KR100910130B1 - Process for Preparing Geldanamycin Using Acidic pH Shock - Google Patents
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Abstract
본 발명은 스트렙토마이시스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)를 배양하면서, 배양물에 산충격을 가함으로써 젤다나마이신의 생산성을 향상시키는 공정을 포함하는, 젤다나마이신의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 젤다나마이신을 높은 생산성으로 제조할 수 있으므로, 젤다나마이신을 이용한 각종 질병의 경제적인 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.The present invention relates to a method for producing geldanamycin, comprising the step of increasing the productivity of geldanamycin by culturing Streptomyces hygroscopicus , and applying an acid shock to the culture. According to the present invention, since geldanamycin can be produced with high productivity, it may be widely used for economic treatment of various diseases using geldanamycin.
젤다나마이신, 산충격, 스트렙토마이시스 하이그로스코피쿠스 Zeldanamycin, Acid Shock, Streptomyces Hygroscopius
Description
본 발명은 산충격을 이용한 젤다나마이신의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 스트렙토마이시스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)를 배양하면서, 배양물에 산충격을 가함으로써 젤다나마이신의 생산성을 향상시키는 공정을 포함하는, 젤다나마이신의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing geldanamycin using acid shock. More specifically, the present invention includes a step of improving the productivity of geldanamycin by applying an acid shock to the culture while culturing Streptomyces hygroscopicus , a method for producing geldanamycin. It is about.
젤다나마이신(geldanamycin)은 거대 환형 락탐구조의 안사마이신 계열의 항생제로서, 허비마이신(herbimycin), 레블라스타틴(reblastatin), 멕베신(mecbecin) 과 같이, 3-아미노-5-하이드록시벤조산(3-amino-5-hydroxybenzoic acid, AHBA)을 전구체로 생합성이 되는 폴리케타이드(polyketide) 골격을 가진 화합물이다. Geldanamycin is an anamycin family of antibiotics with a large cyclic lactam structure and, like herbimycin, reblastatin and mebecbecin, 3-amino-5-hydroxybenzoic acid ( 3-amino-5-hydroxybenzoic acid (AHBA) is a compound with a polyketide skeleton that is biosynthesized as a precursor.
이러한 젤다나마이신은 항암제, 항진균제, 항바이러스제 및 항생제로 이용되고 있는데(참조: C. DeBoer et al., J. Antibiotic., 23:442-447, 1970; S. Omura, et al., J. Antibiotic., 32:225-261, 1979; M. Muroi et al., J. Antibiotic., 33:205-212, 1980; L. Neckers et al., Invest. New Drugs, 17:361-373, 1999), 이의 약리활성은 젤다나마이신이 열충격 단백질의 일종인 Hsp 90(heat shock protein 90)의 기능을 저해하여 나타낸다고 보고되었다(참조: Whitesell et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:8324-8328, 1994). 그러나, 젤다나마이신의 강한 독성과 불용성으로 인하여, 직접 인체에 사용하는 것은 불가능하였으므로, 인체에 사용할 수 있는 다양한 유도체가 개발되었다(참조: 미국특허출원 제 10/461194호, 미국특허출원 제 10/212962, 대한민국특허출원 제 2003-7008551, 대한민국특허출원 제 2004-7004202). 이들 유도체는 젤다나마이신을 변형시켜서 제조되기 때문에, 이들 유도체를 대량으로 제조하기 위하여는, 젤다나마이신의 생산수율을 증대시킬 수 있는 제조방법을 개발하여야만 하였으나, 이에 대하여는 별다른 연구가 진행되지 않고 있는 실정이다.This geldanamycin is used as an anticancer, antifungal, antiviral and antibiotic (see C. DeBoer et al., J. Antibiotic., 23: 442-447, 1970; S. Omura, et al., J. Antibiotic., 32: 225-261, 1979; M. Muroi et al., J. Antibiotic., 33: 205-212, 1980; L. Neckers et al., Invest.New Drugs, 17: 361-373, 1999 Its pharmacological activity has been reported to indicate that geldanamycin inhibits the function of heat shock protein 90 (Hsp 90), a type of heat shock protein (see Whitesell et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91: 8324-8328, 1994). However, due to the strong toxicity and insolubility of geldanamycin, it was not possible to use it directly on the human body, and thus various derivatives that can be used on the human body have been developed (see US Patent Application No. 10/461194, US Patent Application No. 10 /). 212962, Korean Patent Application No. 2003-7008551, Korean Patent Application No. 2004-7004202). Since these derivatives are prepared by modifying geldanamycin, in order to manufacture these derivatives in large quantities, a manufacturing method capable of increasing the production yield of geldanamycin has to be developed, but little research has been conducted on this. It is true.
