KR100901467B1 - 시료의 미세혼합장치 및 이를 포함하는 랩온어칩 - Google Patents

Abstract

본 발명, 시료의 미세혼합장치는 자기장에 의하여 구동되는 마그네틱 디스크가 장착된 시료 혼합 챔버를 포함하며, 상기 시료 혼합 챔버의 양 말단에는 각각 주입구와 배출구가 연결된 것을 특징으로 한다. 본 발명에 의한 미세혼합장치 및 이를 포함하는 랩온어칩은 기존의 복잡하면서도 혼합시간이 많이 소요되는 장치들에 비하여, 장치의 구현이 간단하면서도 단시간에 시료의 높은 혼합 효율을 나타내는 우수한 효과가 있으며, 각종 미세분석장치와의 결합으로 다양한 랩온어칩을 구현할 수 있는 효과가 있다.

미세혼합장치, 랩온어칩, 자기장, 마그네틱 디스크

Description

시료의 미세혼합장치 및 이를 포함하는 랩온어칩{A MICRO­MIXING DEVICE OF SAMPLES AND A LAB-ON-A-CHIP COMPRISING SAID DEVICE}

도 1은 본 발명의 미세혼합장치(micro-mixing device)를 나타낸 마스크 패턴(a), 미세혼합장치의 제조과정에 대한 모식도(b) 및 제조된 미세혼합장치의 실제 사진(c)을 나타낸다.

도 2는 본 발명의 미세혼합장치를 사용하여 시간 변화에 따른 시료의 혼합 정도를 나타낸 그래프(a) 및 사진 이미지와 히스토그램(b)을 나타낸다.

도 3은 마그네틱 디스크가 함침된 폴리디메틸실록산(PDMS)이 장착된 시료 혼합 챔버를 포함하는 미세혼합장치의 제조 과정 모식도(a), 상기 과정에 의하여 제조된 미세혼합장치의 사진(b), 상기 미세혼합장치에 고상추출장치(solid phase extracting device)가 연결된 랩온어칩(lab-on-a-chip)의 모식도(c) 및 상기 랩온어칩 중 미세혼합장치 부분의 상세도(d)를 나타낸다.

<부호의 설명>

EB : 용출 완충액(elution buffer)

SI : 샘플 주입구(sample inlet)

LB : 세포파쇄 완충액(lysis buffer)

V : 밸브(valve)

SA : 사이드암(side-arm)

SPE : 고상추출기(solid phase extraction)

WP : 잔여물 포트(waste port)

도 4는 마그네틱 디스크가 함침된 PDMS가 장착된 시료 혼합 챔버를 포함하는 미세혼합장치를 사용한 세포 파쇄물과 상기 미세혼합장치가 사용되지 않은 세포 파쇄물의 시간 변화에 따른 세포 파쇄 정도 및 그에 따른 세포 내 단백질의 활성변화를 나타낸 그래프이다.

도 5는 본 발명의 미세혼합장치 및 상기 미세혼합장치에 연결된 고상추출장치를 포함하는 랩온어칩의 모식도 및 실제 사진이다.

<부호의 설명>

EB : 용출 완충액

SI : 샘플 주입구

LB : 세포파쇄 완충액

V 1~3 : 밸브 1~3

AS : 항체 용액(antibody solution)

CS : 대조군 용액(control solution)

WP : 잔여물 포트

RE : 표준패턴(refrence electrode)

WE : 작업전극(working electrode)

CE : 제어전극(control electrode)

도 6은 고상추출장치를 제조하는 방법으로서, 고상추출제를 충전하기 위한 in-situ 고분자중합과정을 나타낸 모식도(a) 및 제조된 고상추출장치의 일부분의 전자현미경 사진(b)을 나타낸다.

도 7은 본 발명의 랩온어칩의 금속 패턴 내부의 원자현미경 사진으로서, 금속결합 단백질과 항체의 결합 전후의 사진(a), 금속결합 단백질과 항체가 차례로 금속에 결합한 후의 높이 차이를 나타내는 그래프(b), 금속에 단백질과 항체가 차례로 결합하는 형상을 나타낸 모식도(c), 금속결합 단백질과 항체가 차례로 금속에 결합한 후의 위상차를 보여주는 원자현미경사진(d) 및 금속결합 단백질과 항체가 차례로 금속에 결합한 후의 표면의 높낮이를 알 수 있는 원자현미경사진(e)을 나타낸다.

본 발명은 시료의 미세혼합장치 및 상기 미세혼합장치를 포함하는 랩온어칩에 관한 것이다.

