KR100889572B1 - 시간분할 다중 내부표준물질을 이용한 환경호르몬의 다성분동시 분석법 - Google Patents

시간분할 다중 내부표준물질을 이용한 환경호르몬의 다성분동시 분석법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 시간분할 다중 내부표준물질을 이용한 환경호르몬의 다성분 동시 분석법에 관한 것으로, 구체적으로 a) 환경호르몬 분석을 위한 시료와 Naphthalene-d8, Acenaphthene-d10, Phenanthrene-d10, Fluoranthene-d10, Fluorobenzene, Chrysene-d12, Perylene-d12, 1,2,-dichlorobenzene-d4 및 Pyrene-d10으로 이루어진 군에서 선택되는 6 내지 9종의 서로 상이한 시간분할 다중 내부표준물질을 혼합하는 단계; b) 상기 혼합시료에 추출용매를 첨가하여 불순물이 제거된 시료를 추출하는 단계; c) 상기 추출된 시료를 0 내지 20℃에서 5 내지 100분간 냉각하는 단계; d) 상기 냉각 단계를 거친 시료에 NaCl, CaCl2, MgSO4, Na2SO3, (NH4)2SO4 및 KCl 로 이루어 진 군에서 선택된 물질을 첨가하여 침전물을 형성시키는 단계; e) 상기 침전물과 상등액을 분리하는 단계; f) 상기 상등액에 흡착제 (Primary Secondary Amine ; PSA)를 첨가하여 상등액 내 분석이 불필요한 물질을 흡착제에 흡착시키는 단계; g) 상기 분석이 불필요한 물질이 흡착된 흡착제와 분석물질을 분리하는 단계; h) 상기 분리된 분석물질에서 제거되지 않은 지방성분을 제거하기 위한 -30 내지 -10℃, 30분 내지 2시간 동안의 급속냉동단계; i) 상기 급속냉동단계에서 제거되지 않은 단백질 또는 비극성 비휘발성 물질을 제거하기 위하여 C18 흡착제 1-3g 및 MgSO4 0-1g을 첨가하여 0.5 내지 5분간 격렬하게 흔들어서 상기 흡착제 흡착시키는 단계; j)상기 지방, 단백질 또는 비극성 비휘발성 물질이 흡 착된 흡착제를 분리하는 단계; k) 상기 과정에서 제거하지 못한 나머지 비극성 비휘발성 물질을 최종적으로 제거하기 위하여 헥산(hexane)을 이용한 분배단계; l) 분석물질이 분석기기 내부에 흡착을 방지하기 위하여 시료보호제를 첨가하는 단계; m) 상기 분석물질에 농축배율을 알기위한 표준물질로 기지량의 TPP(Triamine pyrophosphate)을 첨가하는 단계; n) 상기 TPP가 첨가된 분석물질을 진공 농축기에 넣고 건조하는 단계; o) 상기 건조된 분석물질을 희석용매로 희석 후 질량분석기(Mass spectrometer;MS)가 포함된 분석기로 분석하는 단계; 및 p) 상기 분석 질량분석 데이터베이스(AnAdB)를 이용하여 분석물질의 추가 분리 검출단계; 를 포함하는 분석법으로 다수개의 내부표준물질을 시간에 따라 분류하여 적용시킨 질량분석기를 이용하여 토양, 수질, 생체, 식품 시료 등에 함유된 농약을 포함하는 다성분의 환경호르몬을 동시에 매우 빠른 속도로 분석하여도 분석결과의 정확도가 우수한 분석법에 관한 것이다.
시간분할, 다중 내부표준물질, 환경호르몬, 농약, 다성분 동시분석, 질량분석 데이타베이스

Description

시간분할 다중 내부표준물질을 이용한 환경호르몬의 다성분 동시 분석법{The Multiresidue Simultaneous Analytical Technique for Environmental Hormone by Time Segment Multi Internal Standard}
본 발명은 시간분할 다중 내부표준물질을 이용한 환경호르몬 다성분 동시 분석법에 관한 것으로, 다수개의 내부표준물질을 시간에 따라 분류하여 적용시킨 질량분석기를 이용하여 토양, 수질, 생체, 식품 시료 등에 함유된 농약을 포함하는 다성분의 환경호르몬을 동시에 빠른 속도로 분석하여도 분석결과의 정확도가 우수한 분석법에 관한 것이다.
환경호르몬이란, 생물체에서 정상적으로 생성, 분비되는 물질이 아니라, 인간의 산업활동을 통해서 생성, 방출된 화학물질로, 생물체에 흡수되면 내분비계의 정상적인 기능을 방해하거나 혼란케 하는 화학물질을 말하며, 이러한 환경호르몬 은 극히 적은 양으로 생태계 및 인간의 생식기능 저하, 성장장애, 기형, 암 등을 유발하는 중대한 영향을 끼치기 때문에 심각한 문제가 되고 있다.
또한, 환경호르몬을 환경 및 생체잔류성 오염물질 (Persistent, Bioaccumulative, and ToxicOrganicPollutants;PBTs)이라고도 하며, 높은 인체 독 성, 환경 중의 광범위한 분포, 공기 또는 물 등을 통한 이동의 용이성, 환경 및 생체 내 안정성 및 잔류성 등으로 인하여, 전세계적인 환경 문제로 대두하고 있으며, 환경 및 인체에서의 상기 물질들의 모니터링 및 검출 확인과정이 매우 중요한 의미를 지니게 되었다.
환경호르몬은 그 종류도 다양하고 환경 및 생체라는 매우 복잡한 매트릭스(matrix)에 미량으로 존재하기 때문에, 시료 중에 포함되어 있는 환경호르몬이 함유된 시료 매트릭스로부터 추출, 농축하는 과정이 보다 정확하게 극미량 까지 분석 하기 위하여 필수적이다. 이러한 분석을 위하여 가스 크로마토그래피(Gas Chromatography;GC)-전자포획검출기(Electron Capture Detector,ECD)(GC-ECD), 가스 크로마토그래피(Gas Chromatography;GC)-질소-인 검출기(Nitrogen-Phosphorous Detector;NPD)(GC-NPD), 불꽃 광도형 검출기(Flame Photometric Detector;FPD), 가스 크로마토그래피(Gas Chromatography)-질량분석기(Mass Spectrometer), 고성능 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography;HPLC)-자외선 분광광도기(UltraViolet Spectroscopy;UV)(HPLC-UV), 고성능 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography;HPLC)-형광분석법(Flurorimeter;FL)(HPLC-FL), 고성능 엑체 크로마토그래피-질량분석기 (HPLC-LC-MS) 등이 폭넓게 사용되고 있으나, 이들의 경우, 시료 전처리 과정에서 화학분해가 일어날 우려가 있으며, 정확한 다성분 동시분석이 불가능 하여 과다한 시간, 비용 및 노동력 소모가 드는 문제점이 있다.
다시말해, 기존의 방법은 환경호르몬 1건 시료를 분석하기 위하여 최소한 GC-ECD 3대 이상 및 GC-NPD 2대 이상을 동시에 사용하는 등 여러대의 기기가 사용하여야 하는 어려움을 가지고 있다. 아울러 150종 이상의 환경호르몬 분석 시, 150종 이상의 환경호르몬에 대한 기준물질 기준을 정하고, 분석시료를 주입하여 150종 이상을 기준과 비교하여 분석하기 때문에 여러종의 분석시료에 포함된 환경호르몬은 150종 기준물질에 벗어나는 환경호르몬이 포함될 수도 있으며, 서로다른 물질의 피크가 중복되어 분석된 결과가 정확하지 않을 우려가 있다.
또한, 기존에는 시료에서 분석가능한 환경호르몬의 종류가 농약을 포함하여 60 내지 80여종으로 한정되고, 기기분석 시 150 내지 300여종의 농약 등의 환경호르몬을 분석하는데 하나의 내부표준물질만을 사용했기 때문에 분석되지 않은 환경호르몬 의 종류도 많아지게 되어 분석감도의 정확도 및 정밀도에 대한 신뢰성에 심각한 문제점이 발생하게 된다.
150종 이상의 다종의 환경호르몬을 분석하더라도 한개의 내부표준물질을 한 대의 기기를 사용해 왔으며, 각 내부표준물질 마다 적용시켜야할 기기를 여러대 제공하여 분석이 이루어져야 하므로 고가의 장비를 여러대 구비하기도 어려울뿐더러 분석 과정에 있어서도 과다한 노동력 및 시간을 필요로 한다. 아울러 150종 이상의 분석물질을 동시에 분석할 때, 크로마토그래피에서 100% 분리가 되지 않는 경우가 매우 많이 발생하여 분석결과에 심각한 오차가 발생한다.
따라서 150종 이상을 분석하기 위하여는 기존의 5대 이상의 분석기기를 이용하여 100% 분리가 가능한 방법을 사용하고 있으나, 5대 이상 기기를 구입 및 운영하기 위한 비용 및 시간이 많이 필요로 하고 있다. 분석하여야 할 농약 등의 환경 호르몬 분석물질이 2,000여종 이상이기 때문에, 분석물질의 종류숫자에 따라 필요한 분석기기 숫자는 기하급수적으로 증가하게 되고, 아울러 불완전한 분리에 따른 심각한 분석오차가 발생하고 있다.