따라서, 젤다나마이신의 생산수율을 증대시킬 수 있는 제조방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.Therefore, the necessity of developing a manufacturing method that can increase the production yield of geldanamycin has emerged constantly.
이에, 본 발명자들은 젤다나마이신의 생산수율을 증대시킬 수 있는 제조방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 젤다나마이신을 생산할 수 있는 스트렙토마이시스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) 균주의 배양시 적정 시점에서 배지의 pH를 4.5 내지 5.5로 조절하여 산충격을 가할 경우, 젤다나마이신의 생산성을 현저하게 증대시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Therefore, the inventors of the present invention sought to develop a manufacturing method that can increase the production yield of geldanamycin, Streptomysis hygroscopicus ( Streptomyces) that can produce geldanamycin hygroscopicus ) When the acid shock is applied by adjusting the pH of the medium to 4.5 to 5.5 at an appropriate time when culturing the strain, it was confirmed that the productivity of geldanamycin can be significantly increased, and the present invention was completed.
결국, 본 발명의 주된 목적은 배양물에 산충격을 가함으로써 젤다나마이신의 생산성을 향상시키는 공정을 포함하는, 젤다나마이신의 제조방법을 제공하는 것이다.After all, the main object of the present invention is to provide a method for producing geldanamycin, comprising the step of improving the productivity of geldanamycin by applying an acid shock to the culture.
본 발명은 스트렙토마이시스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)를 배양하면서, 배양물에 산충격을 가함으로써 젤다나마이신의 생산성을 향상시키는 공정을 포함하는, 젤다나마이신의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 젤다나마이신을 높은 생산성으로 제조할 수 있으므로, 젤다나마이신을 이용한 각종 질병의 경제적인 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.The present invention provides a method for producing geldanamycin, comprising the step of improving the productivity of geldanamycin by culturing Streptomyces hygroscopicus , while applying an acid shock to the culture. According to the present invention, since geldanamycin can be produced with high productivity, it may be widely used for economic treatment of various diseases using geldanamycin.
미생물 배양시, 탄소원, 질소원, 혹은 기타 배지내 성분들이 고갈되거나, 세포생장이 정지기에 들어가거나 또는 열충격이나 에탄올 충격 등의 요인에 의하여 외부환경이 급격히 변화될 때, 세포내의 쿼럼(quorom) 감지분자(sensing molecule)들이 세포내 신호전달 시스템을 통해 이차대사산물 생산 유전자를 자극하고, 이에 의하여 이차 대사산물의 생산이 시작되는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 스트렙 토마이세스 속 미생물인 스트렙토마이세스 베네주엘라(Streptomyces venezuelae)를 배양하면서 열충격과 에탄올 충격을 가할 경우, 자도마이신 B(jadomycin B)의 생산을 촉진시킬 수 있고(참조: J. Antibiotics, 44:869-871, 1993), 상기 미생물을 배양하면서 배지의 pH를 급격히 변화시킬 경우, 카수가마이신(kasugamycin)의 생산을 촉진시킬 수 있다(참조: Biotechnol. Prog., 16:548-552, 2000). In the culture of microorganisms, quorom molecules are detected when the carbon source, nitrogen source, or other components in the medium are depleted, cell growth enters a stationary phase, or when the external environment changes rapidly due to factors such as thermal shock or ethanol impact. Sensing molecules are known to stimulate secondary metabolite producing genes through intracellular signaling systems, thereby triggering the production of secondary metabolites. For example, incubation of Streptomyces venezuelae, a microorganism of the genus Streptomyces, can induce the production of jadomycin B by thermal shock and ethanol impact (see J. Antibiotics). 44: 869-871, 1993) When the pH of the medium is rapidly changed while culturing the microorganisms, it may promote the production of kasugamycin (Biotechnol. Prog., 16: 548-552). , 2000).
