KR100910026B1 - Method of Inactivating a Biofilm using a Supercritical Fluid - Google Patents

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Abstract

초임계 유체를 이용한 생물막의 불활성화 방법이 개시된다. 생물막의 불활성화 방법에서는, 표면에 생물막(Biofilm)이 형성되어 있는 대상체를 고압 용기에 위치시킨 다음, 생물막을 초임계 유체와 접촉시켜 생물막을 불활성화한다. 생물막을 수용성 매질에 침지하지 않은 상태로 초임계 유체에 노출시킴으로써 단시간에 향상된 소독력으로 생물막을 불활성화할 수 있다.A method of inactivating a biofilm using a supercritical fluid is disclosed. In the method of inactivating a biofilm, an object having a biofilm formed on a surface thereof is placed in a high pressure container, and then the biofilm is contacted with a supercritical fluid to inactivate the biofilm. By exposing the biofilm to a supercritical fluid without immersing it in an aqueous medium, the biofilm can be inactivated with improved disinfection in a short time.

Description

초임계 유체를 이용한 생물막의 불활성화 방법{Method of Inactivating a Biofilm using a Supercritical Fluid}Method of Inactivating a Biofilm using a Supercritical Fluid}

본 발명은 초임계 유체를 이용한 생물막의 불활성화 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 단시간에 효과적으로 생물막을 불활성화할 수 있는 초임계 유체를 이용한 생물막의 불활성화 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method of inactivating a biofilm using a supercritical fluid. More specifically, the present invention relates to a method of inactivating a biofilm using a supercritical fluid capable of effectively inactivating the biofilm in a short time.

종래에는 표준 소독방법으로 습식법에 해당하는 고압 증기 멸균(autoclaving)과 건식법에 해당하는 에틸렌 옥사이드(ethylene oxide), 감마선(gamma irradiation), 과산화수소 플라즈마(hydrogen peroxide plasma) 등을 이용한 소독법이 이용되어 왔다. 그러나 상기 소독법들은 비교적 우수한 소독력 및 살균력을 지니면서도 나름대로의 단점을 가지고 있어 의료 분야를 비롯한 여러 산업 분야에서 활용하는데 있어 한계점을 가지고 있다. 고압 증기 멸균은 고온 고압에 약한 물질을 소독하는데 부적합하며, 수증기에 의해 금속 표면에 산화피막을 형성하여 물질의 성능을 저하시킬 수 있다. 또한, 에틸렌 옥사이드를 이용한 소독은 특정 고분자를 파괴시킬 뿐만 아니라 강한 독성을 지녀 소독 후 이차적인 정화가 요구된다. 감마선 역시 의료용 고분자의 물성을 약화시키고, 과산화수소 플라즈마 는 과량의 활성 라디칼(free radical)을 발생하여 합금 금속표면을 부식시킬 수 있다.Conventionally, disinfection using high pressure steam sterilization (autoclaving) corresponding to the wet method and ethylene oxide (gamma irradiation), gamma irradiation, hydrogen peroxide plasma, etc., corresponding to the wet method has been used as a standard disinfection method. However, the disinfection methods have their own disadvantages while having relatively excellent disinfection and sterilization power, and thus have limitations in using them in various industrial fields including the medical field. High pressure steam sterilization is unsuitable for disinfecting materials susceptible to high temperature and high pressure, and may form an oxide film on the metal surface by water vapor, thereby degrading the performance of the material. In addition, disinfection with ethylene oxide not only destroys specific polymers, but also has strong toxicity and requires secondary purification after disinfection. Gamma rays also weaken the properties of medical polymers, and hydrogen peroxide plasma can produce excess free radicals to corrode alloy metal surfaces.

이처럼 종래에 사용되고 있는 소독법들의 문제점을 극복하기 위하여 이를 보완할 대체 소독법의 개발이 요구되고 있으며, 최근 초임계 이산화탄소를 이용한 소독법이 새롭게 대두되고 있다. 이산화탄소가 임계 온도(TC = 30.978℃)와 임계압력(PC = 73.8 bar) 이상의 초임계 영역에 도달하면, 밀도가 증가되고 점도가 낮아지는 특유의 초임계 유체 특성을 가지게 된다. 상기 초임계 유체는 기체 및 액체 상태 보다 세포 투과성이 우수하고, 독성 및 잔류성이 없는 장점을 지닌다.As such, in order to overcome the problems of the conventional disinfection methods, it is required to develop an alternative disinfection method to compensate for this, and recently, a disinfection method using supercritical carbon dioxide is emerging. When the carbon dioxide reaches the supercritical region above the critical temperature (T C = 30.978 ° C.) and the critical pressure (P C = 73.8 bar), it has a characteristic supercritical fluid characteristic of increasing density and decreasing viscosity. The supercritical fluids have the advantages of better cell permeability than gas and liquid states, and no toxicity and persistence.

기존의 연구에서는 수용액 내에 부유하는 그람 양성 및 음성 세균, 포자, 효모 등의 미생물을 불활성화하기 위한 연구가 주로 수행되었으며, 초임계 이산화탄소에 의한 미생물 불활성화 메커니즘으로는 고압에 의한 기계적인 스트레스, 이산화탄소 용해에 따른 pH 강하, 초임계 유체에 의한 세포내 물질의 추출 등이 추측되고 있다.In the existing studies, researches were mainly conducted to inactivate microorganisms such as gram positive and negative bacteria, spores, and yeast suspended in an aqueous solution. A drop in pH due to dissolution, extraction of intracellular substances by a supercritical fluid, and the like have been estimated.

