protocol with long term administration. Since the concentration of the peptide is determined by taking into consideration various factors such as the age and health status of the patient as well as the route of administration and the number of treatments of the drug, in consideration of this point, a person having ordinary knowledge in the art Appropriate effective dosages for the particular use of the peptides as pharmaceutical compositions may be determined.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.
<< 실시예Example 1> 1> 펩타이드들의Of peptides 합성 및 분리정제 Synthesis and Separation Purification
세포막에 대한 결합력 향상을 위한 본원 발명의 항생 펩타이드를 합성하기 위해, 펩타이드 제조업체에 의뢰하여 ((주) 애니젠, 한국), 메리필드(Merrifield)의 액상 고상법 (Merrifield, RB., J. Am . Chem . Soc ., 85, 2149, 1963)에 따라, Fmoc (9-fluorenylmethoxy carbonyl)를 아미노기 보호 용기로 이용하여, 서열번호 2로 기재되는 HPA3 펩타이드의 9번째 아미노산인 글루타민산을 프롤린으로 치환시킨 서열번호 3으로 기재되는 HPA3-Pro 펩타이드를 합성하였다(표 1 및 도 1). 그 외에도 대조군으로 표 1에서 기재하고 있는 서열번호 1 내지 2 및 서열번호 4의 펩타이드들을 합성하였다.In order to synthesize the antibiotic peptide of the present invention for improving the binding ability to the cell membrane, the peptide manufacturer (Anigen, Korea), the liquid phase solidification method of Merrifield (Merrifield, RB., J. Am) According to Chem . Soc . , 85, 2149, 1963), the ninth amino acid glutamic acid of HPA3 peptide represented by SEQ ID NO: 2 was substituted with proline, using Fmoc (9-fluorenylmethoxy carbonyl) as an amino group protective container. HPA3-Pro peptides described as number 3 were synthesized (Table 1 and FIG. 1). In addition, peptides of SEQ ID NOS: 1 to 2 and SEQ ID NO: 4 described in Table 1 were synthesized as controls.
구체적으로, 본 발명에서 설계한 펩타이드의 카르복실말단이 -NH2 형태인 펩타이드는 Rink Amide MBHA-Resin 을 출발물질로 사용하였으며, 카르복실말단이 -OH 형태의 펩타이드는 Fmoc-아미노산-Wang Resin 을 출발물질로 사용하였다. Fmoc-아미노산의 커플링(coupling)에 의한 펩타이드 사슬 (chain)의 연장은 DCC (N-hydroxybenzo triazole (HOBt)- dicyclo-hexycarbodiimide) 법에 의해 실시하였다. 각 펩타이드의 아미노말단의 Fmoc-아미노산을 커플링 (coupling) 시킨 후, NMP (20% piperidine /N-methyl pyrolidone) 용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 DCM (dichoromethane)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 건조시켰다. 여기에 TFA (trifluoroacetic acid)-phenol-thioanisole-H2O- triisopropylsilane (85: 5: 5: 2.5: 2.5, vol./vol.) 용액을 가하고 2 내지 3시간 반응시켜 보호기의 제거 및 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 후, 디에틸에테르 (diethylether)로 펩타이드를 침전시켰다. 상기의 방법으로 얻은 크루드(crude) 펩타이드는 0.05% TFA가 포함된 아세토니트릴 농도구배 (acetonitrile gradient)에서 정제형 역상 (reverse phase, RP)-HPLC column (Delta Pak, C18 300Å, 15, 19.0mm ×30 cm, Waters, USA)을 이용하여 정제하였다. 합성 펩타이드를 6 N HCl로 110℃에서 가수분해한 후 잔사를 감압 농축하고, 0.02 N HCl에 녹여서 아미노산 분석기 (Hitachi 8500 A)로 아미노산 조성을 측정하였다. 상기의 방법으로 조성된 펩타이드들의 순도를 확인한 결과 95% 이상의 순도를 나타내었으며, MALDI 질량 분석법 (Hill, et al ., Rapid Commun . Mass Spectrometry, 5: 395, 1991) 을 이용하여 분자량을 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 비교한 결과, 그 값이 일치하는 것을 확인하였다. 특히, 본 발명의 접힘 구조를 갖는 펩타이드는 MALDI 분석 결과, 분자량 (HPA3-Pro: 2417.2) 이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가짐을 확인하였다.Specifically, the carboxyl terminus of the peptide designed in the present invention is -NH 2 As the starting peptide, Rink Amide MBHA-Resin was used as a starting material, and the OH-type peptide was used as a starting material for Fmoc-amino acid-Wang Resin. The extension of the peptide chain by the coupling of Fmoc-amino acid was carried out by DCC (N-hydroxybenzo triazole (HOBt) -dicyclo-hexycarbodiimide) method. After coupling the Fmoc-amino acid at the amino terminal of each peptide, remove the Fmoc group with NMP (20% piperidine / N-methyl pyrolidone) solution, wash it several times with NMP and DCM (dichoromethane), and then use nitrogen gas. Dried. A solution