이에, 대한민국 특허발명 제613400호에서는, 수질시료 또는 생체시료 중에 함유된 PAHs(polyaromatic hydrocarbons)와 PCBs(polychlorinated biphenyls)의 동시 분석을 위한 검출법에 관한 것으로, 염석 효과를 위하여 NaCl, CaCl2, MgSO4, Na2SO4,(NH4)2SO4및 KCl 로 이루어 진 군 중에서 선택된 물질이 첨가하고, 유기 용매를 사용하지 않고, 분석 물질을 추출 하는 시료 전처리 기술인 고체상 미량 추출(Solid Phase Microextraction: SPME)을 이용하여, 시료에서 18가지의 PAHs 와 14 가지의 PCBs를 동시 추출 한 후, 기체크로마토래피 또는 기체크로마토그래피/질량분석기를 사용하여 분석하는 방법이이 제안된 바 있으며, 대한민국 특허발명 제643177호에서 역시 상기의 고체상 미량추출(Solid Phase Microextraction: SPME)을 이용하여, 시료에서 60종의 휘발성유기오염물질(Volatile Organic Compounds;VOCs)을 동시 추출한 후, 기체크로마토그래피 또는 기체크로마토그래피/질량 분석기를 이용하여 분석하는 방법이 제안된 바 있다.
그러나, 상기 분석방법은 특정 종류의 극미량의 분석물질의 분석 감도가 향상되는 효과가 있지만, 고체상 미량추출(SPME)은 분석될 수 있는 목적물질만을 추출하여 한정된 종류의 환경호르몬만이 분석가능하고, 최적의 추출 효율을 얻기 위해 적절한 파이버의 종류의 선택, 흡착 온도 및 흡착 시간의 조절, 적절한 염의 첨 가 및 pH의 조절 등의 조건 설정이 까다로우며, 분석 시 2종의 내부표준물질을 사용하여 광범위한 종류인 다성분의 환경호르몬이 함유된 시료를 분석하는 데에는 분석감도에 제한이 따르는 단점이 있다. 또한, 상기 염석 효과를 위한 물질을 첨가할 때 시료에 50℃이상의 열이 발생하면서 분석되어야 할 환경호르몬이 화학분해가 되면서 파괴되어 버릴 위험이 있다.
한편, 환경호르몬 분석에 있어서 가장 문제가 많은 과정이 시료전처리 과정에서 불필요한 물질들을 제거하는 과정으로서 제거가 어느 정도로 완전하게 되었느냐에 따라 분석결과의 정확도가 결정되기 때문에 시료에 지방, 단백질, 기타 비극성 비휘발성 물질들이 포함되어 있는 경우는 분석결과가 부정확할 뿐만 아니라 기기 수명에 심각한 영향을 미치기 때문에, 다양한 종류의 불필요한 방해물질을 제거하기 위한 연구는 세계적으로 활발히 진행되고 있으며, 이러한 방법들은 공개하지 않고 특허로 등록하고 있는 실정이다.
그 밖에 일본 특허공개 제2006-204998호에 있어서, 호수와 늪, 하천 등의 물에 포함되는 농약, 환경호르몬 등의 정량분석을 위한 전처리로 목적성분을 농축시켜 소수성의 음이온교환기 충전재에 포착시킨 후 액체 시료를 통해 불필요 성분을 배출시킨 후, 용출용매를 통해 충전재에 포착된 목적성분만을 용출시켜 분석장치에 도입하는, 분석 대상의 액체 시료에 포함되는 목적성분을 농축하는 것과 동시에 불필요 성분을 제거하기 위한 시료 전처리 방법이 제안된 바 있다. 그러나, 목적물질을 충전재에 포착시키는 과정에 있어서 환경호르몬의 화학분해로 인해 시료 내에 목적물질의 분석이 이루어지지 않아 분석 정확도가 저하될 우려가 있다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명의 목적은 다성분의 목적물질을 지닌 시료를 동시에 분석하여 분석의 편리함과 정확도 및 정밀도가 향상된 분석방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 시료의 전처리 과정에서 시료 내 환경호르몬의 화학분해를 방지하는 시료의 전처리 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 a) 환경호르몬 분석을 위한 시료와 Naphthalene-d8, Acenaphthene-d10, Phenanthrene-d10, Fluoranthene-d10, Fluorobenzene, Chrysene-d12, Perylene-d12, 1,2,-dichlorobenzene-d4 및 Pyrene-d10으로 이루어진 군에서 선택되는 6 내지 9종의 서로 상이한 시간분할 다중 내부표준물질을 혼합하는 단계; b) 상기 혼합시료에 추출용매를 첨가하여 불순물이 제거된 시료를 추출하는 단계; c) 상기 추출된 시료를 0 내지 20℃에서 5 내지 100분간 냉각하는 단계; d) 상기 냉각 단계를 거친 시료에 NaCl, CaCl2, MgSO4, Na2SO3, (NH4)2SO4 및 KCl 로 이루어 진 군에서 선택된 물질을 첨가하여 침전물을 형성시키는 단계; e) 상기 침전물과 상등액을 분리하는 단계; f) 상기 상등액에 PSA를 첨가하여 상등액 내 분석이 불필요한 물질을 PSA에 흡착시키는 단계; g) 상기 분석이 불필요한 물질이 흡착된 PSA와 분석물질을 분리하는 단계; h) 상기 분리된 분석물 질에서 제거되지 않은 지방성분을 제거하기 위한 -30 내지 -10℃, 30분 내지 2시간 동안의 급속냉동단계; i) 상기 급속냉동단계에서 제거되지 않은 단백질 또는 비극성 비휘발성 물질을 제거하기 위하여 C18 흡착제 1-3g 및 MgSO4 0-1g을 첨가하여 0.5 내지 5분간 격렬하게 흔들어서 상기 흡착제 에 흡착시키는 단계; j)상기 지방, 단백질 또는 비극성 비휘발성 물질이 흡착된 흡착제를 분리하는 단계; k) 상기 과정에서 제거하지 못한 나머지 비극성 비휘발성 물질을 최종적으로 제거하기 위하여 헥산(hexane)을 이용한 분배단계; l) 분석물질이 분석기기 내부에 흡착을 방지하기 위하여 시료보호제를 첨가하는 단계; m) 상기 분석물질에 농축배율을 알기위한 표준물질로 기지량의 TPP(Triamine pyrophosphate)을 첨가하는 단계; n) 상기 TPP가 첨가된 분석물질을 진공 농축기에 넣고 건조하는 단계; 및 o) 상기 건조된 분석물질을 희석용매로 희석 후 질량분석기(Mass spectrometer;MS)가 포함된 분석기로 분석하는 단계;를 포함하는 시간분할 다중 내부표준물질을 이용한 환경호르몬의 다성분 동시 분석법을 제공한다.
또한, 본 발명은 p) 상기 분석 질량분석 데이터베이스(AnAdB)를 이용하여 분석물질의 추가 분리 검출단계;를 더 포함하는 시간분할 다중 내부표준물질을 이용한 환경호르몬의 다성분 동시 분석법을 제공한다.
이하 본 발명에 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 우선, 도면들 중, 동일한 구성요소 또는 부품들은 가능한 동일한 참조부호를 나타내고 있음에 유의하여야 한다. 본 발명을 설명함에 있어, 관 련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명은 본 발명의 요지를 모호하지 않게 하기 위하여 생략한다.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본 발명의 환경호르몬 물질로서 잔류농약성분의 검출을 위한 분석법에 대해 설명하되, 환경호르몬의 종류는 잔류농약에 한정되지 않는다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 시간분할 다중 내부표준물질을 이용한 환경호르몬의 다성분 동시 분석 공정도이다. 도 1을 참조하면, 본 발명에서 사용하는 환경호르몬의 분석은 시간분할 다중 내부표준물질 혼합단계 S10, 추출단계 S20, 냉각단계 S30, 염석화단계 S40, 분리단계 S50, 분석 외 물질 흡착단계 S60, 분석 외 물질의 분리단계 S70, 급속냉동단계 S80, 방해물질 흡착단계 S90, 흡착제 분리단계 S100, 분배단계 S110, 시료보호제 첨가단계 S120, 농축배율 표준물질 첨가단계 S130, 분석물질 건조단계 S140, 분석단계 S150 및 질량분석 데이터베이스(AnAdB)를 이용한 분리검출단계 S160으로 진행될 수 있다.
본 발명은 a) 환경호르몬 분석을 위한 시료와 Naphthalene-d8, Acenaphthene-d10, Phenanthrene-d10, Fluoranthene-d10, Fluorobenzene, Chrysene-d12, Perylene-d12, 1,2,-dichlorobenzene-d4 및 Pyrene-d10으로 이루어 진 군에서 선택되는 6 내지 9종의 서로 상이한 시간분할 다중 내부표준물질을 혼합하는 단계;인 내부표준물질혼합단계 S10를 진행시킨다.
상기 환경호르몬 분석을 위한 시료는 농약을 포함하는 1 내지 500종의 환경호르몬을 포함하는 토양 또는 물에서 채취한 환경시료, 농축산물, 수산물, 식품 및 이들의 혼합물에서 선택될 수 있다.
상기에서 선택된 시료를 1 내지 100g 취하여 시료를 균일하게 분쇄한 후, 상기의 분쇄된 사료 0.1 내지 50g을 50ml 테프론 튜브에 넣은 후, 여기에 상기의 내부표준물질을 첨가하여 혼합한다.
b) 상기 혼합시료에 추출용매을 첨가하여 불순물을 제거를 위해 시료를 추출하는 단계;인 추출단계 S20를 진행시킬 수 있다.
