KR100934028B1

KR100934028B1 - Composition for the diagnosis, prevention, and treatment of Alzheimer's disease through Tau modification by GPSN2

Info

Publication number: KR100934028B1
Application number: KR1020070109002A
Authority: KR
Inventors: 정용근; 박혜진
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2007-10-29
Filing date: 2007-10-29
Publication date: 2009-12-28
Also published as: KR20090043251A

Abstract

본 발명은 치매(알츠하이머 병) 질환의 예방 및 치료제에 관한 것으로 GPSN2(Glycoprotein, synaptic 2)에 특이적인 siRNA로 GSPN2의 발현을 저해하여 알츠하이머를 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물에 이용될 수 있으며, GPSN2의 Aβ에 의한 신호 전달, GSK3β에 의한 타우 단백질의 인산화 조절 등이 알츠하이머 질환의 진단, 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.The present invention relates to a prophylactic and therapeutic agent for dementia (Alzheimer's disease), which can be used in pharmaceutical compositions for preventing or treating Alzheimer's by inhibiting the expression of GSPN2 with siRNA specific to GPSN2 (Glycoprotein, synaptic 2). Signal transduction by Aβ of GPSN2, regulation of phosphorylation of tau protein by GSK3β, etc. may be usefully used for the diagnosis, prevention and treatment of Alzheimer's disease.

알츠하이머, 타우(Tau) 단백질, 아밀로이드-베타(Aβ), 응집, 인산화 Alzheimer's, Tau protein, amyloid-beta (Aβ), aggregation, phosphorylation

Description

Composition for the diagnosis, prevention, and treatment of Alzheimer's disease through Tau modification by GPSN2 by glycoprotein synaptic 2

본 발명은 치매질환의 예방 또는 치료기술에 관한 것이다.The present invention relates to a technique for preventing or treating dementia disease.

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알츠하이머 질환(Alzheimer's Disease: 이하 "AD"라 칭함)은 점진적인 신경세포의 퇴화로 인해 인지능력 상실을 가져오는 치매의 50에서 70%를 차지하는 가장 일반적인 질병이다. AD는 뇌에 존재하는 판단, 기억, 언어기능을 담당하는 부분에 손상이 생겨서 기억력이 없어지고, 의식의 불분명해지며, 사고력, 계산력, 판단력, 상식 등의 대뇌기능이 장애를 나타내기 때문에 직업 및 일상 사회생활을 하기 어려워지게 된다.
AD로 사망한 환자의 두뇌에서는 노인성 플라그(senile plaque)와 신경원섬유의 엉킴(neurofibrillary tangles)이 병리학적 특성으로 나타난다. 노인성 플라그는 세포 외부에 단백질과 죽은 세포 등이 축적되어 형성되는 것으로, 주 구성 성분은 아밀로이드-베타(Amyloid-β: 이하 "Aβ"라 칭함)라는 펩티드이다(Hardy, J. et al., Nat Neurosci. 1:355-358, 1998). 그리고 응집체의 주요 구성 요소는 타우(Tau)라 부르는 단백질의 한 형태이다. 타우 단백질은 중추신경계에서 서로 붙어서 신경세포의 내부구조를 단단하게 하는 구조물 역할을 한다. 하지만, 치매 환자의 뇌에서는 이런 타우 단백질이 화학적으로 변성을 일으키고 마치 실타래기에 얽히듯이 서로 얽혀서 제 역할을 못하게 된다. 이로 인해 타우 단백질은 서로 떨어져 신경세포 사이의 연결을 떨어뜨리게 되고 결국 신경세포는 죽게 된다.
현재까지 AD에 관한 연구는, 주로 Aβ 생성 억제제 또는 항산화제 같은 신경세포 독성 저해제들을 이용한 AD 예방 및 치료제가 개발되었다. 현재 니코틴 수용체 작용제(Nicotin receptor agonist)인 ABT-418; 무스카린 수용체 작용제(Muscarin receptor agonist)인 자노멜린(Xanomeline), YM-976; 아세틸콜린 전구체인 레시틴(Lecithin), 아세틸-L-카니틴(Acetyl-L-carnitine); 금속 킬레이터(Metal chelator)인 데스페리옥사민(Desferrioxamine), 리오퀴놀(Lioquinol); 베타-시트 차단제(Beta-sheet breaker)인 iAβ5, iAβ11; 항산화제(Antioxidant)인 비타민 E(Vitamine E), 은행잎추출물(Ginkgo Biloba), 멜라토닌(Melatonin), 아이디비논(Idebenone); sAPP 방출제(releasing agent)인 니코틴(Nicotine), 아세틸콜린(Acetylcholine), 카바콜(Cabachol); β 세크레타제 또는 γ 세크레타제 억제제(inhibitor)인 OM99-1, OM99-2, OM99-3, Z-VLL-CHO; 항염증제(Anti inflammary agent)인 NSAID(Iburofen, Indomethacine); 호르몬(Horemone)인 에스트로겐(Estrogen); 백신인 AN-1792; 콜레스테롤(Cholesterol) 저하제인 심바스타틴(Simvastatin), 아트로바스타틴(Atrovastatin) 등이 개발되고 있으나, 아직 효과가 약간의 병리적 증상을 완화 또는 진행 정도를 늦추는 정도로만 있거나, 자체의 독성 때문에 실제 적용이 어려운 물질이 대부분이어서 안정적이며 효과적인 AD 치료제의 개발이 시급하다.Alzheimer's Disease (hereinafter referred to as "AD") is the most common disease that accounts for 50 to 70% of dementia resulting in cognitive loss due to progressive neuronal degeneration. AD is damaged in the parts responsible for judgment, memory, and language functions present in the brain, memory loss, consciousness unclear, cerebral functions such as thinking, computation, judgment, common sense, etc. It becomes difficult to do everyday social life.
Senile plaque and neurofibrillary tangles are pathological features in the brains of patients who die from AD. The senile plaque is formed by the accumulation of proteins and dead cells, etc., outside the cell, and its main component is a peptide called amyloid-beta (hereinafter referred to as "Aβ") (Hardy, J. et al ., Nat Neurosci. 1: 355-358, 1998). And the major component of aggregates is a form of protein called Tau. Tau proteins bind to each other in the central nervous system and act as structures that strengthen the internal structure of nerve cells. However, in the brains of dementia patients, these tau proteins are chemically denatured and entangled with each other as if they are entangled in a thread. This causes the tau proteins to fall off each other, dropping the connections between the nerve cells and eventually killing them.
To date, studies on AD have mainly developed AD prophylactic and therapeutic agents using neuronal cytotoxic inhibitors such as A [beta] production inhibitors or antioxidants. ABT-418, currently a nicotin receptor agonist; Xanomeline, a Muscarin receptor agonist, YM-976; Acetylcholine precursors Lecithin, Acetyl-L-carnitine; Metal chelator Desferrioxamine, Rioquinol; Beta-sheet breakers iAβ5, iAβ11; Antioxidants (Vitamine E), Ginkgo Biloba, Melatonin (Melatonin), Idebenone (Antioxidant); nicotine, acetylcholine, cabachol, which are sAPP releasing agents; OM99-1, OM99-2, OM99-3, Z-VLL-CHO, which are β secretase or γ secretase inhibitors; Anti-inflammatory (Nanti-flaming agent) NSAID (Iburofen, Indomethacine); Estrogen, a hormone (Horemone); AN-1792 vaccine; Simvastatin and Atrovastatin, cholesterol lowering drugs, have been developed, but the effects are still only effective to alleviate or slow the progress of some pathological symptoms, or due to their toxicity, they are difficult to apply. Most of them are urgently needed to develop stable and effective AD therapies.