of trifluoroacetic acid (TFA) -phenol-thioanisole-H 2 O- triisopropylsilane (85: 5: 5: 2.5: 2.5, vol./vol.) Was added thereto and reacted for 2 to 3 hours to remove the protecting group and the peptide from the resin. After separation, the peptide was precipitated with diethylether. The crude peptide obtained by the above method contains 0.05% TFA. Purification was performed using a reverse phase (RP) -HPLC column (Delta Pak, C 18 300 mm, 15, 19.0 mm x 30 cm, Waters, USA) in an acetonitrile gradient. The synthetic peptide was hydrolyzed at 110 ° C. with 6 N HCl, the residue was concentrated under reduced pressure, dissolved in 0.02 N HCl, and the amino acid composition was measured by an amino acid analyzer (Hitachi 8500 A). As a result of confirming the purity of the peptides prepared by the above method, the purity was over 95%, and MALDI mass spectrometry (Hill, et al ., Rapid Commun . Mass Spectrometry , 5: 395, 1991) was compared with the molecular weight obtained by calculating the molecular weight from the amino acid sequence, it was confirmed that the value is consistent. In particular, the peptide having the folded structure of the present invention, MALDI analysis, the molecular weight (HPA3-Pro: 2417.2) was confirmed to have the correct amino acid sequence because it matches the molecular weight obtained by calculating from the amino acid sequence.
<< 실시예Example 2> 항균활성 측정 2> Antibacterial activity measurement
실시예 1의 방법으로 제조된 본원 발명의 펩타이드의 항균 활성을 측정하기 위하여, 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소 농도인 생육 최소저해농도 (MIC) 값을 측정하였다.In order to measure the antimicrobial activity of the peptides of the present invention prepared by the method of Example 1, the minimum growth concentration (MIC) value, which is the minimum concentration of the peptide which does not divide cells, was measured.
우선, 항균 활성 측정을 위하여 그람 양성균으로써 바실러스 서브틸리스 (KCTC 1918), 스태필로코쿠스 에피더미디스 (KCTC 1917)와 스태필로코쿠스 아우레우스 (KCTC 1621)를, 그람 음성균으로써 대장균 (KCTC 1682), 살모넬라 티피무리움 (KCTC 1926), 슈도모나스 에루기노사 (KCTC 1637)와 프로테우스 불가리스 (KCTC 2433)를 생명공학연구소 유전자은행으로부터 분양받아, 각 균주를 LB 배지(1% 박토 트립톤, 0.5% 박토 이스트 추출물, 1% 염화나트륨; Sigma, USA)에서 중간-로그 상 (mid-log phase)까지 배양한 다음 1% 박토 펩톤 배지 (Difco, USA)로 1×104 세포/100 ㎕의 균체 농도로 희석하여 마이크로 타이트레이트 플레이트 (Nunc, USA)에 접종하였다. 실시예 1에서 합성한 본원 발명의 펩타이드 및 표 1의 펩타이드들을 각각 25 μM/웰 (well)부터 1/2배씩 희석하여 플레이트에 첨가한 후 37℃에서 6 시간 동안 배양하였고, 마이크로 타이트레이트 플레이트 판독기 (Merck Elisa reader, 독일)를 이용하여 620 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하여 각 균주의 MIC 값을 결정하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.First, Bacillus subtilis (KCTC 1918), Staphylococcus epidermidis (KCTC 1917) and Staphylococcus aureus (KCTC 1621) as Gram-positive bacteria, and Escherichia coli (KCTC) as Gram-negative bacteria were used to determine the antimicrobial activity. 1682), Salmonella typhimurium (KCTC 1926), Pseudomonas aeruginosa (KCTC 1637), and Proteus vulgaris (KCTC 2433) were purchased from the Biotechnology Research Institute Genetic Bank, and each strain was isolated from LB medium (1% Bakto tryptone, 0.5). Cultured in 1% Bakto Yep Extract, 1% Sodium Chloride; Sigma, USA to mid-log phase and then in 1% Bakto Peptone medium (Difco, USA) at a concentration of 1 × 10 4 cells / 100 μl Diluted inoculated in micro titrate plate (Nunc, USA). The peptides of the present invention synthesized in Example 1 and the peptides of Table 1 were each diluted 1/2 fold from 25 μM / well and added to the plates, followed by incubation at 37 ° C. for 6 hours, and the micro titrate plate reader. (Merck Elisa reader, Germany) was used to determine the MIC value of each strain by measuring the absorbance at a wavelength of 620 nm, the results are shown in Table 2 below.