그러나, 이러한 외부환경의 변화가 모든 미생물에서 동일한 효과를 나타내는 것은 아니기 때문에, 본 발명자들은 젤다나마이신의 생산시 적용할 수 있는지를 확인하고자 하여, 젤다나마이신을 생산할 수 있는 스트렙토마이시스 하이그로스코피쿠스 균주의 배양시 열충격 또는 에탄올충격은 젤다나마이신의 생산수율을 증대시킬 수 없었고, 오히려 생산균주의 생장을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.However, since such changes in the external environment do not have the same effect in all microorganisms, the present inventors want to confirm whether it can be applied in the production of geldanamycin, so that the streptomysis hygroscopy that can produce geldanamycin Thermal shock or ethanol shock in the culture of the Kusu strain was not able to increase the production yield of geldanamycin, rather it was found to have the effect of inhibiting the growth of the production strain.
이에 반하여, 상기 균주의 배양시 특정시점에서 배지의 pH를 조절할 경우, 젤다나마이신의 생산수율을 증대시킬 수 있음을 확인하였다. 즉, 스트렙토마이시스 하이그로스코피쿠스 균주를 5L 발효기에서 2.5 L의 M2 배지(배지 1L 당, Yeast extract 2g, Glucose 5g, Glycerol 25g, Soytone 4g, CaCO3 0.03g)에서 배양하였을 때, 균주를 배양시점으로부터 40 내지 80시간이 경과한 시점에서 자연적으로 배양물의 pH가 pH 5.0 정도까지 저하되었다가 pH 7.0으로 회복되는 경향을 나타내었고, 이처럼 회복되는 시점에서 배양물에 염산을 가하여 약 pH 4.5 내지 5.5까지 급격히 저하시킬 경우, 배지의 pH를 조절하지 않고 배양한 균주에 비하여, 젤다나마이신의 생산성이 현저하게 증대됨을 확인할 수 있었다.On the contrary, when the pH of the medium was adjusted at the specific time when culturing the strain, it was confirmed that the production yield of geldanamycin could be increased. That is, when the Streptomyces hygroscopicus strain was incubated in a 2.5 L M2 medium (per 1 L medium, Yeast extract 2 g, Glucose 5 g, Glycerol 25 g, Soytone 4 g, CaCO 3 0.03 g) in a 5 L fermenter At 40 to 80 hours from the time point, the pH of the culture naturally decreased to pH 5.0 and then recovered to pH 7.0. At this time, hydrochloric acid was added to the culture to recover the pH to about pH 4.5 to 5.5. In the case of rapidly lowering, the productivity of geldanamycin was remarkably increased compared to the strain cultured without adjusting the pH of the medium.