상기 혼합시료가 들어있는 테프론 튜브에 상기 추출용매로서 1 내지 20ml의 아세토니트릴(Acetonitrle)을 첨가하는 것이 바람직하고, 0.5 내지 5분간 격렬하게 흔들어서 불순물이 제거된 추출시료를 준비한다.
c) 상기 추출된 시료를 0 내지 20℃에서 5 내지 100분간 냉각하는 단계;인 냉각단계 S30을 진행시킬 수 있다. 본 발명에 있어서, 이와 같은 냉각단계는 시료에 포함되어 있는 환경호르몬의 파괴를 방지하기 위한 방법으로, 기존에는 냉각하지 않고 추후 단계인 염석화단계를 거치게 되면, 염석화를 위한 물질의 첨가 시 열이 발생하여 분석하고자 하는 환경호르몬이 화학분해로 파괴되어 분석이 불가능하게 되지만, 본 발명의 냉각단계 S30을 진행함으로써 환경호르몬의 파괴 문제를 저하시킬 수 있어 정확한 분석이 가능하다.
d) 상기 냉각 단계를 거친 시료에 NaCl, CaCl2, MgSO4, Na2SO3, (NH4)2SO4 및 KCl 로 이루어 진 군에서 선택된 물질을 첨가하여 침전물을 형성시키는 단계;인 염석화(Salting out)단계 S40를 진행시킬 수 있다. 상기 염석물질을 시료 10g 당 0.1 내지 10g 의 양으로 첨가하는 것이 바람직하다. 상기 염석물질이 시료 10g 당 0.1g미만으로 첨가되는 경우, 침전물의 형성이 제대로 되기 어려우며, 10g을 초과하면, 초과되는 염석화 물질이 낭비된다. 본 발명에서는 NaCl 0.5 내지 5g과 건조제로 MgSO4 1 내지 10g을 첨가하여 0.5 내지 5분간 격렬하게 흔들어서 염석화를 진행시키는 것이 바람직하다.
e) 상기 침전물과 상등액을 분리하는 단계;로서, 상기 염석화된 침전물과 상등액을 분리하기 위해 분리단계 S50을 진행할 수 있다. 상기 분리단계는 2,000 내지 10,000rpm으로 1 내지 10분간 원심분리하여 환경호르몬이 포함되어 있는 상등액의 채취를 위해 침전물을 분리한다.
f) 상기 상등액에 PSA (Primary Secondary Amine)를 첨가하여 상등액 내 분석이 불필요한 물질인 색깔을 띄는 엽록소, 지방성분, 단맛을 내는 설탕류 등의 분자량이 매우 큰 방해물질들을 흡착시키는 단계;로서 분석 외 물질 흡착단계 S60을 진행할 수 있다.
g) 상기 분석이 불필요한 물질이 흡착된 PSA와 분석물질을 분리하는 단계;로서 상기 분석이 불필요한 물질을 분리하기 위해 분석 외 물질의 분리단계 S70을 진행할 수 있다. 상기 분리에 있어서 2,000 내지 10,000rpm으로 1 내지 10분간 원심 분리하여 분석이 불필요한 물질과 분석물질을 분리한다.
h) 상기 분리된 분석물질에서 제거되지 않은 지방과 같은 기름성분을 제거하기 위한 -30 내지 -10℃, 30분 내지 2시간 동안의 급속냉동단계 S80을 진행시키는데, 상기 분석 외 물질 흡착단계에서 제거되지 않는 기름을 제거하기 위하여 상층액 1 내지 10mL를 15mL 튜브(Tube)에 담아 -20℃에서 1시간 동안 급속냉동을 시키게 되면 시료에 포함되어 있는 기름성분들이 약 50% 정도 제거된다. 일반적으로 기름성분이 제거되지 않은 상태에서 분석을 수행하게 되면 바탕선 상승으로 인하여 분석결과는 매우 부정확하게 되며, 기기내부에 기름성분이 축적되어 고가의 분석기기 수명이 심각할 정도로 단축되는 결과를 초래할 수도 있다.
i) 상기 급속냉동단계에서 제거되지 않은 단백질, 비극성 비휘발성 물질을 제거하기 위하여 C18 흡착제 1-3 g 및 MgSO4 0-1g을 첨가하여 0.5 내지 5분간 격렬하게 흔들어서 염석화 및 흡착제에 방해물질 흡착단계 S90을 진행시킨다.
상기 C18 흡착제는 C18H37 사슬을 포함하고 있는 디메틸 옥타데실 실란(dimethyl octadecyl silane)구조의 역상 크로마토그래피의 정지상으로 사용되는 물질로서, 비극성 물질을 걸러내는데 사용한다.
j) 상기 지방, 단백질 또는 비극성 비휘발성 물질이 흡착된 흡착제를 분리하는 단계;로서, 2,000 내지 5,000rpm으로 5 내지 10분간 원심분리하여 단백질 및 비극성 비휘발성 방해물질이 흡착된 흡착제를 제거하여 환경호르몬이 포함되어 있는 상등액의 채취를 위해 침전물을 분리하는 흡착제 분리단계 S100를 진행시킨다.
k) 상기 i) 및 j)단계에서 제거하지 못한 나머지 비극성 비휘발성 물질을 최종적으로 제거하기 위하여 헥산(hexane)을 이용한 분배단계;로서, 헥산(hexane) 1-3 ml를 첨가하고 0.5 내지 5분간 격렬하게 흔들어서 10분 동안 방치하고 헥산(hexane)층을 분리하여 나머지 남아있는 비극성 비휘발성 방해물질을 제거하는 헥산을 이용한 액-액 분배(liquid-liquid partition)를 이용하는 분배단계 S110를 진행시킨다.
l) 상기 분배단계를 거친 분석물질이 분석기기 내부에 흡착을 방지하기 위하여 분석물질이 분석기기 내부에 흡착을 방지하기 위하여 시료보호제를 첨가하는 단계;인 시료보호제 첨가단계 S120을 진행시킨다. 본 발명에서는 시료보호제로서 25 mg/kg 소비톨(sobitol) 또는 굴로닉산(gulonic acid)을 사용할 수 있다.
본 발명에서의 시료보호제를 사용하는 이유는 환경호르몬이 분석되는 과정에서 분석기기 내부에 흡착이 되어서 따라서 분석결과가 실제치 보다는 심각하게 낮아져서 분석결과가 부정확하게 되는 것을 방지하기 위해서인데, 분석기기 내부에 흡착되어 있는 분석시료들을 제거하기 위하여는 1-2시간마다 주기적으로 모든 분석기기의 내부를 세척하고, 고가의 분석컬럼을 교체하여야 하는 어려움이 있다. 따라서 시료가 기기 내부에 흡착되지 않고 분석이 진행될 수 있도록 시료보호제 (25 mg/kg sobitol, gulonic acid)를 첨가하여 기기내부에 부착되지 않도록 하여, 기기 분석 감도도 향상되고 분석결과의 정확도도 매우 향상된다.
m) 상기 분석물질에 농축배율을 알기위한 표준물질로 기지량의 TPP(Triamine pyrophosphate)을 첨가하는 단계;로서, 상기 분석이 불필요한 물질이 제거된 분석물질에는 분석 전에 농축배율 표준물질 첨가단계 S130을 진행할 수 있다. 상기 분 석물질에 미리 설계된 양의 TPP를 첨가하여 이후 분석단계를 진행시킨 후에 TPP 농도를 계산하여 농축배율을 확인하여, 농축과정에서 분석물질의 농축배율을 간접적으로 측정한다.
n) 상기 TPP가 첨가된 분석물질을 진공 농축기에 넣고 압력 70 cmHg, 온도 50 oC 조건을 이용하여 30분동안 농축하는 단계;인 상기 표준물질의 농축배율 확인을 위한 표준물질이 첨가된 분석물질 건조단계 S140을 진행한다.
o) 상기 건조된 분석물질을 희석용매로 희석 후 질량분석기(Mass spectrometer;MS)가 포함된 분석기로 분석하는 단계; 분석단계 S150이 진행하는 것을 포함하여 본 발명은 시간분할 다중 내부표준물질을 이용한 환경호르몬의 다성분 동시 분석법을 제공한다. 상기 분석을 위한 희석용매로서 아세토니트릴을 사용하고 1 내지 2배로 희석 후 분석하는 것이 바람직하다.
상기 분석단계에서 사용되는 분석기는 GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometer) 또는 LCMSMS(Multiple Liquid Chromatography coupled with tandem Mass Spectrometer)이 바람직하다.
본 발명에서는 환경호르몬 물질의 대표적인 예인 잔류농약의 분석을 위해 기존의 GC-ECD/NPD, HPLC-UV/FL 등을 사용하는 대신 GC 또는 LC를 질량분석기와 사용함으로써, 보다 용이 하면서도 정확한 분석이 가능하다.
상기 o)단계 분석후의 중복피크가 100% 분리되지 않은 분석물질을 정밀하게 분리하기 위해 질량분석 데이터 베이스(AnAdB)를 이용한 분리검출단계를 더 추가 할 수 있다.
p) 상기 분석된 분석물질을 질량분석 데이터베이스 (mass library)를 이용하여 분석물질의 추가 분리 검출단계 S160를 진행시킨다. 이는 많은 종류의 분석물질들이 충분히 분리되지 않아서 질량분석기에서 함께 검출되는 경우에는 자체적으로 작성된 질량분석 데이터베이스 (mass library;AnAdB)를 이용하여 분석물질을 추가로 분리하여 측정한다. 현재 상업용으로 판매되고 있는 질량분석 데이터베이스는 미국표준연구소에서 제작한 질량분석 사전(NIST mass library)를 가장 많이 사용하고 있으나, 포함되지 않은 환경호르몬이 많다.