그 결과, 본 발명의 서열번호 3으로 기재되는 펩타이드는 대조군인 서열번호 1로 기재되는 HP (2-20) 펩타이드에 비해 균주에 따라 32배 이상 높은 항균 활성을 나타내었고, 서열번호 3로 기재되는 HPA3 펩타이드에 비해서는 4배 이상의 높은 항균 활성을 나타내었으며, 양성 대조군으로 사용한 서열번호 4로 기재되는 멜리틴 펩타이드에 대해서는 비슷하거나 2배 이상의 우수한 항균활성을 나타냄을 확인하였다. 결과적으로, 본원 발명의 펩타이드는 그람 양성균 및 그람 음성균 모두에서 기존의 양친화성 펩타이드에 비해 매우 우수한 항균 활성을 나타내었다.As a result, the peptide described in SEQ ID NO: 3 of the present invention exhibited an antimicrobial activity of at least 32 times higher than that of the HP (2-20) peptide described in SEQ ID NO: 1, which is a control group. 4 times higher antimicrobial activity than HPA3 peptide, and the melittin peptide described in SEQ ID NO: 4 used as a positive control, it was confirmed that the similar or two times more excellent antimicrobial activity. As a result, the peptide of the present invention showed a very good antimicrobial activity compared to the existing amphiphilic peptide in both Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria.
<< 실시예Example 3> 항진균 활성 측정 3> Determination of antifungal activity
실시예 1의 방법으로 제조된 본원 발명의 펩타이드의 항진균 활성을 측정하기 위하여, MTT 분석에 의한 MIC 값을 측정하였다.In order to measure the antifungal activity of the peptides of the present invention prepared by the method of Example 1, MIC values by MTT assay were measured.
우선, 96-웰 플레이트에 병원성 진균인 캔디다 알비칸스 (TIMM 1768), 트리코스포론 베이겔라이 (KCTC 7707) 및 사카로마이세스 세르비지애 (KCTC 7296)의 각종 진균을 포함한 PDB 배지 (20% 포테이토 인퓨전 프럼, 2% 박토 덱스트로즈; Difco, USA) 100 ㎕씩을 분주한 다음, 본 발명의 항생 펩타이드를 각각 50 μM/웰 (well)부터 1/2배씩 희석하여 플레이트에 첨가하여 다시 16시간 이상 배양하였다. 이어서, PBS에서 pH 7.4의 5 ㎎/㎖ 농도의 MTT 용액 (3-[4,5-dimethyl-2-thiazolyl]-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide,; Amersham life science, USA) 10 ㎕를 모든 웰에 첨가하여 다시 5 내지 6시간 배양하였다. 그 후, 살아 있는 세포의 미토콘드리아 효소에 의해 생성된 포르마잔 (formazan)을 0.04 N HCl-이소프로판올 (isopropanol) 용액 100 ㎕로 잘 용해시킨 후 ELISA 판독기(reader)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 발색되는 정도로 MIC 값을 측정하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.First, PDB medium (20%) containing various fungi of the pathogenic fungi Candida albicans (TIMM 1768), Tricosporon Beiglai (KCTC 7707) and Saccharomyces cerbizia (KCTC 7296) in 96-well plates. 100 μl of potato infusion frum, 2% bactodextrose; Difco, USA) was added, and then the antibiotic peptides of the present invention were diluted 1/2 fold from 50 μM / well, respectively, and added to the plate for another 16 hours. The above culture was carried out. Subsequently, 10 μl of a MTT solution (3- [4,5-dimethyl-2-thiazolyl] -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide, Amersham life science, USA) at a concentration of 5 mg / ml in PBS at pH 7.4 Was added to all wells and incubated again for 5 to 6 hours. Subsequently, formazan produced by mitochondrial enzymes in living cells was well dissolved with 100 μl of 0.04 N HCl-isopropanol solution, and then absorbance was measured at 570 nm using an ELISA reader. The MIC value was measured to the extent of color development, and the results are shown in Table 3 below.