결국, 본 발명의 젤다나마이신의 제조방법은 스트렙토마이시스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)를 배양하면서, 배양물의 pH가 5.0 정도까지 저하되었다가 7.0으로 회복되는 시점에서, 배지의 산도를 산성 영역으로 조절하여 배양하고, 이로부터 젤다나마이신을 수득하는 공정을 포함한다. 이때, 사용되는 산은 특별히 이에 제한되지 않으나, 초산, 염산 등 미생물의 생장에 직접적으로 영향을 미치지 않는 산을 사용함이 바람직하다. 또한, 배지의 산도는 배양시점으로 부터 40 내지 80시간, 바람직하게는 40 내지 70시간, 보다 바람직하게는 40 내지 60시간, 가장 바람직하게는 48시간이 경과한 시점에서, pH 4.5 내지 5.5, 바람직하게는 pH 4.9 내지 5.2, 가장 바람직하게는 5.0으로 조절한다.As a result, the method for preparing geldanamycin of the present invention, while culturing Streptomyces hygroscopicus , when the pH of the culture was reduced to about 5.0 and then restored to 7.0, the acidity of the medium was changed to the acidic region. Cultivating to control, and obtaining geldanamycin therefrom. At this time, the acid used is not particularly limited, but it is preferable to use an acid that does not directly affect the growth of microorganisms such as acetic acid and hydrochloric acid. In addition, the acidity of the medium is pH 4.5 to 5.5, preferably 40 to 80 hours, preferably 40 to 70 hours, more preferably 40 to 60 hours, most preferably 48 hours from the time of incubation Preferably from pH 4.9 to 5.2, most preferably 5.0.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. .
실시예 1: 배지의 종류에 따른 스트렙토마이시스 하이그로스코피쿠스에서 젤다나마이신 생산성 비교 Example 1 : Comparison of geldanamycin productivity in Streptomyces hygroscopius according to the type of medium
한국생명공학연구원에서 분양받은 스트렙토마이시스 하이그로스코피쿠스 아 종 두아마이세트쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus)를 YEME 배지(Yeast extract 3g/l, Bacto peptone 5g/l, Malt extract 3g/l, Glucose 10g/l, Sucrose 340g/l, MgCl26H2O 1g/l), 변형된 YEME 배지(Yeast extract 3g/l, Bacto peptone 5g/l, Malt extract 3g/l, Glucose 10g/l, Sucrose 103g/l), R2YE 배지(Sucrose 103g/l, MgCl26H2O 10.12g/l, Glucose 10g/l, Yeast extract 5g/l, K2SO4 0.25g/l, Casamino acid 0.1g/l, TES, CaCl22H2O), M2 배지(Yeast extract 2g/l, Glucose 5g/l, Glycerol 25g/l, Soytone 4g/l, CaCO3 0.03g/l) 및 YMG 배지(Yeast extract 4g/l, Malt extract 10g/l, Glucose 4g/l) 배지에 각각 접종하여 배양하면서, 최적의 배지를 선정하려 하였다. Streptomyces of Streptomyces subspecies Duamysetcus, distributed by Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology hygroscopicus subsp. duamyceticus ) into YEME medium (Yeast extract 3g / l, Bacto peptone 5g / l, Malt extract 3g / l, Glucose 10g / l, Sucrose 340g / l, MgCl 2 6H 2 O 1g / l), modified YEME medium (Yeast extract 3g / l, Bacto peptone 5g / l, Malt extract 3g / l, Glucose 10g / l, Sucrose 103g / l), R2YE medium (Sucrose 103g / l, MgCl 2 6H 2 O 10.12g / l, Glucose 10g / l , Yeast extract 5g / l, K 2 SO 4 0.25g / l, Casamino acid 0.1g / l, TES, CaCl 2 2H 2 O), M2 medium (Yeast extract 2g / l, Glucose 5g / l, Glycerol 25g / l , Soytone 4g / l, CaCO 3 0.03g / l) and YMG medium (Yeast extract 4g / l, Malt extract 10g / l, Glucose 4g / l) inoculated and cultured, respectively, to select the optimal medium.