세균은 어떠한 표면에 부착되고 일정농도에 도달하면 적정밀도인식(quorum sensing)을 통해 생물막(biofilm)의 형태로 성장하게 된다. 이렇게 형성된 생물막은 세균의 서식처 및 방어막의 역할을 하게 되어 부유 세균으로 존재할 때보다 일반적인 소독제, 예를 들어, 염소, 과산화수소 또는 오존에 대한 저항성이 수십 내지 수천 배 증가하게 된다. 상기 생물막 형태의 미생물 군집은 최근 의료계에 사용되는 의료 도구들의 안전성을 위협하고 있으며, 생물막을 완벽하게 소독 및 멸균할 수 있는 안전한 소독법이 요구된다. 초임계 유체를 이용한 일반적인 소독법에 관한 기술은 알려져 있으나, 초임계 유체를 이용하여 생물막을 불활성화하는 방법은 보고된 바가 없다. When the bacteria adhere to a certain surface and reach a certain concentration, the bacteria grow in the form of a biofilm through quorum sensing. The biofilm thus formed serves as a habitat and a barrier for the bacteria, thereby increasing tens to thousands of times more resistance to general disinfectants such as chlorine, hydrogen peroxide or ozone than when present as suspended bacteria. The microbial community in the form of the biofilm threatens the safety of medical tools used in the medical industry recently, and a safe disinfection method capable of completely disinfecting and sterilizing the biofilm is required. Although a technique for general disinfection using a supercritical fluid is known, a method of inactivating a biofilm using a supercritical fluid has not been reported.

또한, 초임계 유체를 이용한 미생물의 불활성화 원리에 있어서도 종래의 기술로 소정의 장치를 이용하여 초임계 유체의 압력차를 유도하고, 초임계 유체의 기화팽창의 힘으로 세균 및 바이러스 세포를 파괴하는 바가 보고된 바 있으나, 이는 복잡한 장치와 조작 과정이 수반되어야 하는 문제가 있다.In addition, in the principle of inactivation of microorganisms using a supercritical fluid, the pressure difference between the supercritical fluid is induced by using a predetermined apparatus using a conventional technique, and the bacteria and virus cells are destroyed by the force of vaporization and expansion of the supercritical fluid. Although the bars have been reported, this presents a problem that must be accompanied by complex devices and manipulation procedures.

따라서 본 발명의 목적은 초임계 유체를 이용하여 단시간에 향상된 소독력으로 생물막을 불활성화하는 방법을 제공하는데 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for inactivating a biofilm with an improved disinfection power in a short time using a supercritical fluid.

상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시예에 따른 생물막의 불활성화 방법에서는 표면에 생물막(Biofilm)이 형성되어 있는 대상체를 고압 용기에 위치시킨 다음, 상기 생물막을 초임계 유체와 접촉시켜 상기 생물막을 불활성화한다.In the method of inactivating a biofilm according to an embodiment of the present invention, a subject in which a biofilm is formed on a surface thereof is placed in a high pressure container, and then the biofilm is contacted with a supercritical fluid. Inactivate the biofilm.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 생물막은 수용성 매질에 침지되지 않고 표면에 물기가 묻은 상태로 상기 초임계 유체에 노출될 수 있다. 또한, 상기 생물막은 약 10분 이내의 시간 동안 상기 초임계 유체와 접촉할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the biofilm may be exposed to the supercritical fluid in a state where water is on the surface without being immersed in an aqueous medium. In addition, the biofilm may be in contact with the supercritical fluid for a time within about 10 minutes.

상술한 본 발명의 초임계 유체를 이용한 생물막의 불활성화 방법에 따르면, 기존의 염소계 소독이나 오존 소독에 의해 불활성화가 어려운 생물막을 단시간에 매우 효과적으로 소독 및 멸균하여 생물막을 불활성화시킬 수 있다. 또한, 초임계 유체는 기체 및 액체 상태보다 투과성이 높으며 독성 및 잔류성이 없어, 친환경적으로 의료 도구 및 생물질(biomaterial) 상의 생물막을 소독할 수 있다. 더욱이, 생물막을 수용성 매질에 침지하지 않고 생물막 주변의 수용성 매질의 양을 감소시킨 상태에서 초임계 유체와 접촉시킴으로써, 현저히 향상된 소독력으로 생물막을 멸균시킬 수 있다.According to the method of inactivating the biofilm using the supercritical fluid of the present invention, it is possible to inactivate the biofilm by disinfecting and sterilizing a biofilm that is difficult to inactivate by conventional chlorine disinfection or ozone disinfection very effectively in a short time. In addition, supercritical fluids are more permeable than gaseous and liquid states and are nontoxic and non-residual, which allows environmentally friendly sterilization of biofilms on medical instruments and biomaterials. Moreover, the biofilm can be sterilized with significantly improved disinfection by contacting the biofilm with a supercritical fluid while reducing the amount of water-soluble medium around the biofilm without immersing it in the aqueous medium.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예들에 따른 초임계 유체를 이용한 생물막의 불활성화 방법에 대하여 상세하게 설명한다.Hereinafter, a method of inactivating a biofilm using a supercritical fluid according to preferred embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 실시예들을 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다. 본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "이루어진다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. As the inventive concept allows for various changes and numerous modifications, the embodiments will be described in detail in the text. However, this is not intended to limit the present invention to a specific disclosed form, it should be understood to include all modifications, equivalents, and substitutes included in the spirit and scope of the present invention. In describing the drawings, similar reference numerals are used for similar elements. The terminology used herein is for the purpose of describing particular example embodiments only and is not intended to be limiting of the present invention. Singular expressions include plural expressions unless the context clearly indicates otherwise. In this application, the terms "comprise" or "consist of" are intended to indicate that there is a feature, number, step, operation, component, part, or combination thereof described on the specification, but one or more other features. It is to be understood that the present invention does not exclude the possibility of the presence or the addition of numbers, steps, operations, components, parts, or combinations thereof.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않 는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.Unless defined otherwise, all terms used herein, including technical or scientific terms, have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art. Terms such as those defined in the commonly used dictionaries should be construed as having meanings consistent with the meanings in the context of the related art, and, unless expressly defined in this application, are construed in ideal or excessively formal meanings. It doesn't work.