최근 유전자 분석이나 생화학 분석의 분야에서 많이 사용되고 있는 랩온어칩은 기존의 실험실에서 행해지고 있는 여러 가지 실험이나 분석들을 하나의 작은 칩 위에서 해결할 수 있도록 하는 미세장치이다. 이와 같은 마이크로 차원의 장치 사 용은 기존의 실험실 수준의 실험과 비교할 때, 필요한 시료의 양, 분석 시간, 비용 등의 여러 측면에서 많은 장점을 지니고 있다. 이러한 랩온어칩을 사용한 분석에서는 세포 활성화, 효소 반응 및 단백질 합성 등과 같은 여러 가지 시료들의 효과적인 혼합을 필요로 한다. 그러나, 마이크로 차원의 시스템에서의 유체는 레이놀즈 수(Reynolds number)가 작아 층류 흐름의 양상을 띠게 되고, 미세혼합장치 내에서의 시료의 혼합은 오직 확산에 의해서만 일어나게 되므로, 효과적인 혼합에 필요한 시간이 길어져 전체 분석시스템에 영향을 주게 된다.

마이크로 차원에서 시료의 효과적인 혼합을 위한 종래의 기술은 크게 능동적 혼합 방법과 수동적 혼합 방법으로 분류할 수 있다. 능동적 혼합 방법에 사용되는 능동 유체 혼합기는 내부에 움직이는 부분을 포함시켜 외부에서 주입되는 에너지, 즉 압력이나 전기장 등의 외부적인 힘을 이용하여 유체의 흐름을 능동적으로 제어하며, 수동적 혼합 방법에 사용되는 수동 유체 혼합기는 유체를 일정한 유량으로 흘려주는 것 이외에 다른 부가적 에너지를 가하지 않고, 단지 채널의 구조만을 변화시켜 혼합 성능을 향상시킨다. 능동 유체 혼합기의 경우 유체의 혼합 성능 면에서는 우수하지만, 제작과 동작 제어가 어렵고, 시스템에 집적하는 것이 용이하지 않다는 단점이 있다. 이에 비해, 수동 유체 혼합기의 경우에는 능동 유체 혼합기에 비해 혼합 성능은 다소 떨어지지만, 제작비용이 저렴하며 미세 소자에 집적하기 용이하다는 장점을 지니고 있다.

마이크로 차원의 혼합 방법들은 혼합을 위한 미세 구조를 가지는 구체적인 물리적 구조체로 나타나게 된다. T-형태 또는 Y-형태의 유동 구조를 가지는 2중 적 층(bi-lamination)은 기존의 T자형 혼합장치를 유사하게 소형화시킨 것으로서, 서로 번갈아 가면서 시료를 공급하는 구조를 이용하여 다층의 적층(multi-lamination)이 형성될 수 있으며, 구체적으로는 유체 흐름을 다중문어발식(interdigital)으로 나누거나, 두 가닥 흐름으로 분기(bi-furcation)하는 방법으로 실현될 수 있다.

혼합 속도를 증가시키기 위해서는 구조적인 관점에서 다층의 얇은 판(lamellae)들을 유동이 얇게 일어나도록 할 수 있으며, Split-and-recombine(SAR) 형태의 혼합을 위해서 유동을 나누고, 이를 다시 합치는데 여러 가지 형태가 개발되고 있다. 여기에는, 포크형(fork-like), 스텍형(stack-like), 뫼비우스형(Mobius-type), 3-D 커브 캐터필러식 디자인(3-D curved caterpillar design) 등이 있다.

카오틱 혼합(Chaotic mixing)을 위해서는 마이크로 채널 안에 청어 가시무늬(herringbone) 구조라는 경사진 홈들을 번갈아 배열한다. 혼합 효율을 개선하기 위해 장벽이 첨가된 구조가 덧붙여질 수 있으며, 이후에 단순한 곡선 형태의 채널과 지그재그 형태의 채널들이 사용되었다.

마이크로 플럼 주입(Micro-plume injection)을 이용한 혼합 챔버에서는 여러 개의 구멍을 가진 판을 덧붙이는데, 이들 구멍들을 단순하게 배열하여 직선적으로 주입되도록 하거나, 구멍을 경사지게 만들어 복잡하게 주입되도록 하여 혼합 효과를 얻는 것이다.

그러나, 이러한 장치들은 3차원 구조로 되어 있어 구조가 복잡하고, 제작이 어렵거나 효과적인 혼합 효과가 발생하지 않는다는 단점을 지니고 있다. 이렇게 유체를 분리하여 다시 합치는 방법으로는 유체를 마이크로 채널 안에서 회전시키는 방법이 주로 사용되었으며, 분석하기 위한 샘플과 시약을 혼합하는 경우, 샘플과 시약의 접촉 계면을 증가시킬 수 있다는 장점을 지니고 있으나, 장치의 채널설계가 어렵고, 제작이 용이하지 않다는 단점을 지니고 있다.

