KR100887882B1 - Suspension adapted cell for overproducing recombinant Human Erythropoietin using antisense LDH mRNA expression and MnSOD overexpression - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재조합 인간 EPO의 생산 증대를 위한 안티센스 젖산 탈수소효소 mRNA가 발현되고 MnSOD가 과발현된 부유성 세포주에 관한 것으로, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 안티센스 젖산탈수소효소(LDH) mRNA를 유도할 수 있는 유전자 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 망간 과산소 항돌연변이 효소 MnSOD 유전자를 포함하는 벡터에 의해 형질전환되어 인간 에리트로포이에틴을 고효율로 발현시키는 재조합 세포주를 제공한다. 본 발명의 상기 구성에 의하면, 배양액에 축적되는 젖산 생산이 억제되고 세포주의 항산화능이 높아져 세포주의 수명이 연장됨으로써 EPO 생산성을 증대시킬 수 있는 이점이 있다. 또한 부착성 세포를 무혈청 배지에서의 배양으로 부유성 세포로 적응시켜, 산업화를 위한 대량생산을 위해 스케일-업(scale-up)의 용이성을 가지는 이점이 있다.The present invention relates to a floating cell line in which antisense lactic acid dehydrogenase mRNA is expressed and MnSOD is overexpressed to increase production of recombinant human EPO, and induces antisense lactate dehydrogenase (LDH) mRNA having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. The present invention provides a recombinant cell line which is transformed by a vector containing a manganese peroxygen-antimutant enzyme MnSOD gene having a gene having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and a human erythropoietin with high efficiency. According to the above configuration of the present invention, the production of lactic acid accumulated in the culture medium is suppressed and the antioxidant capacity of the cell line is increased, thereby prolonging the life of the cell line, thereby increasing the EPO productivity. It is also advantageous to adapt adherent cells to floating cells by culturing in serum-free medium, having the ease of scale-up for mass production for industrialization.

에리트로포이에틴, 젖산 탈수소효소, 망간 과산소 항돌연변이 효소, LDH, MnSOD Erythropoietin, lactate dehydrogenase, manganese peroxygen mutant enzyme, LDH, MnSOD

Description

재조합 인간 ＥＰＯ의 생산 증대를 위한 안티센스 젖산 탈수소효소 ｍＲＮＡ가 발현되고 ＭｎＳＯＤ가 과발현된 부유성 세포주 {Suspension adapted cell for overproducing recombinant Human Erythropoietin using antisense LDH mRNA expression and MnSOD overexpression}Suspension adapted cell for overproducing recombinant Human Erythropoietin using antisense LDH mRNA expression and MnSOD overexpression for expressing antisense lactic acid dehydrogenase mRNA and overexpressing MSNOD to increase production of recombinant human EPO

도 1a는 본 발명에 사용된 CHO dhfr - 세포의 LDH 이소타입을 확인한 결과를 나타낸 도면.Figure 1a is a view showing the results confirming the LDH isotype of CHO dhfr - cells used in the present invention.

도 1b는 본 발명에 의한 CHO/dhf +/anti-LDH/EPO 세포주를 제작하기 위해 사용된 LDH DNA 염기서열을 나타낸 도면.Figure 1b is a diagram showing the LDH DNA sequence used to prepare a CHO / dhf + / anti-LDH / EPO cell line according to the present invention.

도 1c는 본 발명에 의한 CHO/dhf +/anti-LDH/EPO 세포주를 제작하기 위해 사용된 벡터의 모식도.Figure 1c is a schematic diagram of the vector used to prepare the CHO / dhf + / anti-LDH / EPO cell line according to the present invention.

도 1d는 본 발명에 의한 CHO/dhf +/anti-LDH 세포주에서 LDH 유전자의 번역 감소를 확인한 결과를 나타낸 도면.Figure 1d is a view showing the results confirmed the reduced translation of the LDH gene in the CHO / dhf + / anti-LDH cell line according to the present invention.

도 2는 본 발명에 의해 구축된 CHO/dhf +/anti-LDH/EPO 세포주를 나타낸 도면.Figure 2 shows the CHO / dhf + / anti-LDH / EPO cell line constructed by the present invention.

도 3은 본 발명에 의해 구축된 pZeoSV2(+)/MnSOD 벡터를 나타낸 도면.3 shows a pZeoSV2 (+) / MnSOD vector constructed according to the present invention.

도 4는 본 발명에 의한 CHO/dhf +/anti-LDH/EPO/MnSOD 세포주 내에서의 EPO 발현양을 웨스턴 블럿팅(Western blotting)을 통해 분석한 결과를 나타낸 도면.Figure 4 is a view showing the results of analysis by Western blotting (Western blotting) the amount of EPO expression in the CHO / dhf + / anti-LDH / EPO / MnSOD cell line according to the present invention.

도 5는 본 발명에 의한 CHO/dhf +/anti-LDH/EPO/MnSOD 세포주의 세포 밖으로 분비되는 EPO 발현양을 웨스턴 블럿팅(Western blotting)을 통해 분석한 결과를 나타낸 도면.5 is a diagram showing the results of analysis by Western blotting of the amount of EPO expression secreted out of cells of the CHO / dhf + / anti-LDH / EPO / MnSOD cell line according to the present invention.