그 결과, 본원 발명의 서열번호 3으로 기재되는 펩타이드의 항진균 활성을 HP (2-20) 펩타이드와 비교하였을 때, C. 알비칸스, S. 세르비지애 및 T. 베이겔라이의 경우에는 대조군 HP (2-20) 펩타이드 보다 8 내지 16배 정도 높은 항진균 활성을 나타내었으며, 양성 대조군으로 사용한 멜리틴 펩타이드 보다는 2 내지 16배 정도 더 높은 항진균 활성을 나타냄을 확인하였다. 결과적으로, 본원 발명의 펩타이드는 병원성 진균 모두에서 기존의 양친화성 펩타이드에 비해 매우 우수한 항진균 활성을 나타내었다.As a result, when comparing the antifungal activity of the peptide set forth in SEQ ID NO: 3 of the present invention with the HP (2-20) peptide, C. Albicans, S. Serbia and T. In the case of Beigelai, the antifungal activity was 8 to 16 times higher than that of the control HP (2-20) peptide, and the antifungal activity was 2 to 16 times higher than the melittin peptide used as the positive control. As a result, the peptides of the present invention showed very good antifungal activity compared to existing amphiphilic peptides in both pathogenic fungi.
<< 실시예Example 4> 세포 독성 측정 4> Cytotoxicity Measurement
실시예 1의 방법으로 제조된 접힘 구조를 갖는 펩타이드가 세포독성을 나타내는지를 확인하기 위하여, 접힘 구조를 갖는 펩타이드의 적혈구 파괴능을 조사하였다.In order to confirm whether the peptide having the folded structure prepared by the method of Example 1 exhibits cytotoxicity, the erythrocyte destruction ability of the peptide having the folded structure was investigated.
우선, 인간 적혈구를 8%의 농도가 되도록 인산염 완충용액 (PBS, pH 7.0)으로 희석하고 여기에 12.5 μM/웰부터 1/2의 농도로 표 1에 서열번호 1 내지 4로 기재된 펩타이드들을 각각 연속적으로 희석하여 37℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 이후, 1,000 g로 원심분리하여 그 상등액 속에 포함된 헤모글로빈량을, 414 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하여 조사하였다. 세포 파괴 정도를 비교 조사하기 위하여 1% 트리톤 X-100 (sigma, USA) 을 인간 적혈구 세포에 첨가하여 그 상등액의 흡광도를 측정하였다. 상기 1% 트리톤 X-100의 세포 파괴능을 100%로 하고, 하기 수학식 1에 따라 본원 발명의 펩타이드 및 표 1의 펩타이드들의 적혈구 파괴능을 계산하였다.First, dilute human erythrocytes with phosphate buffer (PBS, pH 7.0) to a concentration of 8% and continuously sequence the peptides listed in SEQ ID NOS: 1-4 in Table 1 at concentrations from 12.5 μM / well to 1/2 It was diluted with and reacted at 37 ℃ for 1 hour. Then, the amount of hemoglobin contained in the supernatant by centrifugation at 1,000 g was investigated by measuring the absorbance at 414 nm wavelength. In order to investigate the degree of cell destruction, 1% Triton X-100 (sigma, USA) was added to human red blood cells to measure the absorbance of the supernatant. The cell destruction capacity of the 1% Triton X-100 was 100%, and the red blood cell destruction ability of the peptide of the present invention and the peptides of Table 1 was calculated according to the following Equation 1.