또한, 수중방전충격(electrohyrodynamic convection) 장치는 복잡한 유로상에 전기장을 인가하여 마이크로 채널 안에서 유체를 회전시켜 혼합하였는데, 이 경우 혼합효과가 우수하지 않고, 그 구성이 복잡하여 제작이 용이하지 않는 문제점이 있었다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 구조가 간단하면서도 우수한 시료의 혼합 효과를 나타내는 미세혼합장치 및 이를 포함하는 랩온어칩을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명, 시료의 미세혼합장치는 자기장에 의하여 구동되는 마그네틱 디스크가 장착된 시료 혼합 챔버를 포함하며, 상기 시료 혼합 챔버의 양 말단에는 각각 주입구와 배출구가 연결된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 미세혼합장치는 벌크 상에서 이용하는 일반적인 마그네틱 혼합장치를 모사하여, 반도체 제조에 사용되는 포토리쏘그래피(photolithography) 공정을 이용하여 제조될 수 있다.

상기 마그네틱 디스크는 그 자체가 시료 혼합 챔버 내에 장착되거나 또는 고분자막에 함침되어 시료 혼합 챔버 내에 장착될 수 있다. 상기 고분자막은 바람직하게는 폴리디메틸실록산(PDMS)이다.

상기 시료 혼합 챔버와 배출구 사이에는 시료 혼합 챔버에서 혼합된 시료의 혼합 효율을 분석하기 위한 분석 챔버를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 상기 미세혼합장치를 포함하는 랩온어칩을 제공하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 랩온어칩 상에는 본 발명의 미세혼합장치에 어떠한 미세분석장치라도 연결될 수 있으며, 예를 들어 세포파쇄 후 잔여물을 제거시키기 위한 고상추출장치가 연결될 수 있으며, 예를 들어 항원-항체 반응을 수행할 수 있는 미세패턴장치가 더 연결될 수도 있다.

상기 고상추출장치는 바람직하게는 고분자 고상추출제가 in - situ 중합반응으로 충전된 것일 수 있다.

이하에서는, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

[ 실시예 ]

실시예 1

1. 마그네틱 디스크가 장착된 미세혼합장치의 제조

도 1의 b는 본 발명에 사용되는 마그네틱 디스크를 이용한 미세혼합장치의 제조과정이다.

본 발명에 사용되는 랩온어칩의 리플리커를 반도체 제조에 사용되는 포토리쏘그래피 공정을 이용하여 제조하였다.

포토레지스트층을 형성하여 소정 패턴으로 식각하여 몰드를 제조한 다음, 미세크기의 실린더를 시료 혼합 챔버 부분에 접착하여 시료 혼합 챔버에 마그네틱 디스크가 포함될 수 있는 공간을 형성하였다.

다음으로, PDMS와 경화제(curing agent)를 10:1의 중량비로 혼합하여 몰드에 부어 경화시킨 다음, 경화된 PDMS 리플리커를 오븐에서 꺼내어 몰드로부터 분리하고, 시료 혼합 챔버에 마그네틱 디스크를 넣었다. 그 후에, 표면을 플라즈마로 처리하여 유리와 접착하여 본 발명의 자기장 인가에 따라 구동하는 미세혼합장치를 제조하였다.

도 1의 c는 위의 공정을 통하여 제조한 실제 미세혼합장치를 보여주는 실제사진이다.

2. 시료의 혼합효율 분석

상기 1.에서 제조된 미세혼합장치를 이용한 시료의 혼합효율을 분석하기 위하여, 검정과 흰색의 수용성 물감을 수용액 상에 용해시켜 시료샘플을 준비하였다.

두 개의 샘플시료는 각각 마이크로 펌프를 이용하여 유속 20㎕/분으로 미세혼합장치로 주입하였다. 주입된 시료는 외부에서 인가되는 자기장의 세기변화(50~500rpm)에 따라 혼합 효율 값(mixing index)이 측정되었다.

도 2의 a는 본 발명의 미세 혼합기를 이용해서, 시간변화에 따른 혼합정도를 나타낸 그래프이다. 상기의 미세혼합기를 이용하여 두 가지 시료샘플의 혼합 효율을 분석하기 위하여 아래와 같은 혼합효율 값을 정의하였다.