한편, GPSN2(Glycoprotein, synaptic 2)는 기존에 지방산(Fatty acid) 합성에서 환원효소(reductase)의 역할을 하는 것으로 알려져 있으며(Young-Ah Moon et al., J. Biol. Chem. 278:7335-7343, 2003), 최근 쥐에게서 시냅스 당단백질(synaptic glycoprotein)로도 발견되었다(Yu AC et al., Neurochem Res. 10:1289-94, 2005). 하지만 치매 또는 치매치료와의 연관성에 대해서는 알려진 바는 없다. 한편 최근 들어 비만, 당뇨 등의 질병과 치매와의 연관성이 보고되고 있고, 이에 대한 연구가 진행 중이다. 또한 지방산에 의해 타우 단백질의 인산화가 증가한다는 보고도 있다(Patil S et al., Neurosci Lett. 384:288-293, 2005). 이러한 근거로 GPSN2가 지방산의 합성과 연관하여 치매에 있어 타우의 인산화와 응집현상을 조절하는 중요한 요소가 될 수 있음을 예측하고, 본 발명자들은 타우 단백질의 응집현상 및 인산화가 GPSN2에 의한 것임을 확인하고, 상기 GPSN2 발현의 억제를 통해, 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.On the other hand, GPSN2 (Glycoprotein, synaptic 2) has been known to play a role of reductase in fatty acid synthesis (Young-Ah Moon et al. , J. Biol. Chem . 278: 7335- 7343, 2003), recently found to be synaptic glycoproteins in mice (Yu AC et al ., Neurochem Res . 10: 1289-94, 2005). However, there is no known association with dementia or dementia treatment. Recently, there have been reports of association between diseases such as obesity and diabetes and dementia. In addition, fatty acids increase the phosphorylation of tau protein (Patil S et al ., Neurosci Lett . 384: 288-293, 2005). On this basis, we predicted that GPSN2 could be an important factor controlling tau phosphorylation and coagulation in dementia in association with fatty acid synthesis, and the present inventors confirmed that coagulation and phosphorylation of tau protein was caused by GPSN2. The present invention was completed by confirming that it can be usefully used for the prevention or treatment of Alzheimer's disease through the inhibition of GPSN2 expression.

본 발명의 목적은 타우(Tau) 단백질의 신경독성을 유발하는 유전자를 밝히고, 이 유전자의 독성 매개 기능을 입증하여, 이를 통해 알츠하이머를 진단, 예방 및 치료하고자 하는 것이다.An object of the present invention is to identify genes that induce neurotoxicity of the Tau protein, and to demonstrate the toxicity-mediated function of these genes, thereby diagnosing, preventing and treating Alzheimer's disease.