구체적으로, 500mL 플라스크에 상기 각 배지를 50ml씩 넣고, 121℃에서 15 분간 멸균하였다. 그 후, 상기 균주를 접종하고, 28℃에서 200rpm 교반속도로 7일간 배양하였다. 상기 배양물에 포함된 젤다나마이신의 생산량을 측정하기 위해, 각각의 배양물을 5000rpm으로 10분간 원심분리하여 배양액을 수득하고, 상기 수득한 배양액 3ml과 3ml의 에틸아세테이트를 혼합하여 상온에서 1시간동안 반응시켰다. 반응액을 원심분리하여 상등액을 수득하고, 상등액에 포함된 에틸아세테이트를 증발시킨 다음, 잔사를 메탄올에 용해시키고, HPLC에 적용하여 젤다나마이신의 함량을 측정하였다. 이때, HPLC 분석조건은, 이동상으로서 60% 아세토나이트릴을 사용하고, 이동상 속도는 0.5ml/min이며, 컬럼은 C18 역상컬럼을 사용하고, 컬럼온 도는 40℃이었으며, 315nm 자외선 흡광도로 젤다나마이신을 검출하였다(참조: 표 1).Specifically, 50 ml of each medium was put in a 500 mL flask and sterilized at 121 ° C. for 15 minutes. Thereafter, the strains were inoculated and incubated at 28 ° C. at 200 rpm for 7 days. In order to measure the yield of geldanamycin contained in the culture, each culture was centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes to obtain a culture solution, and the obtained culture solution was mixed with 3 ml of 3 ml of ethyl acetate for 1 hour at room temperature. Reacted for a while. The reaction solution was centrifuged to obtain a supernatant, the ethyl acetate contained in the supernatant was evaporated, the residue was dissolved in methanol, and subjected to HPLC to measure the content of geldanamycin. At this time, HPLC analysis conditions, using 60% acetonitrile as the mobile phase, the mobile phase speed is 0.5ml / min, the column is C18 reverse phase column, the column temperature was 40 ℃, geldanamycin with 315nm ultraviolet absorbance Was detected (see Table 1).
상기 표 1에서 보듯이, M2 배지에서 젤다나마이신이 가장 높은 생산량(288mg/L)으로 생산됨을 알 수 있었다.As shown in Table 1, it can be seen that geldanamycin is produced at the highest yield (288 mg / L) in M2 medium.
실시예 2: pH조절에 따른 스트렙토마이시스 하이그로스코피쿠스로부터 젤다나마이신의 생산성 비교 Example 2 Comparison of productivity of geldanamycin from Streptomyces hygroscopius according to pH control
실시예 1에서 선정한 M2 배지를 이용하여, 5L 발효기에서 2.5 L 작동부피로 스트렙토마이시스 하이그로스코피쿠스로부터 젤다나마이신을 생산하였다. Using the M2 medium selected in Example 1, geldanamycin was produced from Streptomyces hygroscopicus with 2.5 L working volume in a 5 L fermentor.
먼저, 500ml의 플라스크에 100ml R2YE 배지를 넣고 스트렙토마이시스 하이그로스코피쿠스 포자를 접종하여 28℃ 및 200rpm의 교반속도로 24시간을 배양하였다. 상기 배양액을 2.5L의 M2 배지가 들어 있는 5L 발효기에 접종하여 28℃, 300 내지 450rpm 및 1.5 내지 2vvm 조건으로 7일동안 배양하고, 상기 실시예 1의 방법을 이용하여 배양액에 포함된 젤다나마이신의 함량을 분석하였다. First, 100 ml R2YE medium was added to a 500 ml flask, and incubated with Streptomyces hygroscopicus spores and incubated at 28 ° C. and 200 rpm for 24 hours. The culture solution was inoculated in a 5L fermenter containing 2.5 L of M2 medium and incubated at 28 ° C., 300 to 450 rpm and 1.5 to 2 vvm for 7 days, and geldanamycin contained in the culture solution using the method of Example 1 above. The content of was analyzed.
한편, 1N HCl과 1N NaOH 수용액을 이용하여 pH를 6.9 내지 7.0으로 일정하게 유지하는 것을 제외하고는, 상기 방법과 동일한 방법으로 스트렙토마이시스 하이그로스코피쿠스를 배양하고, 배양액에 포함된 젤다나마이신의 함량을 측정하였다.On the other hand, except using a 1N HCl and 1N NaOH aqueous solution to maintain a constant pH of 6.9 to 7.0, culturing Streptomyces hygroscopicus in the same manner as the above method, the geldanamycin contained in the culture The content of was measured.