상기 식에서, 흡광도 A는 414 ㎚ 파장에서 펩타이드 용액의 흡광도, 흡광도 B는 414 ㎚ 파장에서 PBS의 흡광도 그리고 흡광도 C는 414 ㎚ 파장에서 1% 트리톤 X-100의 흡광도를 나타낸다.In the above formula, absorbance A is the absorbance of the peptide solution at 414 nm wavelength, absorbance B is the absorbance of PBS at 414 nm wavelength and absorbance C is the absorbance of 1% Triton X-100 at 414 nm wavelength.
상기 식에 의한 적혈구 파괴능의 결과를 하기 표 4에 나타내었다.The results of erythrocyte destructive ability according to the above formula are shown in Table 4 below.
또한, 정상의 사람 혈액으로부터 적혈구만을 분리하여 이들 적혈구에 본 발명의 펩타이드를 최소생육저해농도의 60%만을 처리하고 필터에 거른 후 고정 처리하고 이들의 적혈구가 파괴되는지를 확인하기 위해 무처리군을 음성 대조군으로 하여 본원 발명의 서열번호 3의 펩타이드 처리군과 서열번호 4의 펩타이드 처리군의 전자현미경 관찰을 수행하였다.In addition, only red blood cells are separated from normal human blood, and the red blood cells are treated with only 60% of the minimum growth inhibitory concentration of the peptides of the present invention, filtered through a filter, and treated to determine whether their red blood cells are destroyed. As a negative control, electron microscopy of the peptide treatment group of SEQ ID NO: 3 and the peptide treatment group of SEQ ID NO: 4 was performed.
그 결과, 본원 발명의 서열번호 3으로 기재되는 펩타이드는 세포독성을 거의 나타내지 않는 반면에, 양성 대조군으로 사용한 멜리틴 펩타이드는 세포독성이 매우 높게 나타남을 알 수 있다(표 4와 도 2).As a result, the peptide described in SEQ ID NO: 3 of the present invention shows little cytotoxicity, whereas the melittin peptide used as a positive control shows very high cytotoxicity (Table 4 and Figure 2).
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 접힘 구조를 포함함으로써 그람 양성균 및 그람 음성균 모두에서 탁월한 항균작용을 나타내고, 진균에 대해서도 높은 항진균 활성을 나타내는 서열번호 3으로 기재되는 접힘 구조를 갖는 항생 펩타이드를 제공한다. 또한, 본 발명에 의해 제공되는 항생 펩타이드와 조성물은 세포독성을 나타내지 않으므로 인체에 안전한 항생제로 유용하게 사용될 수 있다.As described above, the present invention provides an antibiotic peptide having a folding structure described in SEQ ID NO: 3 that exhibits excellent antibacterial activity in both Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria by including a folding structure, and also exhibits high antifungal activity against fungi. . In addition, since the antibiotic peptide and the composition provided by the present invention does not exhibit cytotoxicity, it may be usefully used as an antibiotic that is safe for the human body.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Chosun University <120> Novel synthetic antimicrobial hinge peptide derived from Ribosomal Protein L1 of Helicobacter pylori and composition therefrom <130> 7P-06-10 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <400> 1 Ala Lys Lys Val Phe Lys Arg Leu Glu Lys Leu Phe Ser Lys Ile Gln 1 5 10 15 Asn Asp Lys <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA3 <400> 2 Ala Lys Lys Val Phe Lys Arg Leu Glu Lys Leu Phe Ser Lys Ile Trp 1 5 10 15 Asn Trp Lys <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA3-Pro <400> 3 Ala Lys Lys Val Phe Lys Arg Leu Pro Lys Leu Phe Ser Lys Ile Trp 1 5 10 15 Asn Trp Lys <210> 4 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mellitin <400> 4 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln 20 25 <110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Chosun University <120> Novel synthetic antimicrobial hinge peptide derived from Ribosomal Protein L1 of Helicobacter pylori and composition therefrom <130> 7P-06-10 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <400> 1 Ala Lys Lys Val Phe Lys Arg Leu Glu Lys Leu Phe Ser Lys Ile Gln 1 5 10 15 Asn Asp Lys <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA3 <400> 2 Ala Lys Lys Val Phe Lys Arg Leu Glu Lys Leu Phe Ser Lys Ile Trp 1 5 10 15 Asn Trp Lys <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA3-Pro <400> 3 Ala Lys Lys Val Phe Lys Arg Leu Pro Lys Leu Phe Ser Lys Ile Trp 1 5 10 15 Asn Trp Lys <210> 4 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mellitin <400> 4 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln 20 25
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