도 1은 본 발명의 실시예들에 따른 생물막의 불활성화 방법을 수행하는데 사용되는 소독 장치를 설명하기 위한 모식도이다.1 is a schematic diagram for explaining a disinfection device used to perform the biofilm deactivation method according to embodiments of the present invention.

도 1을 참조하면, 가스 탱크(1)에서 제공되는 가스는 냉각조(2)를 거쳐 액화되고, 고압 펌프(3)를 거치면서 임계 압력을 넘는 고압 상태의 유체가 된다. 고압의 액화된 유체는 유입밸브(4)를 통해 고압 소독조(6)로 유입되고, 소독 후에는 배출밸브(10)를 통해 외부로 배출된다. 고압 소독조(6)의 상부는 고압 소독조 덮개(5)로 덮여 있고, 고압 소독조(6)는 항온조(7)에 침지되어 초임계 상태에 필요한 온도로 일정하게 유지될 수 있다. 고압 소독조(6)의 내부에는 그물망 삼발이(8)가 위치하며, 그물망 삼발이(8) 위에 생물막 시편(9)이 놓이게 된다.Referring to FIG. 1, the gas provided in the gas tank 1 is liquefied through the cooling tank 2 and becomes a fluid of a high pressure state exceeding a critical pressure while passing through the high pressure pump 3. The high pressure liquefied fluid is introduced into the high pressure disinfection tank 6 through the inlet valve 4, and after disinfection, is discharged to the outside through the discharge valve 10. The upper part of the autoclave 6 is covered with a autoclave cover 5, and the autoclave 6 can be immersed in the thermostat 7 and kept constant at the temperature required for the supercritical state. Inside the high pressure disinfection tank (6) is a mesh trivet (8) is positioned, the biofilm specimen (9) is placed on the mesh trivet (8).

본 발명의 실시예들에 따른 생물막의 불활성화 방법에서는, 먼저 고압 소독조(6)내에 생물막 시편(9)을 위치시킨다. 생물막 시편(9)은 생물막이 형성되어 있는 의료기기 또는 각종 생활 도구 등을 포함할 수 있다. 세균이 어떠한 표면에 부착되고 일정농도에 도달하면 적정밀도인식(quorum sensing)을 통해 생물막(biofilm)의 형태로 성장하게 되는데, 상기 생물막은 세균의 서식처 및 방어막의 역할을 하게 되어 부유 세균으로 존재할 때보다 일반적인 소독제, 예를 들어, 염소, 과산화수소 또는 오존에 대한 저항성이 수십 내지 수천 배 증가하여 쉽게 사멸되지 않는 특성을 보인다. 상기 생물막을 형성하는 세균의 예로는 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 하베아이(Vibrio harveyi), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 대장균(Escherichia coli) 등과 같은 그람음성균 및 캔디다 알비칸스(Candidad albicans)와 같은 진균을 들 수 있다.In the biofilm deactivation method according to embodiments of the present invention, the biofilm specimen 9 is first placed in the autoclave 6. The biofilm specimen 9 may include a medical device or various living tools on which the biofilm is formed. When bacteria adhere to a certain surface and reach a certain concentration, they grow in the form of a biofilm through quorum sensing. The biofilm acts as a habitat and a protective film for bacteria and is present as floating bacteria. The resistance to common disinfectants, for example, chlorine, hydrogen peroxide or ozone, is increased by tens to thousands of times, showing that they are not easily killed. Examples of the bacteria forming the biofilm include Gram-negative bacteria and Candida albicans such as Pseudomonas aeruginosa , Vibrio harveyi , Agrobacterium tumefaciens , Escherichia coli , and the like. Fungi, such as Candidad albicans .

상기와 같은 생물막이 형성되어 있는 생물막 시편(9)을 수용성 매질에 침지시키지 않은 상태로 고압 소독조(6)의 그물망 삼발이(8) 위에 위치시킨 다음, 고압 소독조 덮개(5)를 덮는다. 생물막 시편(9)을 수용성 매질에 침지시키지 않는다는 것은 생물막을 완전히 덮는 수용성 용액을 매개로 초임계 유체와 간접적으로 접촉하는 것이 아니라, 생물막이 직접 초임계 유체에 노출되는 것을 의미한다. 또한, 수용성 매질에 침지시키지 않는다는 것은 생물막 시편(9)의 표면에 물기가 남아 있는 것을 배제하는 것은 아니다. 미생물이 생물막을 형성하는데 있어 기본적으로 수분과 영양분이 필요하므로 형성되는 생물막은 기본적으로 어느 정도의 수분을 포함하며 생물막의 표면에 약간의 물기가 남아 있을 수 있다. 또한, 생물막 시편(9)을 수용성 매질에 담갔다가 꺼내어 표면에 물기가 약간 남아 있는 경우에도 생물막은 초임계 유체에 의해 우수한 소독력으로 불활성화될 수 있다. 특히, 생물막이 완전히 건조된 상태에서는 초임계 유체에 의한 소독능이 떨어질 수 있으므로, 수용성 매질에 완전히 침지되지는 않으면서 생물막의 표면에 약간의 물기가 남아있는 상태에서 소독이 이루어지는 것이 바람직하다.The biofilm specimen 9 on which the biofilm is formed is placed on the mesh trivet 8 of the autoclave 6 without being immersed in an aqueous medium, and then the autoclave cover 5 is covered. Not immersing the biofilm specimen 9 in the aqueous medium means that the biofilm is directly exposed to the supercritical fluid, rather than indirectly contacting the supercritical fluid via an aqueous solution that completely covers the biofilm. Further, not immersing in a water-soluble medium does not exclude the remaining of water on the surface of the biofilm specimen (9). Since the microorganisms basically need water and nutrients to form the biofilm, the biofilm formed basically contains some moisture and there may be some water on the surface of the biofilm. In addition, even when the biofilm specimen 9 is immersed in an aqueous medium and taken out so that some water remains on the surface, the biofilm may be inactivated by the supercritical fluid with excellent disinfection. In particular, since the biofilm is completely dried, the disinfection ability by the supercritical fluid may be degraded, so that the disinfection may be performed while some water remains on the surface of the biofilm without being completely immersed in the aqueous medium.