그 결과, pH를 조절하지 않은 경우에는 최대 414mg/L의 젤다나마이신을 생산할 수 있었으나, pH를 중성 pH 수준(pH 6.9 내지 7.0)으로 조절한 경우에는 283mg/L의 젤다나마이신을 생산할 수 있었으므로, pH를 일정하게 유지한 경우에는 젤다나마이신의 생산성이 저하됨을 알 수 있었다.As a result, up to 414 mg / L of geldanamycin could be produced when the pH was not adjusted, but 283 mg / L of geldanamycin could be produced when the pH was adjusted to neutral pH levels (pH 6.9 to 7.0). Therefore, when pH was kept constant, it turned out that the productivity of geldanamycin falls.
실시예 3: 산충격에 의한 스트렙토마이이스 하이그로스코피쿠스로부터 생산성 향상 Example 3 Productivity Enhancement from Streptomyces hygroscopicus by Acid Shock
1N 의 염산 수용액을 이용하여 다양한 방법으로 산충격을 가하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 스트렙토마이시스 하이그로스코피쿠스를 배양하였다.Streptomyces hygroscopius was cultured in the same manner as in Example 2, except that acid shock was applied in various ways using 1 N aqueous hydrochloric acid.
구체적으로, 스트렙토마이시스 하이그로스코피쿠스를 접종하여 배양시점으로부터 168시간이 경과하기 까지 pH를 전혀 조절하지 않은 양성대조군; 배양하면서 지속적으로 pH 6.9 내지 7.0으로 조절한 음성대조군; 배양시점으로부터 48시간이 경과한 시점에서, 1N HCl을 가하여 pH 5로 적정하고 이를 유지하면서 100시간이 경과한 시점까지 배양하며, 1N NaOH를 가하여 pH 6으로 적정하고 이를 유지하면서 168시간이 경과한 시점까지 배양한 실험군 1; 배양시점으로부터 48시간이 경과한 시점에서, 1N HCl을 가하여 pH 5로 적정하고 이를 유지하면서 168시간이 경과한 시점까지 배양한 실험군 2; 및, 배양시점으로부터 24시간이 경과한 시점에서, 1N HCl을 가하여 pH 4로 적정하고 이를 유지하면서 36시간이 경과한 시점까지 배양하며, 1N NaOH를 가하여 pH 6.5로 적정하고 이를 유지하면서 84시간이 경과한 시점까지 배양하며, 다시 1N HCl을 가하여 pH 5로 적정하고 이를 유지하면서 168시간이 경과한 시점까지 배양 실험군 3을 각각 준비하고, 각 실험군의 배지에 포함된 젤다나마이신의 생산량을 실시예1의 방법으로 측정하고, 시간의 경과에 따른 pH 변화를 측정하였다(참조: 도 1 및 도 2).Specifically, the positive control group inoculated with Streptomyces hygroscopius did not adjust the pH at all until 168 hours from the time of culture; Negative control group continuously adjusted to pH 6.9 to 7.0; After 48 hours from the incubation time, 1N HCl was added to titrate to
도 1은 각 실험군에서 시간의 변화에 따른 배지에 포함된 젤다나마이신의 함량 변화를 나타내는 그래프로서, (■)는 양성대조군을 나타내고, (●)는 실험군 1을 나타내며, (○)는 실험군 2를 나타내고, (▼)는 실험군 3을 나타내며, (▽)는 음성대조군을 각각 나타낸다. 한편, 도 2는 배양조건이 상이한 각 실험군에서, 배양시간의 변화에 따른 배지의 pH 변화를 나타내는 그래프로서, (▽)는 양성대조군을 나타내고, (●)는 실험군 1을 나타내며, (○)는 실험군 2를 나타내고, (▼)는 실험군 3을 나타내며, (■)는 음성대조군을 나타낸다.1 is a graph showing the change in the content of geldanamycin contained in the medium with time in each experimental group, (■) represents the positive control group, (●) represents the experimental group 1, (○) is experimental group 2 Denotes test group 3, and denotes negative control group, respectively. On the other hand, Figure 2 is a graph showing the pH change of the medium according to the change in culture time in each experimental group different in culture conditions, (▽) represents a positive control group, (●) represents Experiment group 1, (○) is Experimental group 2 is shown, (▼) represents experimental group 3, and (■) represents a negative control group.