위 식에서

값은 픽셀 케이(pixel k)에서 색 값(color index),

는 분석 이미지의 N개의 픽셀에 대한 평균 색 값을 나타내고 있다. 문헌상의 보고에 의하면, 혼합 효율 값이 0.2 이하일 경우 완전 혼합(perfect mixing)으로 정의하고 있다.

도 2의 a에서 보이는 바와 같이, 외부에서 인가되는 자기장의 세기가 증가할수록 혼합효율이 증가하고 있음을 확인할 수 있으며, 4초 이내의 혼합시간에 두 개의 유체 샘플이 거의 균일하게 혼합되고 있음을 보여 주고 있다.

도 2의 b는 500rpm에서 시간변화에 따른 시료 혼합 챔버 안에서의 혼합되는 정도를 광학현미경을 통해 얻은 후, 이미지분석 소프트웨어(Scion Image, Scion Co., Frederick, MD)를 이용하여 미세혼합장치의 혼합 정도를 분석한 것이다. 도 2의 b에서 보이는 바와 같이, 4초 이내의 혼합시간에 두 유체흐름이 균일하게 혼합 되고 있음을 사진 이미지와 이를 소프트웨어로 분석한 히스토그램을 통해 확인할 수 있었다.

실시예 2

1. 미세혼합장치와 고상추출장치로 이루어진 랩온어칩의 제조

도 3의 a는 PDMS와 마그네틱 디스크를 이용한 자기력에 의해 움직이는 미세혼합장치와 고상추출장치로 이루어지는 랩온어칩의 제조과정을 나타낸다.

이는 상기 실시예 1에서 나타낸 미세혼합장치의 응용으로, 보다 효과적인 난류형성을 통한 혼합효율을 나타내기 위해 상하로 구동이 가능한 마그네틱 디스크를 포함한 고분자막을 이용한 미세혼합장치를 구현할 수 있으며, 시료의 혼합 후에 생성된 고상추출물을 효율적으로 제거할 수 있다.

제조 방법을 구체적으로 설명하면, 포토레지스트층을 형성하여 소정 패턴으로 식각하여 몰드를 제조한 다음, 미세크기의 실린더를 시료 혼합 챔버 부분에 쉽게 탈착이 가능하도록 시료 혼합 챔버 부분에 정렬(align)시킨다.

다음으로, PDMS와 경화제를 10:1의 중량비로 혼합하여 몰드에 부어 경화시킨 다음, 시료 혼합 챔버에 있는 실린더를 제거한다.

실린더가 제거된 시료 혼합 챔버에 PDMS와 경화제를 20:1의 중량비로 혼합하여 마그네틱 디스크와 동시에 경화시켜 자기력인가에 구동이 가능한 PDMS 고분자막을 형성하여 미세혼합장치를 제조하였다.

고상추출장치는 in - site 고분자 중합과정으로 제조되며, 이를 보다 구체적으 로 설명하면, 고상추출 미세 채널 챔버의 사이드 암(side arm)을 통해 표면 개질 용액을 주입한 후, 고상추출 미세 챔버 영역만을 마스크 패턴을 이용해 자외선을 5분 정도 조사하였다.

표면 개질된 고상추출 미세챔버 영역에 자외선에 민감하게 반응하는 고분자 모노머 용액을 사이드 암을 통해 주입 후, 마스크 패턴을 정렬하여 자외선을 20분 정도 조사하고, 다음으로, 완전하게 고분자 중합이 종료된 고상추출 미세 챔버는 용매를 통해 미개시된 모노머를 제거하여, 고분자 고상추출제를 미세채널에 충전하였다.

이와 같이 제조된 랩온어칩은, PDMS 고분자막에 마그네틱 디스크를 함침하여 외부 자기장인가에 따라 마그네틱 디스크를 포함한 고분자막이 상하 운동을 하며, 주입구를 통해 유입되는 두 가지 유체 흐름인 미생물 세포시료샘플과 화학적 세포파쇄를 위한 용해용액(lysis buffer)을 혼합하는 미세혼합장치; 일정시간 시료샘플이 미세혼합영역에 체류하기 위한 미세채널 기둥 및 그 위에 1% 테프론 용액(teflon solution)을 코팅한 소수성필름밸브; 일정시간 세포 파쇄 후 세포용해 용액에 존재하는 고형물 및 불순물제거를 위한 고상추출제가 in - situ고분자 반응을 통해 충진된 고상추출장치; 및 최종적으로 세포용해용액이 유출되는 배출구로 구성된다.