또한, 생물막 시편(9)이 고압 소독조(6) 내의 그물망 삼발이(8) 위에 위치함으로써, 생물막 시편(9)은 효율적으로 초임계 유체와 접촉할 수 있다. 예를 들어, 생물막 시편(9)의 전면에 걸쳐 생물막이 형성되어 있는 경우, 그물망 삼발이(8)와 접촉하는 생물막 시편(9)의 하부면에도 초임계 유체가 용이하게 접촉할 수 있고, 이로써 생물막 시편(9)을 전면에 걸쳐 효과적으로 소독할 수 있다.In addition, by placing the biofilm specimen 9 on the mesh trivet 8 in the autoclave 6, the biofilm specimen 9 can be in efficient contact with the supercritical fluid. For example, in the case where the biofilm is formed over the entire surface of the biofilm specimen 9, the supercritical fluid may easily contact the lower surface of the biofilm specimen 9 in contact with the mesh trivet 8, thereby allowing the biofilm to easily contact the biofilm. The specimen 9 can be effectively disinfected throughout.

생물막 시편(9)을 고압 소독조(6)에 위치시킨 다음, 유입 밸브(4)를 통하여 고압의 유체가 고압 소독조(6)로 공급된다. 고압 소독조(6)는 공급되는 유체의 임계 온도 이상으로 유지되는 항온조(7)에 의해 일정한 온도로 유지되며, 유입되는 유체는 임계온도 및 임계압력을 초과하는 온도와 압력을 지님으로써 초임계 상태를 가질 수 있다. 상기 초임계 유체의 예로는 초임계 이산화탄소, 초임계 일산화이질소 또는 이들의 혼합 유체를 들 수 있다.After placing the biofilm specimen 9 in the autoclave 6, high pressure fluid is supplied to the autoclave 6 through the inlet valve 4. The autoclave 6 is maintained at a constant temperature by a thermostat 7 which is maintained above the critical temperature of the supplied fluid, and the incoming fluid has a supercritical state by having a temperature and pressure exceeding the critical temperature and the critical pressure. Can have Examples of the supercritical fluid include supercritical carbon dioxide, supercritical dinitrogen monoxide, or mixed fluids thereof.

또한, 본 발명의 실시예들에 따르면 상기 초임계 유체는 수분을 함유할 수 있다. 예를 들어, 초임계 이산화탄소를 이용하는 경우 이산화탄소가 생물막을 구성하는 미생물 외부의 수용액이나 미생물 내부의 수분 속에 신속히 용해되고, 미생물 내부 또는 외부의 pH가 낮아져서 미생물이 불활성화될 수 있다. 만약 소독의 대상이 되는 생물막이 건조된 조건에서 처리되면, 초임계 유체에 의한 소독능이 크게 저하될 수 있다. 따라서 초임계 유체를 이용하여 생물막을 불활성화하는 경우, 초임계 유체가 수분을 함유한 상태로 생물막과 접촉하거나 생물막 표면에 약간의 물기가 남아있는 것이 바람직하다.Further, according to embodiments of the present invention, the supercritical fluid may contain water. For example, in the case of using supercritical carbon dioxide, carbon dioxide is rapidly dissolved in an aqueous solution outside the microorganism constituting the biofilm or water inside the microorganism, and the microorganism may be inactivated because the pH of the microorganism is lowered. If the biofilm to be sterilized is treated in the dried condition, the disinfection ability by the supercritical fluid may be greatly reduced. Therefore, when the biofilm is inactivated using the supercritical fluid, it is preferable that the supercritical fluid is in contact with the biofilm or contains some moisture on the surface of the biofilm in a state of containing water.

본 발명의 일 실시예에 따라 초임계 이산화탄소를 사용하는 경우, 고압 소독조(6)의 온도와 압력을 이산화탄소의 임계 온도(TC = 30.978℃)와 임계압력(PC = 73.8 bar)을 초과하도록 조절함으로써 초임계 상태를 유지시킬 수 있다. 예를 들어, 고압 소독조(6)는 약 31 내지 40℃의 온도를 가질 수 있다. 또한, 고압 소독조 의 압력은 약 75 내지 약 300bar의 범위일 수 있고, 생물막에 대한 소독력과 소독 공정의 효율을 고려할 때 약 95 내지 약 210bar인 것이 바람직하다.When using the supercritical carbon dioxide according to one embodiment of the present invention, the temperature and pressure of the autoclave 6 to exceed the critical temperature (T C = 30.978 ° C) and critical pressure (P C = 73.8 bar) of the carbon dioxide. By adjusting, the supercritical state can be maintained. For example, the autoclave 6 may have a temperature of about 31 to 40 ° C. In addition, the pressure of the autoclave may be in the range of about 75 to about 300 bar, preferably from about 95 to about 210 bar in consideration of the disinfection power for the biofilm and the efficiency of the disinfection process.