상기 도 1에서 보듯이, 실험군 1은 대조군과 유사한 양상을 나타내었으나, 실험군 2는 대조군보다도 현저하게 높은 젤다나마이신의 생산량을 나타내었고, 실험군 3은 젤다나마이신이 전혀 생산되지 않음을 알 수 있었다. 최종적으로, 배양이 종료된 168시간이 경과한 시점에서 실험군 1에서는 428mg/L의 젤다나마이신이 생산되었고, 실험군 2에서는 768mg/L의 젤다나마이신이 생산되었으며, 실험군 3에서는 젤다나마이신이 생산되지 않았다.As shown in FIG. 1, Experimental Group 1 showed a similar pattern to the control group, but Experimental Group 2 showed a significantly higher yield of geldanamycin than the control group, and Experimental Group 3 showed no production of geldanamycin. . Finally, 428 mg / L of geldanamycin was produced in Experimental Group 1, 768 mg / L of geldanamycin was produced in Experimental Group 1, and geldanmycin was produced in Experimental Group 3 at 168 hours after the incubation. It wasn't.
또한, 상기 도 2에서 보듯이, pH를 전혀 조절하지 않고 배양할 경우(양성대조군)에는, 배양시작 후 20 내지 40시간이 경과하면서 배지의 pH가 급격히 저하되고, 40 내지 80시간이 경과하면서 다시 배지의 pH가 증가됨을 알 수 있었다.In addition, as shown in FIG. 2, in the case of culturing without controlling the pH at all (positive control group), the pH of the medium rapidly decreases after 20 to 40 hours after the start of the culture, and again after 40 to 80 hours has elapsed. It was found that the pH of the medium was increased.
상기 결과에서 볼 수 있듯이, 배양 중 산충격을 가함에 있어, pH변화의 정도와 시점의 선택이 젤다나마이신의 생산성 향상에 중요한 요소임을 알 수 있었다. As can be seen from the results, it was found that the choice of the degree and timing of the pH change in the acid shock during the cultivation is an important factor in improving the productivity of geldanamycin.
실시예 4: 최적 산충격 조건의 확립 Example 4 Establishment of Optimal Acid Shock Conditions
상기 실시예 3에서 보듯이, 배양 중 산충격을 가함에 있어, pH변화의 정도와 시점의 선택이 젤다나마이신의 생산성 향상에 중요한 요소임을 확인하였는 바, 젤다나마이신의 생산성을 향상시킬 수 있는 최적의 산충격 조건을 확립하고자 하였다.As shown in Example 3, it was confirmed that the choice of the degree and time point of the pH change in the acid shock during the cultivation is an important factor for the improvement of the productivity of geldanamycin, which can improve the productivity of the geldanamycin. An attempt was made to establish optimal acid shock conditions.
실시예 4-1: 최적 pH 조건의 확립 Example 4-1 : Establishment of Optimal pH Conditions
배양시점으로부터 48시간이 경과한 시점에서, 1N HCl을 가하여 pH 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5 및 6.0으로 적정하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3의 실험군 2와 동일한 조건으로 스트렙토마이시스 하이그로스코피쿠스를 배양하고, 젤다나마이신의 최종 생산량을 측정하였다(참조: 표 2).At 48 hours after incubation, streptomyce under the same conditions as in Experiment 3 of Example 3, except that 1N HCl was added and titrated to pH 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5 and 6.0. Cis hygroscopicus was incubated and the final production of geldanamycin was determined (see Table 2).