따라서, 자체적으로 제작된 질량분석 데이터베이스(AnAdB)는 375종을 포함하고 있는데, 미국표준연구소의 질량분석 사전(NIST mass library)에도 포함되지 않은 34종 환경호르몬에 대한 질량 분석데이터 베이스를 자체적으로 구축하여 측정함으로써 기존에 분리되지 않고 겹치는 중복피크들을 분리하여 정밀한 검출이 가능하다.
본 발명의 질량분석 데이터베이스(AnAdB)로서 현재까지 구축된 AnAdB에 포함된 농약 375종은 하기 표 1에 나타내었으며, 앞으로 종류를 증가하면서 계속 구축하게 된다.
[표 1]
Alachlor Carbaryl 2.6-Dichlorobenzonitrile
Aldicarb Carbendazim Dimethoate
Acenaphthene-d10 Carbofuran 3',4'-Dichloropropionanilide
Acetochlor Carboxin Diphenylamine
Acephate Carbophenothion Diclofop methyl
Anilofos Chlorobenzilate Dicloran
Azinphos-methyl oxon Clofentezine Diethofencarb
Acetamiprid Chlorfenapyr Dicofol
Amitraz Cinosulfuron Diflubenzuron
Asana™ Chlorpropham Dimethomorph
Acetaldehyde(DNPH Derivative) Chlorpyrifos Diphenamid
Abamectin Chlorpyrifos- Methyl Disulfoton
Acibenzolar-s-methyl Chlorothalonil Diuron
Azocyclotin Chrysene-d12 Dylox (TM)11
Azoxystrobin lambda-Cyhalothrin 2,4-dichlorophenoxyacetic acid
Acrinathrin Cypermethrin Daminozide
Azinphosmethyl Cyproconazole Dazomet
Azafenidin Cyprodinil Diafenthiuron
Aldrin™™™™ Cadusafos Dicamba
Baycarb(TM)11 Carbosulfan Dimethipin
Baythroid(TM)-iso Carfentrazone-ethyl Dinocap
Beam(TM) Cartap hydrochloride Dithianon
Benthiocarb Chlormequat chloride Dimethyl-P-nitrophenylphosphate
Benalaxyl Clethodim Dodine
BHC(mixed isomers) Command Dimethylvinphos
BHC alpha isomer Cyclosulfamuron Difenoconazole
BHC beta isomer Cymoxanil Dimepiperate
BHC delta isomer cyromazine Diniconazole
Bifenthrin p-chlorophenoxy acetic acid Dithiopyr
Bifenox clothianidin Dimethenamid
Bitertanol chlorfluazuron Diquat dibromide monohydrate
Bromacil Cycloprothrin Edifenphos
Bromopropylate Cyazofamid Endosulfan
Buprofezin Cyhalofop-butyl Endrin
Butyraldehyde(DNPH Derivative) cis-Chlordane EPN
Bendiocarb trans-Chlordane Etoxazole
Benomyl chlorofenvinphos Ethalfluralin
Bensultap o,p'-DDD Ethion
Bentazon p,p'-DDD Ethiofencarb
Bifenazate p,p'-DDE Etrimfos
Baygon™™™™ o,p'-DDT Emamectinbenzoate
Benfuracarb p,p'-DDT Esprocarb
Boscalid DDT(mixture p,p'&o,p') Ethaboxam
Baycarb(TM) Deltamethrin Endosulfan sulfate
Benzoximate Devrinol Fosetyl aluminium
Butachlor Diazinon Fluquinconazole
Bioresmethrin Dieldrin Flufenoxuron
Captan Dichlofluanid Fenhexamid
Captafol Dichlorvos Fenpyroximate
Flufenacet Indanofan Nitrapyrin
Fosetyl-Aluminum Iprodione Norflurazon(TM)
Fenitrothion Isoprothiolane Nuarimol
Fluroxypyr-meptyl Isofenphos Nabam
Fentin hydroxide Indoxacarb 1,2,4,5-Tetrachloro-
4-nitrobenzene
Ferbam Isazophos Novaluron
Forchlorfenuron Imibenconazole Omite™™™™
Fludioxonil Iprovalicarb Oxamyl
Fenoxycarb Iminoctadine triacetate Oxyfluorfen
Fipronil Isoprocarb Oxadiazon
Fenamidone Iprobenfos Oxadixyl
Fenazaquin Imidan™™™™ Omethoate
Flusilazole Kresoxim-methyl Oryzalin
Furathiocarb Lindane Ofurace
Formaldehyde(DNPH Derivative) Linuron Oxaziclomefone
Fenthion Lufenuron cis-Permethrin
Fenbutatin-oxide Malathion Paclobutrazol
Fenbuconazole Mecarbam Parathion™™™™11
Folpet Mepronil Penconazole
Fenoxaprop-ethyl standard Metalaxyl Pentachloronitrobenzene
Fluoroimide Metolachlor Perylene-d12
Fluazinam standard Metribuzin Phenanthrene
Fluazifop-butyl Methamidophos Phenthoate
Fosthiazate Methiocarb Phenamiphos
Flucythrinate Methoxychlor Pyroquilon
Fenarimol Metobromuron Phosalone
Fluoranthene-d10 Monocrotophos Phosdrin(TM)-iso
Fensulfothion Maleic hydrazide Phosphamidon
Flutolanil Mepiquat chloride Phoxim
Flusulfamide Metham sodium Pirimicarb
Fenothiocarb Methabenzthiazuron Pirimiphos-methyl
Fenoxanil Maneb Pirimiphos-ethyl
Fluacrypyrim Mancozeb Procymidone
Ferimzone Methomyl Prochloraz
Flumethrin Mepanipyrim Profenofos
Fenpropathrin Methoxyfenozide Propamocarb HCl
tau-Fluvalinate Metconazole Prophos
Folicur™™™™ Methyl pentachlorophenyl sulfide Pyributicarb
Glyphosate Metabenzthiazuron Propisochlor
Glufosinate-ammonium Metolcarb Pyrazophos
Hexaconazole Molinate Prometryne
Hexythiazox Mefenacet phosphonic acid(2-chloroethyl)
Hexaflumuron Milbemectin A3 pymetrozine
Haloxyfop(free acid) Milbemectin A4 pyraclofos
Heptachlor Methacrifos pyridaphenthion
Halfenprox Methoprene pyriproxyfen
Imazalil Methidathion polyram™™™™
Imidacloprid Naphthalene-d8 Propineb
propaquizafop Propargite Tetramethylthiuram disulfide
pyraflufen-ethyl Phthalide Tricyclohexyltin hydroxide
pyrethrins(technical) Pendimethalin Terrazole™™
pyrimethanil Phosmet Tebufenozide
pyraclostrobin Pyridaben Tebupirimfos
o-Phenylphenol standard Quinomethionate Thiabendazole™™
Parathion-methyl Quizalofop ethyl Triforine
Parathion-ethyl Spirodiclofen Tetraconazole
Pencycuron Sanmarton Thiacloprid
Pyridalyl Simazine Triclopyr
Pyrimidifen Sethoxydim Thiocyclam hydrogenoxalate
Pyriminobac-methyl(E) Spinosad Trifloxystrobin
Pyriminobac-methyl(Z) Silafluofen Triphenylphosphate
Pyraclostrobin Tilt™™ Triazamate
Pentoxazone Tokuthion™™ Tiadinil
Pyributicarb Tolylfluanid Thenylchlor
Pyraclostrobin Tolclofos-Methyl Triflumuron
Pyrazolynate(Pyrazolate) Tri-allate Thiazopyr
Prothiophos Triadimenol Tefluthrin
Prothiofos Triadimefon Triazamate
Pretilachlor Triazophos Thiram
Probenazole Trifluralin Thifluzamide
Pentachloronitrobenzene Triflumizole Tralomethrin
Pyridalyl Thiodicarb Vamidothion
Pyrimidifen Thiophanate-methyl Vinclozolin
Paraquat dichloride Thiamethoxam Ziram
Phoxim Thidiazuron Zoxamide
하기 표 2는 기존의 분석방법과 본 발명의 분석방법을 비교한 표이다.
[표 2]
구분 기존방법 1 기존방법 2 본 발명의 방법 비 고
시료추출 유기용매 acetnitrile acetone acetnitrile -
내부표준물 1개 6-9개 분석정확도 향상
컬럼정제 SPE Florisil PSA -
농축 - 질소 purge evaporation rotary evaporator vacuum concentrator 내부표준물질 정확한 농축배율 을 측정하기위해 내부표준물 사용
기기분석 GC GC-ECD 3대 GC-NPD 2대 GC-MS 1대 -
피이크 중복 해결 - 불가능 가능 다성분 동시분석에서 AnAdb를 이용하여 중복 피이크 해결
환경호르몬 종류 확인 불가능 불가능 가능 질량분석기(GC -MS)를 사용하기 때문에 가능
상술한 바와 같이 본 발명의 시간분할 다중 내부표준물질을 이용한 환경호르몬의 다성분 동시 분석법은 다성분의 환경호르몬을 지닌 시료를 다수개의 내부표준물질을 시간별로 나누어 동시에 분석함으로써 한 대의 기기로도 1,500여종 이상의 다수종의 환경호르몬을 분석할 수 있으므로 분석의 편리함 뿐만 아니라 정확도 및 정밀도를 제공하는 효과가 있다.