본 발명자는 타우 단백질 응집현상과 인산화의 변화를 유도하는 독특한 GPSN2(Glycoprotein, synaptic2)유전자를 확인하고, 이 유전자를 분리한 후 녹-아웃 유전자, 타우 인산화 관련 항체 등을 이용하여 이 유전자가 타우 단백질의 응집현상과 인산화를 매개한다는 것을 입증하였다.The present inventors identified a unique GPSN2 (Glycoprotein, synaptic2) gene that induces tau protein aggregation and phosphorylation, isolates the gene, and then uses the knock-out gene, tau phosphorylation-related antibody, and the like to identify the tau protein. Mediated aggregation and phosphorylation.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 신경세포주에서 GPSN2(Glycoprotein, synaptic 2)의 농도에 의존적으로 타우(Tau) 단백질의 응집현상 및 인산화가 증가하며(도 1 참조), GPSN2를 녹-아웃 시킬 경우 타우의 응집현상이 완화되었고(도 2a 참조), 인산화가 감소하는 것(도 2b 참조)을 확인하였다. 또한, Aβ_1-42에 의해 GPSN2를 상향 조절하며(도 2c 참조), 알츠하이머 질환에서 나타나는, 타우 단백질의 대표적 인산화 장소인 396 및 404번째 세린을 인산화시키는 GSK3β 키나아제가 상기 GPSN2에 의해 상향 조절되는 것을 확인하였다(도 3 참조).In a specific embodiment of the present invention, the aggregation and phosphorylation of the Tau protein increases depending on the concentration of GPSN2 (Glycoprotein, synaptic 2) in the neuronal cell line (see FIG. 1), and tau when knocking out GPSN2 It was confirmed that the aggregation phenomenon of (refer to Figure 2a), phosphorylation is reduced (see Figure 2b). In addition, GSK3β kinase, which upregulates GPSN2 by Aβ _1-42 (see FIG. 2C) and phosphorylates 396 and 404 th serine, which are representative phosphorylation sites of tau protein, in Alzheimer's disease, is upregulated by GPSN2. It was confirmed (see FIG. 3).

이로 보아, 상기 GPSN2의 발현 또는 활성을 억제하는 물질은 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
이에, 본 발명은
1) 서열번호 2로 기재되는 GPSN2(Glycoprotein, synaptic 2) 유전자의 발현수준의 증감을 측정하는 단계; 및,
2) 상기 GPSN2 유전자의 발현수준의 증감을 서열번호 1로 기재되는 타우(Tau) 단백질의 응집 및 인산화의 증감과 관련시키는 단계를 포함하는 타우 단백질의 응집 및 인산화 정도의 시험관 내 측정방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) GPSN2를 암호화하는, 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 서열번호 1로 기재되는 타우 단백질을 발현하는 세포주에 상기 발현벡터를 형질도입하는 단계;
3) 상기 형질도입된 세포주에서 GPSN2의 과발현을 유도하는 단계;
4) 상기 과발현이 유도된 세포주에 GPSN2의 발현 또는 활성을 억제하는 후보물질을 처리하는 단계; 및,
5) 미처리군에 비해 GPSN2의 발현 또는 활성을 억제하는 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는 타우 단백질의 응집 및 인산화를 억제하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시예에서와 마찬가지로 상기 GPSN2의 발현은 GPSN2에 특이적인 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅의 방법으로 확인할 수 있으며, GPSN2의 활성은 타우 단백질의 396 및 404번째 세린의 인산화 상태를 인지할 수 있는 PHF-1 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅을 수행함으로써 타우 단백질의 인산화 정도를 확인하는 방법 또는 형광현미경으로 타우 단백질의 응집현상 정도를 관측하는 방법 등으로 확인할 수 있다.
아울러, 본 발명은 GPSN2에 특이적인 서열번호 3 또는 서열번호 4의 siRNA를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.In view of this, a substance that inhibits the expression or activity of GPSN2 may be usefully used for the prevention or treatment of Alzheimer's disease.
Thus, the present invention
1) measuring the increase or decrease in the expression level of the GPSN2 (Glycoprotein, synaptic 2) gene described in SEQ ID NO: 2; And,
2) provides an in vitro measurement method of the degree of aggregation and phosphorylation of tau protein comprising the step of associating the increase and decrease of the expression level of the GPSN2 gene with the increase and decrease of aggregation and phosphorylation of the Tau protein described in SEQ ID NO: .
In addition, the present invention
1) preparing an expression vector operably linked to the polynucleotide set forth in SEQ ID NO: 2, encoding GPSN2;
2) transducing the expression vector into a cell line expressing the tau protein set forth in SEQ ID NO: 1;
3) inducing overexpression of GPSN2 in the transduced cell line;
4) treating a candidate substance that inhibits the expression or activity of GPSN2 in the overexpression-induced cell line; And,
5) Provides a method for screening a substance that inhibits aggregation and phosphorylation of tau protein, comprising selecting a candidate substance that inhibits the expression or activity of GPSN2 compared to the untreated group.
As in the embodiment of the present invention, the expression of GPSN2 can be confirmed by Western blotting method using an antibody specific for GPSN2, and the activity of GPSN2 can recognize the phosphorylation status of 396 and 404 th serine of tau protein. Western blotting using the PHF-1 antibody may be used to confirm the degree of phosphorylation of the tau protein or to observe the degree of aggregation of the tau protein under a fluorescence microscope.
In addition, the present invention provides a composition for preventing or treating Alzheimer's disease comprising siRNA of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 specific to GPSN2 as an active ingredient.