생물막 시편(9)이 상기 초임계 유체와 접촉하는 시간은 생물막을 이루는 미생물의 종류와 초임계 유체의 온도 및 압력에 따라 다소 변경될 수 있으나, 약 10분 정도의 시간이면 충분히 생물막이 불활성화될 수 있다. 여기서, 생물막의 불활성화라 함은 생물막을 구성하는 미생물의 증식을 억제하거나, 미생물을 사멸 또는 제거시켜 감염성을 없애는 것을 의미한다.The time that the biofilm specimen 9 is in contact with the supercritical fluid may vary somewhat depending on the type of microorganism constituting the biofilm and the temperature and pressure of the supercritical fluid, but the biofilm may be inactivated sufficiently for about 10 minutes. Can be. Here, inactivation of a biofilm means inhibiting proliferation of microorganisms constituting the biofilm or killing or removing microorganisms to eliminate infectivity.

상술한 본 발명의 초임계 유체를 이용한 생물막의 불활성화 방법에 따르면, 기존의 염소계 소독이나 오존 소독에 의해 불활성화가 어려운 생물막을 단시간에 매우 효과적으로 소독 및 멸균하여 생물막을 불활성화시킬 수 있다. 또한, 생물막을 수용성 매질에 침지하지 않고 생물막 주변의 수용성 매질의 양을 감소시킨 상태에서 초임계 유체와 접촉시킴으로써, 현저히 향상된 소독력으로 생물막을 멸균시킬 수 있다. 아울러, 초임계 유체와 생물막을 접촉시키는 단계에서, 유체의 압력을 조절하여 유체의 기화팽창을 유도하는 등의 복잡한 공정을 거치지 않고 초임계 유체와 생물막의 단순 접촉만으로도 생물막을 우수한 소독력으로 불활성화할 수 있다.According to the method of inactivating the biofilm using the supercritical fluid of the present invention, it is possible to inactivate the biofilm by disinfecting and sterilizing a biofilm that is difficult to inactivate by conventional chlorine disinfection or ozone disinfection very effectively in a short time. In addition, the biofilm can be sterilized with significantly improved disinfection by contacting the biofilm with a supercritical fluid while reducing the amount of water-soluble medium around the biofilm without immersing it in the water-soluble medium. In addition, in the step of contacting the supercritical fluid and the biofilm, it is possible to inactivate the biofilm with excellent disinfecting power by simple contact between the supercritical fluid and the biofilm without controlling the pressure of the fluid to induce vaporization of the fluid. Can be.

이하, 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명은 하기 실시예에 의하여 한정되지 않고 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through experimental examples. However, the following experimental examples are intended to illustrate the present invention and the present invention is not limited to the following examples and may be variously modified and changed.

생물막Biofilm 불활성화 평가 Inactivation evaluation

초임계 이산화탄소 처리를 통하여 생물막이 불활성화되는지 여부를 평가하기 위하여, 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 균주를 CDC 생물막 반응기(BioSurface Technologies사 제조, 미합중국)에서 약 48시간 동안 성장시켜 생물막을 준비하였다. 상기 생물막 내에 존재하는 세균 농도는 약 1O7~108 CFU/cm2로 측정되었다.To evaluate whether the biofilm is inactivated through supercritical carbon dioxide treatment, Pseudomonas aeruginosa strains were grown in a CDC biofilm reactor (BioSurface Technologies, USA) for about 48 hours to prepare a biofilm. The bacterial concentration present in the biofilm was measured at about 10 7-10 8 CFU / cm 2 .

생물막 시편이 수용액에 침지되는 정도에 따른 슈도모나스 애루지노사 생물막의 불활성화를 확인하기 위하여, 생물막 시편이 침지되는 탈이온수(Deionized Water, D.W.)의 양을 약 3mL, 약 5ml 및 약 7mL로 조절하였으며, 고압 용기에서 약 35℃ 및 약 100bar의 초임계 이산화탄소를 상기 생물막에 접촉시켰다. 증류수의 양에 따른 생물막의 불활성화 평가 결과를 도 2에 나타낸다.In order to confirm the inactivation of Pseudomonas aeruginosa biofilm according to the degree to which the biofilm specimen was immersed in the aqueous solution, the amount of deionized water (DW) in which the biofilm specimen was immersed was adjusted to about 3mL, about 5ml, and about 7mL. In a high pressure vessel, about 35 ° C. and about 100 bar of supercritical carbon dioxide were contacted with the biofilm. The inactivation evaluation result of the biofilm according to the amount of distilled water is shown in FIG.

또한, 생물막 시편이 수용액에 침지되지 않고 시편 표면에 물기만 묻은 조건에서 초임계 이산화탄소에 의한 슈도모나스 애루지노사 생물막의 불활성화를 확인하였다. 표면에 물기가 묻은 생물막 시편을 고압 용기에 넣고 초임계 이산화탄소에 접촉시켰다. 초임계 이산화탄소의 온도는 약 35℃로 하였고, 압력은 100bar, 150bar 및 200bar로 조절하였다. 물에 침지시키지 않은 생물막 시편에 대한 생물막의 불활성화 평가 결과를 도 3에 나타낸다.In addition, inactivation of the Pseudomonas aeruginosa biofilm by supercritical carbon dioxide was confirmed under conditions in which the biofilm specimen was only immersed in the surface of the specimen without being immersed in the aqueous solution. Biofilm specimens with wet surfaces were placed in a high pressure vessel and contacted with supercritical carbon dioxide. The temperature of the supercritical carbon dioxide was about 35 ° C., and the pressure was adjusted to 100 bar, 150 bar and 200 bar. The inactivation evaluation results of the biofilms on the biofilm specimens not immersed in water are shown in FIG. 3.