또한, 기존에는 여러대의 기기를 사용하는데 반해 본 발명의 방법은 한 대의 기기를 사용하여 분석이 가능하며, 기존에는 한 사람이 하루에 20개 정도로 분석할 수 있지만, 본 발명의 방법은 한 사람이 하루에 100개 정도를 분석할 수 있을 정도로 분석시간이 빠른 효과가 있다.
또한, 질량분석기를 정성, 정량분석에 사용함으로서 기존의 ECD, NPD, FPD, UV, FL 방법에 비해 분석결과의 정확도를 향상시키는 효과가 있고, 아울러 기존의 방법으로는 환경호르몬 종류를 확인하기가 불가능하지만, 질량분석기를 사용함으로서 종류를 확인할 수 있다.
또한, 시료의 전처리 과정에서 냉각과정을 도입하여 환경호르몬의 화학분해를 방지하여 더 많은 환경호르몬이 분석되어 탁월한 정확도를 제공하는 효과가 있다.
하기의 실시예를 통하여 좀 더 상세하게 설명하고자 한다.
실시예 1
a) 수박에 포함된 156종 잔류농약을 동시분석하기 위하여, 가식부와 껍질을 포함하여 50g 수박 시료를 취하여 균질하게 분쇄하고, 분쇄된 사료 중에서 10g을 50ml 테프론 튜브에 넣고, 상기 테프론 튜브에 분석시간에 따라 시간을 분할하는 6종 내부표준물질로서 10 mg/kg Naphthalene-d8 (0.1 ml), 10 mg/kg Acenaphthene-d10 (0.1 ml), 10 mg/kg Phenanthrene-d10 (0.1 ml), 10 mg/kg Fluoranthene-d10 (0.1 ml), 10 mg/kg Chrysene-d12 (0.1 ml), 10 mg/kg Perylen-d12 (0.1 ml), 을 첨가하여 내부표준물질혼합단계 S10를 진행시켰다.
b) 상기 시료와 표준물질의 혼합시료가 포함된 테프론 튜브에 10ml의 아세토니트릴을 첨가하여 1분간 격렬하게 흔들어줌으로써 불순물이 제거되도록 시료를 추출하는 추출단계 S20을 진행시켰다.
가장 적절한 추출용매를 선택하기 위하여 극성차이가 많은 6가지 농약을 사용하여 아세톤(acetone), 헥산(hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate;EtAc), 아세토니트릴(acetonitrile;MeCN) 등의 추출효율, 방해효과 등을 조사하였다.
도 2는 농약의 추출용매에 따른 비교 결과이다. 도 2를 참조하면, 농약으로서 극성물질인 메빈포스(mevinphos), 디메토에이트(dimethoate)는 에틸아세테이트(EtAc), 아세토니트릴(MeCN)을 사용하여 84-91% 회수율이 측정되었지만, 아세톤(acetone)을 사용하는 경우 회수율이 62-66%로서 좋지 않았다. 중간 극성물질인 디크로로베닐(dichlorobenil) 및 말라티온(malathion)과 극성이 낮은 물질 사이플루스린(cyfluthrin)과 사이퍼메스린(cypermethrin)은 모든 종류의 용매를 사용하더라도 81-95% 회수율을 나타내었다.
따라서, 유기용매에 잔류하는 수분을 완전히 제거하기 위하여 첨가하는 MgSO4 는 아세톤(acetone)에는 용해되지만, MeCN에는 전혀 용해되지 않기 때문에 MeCN이 추출용매로 사용하기에는 더 적절한 것을 확인할 수 있다.
아울러 사용된 용매들의 추출효율들은 유사하지만, MeCN은 GC 및 LC에서 사용할 수 있고, 극성용매로서 극성 잔류농약들을 보다 더 효율적으로 추출할 수 있어서 본 분석방법에서 사용하였다.
c) 상기 추출단계를 거친 시료가 포함된 테프론 튜브를 4℃에서 30분간 보관하여 냉각단계 S30를 진행시켰다.
d) 이후, 상기 냉각된 시료가 포함된 테프론 튜브에 NaCl 1g, MgSO4 4g을 첨가하여 1분간 격렬하게 흔들어 주어 침전물생성을 위해 건조와 함께 염석화단계 S40를 진행시켰다.
e) 상기 염석화된 침전물을 4,000rpm으로 5분간 원심분리하여 상등액과 침전물로 분리단계 S50를 진행시켰다.
f) 상기 상등액에서 2ml를 취하여 건조제로 MgSO4 0.3g과 PSA 1g을 첨가하여 분석 외 물질 흡착단계 S60를 진행시켰다. 상기 PSA는 색깔을 띄는 엽록소, 지방성분, 단맛을 내는 설탕류 등의 분자량이 매우 큰 방해물질들을 PSA를 사용하여 분석이 불필요한 방해물질을 흡착시키는 데 사용하였다.
g) 상기 흡착 후 PSA 흡착제를 분리 제거하여 분석 외 물질의 분리단계 S70을 진행하였다.
h) 상기 분리된 분석물질에서 제거되지 않은 지방성분을 제거하기 위해 상층 액 5mL를 15mL 튜브(Tube)에 담아 -20℃에서 1시간 동안 급속냉동단계 S80을 진행하여 5회 반복하였다.
도 3은 급속냉동 횟수에 따른 지방성분 제거효과 그래프이다. 도 3을 참조하면, 상기 분리된 분석물질의 급속냉동을 반복함에 따라 지방이 고형화되는데, 고형화된 지방의 무게를 직접 측정해 본 결과 41.2 - 49.0 % 지방성분의 제거 효과가 측정되었다.
i) 상기 급속냉동단계에서 제거되지 않은 단백질 또는 비극성 비휘발성 방해물질들을 제거하기 위하여 C18 및 MgSO4를 사용하여 방해물질 흡착단계 S90를 진행하여 5회 반복하였다.
도 4는 흡착제로 추출 횟수에 따른 방해물질 제거효과 그래프이다. 도 4를 참조하면, 상기 급속냉동단계에서 제거되지 않은 방해물질이 48.5-57.4 % 의 제거효과가 나타남을 확인할 수 있다. 방해물질의 제거효율은 흡착전과 흡착후의 흡착제의 무게를 측정하여 흡착된 방해 물질의 양을 측정하거나, 남아있는 용액의 흡광도를 측정하여 제거효율을 측정한다. 급속냉동과정에서 41.2-49.0 %의 지방 및 방해물질이 제거되고, 다시 흡착제 과정을 통하여 남아있는 방해물질의 48.5-57.4%를 추가로 연속 제거하는 과정을 개발함으로서, 두 단계의 제거과정을 거쳐 전체적으로는 69.7 - 78.3 %의 제거효율을 가지게 되었다. 기존의 다른 방법들은 이렇게 제거하지 못하기 때문에 분석결과의 정확도가 매우 낮아지게 된다.
j)상기 지방, 단백질 또는 비극성 비휘발성 물질이 흡착된 흡착제인 C18를 분리하는 흡착제 분리단계 S100을 진행시켰다.
k) 상기 과정에서 제거하지 못한 나머지 비극성 비휘발성 방해물질을 최종적으로 제거하기 위하여 헥산(hexane)을 이용하여 액-액 분배(liquid-liquid partition)를 통하여 제거하는 분배단계 S110를 진행하였다.
l) 상기 분배단계를 거친 분석물질이 분석기기 내부에 흡착을 방지하기 위하여 시료보호제 (analyte protectant)로서 20 mg/kg 소비톨(sobitol), 20 mg/kg 굴로닉산(gulonic acid)을 0.1 ml 첨가하여 시료보호제 첨가단계 S120을 진행하였다.
m) 상기 분석물질이 포함된 테프론 튜브에 농축배율 표준물질로 10 mg/kg TPP(Triamine pyrophosphate)를 0.1 ml 첨가하는 표준물질 첨가단계 S130을 진행시켰다.
n) 상기 TPP가 첨가된 분석물질을 진공 농축기에 넣어 건조단계로서 최적의 조건 설정을 위해 하기와 같은 실험을 진행하였다.
도 5는 농축건조 조건 설정을 위한 시간에 따른 용매증발량 변화 그래프이다. 도 5를 참조하면, 상기 그래프는 농축단계 최적화를 위하여 재현성을 측정한 결과로서, 1.8 ml 시료를 15분동안 농축하였을 때는 0.6 ml가 증발되어 약 30% 농축효과가 발생하였고, 30분 동안 농축하였을 때 1ml가 증발되었고, 그리고 40분동안 농축하였을 1.2 ml가 증발되었다. 그리고 도 5에 의하면 재현성은 5-10 % 정도였기에, 내부표준물질 TPP를 농축 전에 첨가하여 농축후 TPP 농도를 측정하여 분석물질의 농축비율을 정확하게 측정하였는데 본 실험에서는 30분 농축시간을 사용하였다.