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이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.Hereinafter, the term used by this invention is demonstrated.

siRNA는 세포 안에서 특이 서열에 결합하여 유전자를 녹-아웃(knock-out)시키는 기능을 하는 RNA 분자를 의미한다. 상기 siRNA는 RNA올리고뉴클레오티드의 화학적 합성, 시험관내 전사(in vitro transcription)을 이용한 작은 RNA(small RNA)의 합성, 시험관내 전사에 의해 합성된 긴 dsRNA의 Rnase Ⅲ 또는 다이서(Dicer)를 이용한 절단, siRNA 발현 플라스미드나 바이러스 벡터의 세포내 전달을 통한 발현, PCR-유래 siRNA 발현 카세트(cassette)의 세포 내 전달을 통한 발현에 의해 제작될 수 있다. siRNA refers to an RNA molecule that functions to bind to a specific sequence in a cell and knock out a gene. The siRNA is cleaved using Rnase III or Dicer of long dsRNA synthesized by chemical synthesis of RNA oligonucleotides, synthesis of small RNA using in vitro transcription, and in vitro transcription. , expression through intracellular delivery of siRNA expression plasmids or viral vectors, and expression through intracellular delivery of PCR-derived siRNA expression cassettes.

응집현상은 단백질이 서로 결합하여 하나의 덩어리를 이루는 상태를 말하는 것이다. 본 발명에서 사용된 타우의 응집현상이란 타우 단백질이 서로 뭉쳐지는 현상을 타우 단백질에 붙어있는 형광 단백질을 통해 현미경 상에서 간접적으로 보이는 상태를 말한다. Aggregation refers to a state in which proteins bind to each other to form a mass. Agglomeration of tau used in the present invention refers to a state in which the tau protein aggregates with each other indirectly on a microscope through a fluorescent protein attached to the tau protein.

인산화란 키나아제에 의해서 인산기가 붙는 것을 말한다. 본 발명에 사용된 타우의 인산화란 GSK3β 등의 키나아제에 의해 타우 단백질이 인산화되는 현상으로 알츠하이머 환자에서 인산화현상이 증가되는 것으로 보고된다. 본 발명에서 타우의 인산화는 알츠하이머에서 나타나는 대표적 인산화 장소인 396, 404번째 세린이 인산화 된 상태를 인지하는 PHF-1 항체에 의해 나타내었다.Phosphorylation refers to the attachment of phosphate groups by kinases. Phosphorylation of tau used in the present invention is a phenomenon in which tau protein is phosphorylated by kinases such as GSK3β, which is reported to increase phosphorylation in Alzheimer's patients. In the present invention, phosphorylation of tau was represented by PHF-1 antibody that recognizes the phosphorylated state of 396, 404 th serine, which is a representative phosphorylation site in Alzheimer's.

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상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명자는 GPSN2 유전자가 타우 단백질의 응집현상과 인산화를 증가시키는 것에 관여한다는 것을 밝혀냈으며 또한 GSPN2의 Aβ에 의한 신호 전달, GSK3β에 의한 타우 단백질의 인산화 조절에 관여함으로써 알츠하이머 질환의 진단, 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.As discussed above, the present inventors have found that the GPSN2 gene is involved in increasing the aggregation and phosphorylation of tau protein and is also involved in signaling of GSPN2 by Aβ and in the regulation of phosphorylation of tau protein by GSK3β in Alzheimer's disease. It can be confirmed that it can be usefully used for the diagnosis, prevention and treatment of the.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.

<실시예 1> 인간 신경 세포주에서 GPSN2의 발현량에 따른 타우(Tau)의 응집 형성과 인산화 정도의 확인Example 1 Identification of Tau Aggregation and Phosphorylation According to the Expression of GPSN2 in Human Neuronal Cell Lines

<1-1> GPSN2의 발현량에 따른 타우의 응집 형성 확인<1-1> Confirmation of Tau Aggregation According to the Expression of GPSN2

4개의 미세관결합 도메인(microtubule-binding domain; MBD)을 갖는 인간 타우 단백질(P10636: 서열번호 1)을 암호화하는 유전자를 pEGFP 발현벡터에 서브클로닝(Tau-GFP)하였다. 이후, 상기 발현벡터를 10%(v/v) FBS가 함유된 듈베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagles Medium:DMEM)에서 배양한 인간 신경모세포종인 SH-SY5Y에 LipofectAMINE^TM 시약(GIBCO BRL)을 사용하여 제작자의 프로토콜에 따라 형질도입하여 Tau-GFP를 과발현시켰다. 이후, 상기 과발현 세포주에 GPSN2(NM_138501: 서열번호 2)의 발현벡터를 pcDNA 벡터에 제작하여 200, 400 및 800 ng의 농도별로 일시적 형질도입한 후, 24시간 및 48시간 후에 GPSN2 발현벡터의 농도에 따른 응집현상 정도를 형광현미경(Leica DMRBE, Germany)으로 조사하였다. 이때, Tau-GFP의 발현량은 100 ng 이었다.
그 결과, 도 1a에서 나타난 바와 같이 GPSN2의 농도에 의존적으로 응집현상이 증가하는 것을 확인하였다.Genes encoding human tau protein (P10636: SEQ ID NO: 1) having four microtubule-binding domains (MBD) were subcloned (Tau-GFP) into pEGFP expression vectors. Subsequently, the expression vector was used with LipofectAMINE ^™ reagent (GIBCO BRL) in SH-SY5Y, a human neuroblastoma cultured in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) containing 10% (v / v) FBS. Was transduced according to the manufacturer's protocol to overexpress Tau-GFP. Thereafter, an expression vector of GPSN2 (NM_138501: SEQ ID NO: 2) was prepared in the pcDNA vector in the overexpressed cell line, and transiently transduced according to the concentrations of 200, 400, and 800 ng. The degree of aggregation was determined by fluorescence microscopy (Leica DMRBE, Germany). At this time, the expression level of Tau-GFP was 100 ng.
As a result, as shown in Figure 1a it was confirmed that the aggregation phenomenon increases depending on the concentration of GPSN2.