상기 표 2에서 보듯이, pH의 변화에 따라, 젤다나마이신의 생산량이 변화됨을 알 수 있었다. 특히, pH 4.5 내지 5.5인 경우에는 젤다나마이신의 생산량이 급격히 증가되었으나, pH 6.0에서는 젤다나마이신의 생산량이 낮은 수준을 유지하였다. 아울러, pH 3.0 및 3.5에서는 스트렙토마이시스 하이그로스코피쿠스가 성장하지 않아, 젤다나마이신을 생산할 수 없음을 확인하였다.As shown in Table 2, it can be seen that the production of geldanamycin changes with the change of pH. In particular, in the case of pH 4.5 to 5.5, the production rate of geldanamycin was sharply increased, but the production of geldanamycin was maintained at a low level at pH 6.0. In addition, it was confirmed that at pH 3.0 and 3.5, Streptomyces hygroscopius does not grow, and geldanamycin cannot be produced.
실시예 4-2: 산충격 시간조건의 확립 Example 4-2 : Establishment of Acid Shock Time Conditions
배양시점으로부터 30 내지 100시간이 경과한 시점에서, 1N HCl을 가하여 pH 5.0으로 적정하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3의 실험군 2와 동일한 조건으로 스트렙토마이시스 하이그로스코피쿠스를 배양하고, 젤다나마이신의 최종 생산량을 측정하였다(참조: 표 3).At 30 to 100 hours after the incubation, Streptomyces hygroscopius was cultured under the same conditions as in Experiment 2 of Example 3, except that 1N HCl was added thereto and titrated to pH 5.0. Final production of namycin was determined (see Table 3).
상기 표 3에서 보듯이, 산 충격을 가하는 시점에 따라, 젤다나마이신의 생산량이 변화됨을 알 수 있었다. 특히, 배양시점으로부터 40 내지 80시간이 경과한 시점에 산충격을 가한 경우 젤다나마이신의 생산량이 급격히 증가되었으나, 배양시점으로부터 30시간, 90시간 및 100시간이 경과한 시점에 산충격을 가한 경우에는 젤다나마이신의 생산량이 낮은 수준을 유지하였다. As shown in Table 3, it can be seen that the production of geldanamycin changes with the time of acid shock. In particular, when acid shock was applied 40 to 80 hours from the time of culture, the production of geldanamycin increased rapidly, but acid shock was added 30, 90, and 100 hours after the culture. The production of zeldanamycin remained low.
따라서, 상술한 실시예 4-1 및 4-2의 결과를 종합하면, 스트렙토마이시스 하이그로스코피쿠스를 배양시점으로부터 40 내지 80시간이 경과한 시점에서, 배지의 pH를 pH 4.5 내지 5.5로 조절할 경우, 젤다나마이신의 생산성을 극대화할 수 있음을 알 수 있었다.Therefore, when the results of Examples 4-1 and 4-2 described above are combined, the pH of the medium is adjusted to pH 4.5 to 5.5 at the time when 40 to 80 hours have elapsed from the time of culturing Streptomysis hygroscopius. In this case, it was found that the productivity of zeldanamycin can be maximized.
도 1은 배양조건이 상이한 각 실험군에서, 배양시간의 변화에 따른 배지에 포함된 젤다나마이신의 함량 변화를 나타내는 그래프이다.1 is a graph showing the change in the content of geldanamycin contained in the medium according to the change of incubation time in each experimental group having different culture conditions.
도 2는 배양조건이 상이한 각 실험군에서, 배양시간의 변화에 따른 배지의 pH 변화를 나타내는 그래프이다.2 is a graph showing the pH change of the medium according to the change of incubation time in each experimental group having different culture conditions.
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| 한국과학기술원 학위 논문, 김윤정, 2007.02. |
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