도 6은 건조조건 설정을 위한 압력, 온도, 및 시간에 따른 건조효과 그래프이다. 도 6을 참조하면, 분석시료의 건조 조건으로 C7 (13.5 psi, 60℃)이 가장 빨리 건조되었으나 건조 시 분석하고자 하는 환경호르몬도 함께 휘발 건조되어서, 온도가 조금 낮은 C6 압력 70 cmHg (13.5 psi), 온도 50℃ 조건을 이용하여 30분 동안 농축하는 실험조건이 가장 최적상태(건조시간 및 환경호르몬 휘발정도)로 결정되어, 상기 표준물질이 첨가된 분석물질을 압력 70 cmHg (13.5 psi), 온도 50℃ 조건을 이용하여 30분 동안 농축하는 건조단계 S140을 진행시켰다.
o) 상기 농축되어 건조된 분석물질 0.1 ml를 0.4ml의 아세토니트릴로 희석시켜 GC-MS로 분석단계 S150을 진행시켰다.
p) 상기 분석된 분석물질을 질량분석 데이터베이스 (mass library)를 이용하여 분석물질의 추가 분리 검출단계 S160을 진행함으로써 본 발명의 분석을 완결시켰다. GC-MS로 150종 이상의 잔류농약을 분석하는 경우 중복에 의하여 분석결과에 많은 오차가 발생하기 때문에, S160 단계에서는 자체적으로 제작된 AnAdB를 이용하여 분리하여 각각 개별성분으로 측정하였다.
실시예 2 내지 6
실시예 1과 동일하되, 각각 시료를 양파(실시예 2), 고추(실시예 3), 딸기(실시예 4), 벼(실시예 5) 및 배추(실시예 6)시료를 사용하였다.
비교예 1 내지 6
실시예 1과 동일하되, l) 상기 분배단계를 거친 분석물질이 분석기기 내부에 흡착을 방지하기 위하여 시료보호제 첨가단계 S120를 제외하고 양파(비교예 2), 고 추(비교예 3), 수박(비교예 1), 딸기(비교예 4), 벼(비교예 5) 및 배추(비교예 6)에 분석을 진행하였다.
도 7은 시료보호제 첨가여부에 따른 검출 세기 결과 그래프이다. 도 7을 참조하면, 양파, 고추, 수박, 딸기, 벼 및 배추시료에 시료보호제 (analyte protectant)로서 20mg/kg 소비톨(sobitol) 및 20mg/kg 굴로닉산(gulonic acid)을 첨가하여 디크로보스(Dichlovos)를 검출하였는데, 양파, 고추, 수박, 딸기, 벼, 그리고 배추의 경우, 도 9에서 보는 바와 같이 시료보호제를 첨가한 실시예 1 내지 6 그래프의 경우 검출세기가 훨씬 높게 측정되었다.
도 7에 있어서, 50 ppb는 50ppb 표준용액이 아세트니트릴 용매에 포함된 경우인 블랭크(blank)이고, 양파(onion), 고추(chili), 수박(watermelon), 딸기(strawberry), 벼(rice paddy) 및 배추(cabbage)에 50ppb 표준용액이 포함되어 있는 경우를 의미한다.
비교예 7
실시예 1과 동일하되, c) 상기 추출단계를 거친 시료가 포함된 테프론 튜브를 4℃에서 30분간 보관하여 냉각단계 S30을 제외하고 진행시켰다.
도 8은 농약성분인 캡탄의 분해에 따른 열 효과 그래프이다. 이에 대한 예로서, 이후 기술할 침전물을 형성시키는 염석화단계에서 MgSO4을 첨가하는 과정에서 열이 발생하여 분석하고자 하는 농약이 분해되는 문제점의 발생을 방지하기 위해 도 8에서 보는 바와 같이 살균 농약 성분의 하나인 캡탄(captan)에 20℃, 50℃, 60℃, 70℃, 80℃에서 열을 단순히 가했을 때 캡탄(captan)은 아무런 변화없이 분해되지 않았는데, MgSO4 4g을 첨가하는 경우　순간적인 급격한 온도상승으로 인하여 약 50% 정도 분해되었다.
따라서 염석화 과정에서 첨가하는 MgSO4 인하여 발생되는 급격한 열로 인한 영향을 최대한 감소시키기 위하여 추출과정 후의 테프론 튜브를 냉장고에 보관하여 4℃에서 30분간 보관하여 냉각단계를 거치게 되면 열로 인하여 발생되는 분석불질의 변화를 최대한 감소시킬 수 있다.
비교예 8
가식부와 껍질을 포함하여 50g 수박 시료를 취하여 균질하게 분쇄하고, 분쇄된 사료 중에서 10g을 50ml 테프론 튜브에 넣고, 전처리를 하지 않고 이온 크로마토그래피로 분석하였다.
도 9는 잔류농약이 포함된 비교예 8의 TIC그래프이다. 도 9를 참조하면, 많은 잔류농약이 포함된 TIC (Total Ion Chromatogram)을 보여 주고 있는데, 170여종의 많은 농약들의 검출 피이크들이 서로 중복되어 있다.
일반적으로는 170여종 분석에서 오차를 극소화하기 위하여는 6대의 GC-ECD, NPD분석기기를 사용하여야 하고 분석시간도 6시간 이상 (1시간/대) 소요되는 데 비하여, 본 방법을 사용하는 경우 1대 GC-MS를 이용하여 30분 이내에 분석을 성공적으로 수행할 수 있다. 아울러 이 방법은 질량분석기를 사용하여야만 가능하기 때문에, 기존 방법인 GC-ECD, NPD를 사용하는 경우는 사용이 불가능하다.
도 10a는 비교예 1의 방법으로 분석한 이소프로카브와 몰리네이트 두가지 농약의 TIC 분석결과이다. 도 10a를 참조하면, 이소프로카브(Isoprocarb)와 몰리네이트(Molinate)의 두가지 농약도 TIC 도 10a에서 보는 바와 같이 한 개의 피이크로 중복되어 나오게 되어 분석이 불가능하다.
도 10b는 실시예 1의 방법으로 분석한 이소프로카브와 몰리네이트 두가지 농약의 분석결과이다. 도 10b를 참조하면, 자체적으로 구축된 상기 표 1의 AnAdB를 이용하여 중복 피이크를 이소프로카브(isoprocarb)와 몰리네이트(Molinate) 성분으로 각각 분리하여 정량분석한 분석결과이다.
* 유효성 시험
실시예 1의 분석결과에 대한 유효성 시험을 위해 o) 상기 농축되어 건조된 분석물질을 0.4ml의 아세토니트릴로 희석시켜 GC-MS로 분석단계 S150을 거쳐서 수박에 포함된 잔류농약을 측정하기 위하여 분석방법 유효화 (Method Validation)를측정하였다. 정량한계 (limit of quantitation, LOQ)는 바탕선의 시그널 대 노이즈 비율(signal-to-noise ratio)의 10배에 해당되는 농도를 156종 농약에 대하여 검출하였는데, 156종 농약에 대하여 0.005 mg/kg 으로 측정하였다. 측정된 0.005 mg/kg은 잔류농약 허용범위 (maximum residue level, MRL) 이하로 측정되어 실제시료 분석에 가능하였다.
또한, 정확도를 측정하기 위하여 0.02, 0.08, 0.12mg/kg의 156종 농약을 수박시료에 첨가하여 측정된 회수율(Recovery　Yield)을 하기 표 3에 나타내었는데, 70-121 %의 만족할 만한 회수율이 측정되었고, 정밀도 (precision)는 12% 이하로 측정되었다.
검정곡선 (Calibration curve)를 작성하기 위하여 0.010, 0.20, 0.040, 0.080, 0.120, 0.160 mg/kg 표준용액들을(표 3에 사용된 표준용액)을 사용하였으며, 감도가 낮은 브로마실(Bromacil), 사이클로프로스린(Cycloprothrin), 사이퍼메스린(Cypermethrin), 사이프로코나졸(Cyproconazole), 엔도술판(Endosulfan), 플루사이스리네이트(Flucythrinate), 플루디옥소닐(Fludioxonil), 플루랄리네이트(Fluralinate), 포스메트(Phosmet), 프로파닐(Propanil), 파이라코포스(Pyrazophos), 산마르톤(Sanmarton), 트랄로메스린(Tralomethrine) 같은 농약들은 0.020, 0.040, 0.080, 0.160, 0.240, 0.320 mg/kg 표준용액을 사용하여 검정곡선을 작성하였고 정량분석을 수행하였다. 모든 검정곡선의 직선성은 0.99 이상으로 측정되었다.
하기 표 3에서는 정량한계 (LOQ), 머무른 시간 (retention time), 그리고 회수율 실험에 대한 분석방법 유효성 검증결과를 보여주고 있는데, 0.001 내지 0.05mg/kg범위의 정량한계, 5 내지 35분의 짧은 머무른 시간, 높은 회수율을 나타내어 150종의 환경호르몬을 동시에 분석할 수 있는 매우 탁월한 분석결과를 보여주고 있다.