2. 세포파쇄 상등액의 단백질 농도 측정

본 연구에 사용한 모델 세포시료는 형광분석이 가능한 EGFP(enhanced green fluorescent protein) 단백질을 발현시켜 사용하였다. 고분자막을 이용한 미세혼합장치에서 EGFP가 발현된 세포시료와 용해용액을 일정시간 혼합시킨 후, 용출용액 주입구를 통해 용해된 상등액을 고상추출장치로 이동시킨다. 고분자막을 이용한 미세혼합장치에서의 체류시간 변화에 따라 고상추출제를 통과하면서 고형물 및 불순물이 제거된 상등액 샘플을 출구에서 분획하여 단백질 농도를 정량하였다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 자기력 인가에 의해 구동하는 고분자막 미세혼합장치를 사용할 때와 사용하지 않았을 경우를 비교한 결과, 미세혼합장치를 이용했을 경우에 효과적으로 세포파쇄를 수행할 수 있음을 알 수 있다. 또한, 세포파쇄시간이 증가할수록 미생물 세포로부터 용출되어 나오는 단백질의 농도가 증가하고 있음을 확인할 수 있다.

실시예 3

1. 바이러스질환의 검출용 랩온어칩의 제조

바이러스질환의 검출용 랩온어칩을 실시예 1에서 설명된 포토리쏘그래피 공정을 사용하여 제조하였다.

본 실시예의 랩온어칩은 실시예 1의 미세혼합장치를 적용하여 주입구를 통해 유입되는 두 가지 유체 흐름(급성호흡기증후군(SARS)질환을 유발할 수 있는 바이러스를 세포내부에 발현시킨 시료샘플과 화학적 세포파쇄를 위한 용해용액(lysis buffer))을 혼합하는 미세혼합장치 영역; 일정시간 시료샘플이 미세혼합영역에 체류하기 위한 미세채널 기둥 및 그 위에 1 % 테프론 용액(teflon solution)을 코팅 한 소수성필름밸브; 일정시간 세포 파쇄 후 세포용해 용액에 존재하는 고형물 및 불순물제거를 위한 고상추출제가 in - situ 고분자 반응을 통해 충전된 고상충전장치; 병원성 바이러스를 검출할 수 있는 미세패턴배열 및 미세전극패턴을 이용한 검출영역으로 구성되어 있다.

2. 항원-항체 반응

상기 렙온어칩을 사용하여 세포내에 있는 병원성 물질의 미세패턴영역에서의 항원-항체반응을 병원성 물질이 금속 미세패턴영역에 결합을 한 후, 항원-항체반응의 특이결합이 형성되고 있음을 미세패턴의 높이차이 및 표면변화를 통해 분석하고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7의 1은 금속 미세패턴의 표면을 나타내는 것이며, 2는 금속결합 단백질을 이용한 항원 단백질이 결합된 이후를 나타내는 것이고, 3은 항체가 특이적으로 결합된 이후의 원자현미경 분석결과를 나타내는 것이다.

상기 설명한 바와 같이, 본 발명에 의한 미세혼합장치 및 이를 포함하는 랩온어칩은 기존의 복잡하면서도 혼합시간이 많이 소요되는 장치들에 비하여, 장치의 구현이 간단하면서도 단시간에 시료의 높은 혼합 효율을 나타내는 우수한 효과가 있으며, 각종 미세분석장치와의 결합으로 다양한 랩온어칩을 구현할 수 있는 효과가 있다.

Claims (12)

1. soft lithography 기술을 이용하여 형성된 미세유체 채널 및, 폴리디메틸실록산(PDMS) 고분자막에 함침되고 자기장에 의하여 구동되는 마그네틱 디스크가 장착된 시료 혼합 챔버를 포함하며, 상기 시료 혼합 챔버의 양 말단에는 각각 주입구와 배출구가 연결된 것을 특징으로 하는 시료의 미세혼합장치.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,

   상기 시료 혼합 챔버와 배출구 사이에 시료의 혼합 효율을 분석하기 위한 분석 챔버를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시료의 미세혼합장치.
5. 제1항 또는 제4항의 미세혼합장치를 포함하는 것을 특징으로 하는 랩온어칩.
6. 삭제
7. 제5항에 있어서,

   상기 미세혼합장치에 고상추출장치가 연결된 것을 특징으로 하는 랩온어칩.
8. 제7항에 있어서,

   상기 고상추출장치는 고분자 고상추출제가 in - situ 중합반응으로 충전된 것을 특징으로 하는 랩온어칩.
9. 삭제
10. 삭제
11. 제7항에 있어서,

    상기 고상추출장치에 미세패턴장치가 더 연결된 것을 특징으로 하는 랩온어칩.
12. 삭제

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