<1-2> GPSN2의 발현량에 따른 타우의 인산화 정도 확인<1-2> Identification of Tau Phosphorylation According to the Expression Level of GPSN2

실시예 1-1의 과발현 세포주를 샘플링 완충액(10% 글리세롤, 2% SDS, 62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8)으로 용해시켜서 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질을 대상으로 SDS-PAGE를 수행하여 통해 단백질을 겔 상에서 분리한 후, PVDF 막으로 옮겼다. 그 후, 탈지분유(non-fat dry milk)를 이용해 차단하였고, 일차 항체(타우 단백질의 396 및 404번째 아미노산의 인산화를 인지하는 항체(PHF-1) 및 항-Tau12 항체) 및 이차 항체를 순차적으로 혼성화시켰고, ECL 반응을 통해 인산화의 변화를 관찰하였다. PHF-1 항체는 알츠하이머 질환에서 나타나는 타우의 대표적 인산화 장소인 396 및 404번째 세린이 인산화된 상태를 인지할 수 있다.
그 결과, 도 1b에서 나타난 바와 같이 GPSN2의 농도에 의존적으로 타우 단백질의 인산화가 증가하는 것을 확인하였다.The protein was extracted by dissolving the overexpressing cell line of Example 1-1 in sampling buffer (10% glycerol, 2% SDS, 62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8). SDS-PAGE was performed on the extracted protein to separate the protein on the gel, and then transferred to the PVDF membrane. Subsequently, it was blocked using non-fat dry milk, and the primary antibody (an antibody that recognizes phosphorylation of the 396th and 404th amino acids of the tau protein (PHF-1) and an anti-Tau12 antibody) and a secondary antibody were sequentially Hybridization and changes in phosphorylation were observed through the ECL reaction. The PHF-1 antibody can recognize the phosphorylated state of 396 and 404 th serines, which are the representative phosphorylation sites of tau in Alzheimer's disease.
As a result, as shown in Figure 1b it was confirmed that the phosphorylation of tau protein increases depending on the concentration of GPSN2.

<실시예 2> GPSN2 녹-아웃에 의한 타우의 응집 형성과 인산화 정도의 확인Example 2 Confirmation of Tau Aggregation and Phosphorylation by GPSN2 Knock-out

실시예 1의 Tau-GFP 발현벡터를 10%(v/v) FBS가 함유된 DMEM에서 배양한 쥐의 신경모세포종인 HT22에 형질도입하여 Tau-GFP를 과발현시켰다. 이후, 하기 서열번호 3 및 4로 기재되는 센스 및 안티센스 올리고머를 제작한 후, pSuper-neo(Oligoengine, USA) 벡터에 삽입하여 GPSN2에 특이적인 siRNA(siGPSN2)를 발현하는 벡터를 제작하였다. 상기 벡터를 Tau-GFP가 과발현된 HT22에 형질도입시켜서 GPSN2를 녹-아웃 시켰다.The Tau-GFP expression vector of Example 1 was transduced into HT22, a mouse neuroblastoma cultured in DMEM containing 10% (v / v) FBS, to overexpress Tau-GFP. Subsequently, the sense and antisense oligomers described in SEQ ID NOs: 3 and 4 were prepared, and then inserted into a pSuper -neo (Oligoengine, USA) vector to prepare a vector expressing siRNA (siGPSN2) specific for GPSN2. The vector was transduced with Tau-GFP overexpressed HT22 to knock out GPSN2 .

이후, 상기 녹-아웃 세포주를 대상으로 응집현상과 인산화 정도를 확인한 결과, 타우의 응집현상이 완화되었고(도 2a), 인산화가 감소한 것(도 2b)으로 나타났다.Then, as a result of confirming the degree of aggregation and phosphorylation of the knock-out cell line, the aggregation phenomenon of the tau was alleviated (FIG. 2a), and phosphorylation was reduced (FIG. 2b).

siGPSN2-5-센스 올리고머(서열번호 3):siGPSN2-5-sense oligomer (SEQ ID NO: 3):

5'-GATCCCCAAATACGACTTTACGTCCATTCAAGAGATGGACGTAAAGTCGTATTTTTTTTA-3'5'-GATCCCCAAATACGACTTTACGTCCATTCAAGAGATGGACGTAAAGTCGTATTTTTTTTA-3 '

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siGPSN2-3-안티센스 올리고머(서열번호 4):siGPSN2-3-antisense oligomer (SEQ ID NO: 4):