[표 3]
Name LOQs (mg/kg) Retention time (min) Recovery　Yield
0.02mg/kg 0.08mg/kg 0.12mg/kg
Acetochlor 0.003 11.598 85 ± 5 91 ± 6 103 ± 4
Alachlor 0.002 11.847 85 ± 5 90 ± 7 102 ± 4
Aldrin 0.003 12.8 88 ± 6 84 ± 9 89 ± 5
Amitraz 0.007 24.742 81 ± 6 80 ± 10 108 ± 16
Benalaxyl 0.002 19.189 83 ± 3 91 ± 6 101 ± 3
BHC-alpha 0.002 9.63 92 ± 2 84 ± 5 93 ± 7
BHC-beta 0.002 10.136 77 ± 3 74 ± 7 90 ± 8
BHC-delta 0.002 10.75 82 ± 7 87 ± 7 97 ± 3
BHC-gamma 0.002 10.249 80 ± 3 75 ± 7 90 ± 7
Bifenox 0.02 22.927 84 ± 4 82 ± 12 83 ± 11
Bifenthrin 0.002 22.381 75 ± 5 87 ± 6 94 ± 3
Bromacil 0.015 12.462 75 ± 5 86 ± 9 99 ± 6
Bromopropylate 0.008 21.969 91 ± 5 82 ± 6 88 ± 3
Buprofezin 0.002 16.665 88 ± 4 98 ± 6 108 ± 3
Cadusafos 0.004 9.439 87 ± 3 83 ± 6 96 ± 6
Captafol 0.004 20.172 107 ± 4 85 ± 7 98 ± 4
Captan 0.02 14.298 81 ± 8 86 ± 11 85 ± 8
Carboxin 0.004 16.517 75 ± 5 86 ± 6 95 ± 2
Chinomethionat 0.008 14.786 85 ± 2 82 ± 7 90 ± 1
Chlofennapyl 0.002 17.386 79 ± 5 84 ± 7 91 ± 2
Chlofentezine 0.002 5.753 83 ± 9 85 ± 3 84 ± 14
Chlorfenvinphos 0.008 14.344 77 ± 5 89 ± 8 105 ± 8
Chlorobenzilate 0.002 17.665 80 ± 5 86 ± 6 92 ± 1
Chlorothalonil 0.03 10.857 75 ± 8 74 ± 10 81 ± 3
Chlorpropham 0.005 9.121 88 ± 4 81 ± 6 96 ± 7
Chlorpyrifos 0.002 12.998 78 ± 10 84 ± 8 95 ± 4
Chlorpyrifos-methyl 0.002 11.643 97 ± 5 92 ± 7 112 ± 5
Cycloprothrin 0.015 9.559 85 ± 11 83 ± 4 98 ± 11
Cyfluthrine 0.005 28.05 105 ± 13 75 ± 7 87 ± 7
Cyhalothrin 0.004 25.258 94 ± 5 84 ± 9 84 ± 5
Cypermethrin 0.015 28.555 75 ± 3 95 ± 8 87 ± 7
Cyproconazole 0.01 17.086 79 ± 4 82 ± 7 100 ± 5
Deltamethrin 0.04 30.91 78 ± 4 98 ± 6 88 ± 4
Diazinon 0.002 10.53 86 ± 3 84 ± 5 100 ± 8
Dichlofluanid 0.005 12.62 88 ± 4 84 ± 7 97 ± 4
Dichlorobenil 0.002 7.015 94 ± 8 85 ± 3 88 ± 7
Dichlovos 0.002 6.28 89 ± 4 91 ± 5 95 ± 5
Diclofop-methyl 0.004 20.458 79 ± 5 86 ± 7 92 ± 2
Dicloran 0.004 9.86 79 ± 7 77 ± 7 89 ± 7
Dicofol 0.003 13.071 76 ± 5 86 ± 8 103 ± 4
Dieldrin 0.002 16.211 86 ± 4 82 ± 7 82 ± 1
Diethofencarb 0.004 12.816 88 ± 5 90 ± 7 104 ± 5
Dimethoate 0.008 9.899 82 ± 4 83 ± 6 95 ± 7
Dimethylvinphos 0.004 12.96 85 ± 5 87 ± 8 99 ± 7
Diphenamid 0.004 13.576 88 ± 5 91 ± 7 103 ± 5
Diphenylamine 0.005 8.933 94 ± 2 84 ± 5 94 ± 7
Disulfoton 0.002 10.657 74 ± 7 85 ± 6 99 ± 4
Diuron 0.008 6.732 86 ± 11 84 ± 5 93 ± 8
Edifenphos 0.004 19.229 77 ± 3 80 ± 7 93 ± 7
Endosulfan-alpha 0.015 15.248 86 ± 3 86 ± 8 88 ± 2
Endosulfan-beta 0.015 17.447 84 ± 2 86 ± 9 88 ± 1
Endrine 0.003 17.041 71 ± 7 85 ± 9 91 ± 3
EPN 0.008 22 74 ± 5 83 ± 8 79 ± 12
Ethafluralin 0.003 9.171 87 ± 3 89 ± 5 92 ± 9
Ethion 0.003 18.225 98 ± 5 76 ± 7 90 ± 4
Ethoprophos 0.003 9 86 ± 5 83 ± 5 96 ± 6
Etoxazole 0.004 22.748 72 ± 5 93 ± 8 106 ± 4
Fenamidone 0.003 22.728 72 ± 4 95 ± 7 106 ± 4
Fenarimol 0.004 25.053 115 ± 4 93 ± 6 104 ± 4
Fenazaquin 0.004 22.759 79 ± 3 98 ± 6 110 ± 4
Fenitrothion 0.007 12.402 87 ± 4 89 ± 8 96 ± 8
Fenobucarb 0.002 8.801 94 ± 5 87 ± 4 100 ± 6
Fenoxycarb 0.003 22.13 81 ± 6 91 ± 6 106 ± 5
Fenpropathrin 0.004 22.632 79 ± 3 82 ± 7 96 ± 5
Fenthion 0.002 12.943 79 ± 5 88 ± 7 100 ± 4
Fipronil 0.004 14.425 95 ± 5 83 ± 7 90 ± 3
Flucythrinate 0.015 28.935 116 ± 12 105 ± 6 90 ± 8
Fludioxonil 0.015 16.567 71 ± 5 98 ± 7 107 ± 10
Flufenacet 0.004 13.129 82 ± 5 91 ± 8 104 ± 7
Flufenoxuron 0.003 10.939 83 ± 10 79 ± 12 85 ± 12
Fluquinconazole 0.004 27.12 78 ± 5 84 ± 6 105 ± 5
Flusilazole 0.002 16.714 87 ± 8 82 ± 6 99 ± 5
Flutolanil 0.005 15.982 75 ± 5 87 ± 6 98 ± 4
Fluvalinate 0.015 30.236 114 ± 5 104 ± 6 91 ± 6
Folpet 0.07 14.531 87 ± 6 73 ± 11 80 ± 3
Fosthiazate 0.004 13.611 94 ± 8 100 ± 10 95 ± 13
Furathiocarb 0.003 23.729 85 ± 8 78 ± 6 112 ± 8
Heptachlor 0.002 11.897 82 ± 9 92 ± 14 98 ± 6
Hexaconazole 0.002 15.818 101 ± 5 86 ± 6 96 ± 4
Hexaflumuron 0.005 7.479 79 ± 8 86 ± 6 92 ± 9
Imazalil 0.008 15.932 75 ± 5 87 ± 6 98 ± 4
Indoxacarb 0.004 7.139 88 ± 13 88 ± 6 99 ± 10
Iprobenfos 0.004 11.016 77 ± 6 100 ± 8 121 ± 8
Iprodione 0.01 21.654 72 ± 5 83 ± 7 92 ± 4
Isazophos 0.005 10.826 81 ± 5 89 ± 7 101 ± 4
Isophenphos 0.003 14.352 110 ± 5 86 ± 8 100 ± 6
Isoprothiolane 0.007 16.095 79 ± 5 88 ± 7 95 ± 3
Kresoxim-methyl 0.003 16.932 79 ± 10 86 ± 7 94 ± 2
Lufenuron 0.004 7.409 86 ± 6 82 ± 15 83 ± 8
Malathion 0.005 12.69 106 ± 5 85 ± 8 99 ± 6
Mecarbam 0.005 14.398 82 ± 4 85 ± 9 99 ± 6
Mepronil 0.005 18.584 74 ± 5 87 ± 7 102 ± 4
Metalaxyl 0.002 11.981 91 ± 6 92 ± 8 103 ± 5
Metconazole 0.004 22.697 117 ± 11 79 ± 7 103 ± 6
Methidathion 0.003 14.901 75 ± 5 88 ± 6 95 ± 2
Metobromuron 0.004 11.173 81 ± 7 76 ± 16 119 ± 12
Metolachlor 0.004 12.863 89 ± 5 92 ± 7 103 ± 5
Metribuzin 0.004 11.477 106 ± 5 82 ± 7 103 ± 7
Mevinphos 0.007 7.532 88 ± 3 83 ± 4 94 ± 5
Myclobutanil 0.002 16.597 117 ± 4 88 ± 6 102 ± 4
Nitrapyrin 0.005 7.721 76 ± 6 80 ± 4 89 ± 4
Nuarimol 0.008 20.074 72 ± 7 90 ± 7 104 ± 3
Omethoate 0.005 8.737 84 ± 6 87 ± 8 109 ± 10
op-DDD 0.002 16.543 80 ± 5 89 ± 6 94 ± 2
op-DDT 0.002 17.993 72 ± 3 82 ± 11 87 ± 5
Oxadiazone 0.002 16.483 84 ± 1 86 ± 7 91 ± 1
Oxadixyl 0.005 18.136 74 ± 6 91 ± 5 107 ± 4
Oxyfluorfen 0.008 16.732 93 ± 2 83 ± 7 81 ± 7
Pachlobutrazol 0.002 15.075 79 ± 6 89 ± 6 102 ± 7
Parathion 0.005 13.031 90 ± 4 89 ± 9 95 ± 8
Parathion-methyl 0.005 11.664 88 ± 4 87 ± 8 94 ± 10