도 2는 생물막 시편이 침지되어 있는 탈이온수의 양에 따른 생물막 내 개체 수의 변화를 보여주는 그래프이고, 도 3은 물에 침지시키지 않은 생물막 시편에 대한 생물막 내 개체 수의 변화를 보여주는 그래프이다.FIG. 2 is a graph showing the change in the number of individuals in the biofilm according to the amount of deionized water in which the biofilm specimen is immersed, and FIG. 3 is a graph showing the change in the number of individuals in the biofilm for the biofilm specimen not immersed in water.

도 2 및 도 3을 참조하면, 물에 침지된 생물막 시편은 초임계 이산화탄소로 약 20분 동안 처리하더라도 초기 개체 수에 비해 약 1/102.5-1/103.5 정도로 감소하는 것으로 나타났고, 약 60분이 경과하더라도 약 1/103.5-1/104.7 정도로 감소하는데 그쳐 미생물을 완전히 사멸시키지 못하는 것으로 나타났다. 이에 비하여, 물에 침지시키지 않고 표면에 물기만이 남아 있는 생물막 시편은 동일한 온도 압력 조건(35℃, 100bar)에서 초임계 이산화탄소로 약 7분 정도 접촉하여 초기 개체 수에 비해 약 1/107.5 정도로 감소하는 것으로 나타났다. 즉, 생물막을 물에 침지시키는 경우에 비하여, 물에 침지시키지 않아 생물막이 초임계 이산화탄소에 직접 접촉하는 경우에 미생물의 사멸 속도가 현저히 증가함을 알 수 있다.Referring to FIGS. 2 and 3, the biofilm specimens immersed in water showed a decrease of about 1/10 2.5 -1/10 3.5 compared to the initial population even after treatment with supercritical carbon dioxide for about 20 minutes. After a minute, it was reduced to about 1/10 3.5 -1/10 4.7, which did not completely kill the microorganisms. On the other hand, biofilm specimens without water immersion and only water remaining on the surface were contacted with supercritical carbon dioxide for about 7 minutes under the same temperature and pressure conditions (35 ℃, 100bar), and about 1/10 7.5% of the initial population. It appeared to decrease. That is, compared to the case where the biofilm is immersed in water, it can be seen that the rate of killing of microorganisms is significantly increased when the biofilm is in direct contact with supercritical carbon dioxide without being immersed in water.

또한, 생물막 시편이 침지되는 물의 양이 3mL로 적은 경우가 물의 양이 5mL 또는 7mL로 많은 경우에 비하여, 약 30분 동안 초임계 이산화탄소로 처리하였을 때 약 10배 이상 개체 수가 더 감소하는 것으로 나타났다. 즉, 생물막 시편을 물에 침지시키는 경우에도 물의 양이 감소할수록 생물막의 소독력이 훨씬 증가함을 알 수 있다.In addition, when the amount of water to be immersed in the biofilm specimen was 3mL less than the amount of water when the amount of 5mL or 7mL, when treated with supercritical carbon dioxide for about 30 minutes, the number of population was about 10 times or more. That is, even when the biofilm specimens are immersed in water, it can be seen that the disinfection power of the biofilm increases much as the amount of water decreases.

아울러, 물에 침지시키지 않은 생물막 시편에 대하여 초임계 이산화탄소의 압력을 변화시킨 실험에서는, 유체의 압력이 증가함에 따라 미생물의 사멸속도가 증가하는 것으로 나타났다. 구체적으로, 초임계 이산화탄소에 5분 동안 노출되는 경우, 100bar의 압력에서는 초기 개체 수에 비하여 약 1/104 정도로 개체 수가 감소하지만, 200bar의 압력에서는 초기 개체 수에 비하여 약 1/106 정도로 개체 수가 감 소하여 5분 처리시 약 100배 정도 소독력이 강함을 알 수 있다.In addition, in an experiment in which the pressure of supercritical carbon dioxide was changed for a biofilm specimen not immersed in water, the rate of microbial death increased as the pressure of the fluid increased. Specifically, when exposed to supercritical carbon dioxide for 5 minutes, the population decreases by about 1/10 4 at 100 bar pressure compared to the initial population, but at 200 bar pressure about 1/10 6 compared to the initial population. As the number is reduced, it can be seen that the sterilizing power is about 100 times stronger after 5 minutes treatment.

한편, 슈도모나스 애루지노사 생물막이 초임계 이산화탄소 처리에 의해 생물막 내부까지 효과적으로 불활성화되는지 여부를 확인하기 위하여, 초임계 이산화탄소 처리 전과 후에 생물막을 염색하고 이를 공초점 현미경(Confocal Laser Scanning Microscopy; CLSM)을 이용하여 관찰하였다. 생물막의 염색은 LIVE/DEAD BacLight bacterial viability kit (Molecular Probes)를 이용하여 수행하였다. 공초점 현미경의 관찰에서 초록색은 살아있는 세포를 의미하고, 붉은 색은 죽은 세포를 의미한다. 물에 침지시키지 않고 표면에 물기만 남은 생물막 시편에 대하여 초임계 이산화탄소를 약 7분 동안 접촉시켰으며, 약 35℃의 온도 및 약 100bar의 압력에서 실험을 수행하였다. 초임계 이산화탄소 처리의 전과 후에 생물막을 관찰한 결과를 도 4 및 도 5에 나타낸다.On the other hand, in order to confirm whether the Pseudomonas aeruginosa biofilm is effectively inactivated to the inside of the biofilm by supercritical carbon dioxide treatment, the biofilm is dyed before and after the supercritical carbon dioxide treatment and subjected to confocal laser scanning microscopy (CLSM). It observed using. Biofilm staining was performed using a LIVE / DEAD BacLight bacterial viability kit (Molecular Probes). In confocal microscopy, green means live cells and red means dead cells. Supercritical carbon dioxide was contacted for about 7 minutes to the biofilm specimens remaining on the surface without immersion in water, and the experiment was performed at a temperature of about 35 ℃ and a pressure of about 100 bar. The results of observing the biofilm before and after the supercritical carbon dioxide treatment are shown in FIGS. 4 and 5.