5'-AGCTTAAAAAAAATACGACTTTACGTCCATCTCTTGAATGGACGTAAAGTCGTATTTGGG-3'5'-AGCTTAAAAAAAATACGACTTTACGTCCATCTCTTGAATGGACGTAAAGTCGTATTTGGG-3 '

<실시예 3> GPSN2 녹-아웃 세포주에서 Aβ 처리 후 응집현상 변화<Example 3> Aggregation change after Aβ treatment in GPSN2 knock-out cell line

실시예 1의 Tau 과발현 및 GPSN2 과발현 HT22세포에 실시예 2에서 제작한 siGPSN2를 형질도입한 후, 5 μM의 Aβ_1-42 또는 PBS를 처리하여 12시간 또는 24시간 후에 응집현상을 관찰하였다.After transducing siGPSN2 prepared in Example 2 to Tau overexpression and GPSN2 overexpressing HT22 cells of Example 1, 5 μM Aβ _1-42 or PBS was treated to observe the aggregation after 12 hours or 24 hours.

그 결과, 도 2c에서 나타난 바와 같이 GPSN2를 녹-아웃 시켰을 경우 Aβ에 의한 타우 단백질의 응집현상 증가를 관찰할 수 없었다. 따라서 GPSN2가 Aβ에 의한 타우 응집현상을 매개하는 것을 지시하였다.As a result, as shown in Fig. 2c, when the GPSN2 was knocked out, it was not observed to increase the aggregation phenomenon of tau protein by Aβ. Therefore, it is indicated that GPSN2 mediates tau aggregation by Aβ.

<실시예 4> 타우 키나아제 GSK3β의 저해제로 응집현상 변화Example 4 Aggregation Changes with Inhibitors of Tau Kinase GSK3β

Tau-GFP 발현벡터를 인간 신경세포주인 SH-SY5Y에서 과발현시킨 후, GPSN2의 발현벡터를 일시적 형질도입하였다. GSK3β의 저해제인 리튬클로라이드(LiCl) 10 mM, SB216763 10 μM 또는 다른 키나아제의 저해제인 SB203580 30 μM을 처리하여 48시간 동안 배양한 후, 타우 단백질의 응집 축적 및 인산화 정도를 조사하였다.
그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이 LiCl과 SB216763 저해제를 처리한 세포에서 응집현상과 인산화가 감소하였다. 따라서 GPSN2가 알츠하이머 질환에서 나타나는, 타우 단백질의 대표적 인산화 장소인 396 및 404번째 세린을 인산화시키는 GSK3β 키나아제의 조절 인자인 것을 지시하였다.After overexpressing the Tau-GFP expression vector in human neuronal cell line SH-SY5Y, the expression vector of GPSN2 was transiently transduced. After treatment with 10 mM lithium chloride (LiCl) inhibitor of GSK3β, 10 μM of SB216763 or 30 μM of SB203580 inhibitor of another kinase, the tau protein aggregated accumulation and phosphorylation were examined.
As a result, as shown in FIG. 3, aggregation and phosphorylation were reduced in cells treated with LiCl and SB216763 inhibitors. Therefore, it was indicated that GPSN2 is a regulatory factor of GSK3β kinase that phosphorylates 396 and 404 th serine, which are representative phosphorylation sites of tau protein in Alzheimer's disease.

도 1은 인간 신경 세포주에서 GPSN2의 발현량에 따른 타우(Tau)에 의한 응집 형성과 인산화 정도를 나타낸 도이다. 1 is a diagram showing the degree of aggregation and phosphorylation by Tau according to the expression level of GPSN2 in human neuronal cell lines.

도 2a-b는 쥐 신경 세포주에서 GPSN2를 녹-아웃 시켰을 때의 타우에 의한 응집 형성과 인산화 정도를 나타낸 도이고, 도 2c는 알츠하이머 질환의 주요한 병리적 특징인 아밀로이드 베타(Amyloid-β: Aβ)와의 관계를 나타낸 도이다. Figure 2a-b is a diagram showing the degree of aggregation and phosphorylation by tau when GPSN2 knocked out in a rat neuronal cell line, Figure 2c is amyloid-β (Aβ) which is a major pathological feature of Alzheimer's disease This diagram shows the relationship with.

도 3은 인간 신경 세포주에서 타우 단백질을 인산화시키는 키나아제인 GSK3β와 GPSN2의 관련성을 나타낸 도이다. 3 is a diagram showing the relationship between GSK3β and GPSN2, a kinase for phosphorylating tau protein in human neuronal cell lines.