Penconazole 0.002 14.077 112 ± 5 84 ± 8 104 ± 7
Pendimethalin 0.003 14.036 102 ± 4 89 ± 8 95 ± 8
Penthoate 0.003 14.454 70 ± 2 86 ± 7 93 ± 1
Permethrine 0.003 26.82 103 ± 2 84 ± 6 97 ± 4
Phorate 0.005 9.519 74 ± 2 81 ± 4 97 ± 6
Phosalone 0.008 23.754 111 ± 3 75 ± 8 92 ± 5
Phosmet 0.012 21.773 116 ± 3 75 ± 8 93 ± 6
Phosphamidone 0.004 11.432 70 ± 7 87 ± 8 116 ± 12
Pirimicarb 0.002 11.119 94 ± 7 94 ± 7 109 ± 7
Pirimiphos-ethyl 0.002 13.711 71 ± 4 87 ± 6 103 ± 6
Pirimiphos-methyl 0.002 12.438 78 ± 4 90 ± 7 104 ± 5
pp-DDD 0.002 17.823 75 ± 2 85 ± 7 92 ± 1
pp-DDE 0.002 16.221 86 ± 2 85 ± 6 89 ± 1
pp-DDT 0.002 19.537 84 ± 3 74 ± 8 87 ± 2
Procymidone 0.002 14.636 90 ± 5 89 ± 7 92 ± 1
Profenofos 0.008 16.108 76 ± 3 78 ± 7 97 ± 4
Prometryn 0.01 11.946 83 ± 5 90 ± 7 104 ± 6
Propanil 0.015 11.428 74 ± 6 85 ± 8 113 ± 5
Propargite 0.004 20.561 83 ± 5 98 ± 6 115 ± 5
Pyrazophos 0.015 25.112 80 ± 4 91 ± 7 103 ± 4
Pyridaben 0.002 26.953 115 ± 3 76 ± 7 97 ± 6
Pyridaphenthion 0.003 21.807 75 ± 6 77 ± 6 107 ± 7
Pyrimethanil 0.003 10.487 86 ± 3 81 ± 5 98 ± 8
Quintozene 0.01 10.349 79 ± 5 85 ± 14 95 ± 6
Sanmarton 0.02 30.205 112 ± 4 76 ± 6 94 ± 5
Simazine 0.01 9.921 82 ± 2 81 ± 5 101 ± 7
Tebuconazole 0.004 20.126 94 ± 9 101 ± 6 103 ± 6
Tebufenpyrad 0.004 22.769 79 ± 3 92 ± 6 103 ± 5
Teflubenzuron 0.005 6.337 84 ± 11 82 ± 10 86 ± 13
Terbufos 0.003 10.311 78 ± 3 83 ± 6 99 ± 7
Terbuthylazine 0.005 10.298 89 ± 2 84 ± 6 102 ± 8
Tetradifon 0.002 23.216 84 ± 5 88 ± 7 93 ± 2
Thiobencarb 0.002 12.671 84 ± 5 90 ± 7 102 ± 4
Thiometon 0.004 9.71 87 ± 3 81 ± 6 92 ± 5
Tolclofos-methyl 0.002 11.779 85 ± 6 90 ± 7 100 ± 3
Tolyfluanid 0.004 14.212 92 ± 4 82 ± 9 94 ± 6
Tralomethrine 0.015 17.567 79 ± 5 86 ± 6 92 ± 1
Triadimefon 0.002 13.099 71 ± 5 83 ± 8 96 ± 5
Triadimenol 0.002 14.687 79 ± 4 86 ± 6 101 ± 7
Triazophos 0.008 18.819 78 ± 4 82 ± 7 99 ± 5
Tricyclazole 0.01 16.049 97 ± 5 80 ± 8 95 ± 5
Triflumizole 0.004 14.795 85 ± 10 84 ± 6 83 ± 9
Trifluralin 0.01 9.298 80 ± 3 89 ± 4 94 ± 5
Vinclozoline 0.004 11.618 84 ± 5 91 ± 7 101 ± 4
Zoxamide 0.01 14.569 88 ± 5 82 ± 7 81 ± 2
도 1은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 시간분할 다중 내부표준물질을 이용한 환경호르몬의 다성분 동시 분석 공정도.
도 2는 농약의 추출용매에 따른 비교 결과.
도 3은 급속냉동 횟수에 따른 지방성분 제거효과 그래프.
도 4는 흡착제로 추출 횟수에 따른 방해물질 제거효과 그래프.
도 5는 농축건조 조건 설정을 위한 시간에 따른 용매증발량 변화 그래프.
도 6은 건조조건 설정을 위한 압력, 온도, 및 시간에 따른 건조효과 그래프.
도 7은 시료보호제 첨가여부에 따른 검출 세기 결과 그래프.
도 8은 농약성분인 캡탄의 분해에 따른 열 효과 그래프.
도 9는 잔류농약이 포함된 비교예 8의 TIC(Total Ion Chromatogram)그래프.
도 10a는 비교예 1의 방법으로 분석한 이소프로카브와 몰리네이트 두가지 농약의 TIC 분석결과.
도 10b는 실시예 1의 방법으로 분석한 이소프로카브와 몰리네이트 두가지 농약의 분석결과.

Claims (9)

  1. a) 환경호르몬 분석을 위한 시료와 Naphthalene-d8, Acenaphthene-d10, Phenanthrene-d10, Fluoranthene-d10, Fluorobenzene, Chrysene-d12, Perylene-d12, 1,2,-dichlorobenzene-d4 및 Pyrene-d10으로 이루어진 군에서 선택되는 6 내지 9종의 서로 상이한 시간분할 내부표준물질을 혼합하여 혼합시료를 준비하는 단계;
    b) 상기 혼합시료에 추출용매를 첨가하여 불순물이 제거된 시료를 추출하는 단계;
    c) 상기 추출된 시료를 0 내지 20℃에서 5 내지 100분간 냉각하는 단계;
    d) 상기 냉각 단계를 거친 시료에 NaCl, CaCl2, MgSO4, Na2SO3, (NH4)2SO4 및 KCl 로 이루어 진 군에서 선택된 물질을 첨가하여 침전물을 형성시키는 단계;
    e) 상기 침전물과 상등액을 분리하는 단계;
    f) 상기 상등액에 PSA(Primary Secondary Amine)를 첨가하여 상등액 내 분석이 불필요한 물질을 흡착시키는 단계;
    g) 상기 f)단계의 상등액 내 분석이 불필요한 물질이 흡착된 PSA와 f)단계의 상등액 내 PSA에 흡착되지 않은 나머지 물질인 분석이 필요한 분석물질을 분리하는 단계;
    h) 상기 분리된 분석물질에서 제거되지 않은 지방성분을 제거하기 위한 -30 내지 -10℃, 30분 내지 2시간 동안의 급속냉동단계;
    i) 상기 급속냉동단계에서 제거되지 않은 단백질 또는 비극성 비휘발성 물질을 제거하기 위하여 C18 흡착제 1-3g 및 MgSO4 0-1g을 첨가하여 0.5 내지 5분간 격렬하게 흔들어서 상기 흡착제에 흡착시키는 단계;
    j)상기 지방, 단백질 또는 비극성 비휘발성 물질이 흡착된 흡착제를 분리하는 단계;
    k) 상기 i) 및 j)단계에서 제거하지 못한 나머지 비극성 비휘발성 물질을 최종적으로 제거하기 위하여 헥산(hexane)을 이용한 분배단계;
    l) 분석물질이 분석기기 내부에 흡착을 방지하기 위하여 시료보호제를 첨가하는 단계;
    m) 상기 분석물질에 농축배율을 알기위한 표준물질로 기지량의 TPP(Triamine pyrophosphate)을 첨가하는 단계;
    n) 상기 TPP가 첨가된 분석물질을 진공 농축기에 넣고 건조하는 단계; 및
    o) 상기 건조된 분석물질을 희석용매로 희석 후 질량분석기(Mass spectrometer;MS)가 포함된 분석기로 분석하는 단계;
    를 포함하는 시간분할 다중 내부표준물질을 이용한 환경호르몬의 다성분 동시 분석법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 o)단계 이후 p) 상기 분석단계를 거쳐 분석된 분석물질을 질량분석 데이터베이스(AnAdB)를 이용하여 분석물질의 분리 검출단계;를 더 추가하는 것을 특징으로 하는 환경호르몬의 다성분 동시 분석법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 질량분석 데이터 베이스(AnAdB)는 o)단계 분석후의 중복피크가 100% 분리되지 않은 분석물질을 분리하는 것을 특징으로 하는 시간분할 다중 내부표준물질을 이용한 환경호르몬의 다성분 동시 분석법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 환경호르몬은 농약인 것을 특징으로 하는 환경호르몬의 다성분 동시 분석법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 환경호르몬 분석을 위한 시료는 1 내지 500종의 환경호르몬을 포함하는 토양, 물, 농축산물, 수산물, 식품 및 이들의 혼합물에서 선택된 시료인 시간분할 다중 내부표준물질을 이용한 환경호르몬의 다성분 동시 분석법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 추출용매 또는 희석용매는 아세토니트릴인 시간분할 다중 내부표준물질을 이용한 환경호르몬의 다성분 동시 분석법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 시료보호제는 소비톨(sobitol) 또는 굴로닉산(gulonic acid)인 것을 특 징으로 하는 시간분할 다중 내부표준물질을 이용한 환경호르몬의 다성분 동시 분석법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 g) 및 j)단계의 분리는 원심분리법인 시간분할 다중 내부표준물질을 이용한 환경호르몬의 다성분 동시 분석법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 o)단계의 질량분석기가 포함된 분석기는 GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometer) 또는 LCMSMS(Multiple Liquid Chromatography coupled with tandem Mass Spectrometer)인 시간분할 다중 내부표준물질을 이용한 환경호르몬의 다성분 동시 분석법.
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