도 4는 초임계 이산화탄소 처리 전의 생물막을 보여주는 공초점 현미경 사진이고, 도 5는 초임계 이산화탄소로 처리된 생물막을 보여주는 공초점 현미경 사진이다.4 is a confocal micrograph showing a biofilm before supercritical carbon dioxide treatment, and FIG. 5 is a confocal micrograph showing a biofilm treated with supercritical carbon dioxide.

도 4 및 도 5를 참조하면, 초임계 이산화탄소로 처리하기 전에 초록색으로 관찰되는 생물막은 초임계 이산화탄소와 접촉한 후에 대부분의 세포가 사멸되어 붉은 색으로 관찰되었다. 따라서 물에 침지시키지 않은 생물막은 초임계 이산화탄소 처리를 통해 약 7분 이내에 생물막을 이루는 대부분의 미생물이 사멸하는 것을 알 수 있다.4 and 5, the biofilm observed in green before the treatment with the supercritical carbon dioxide was observed in red color due to the death of most cells after contact with the supercritical carbon dioxide. Therefore, the biofilm not immersed in water can be seen that most microorganisms forming the biofilm are killed within about 7 minutes through supercritical carbon dioxide treatment.

소독제의 종류에 따른 According to the type of disinfectant 생물막의Biofilm 불활성화 평가 Inactivation evaluation

초임계 이산화탄소에 의한 생물막 불활성화 효과를 기존에 사용되고 있는 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 및 오존(ozone) 소독과 비교하기 위하여, 상기 평가에서 사용한 슈도모나스 애루지노사 생물막 시편을 각기 10ppm의 차아염소산나트륨 수용액과 약 10ppm의 오존수용액으로 약 10분간 처리한 후, 남아있는 미생물의 개체 수를 측정하였다. 또한, 초임계 이산화탄소 처리는 표면에 물기만이 남은 생물막을 약 35℃의 온도 및 약 100bar의 압력에서 약 10분 동안 접촉시킨 후, 남아있는 미생물의 개체 수를 측정하였다. 소독제의 종류별 생물막의 불활성화를 평가한 결과는 도 6에 나타낸다.In order to compare the biofilm inactivation effect by supercritical carbon dioxide with conventional sodium hypochlorite and ozone disinfection, Pseudomonas aeruginosa biofilm specimens used in the above evaluation were each 10 ppm aqueous sodium hypochlorite solution. After treatment for about 10 minutes with an aqueous 10 ppm ozone solution, the number of microorganisms remaining was measured. In addition, the supercritical carbon dioxide treatment contacted the biofilm having only water on the surface for about 10 minutes at a temperature of about 35 ° C. and a pressure of about 100 bar, and then measured the number of microorganisms remaining. The results of evaluating inactivation of the biofilm according to the type of disinfectant are shown in FIG. 6.

도 6은 소독제의 종류에 따른 잔류 미생물의 개체 수를 나타내는 그래프이다.6 is a graph showing the population of residual microorganisms according to the type of disinfectant.

도 6을 참조하면, 오존 수용액 및 차아염소산나트륨으로 처리된 생물막 시편에서는 다량의 미생물이 남아있지만, 초임계 이산화탄소로 처리된 생물막 시편에서는 미생물이 모두 사멸되어 검출되지 않았다. 즉, 동일한 처리 시간에서 오존 소독이나 차아염소산나트늄 소독에 비하여 초임계 이산화탄소 처리는 생물막의 불활성화에 매우 효과적임을 알 수 있다.Referring to FIG. 6, a large amount of microorganisms remained in the biofilm specimens treated with an aqueous ozone solution and sodium hypochlorite, but all of the microorganisms were killed and not detected in the biofilm specimens treated with supercritical carbon dioxide. That is, it can be seen that supercritical carbon dioxide treatment is very effective for inactivation of the biofilm as compared with ozone disinfection or sodium hypochlorite disinfection at the same treatment time.

상술한 바와 같이 초임계 이산화탄소 소독법을 이용하여 생물막을 처리한 경우 생물막이 수용액 내에 침지되는 조건에서는 60분의 오랜 처리에도 불구하고 생물막 불활성화 효과가 미미한 것을 확인하였으며, 생물막이 수용액 내에 침지되지 않는 조건에서 가장 큰 소독 효과가 나타남을 확인하였다. 또한 기존에 사용되는 오존 및 염소산 소독 처리와의 비교에서도 초임계 이산화탄소 처리는 매우 짧은 시 간에 세균이 두껍게 형성하고 있는 생물막에 대해 생물막 내부에 있는 세균까지 매우 효과적으로 불활성화할 수 있음을 확인하였다.As described above, when the biofilm was treated using the supercritical carbon dioxide disinfection method, it was confirmed that the biofilm inactivation effect was insignificant despite the long time treatment of 60 minutes in the condition that the biofilm was immersed in the aqueous solution, and the biofilm was not immersed in the aqueous solution. The largest disinfection effect was found in. In addition, in comparison with ozone and chloric acid disinfection treatment, it was confirmed that supercritical carbon dioxide treatment can effectively inactivate the bacteria inside the biofilm against the biofilm that is thickly formed in a very short time.