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R&DB Foundation <120> Composition for the diagnosis, prevention, and treatment of Alzheimer's disease through Tau modification by GPSN2 <130> 9P-05-31 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 758 <212> PRT <213> Human Microtubule-associated protein tau <400> 1 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Glu Pro Glu Ser 115 120 125 Gly Lys Val Val Gln Glu Gly Phe Leu Arg Glu Pro Gly Pro Pro Gly 130 135 140 Leu Ser His Gln Leu Met Ser Gly Met Pro Gly Ala Pro Leu Leu Pro 145 150 155 160 Glu Gly Pro Arg Glu Ala Thr Arg Gln Pro Ser Gly Thr Gly Pro Glu 165 170 175 Asp Thr Glu Gly Gly Arg His Ala Pro Glu Leu Leu Lys His Gln Leu 180 185 190 Leu Gly Asp Leu His Gln Glu Gly Pro Pro Leu Lys Gly Ala Gly Gly 195 200 205 Lys Glu Arg Pro Gly Ser Lys Glu Glu Val Asp Glu Asp Arg Asp Val 210 215 220 Asp Glu Ser Ser Pro Gln Asp Ser Pro Pro Ser Lys Ala Ser Pro Ala 225 230 235 240 Gln Asp Gly Arg Pro Pro Gln Thr Ala Ala Arg Glu Ala Thr Ser Ile 245 250 255 Pro Gly Phe Pro Ala Glu Gly Ala Ile Pro Leu Pro Val Asp Phe Leu 260 265 270 Ser Lys Val Ser Thr Glu Ile Pro Ala Ser Glu Pro Asp Gly Pro Ser 275 280 285 Val Gly Arg Ala Lys Gly Gln Asp Ala Pro Leu Glu Phe Thr Phe His 290 295 300 Val Glu Ile Thr Pro Asn Val Gln Lys Glu Gln Ala His Ser Glu Glu 305 310 315 320 His Leu Gly Arg Ala Ala Phe Pro Gly Ala Pro Gly Glu Gly Pro Glu 325 330 335 Ala Arg Gly Pro Ser Leu Gly Glu Asp Thr Lys Glu Ala Asp Leu Pro 340 345 350 Glu Pro Ser Glu Lys Gln Pro Ala Ala Ala Pro Arg Gly Lys Pro Val 355 360 365 Ser Arg Val Pro Gln Leu Lys Ala Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp 370 375 380 Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Thr Ser Thr Arg Ser Ser 385 390 395 400 Ala Lys Thr Leu Lys Asn Arg Pro Cys Leu Ser Pro Lys Leu Pro Thr 405 410 415 Pro Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ile Gln Pro Ser Ser Pro Ala Val Cys 420 425 430 Pro Glu Pro Pro Ser Ser Pro Lys His Val Ser Ser Val Thr Ser Arg 435 440 445 Thr Gly Ser Ser Gly Ala Lys Glu Met Lys Leu Lys Gly Ala Asp Gly 450 455 460 Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys 465 470 475 480 Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro 485 490 495 Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser 500 505 510 Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg 515 520 525 Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala 530 535 540 Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu 545 550 555 560 Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys 565 570 575 Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val 580 585 590 Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys 595 600 605 Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln 610 615 620 Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 625 630 635 640 Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val 645 650 655 Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly 660 665 670 Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile 675 680 685 Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp 690 695 700 His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr 705 710 715 720 Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met 725 730 735 Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser 740 745 750 Leu Ala Lys Gln Gly Leu 755 <210> 2 <211> 1197 <212> DNA <213> Homo sapiens glycoprotein, synaptic 2 <400> 2 ggggcggggc ggacgcagag ccgcgtttag tctatcgctg cggttgcgag cgctgtaggg 60 agcctgtgct gtgccgcgca gttaggcagc agcagccgcg gagcagtagc cgccgtggga 120 gggagccatg aagcattacg aggtggagat tctggacgca aagacaaggg agaagctgtg 180 tttcttggac aaggtggagc cccacgccac cattgcggag atcaagaacc tcttcactaa 240 gacccatccg cagtggtacc ccgcccgcca gtccctccgc ctggacccca agggcaagtc 300 cctgaaggat gaggatgttc tgcagaagct gcccgtgggc accacggcca cactgtactt 360 ccgggacctg ggggcccaga tcagctgggt gacggtcttc ctaacagagt acgcggggcc 420 ccttttcatc tacctgctct tctacttccg agtgcccttc atctatggcc acaaatatga 480 ctttacgtcc agtcggcata cagtggtgca cctcgcctgc atctgtcact cattccacta 540 catcaagcgc ctgctggaga cgctcttcgt gcaccgcttc tcccatggca ctatgccttt 600 gcgcaacatc ttcaagaact gcacctacta ctggggcttc gccgcgtgga tggcctatta 660 catcaatcac cctctctaca ctccccctac ctacggagct cagcaggtga aactggcgct 720 cgccatcttt gtgatctgcc agctcggcaa cttctccatc cacatggccc tgcgggacct 780 gcggcccgct gggtccaaga cgcggaagat cccatacccc accaagaacc ccttcacgtg 840 gctcttcctg ctggtgtcct gccccaacta cacctacgag gtggggtcct ggatcggttt 900 cgccatcatg acgcagtgtc tcccagtggc cctgttctcc ctggtgggct tcacccagat 960 gaccatctgg gccaagggca agcaccgcag ctacctgaag gagttccggg actacccgcc 1020 cctgcgcatg cccatcatcc ccttcctgct ctgagcgctc acccctgctg aggctcagcc 1080 cctcaacccg gtggcattct gggggaggag tggggcccac agctctccag cacccggaat 1140 aaagcccgcc tgccccagtc ggaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1197 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siGPSN2-5-sense oligomer <400> 3 gatccccaaa tacgacttta cgtccattca agagatggac gtaaagtcgt atttttttta 60 60 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siGPSN2-3-antisense oligomer <400> 4 agcttaaaaa aaatacgact ttacgtccat ctcttgaatg gacgtaaagt cgtatttggg 60 60 <110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R & DB Foundation <120> Composition for the diagnosis, prevention, and treatment of Alzheimer's disease through Tau modification by GPSN2 <130> 9P-05-31 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 758 <212> PRT <213> Human Microtubule-associated protein tau <400> 1 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Glu Pro Glu Ser 115 120 125 Gly Lys Val Val Gln Glu Gly Phe Leu Arg Glu Pro Gly Pro Pro Gly 130 135 140 Leu Ser His Gln Leu Met Ser Gly Met Pro Gly Ala Pro Leu Leu Pro 145 150 155 160 Glu Gly Pro Arg Glu Ala Thr Arg Gln Pro Ser Gly Thr Gly Pro Glu 165 170 175 Asp Thr Glu Gly Gly Arg His Ala Pro Glu Leu Leu Lys His Gln Leu 180 185 190 Leu Gly Asp Leu His Gln Glu Gly Pro Pro Leu Lys Gly Ala Gly Gly 195 200 205 Lys Glu Arg Pro Gly Ser Lys Glu Glu Val Asp Glu Asp Arg Asp Val 210 215 220 Asp Glu Ser Ser Pro Gln Asp Ser Pro Pro Ser Lys Ala Ser Pro Ala 225 230 235 240 Gln Asp Gly Arg Pro Pro Gln Thr Ala Ala Arg Glu Ala Thr Ser Ile 245 250 255 Pro Gly Phe Pro Ala Glu Gly Ala Ile Pro Leu Pro Val Asp Phe Leu 260 265 270 Ser Lys Val Ser Thr Glu Ile Pro Ala Ser Glu Pro Asp Gly Pro Ser 275 280 285 Val Gly Arg Ala Lys Gly Gln Asp Ala Pro Leu Glu Phe Thr Phe His 290 295 300 Val Glu Ile Thr Pro Asn Val Gln Lys Glu Gln Ala His Ser Glu Glu 305 310 315 320 His Leu Gly Arg Ala Ala Phe Pro Gly Ala Pro Gly Glu Gly Pro Glu 325 330 335 Ala Arg Gly Pro Ser Leu Gly Glu Asp Thr Lys Glu Ala Asp Leu Pro 340 345 350 Glu Pro Ser Glu Lys Gln Pro Ala Ala Ala Pro Arg Gly Lys Pro Val 355 360 365 Ser Arg Val Pro Gln Leu Lys Ala Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp 370 375 380 Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Thr Ser Thr Arg Ser Ser 385 390 395 400 Ala Lys Thr Leu Lys Asn Arg Pro Cys Leu Ser Pro Lys Leu Pro Thr 405 410 415 Pro Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ile Gln Pro Ser Ser Pro Ala Val Cys 420 425 430 Pro Glu Pro Pro Ser Ser Pro Lys His Val Ser Ser Val Thr Ser Arg 435 440 445 Thr Gly Ser Ser Gly Ala Lys Glu Met Lys Leu Lys Gly Ala Asp Gly 450 455 460 Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys 465 470 475 480 Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro 485 490 495 Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser 500 505 510 Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg 515 520 525 Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala 530 535 540 Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu 545 550 555 560 Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys 565 570 575 Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val 580 585 590 Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys 595 600 605 Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln 610 615 620 Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 625 630 635 640 Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val 645 650 655 Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly 660 665 670 Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile 675 680 685 Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp 690 695 700 His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr 705 710 715 720 Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met 725 730 735 Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser 740 745 750 Leu Ala Lys Gln Gly Leu 755 <210> 2 <211> 1197 <212> DNA <213> Homo sapiens glycoprotein, synaptic 2 <400> 2 ggggcggggc ggacgcagag ccgcgtttag tctatcgctg cggttgcgag cgctgtaggg 60 agcctgtgct gtgccgcgca gttaggcagc agcagccgcg gagcagtagc cgccgtggga 120 gggagccatg aagcattacg aggtggagat tctggacgca aagacaaggg agaagctgtg 180 tttcttggac aaggtggagc cccacgccac cattgcggag 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Claims

1) measuring the increase or decrease in the expression level of the GPSN2 (Glycoprotein, synaptic 2) gene described in SEQ ID NO: 2; And,

2) When the expression level of the GPSN2 gene of step 1) increases, the aggregation and phosphorylation of the Tau protein described in SEQ ID NO: 1 increases, and when the expression level of the GPSN2 gene decreases, An in vitro measurement method of the degree of aggregation and phosphorylation of tau protein, comprising determining a decrease in aggregation and phosphorylation.

1) preparing an expression vector operably linked to the polynucleotide set forth in SEQ ID NO: 2, encoding GPSN2;

2) transducing the expression vector into a cell line expressing the tau protein set forth in SEQ ID NO: 1;

3) inducing overexpression of GPSN2 in the transduced cell line;

4) treating a candidate substance that inhibits the expression or activity of GPSN2 in the overexpression-induced cell line; And,

5) A method for screening a substance that inhibits aggregation and phosphorylation of tau protein, comprising selecting a candidate substance that inhibits the expression or activity of GPSN2 compared to the untreated group.

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A composition for preventing or treating Alzheimer's disease comprising siRNA consisting of a sense strand described in SEQ ID NO: 3 and an antisense strand described in SEQ ID NO: 4 specific for GPSN2 .

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