상술한 본 발명의 초임계 유체를 이용한 생물막의 불활성화 방법에 따르면, 기존의 염소계 소독이나 오존 소독에 의해 불활성화가 어려운 생물막을 단시간에 매우 효과적으로 소독 및 멸균하여 생물막을 불활성화시킬 수 있다. 또한, 초임계 유체는 기체 및 액체 상태보다 투과성이 높으며 독성 및 잔류성이 없어, 친환경적으로 의료 도구 및 생물질(biomaterial) 상의 생물막을 소독할 수 있다. 더욱이, 생물막을 수용성 매질에 침지하지 않고 생물막 주변의 수용성 매질의 양을 감소시킨 상태에서 초임계 유체와 접촉시킴으로써, 현저히 향상된 소독력으로 생물막을 멸균시킬 수 있다. 아울러, 단순히 초임계 유체와의 접촉으로 생물막을 불활성화할 수 있어, 초임계 유체의 기화팽창 원리를 이용하는 기존의 방법에 비하여 간단한 공정만으로 생물막을 효과적으로 불활성화할 수 있다.According to the method of inactivating the biofilm using the supercritical fluid of the present invention, it is possible to inactivate the biofilm by disinfecting and sterilizing a biofilm that is difficult to inactivate by conventional chlorine disinfection or ozone disinfection very effectively in a short time. In addition, supercritical fluids are more permeable than gaseous and liquid states and are nontoxic and non-residual, which allows environmentally friendly sterilization of biofilms on medical instruments and biomaterials. Moreover, the biofilm can be sterilized with significantly improved disinfection by contacting the biofilm with a supercritical fluid while reducing the amount of water-soluble medium around the biofilm without immersing it in the aqueous medium. In addition, the biofilm can be inactivated by simply contacting the supercritical fluid, and the biofilm can be effectively inactivated by a simple process compared to the conventional method using the principle of vapor expansion of the supercritical fluid.

이상, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.As described above with reference to the preferred embodiment of the present invention, those skilled in the art without departing from the spirit and scope of the present invention described in the claims below various modifications and It will be appreciated that it can be changed.

도 1은 본 발명의 실시예들에 따른 생물막의 불활성화 방법을 수행하는데 사용되는 소독 장치를 설명하기 위한 모식도이다.1 is a schematic diagram for explaining a disinfection device used to perform the biofilm deactivation method according to embodiments of the present invention.

도 2는 초임계 이산화탄소로 처리하는 경우, 생물막 시편이 침지되어 있는 탈이온수의 양에 따른 생물막 내 개체 수의 변화를 보여주는 그래프이다.2 is a graph showing the change in the number of individuals in the biofilm according to the amount of deionized water in which the biofilm specimen is immersed when treated with supercritical carbon dioxide.

도 3은 초임계 이산화탄소로 처리하는 경우, 물에 침지되지 않은 생물막 시편에 대한 생물막 내 개체 수의 변화를 보여주는 그래프이다.Figure 3 is a graph showing the change in the number of individuals in the biofilm for biofilm specimens not immersed in water when treated with supercritical carbon dioxide.

도 4는 초임계 이산화탄소 처리 전의 생물막을 보여주는 공초점 현미경 사진이다.4 is a confocal micrograph showing the biofilm before supercritical carbon dioxide treatment.

도 5는 초임계 이산화탄소로 처리된 생물막을 보여주는 공초점 현미경 사진이다.5 is a confocal micrograph showing a biofilm treated with supercritical carbon dioxide.

도 6은 소독제의 종류에 따른 잔류 미생물의 개체 수를 나타내는 그래프이다.6 is a graph showing the population of residual microorganisms according to the type of disinfectant.

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명><Explanation of symbols for the main parts of the drawings>

1: 가스 탱크 2: 냉각조1: gas tank 2: cooling tank

3: 고압 펌프 4: 유입밸브3: high pressure pump 4: inlet valve

5: 고압 소독조 덮개 6: 고압 소독조5: autoclave cover 6: autoclave

7: 항온조 8: 그물망 삼발이7: thermostat 8: mesh trivet

9: 생물막 시편 10: 배출밸브9: Biofilm Specimen 10: Discharge Valve

Claims (6)

수용성 매질에 침지되지 않고 표면의 수분이 건조되지 않은 상태의 생물막(Biofilm)이 형성되어 있는 대상체를 고압 용기에 위치시키는 단계; 및Placing a subject in a high pressure container in which a biofilm is formed without being immersed in an aqueous medium and not dried on the surface thereof; And 상기 수용성 매질에 침지되지 않고 표면의 수분이 건조되지 않은 상태의 생물막을 초임계 유체와 접촉시켜 상기 생물막을 불활성화하는 단계를 포함하는 초임계 유체를 이용한 생물막의 불활성화 방법.And inactivating the biofilm by contacting the biofilm in a state where the surface of the water is not dipped in the water-soluble medium and not dried, with the supercritical fluid. 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 초임계 유체는 초임계 이산화탄소, 초임계 일산화이질소 또는 이들의 혼합 유체를 포함하는 것을 특징으로 하는 초임계 유체를 이용한 생물막의 불활성화 방법.The method of claim 1, wherein the supercritical fluid comprises supercritical carbon dioxide, supercritical dinitrogen monoxide, or a mixed fluid thereof. 제1항에 있어서, 상기 초임계 유체는 수분을 함유하는 것을 특징으로 하는 초임계 유체를 이용한 생물막의 불활성화 방법.The method of claim 1, wherein the supercritical fluid contains water. 제1항에 있어서, 상기 생물막은 10분 이내의 시간 동안 상기 초임계 유체와 접촉하는 것을 특징으로 하는 초임계 유체를 이용한 생물막의 불활성화 방법.The method of claim 1, wherein the biofilm is in contact with the supercritical fluid for a time within 10 minutes. 제1항에 있어서, 상기 생물막은 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 하베아이(Vibrio harveyi), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 대장균(Escherichia coli) 또는 캔디다 알비칸스(Candidad albicans)에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 생물막의 불활성화 방법. The biofilm of claim 1, wherein the biofilm is Pseudomonas aeruginosa, Vibrio harveyi, Agrobacterium tumefaciens, Escherichia coli or Candida albicansans. It is formed by the biofilm deactivation method.
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