도 6은 본 발명에 의한 CHO/dhf +/anti-LDH/EPO/MnSOD 세포주의 재조합 인간 EPO(recombinant human EPO)의 생물학적 활성을 분석한 결과를 나타낸 도면.Figure 6 shows the results of analyzing the biological activity of the recombinant human EPO (recombinant human EPO) of the CHO / dhf + / anti-LDH / EPO / MnSOD cell line according to the present invention.

본 발명은 재조합 인간 에리트로포이에틴(erythropoietin, 이하 ‘EPO’라고 약칭함)을 효율적으로 대량 생산하는 세포주에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 EPO 생산 증대를 위한 안티센스 젖산 탈수소효소 mRNA가 발현되고 MnSOD가 과발현된 세포주에 관한 것이다. The present invention relates to a cell line that efficiently mass-produces recombinant human erythropoietin (abbreviated as "EPO"). More specifically, the present invention relates to a cell line in which antisense lactic acid dehydrogenase mRNA is expressed and MnSOD is overexpressed for increasing EPO production.

EPO는 적혈구 생산에 관계하는 조혈촉진 호르몬으로, 골수 내에서 생성된 적아구를 적혈구로 분화시키는 당단백질이다. 이러한 EPO는 인체에서 신장의 상피세포에서 생성되므로, 신장이 이상이 있는 경우 EPO의 생성이 감소되어 극심한 빈혈을 초래하게 된다(Jacobson, L.O., Nature, 179;633, 1947). 따라서 EPO는 급, 만성 신부전환자의 빈혈증 치료제로 사용되며 나아가 항암 및 AIDS 보조치료제로도 쓰이는 등 그 적용범위가 점점 확대되는 추세에 있다.EPO is a hematopoietic stimulating hormone involved in erythrocyte production and is a glycoprotein that differentiates erythrocytes produced in bone marrow into erythrocytes. Since the EPO is produced in the epithelial cells of the kidney in the human body, when the kidney is abnormal, the production of EPO is reduced, resulting in severe anemia (Jacobson, L.O., Nature, 179; 633, 1947). Therefore, EPO is being used as an agent for treating anemia in sudden and chronic renal injuries, and also as an anticancer and AIDS adjuvant therapy.

EPO를 얻기 위해 초기에는 양의 혈장, 사람의 오줌 등으로부터 추출하는 방법이 시도되었으나, 대량생산이 어렵고 고 순도의 정제가 요구되는 단점이 있었다.Initially, a method of extracting from plasma of sheep, human urine, etc. was attempted to obtain EPO. However, mass production was difficult and high purity purification was required.

그 후, 유전공학적 방법의 발달로 인간 EPO를 분리하고 이를 벡터에 삽입시킨 후 포유동물 세포를 형질전환시킴으로서, 순수한 인간 EPO를 생산하는 방법이 개발되었다(Jacobs et al., Nature, 313, 806, 1985;Lin et al., Proc. Natl. Sci. U.S.A.82.7580, 1985).Subsequently, development of genetic engineering methods has resulted in the development of methods for producing pure human EPO by isolating human EPO, inserting it into a vector and transforming mammalian cells (Jacobs et al., Nature, 313, 806, Lin et al., Proc. Natl. Sci. USA 82.7580, 1985).

즉, 유용단백질 발현에 대표적으로 이용되는 동물세포인 CHO dhfr -(dihydrofolate reductase-deficient Chinese Hamster Ovary)를 이용하여 고부가가치의 유용 단백질인 EPO을 생산하는 동물 세포주의 개발을 통해 그 생산량을 증대시키고자 하였다.That is, the useful protein expression typically animal cells such as CHO dhfr is used as the - and using (dihydrofolate reductase-deficient Chinese Hamster Ovary ) through a useful development of animal cell lines to produce the protein of EPO in the value-added increase in the production and chairs It was.

상기 형질전환된 CHO 세포는 메토트렉세이트(MTX)를 첨가한 배지에서 단계적으로 세포를 적응시켜 EPO 유전자를 증폭시킴으로서 EPO의 생산량을 증가시키고자 하였으나(Malik et al., DNA and Cell Biol., 11, 453, 1992), 이러한 방법은 오랜 배양기간이 필요하고, 생산비용이 높아지는 문제점이 있었다. The transformed CHO cells tried to increase the production of EPO by amplifying the EPO gene by adapting the cells stepwise in the medium to which methotrexate (MTX) was added (Malik et al., DNA and Cell Biol., 11, 453). , 1992), this method requires a long incubation period, there is a problem that the production cost is high.

나아가 동물세포주의 장기배양 시에 나타나는 여러 가지 문제점들은 EPO의 지속적인 생산을 어렵게 한다. 이런 문제점들은 세포 간 접촉 저해(cell-to-cell contact inhibition), pH의 저하, 산화적 스트레스, 독성이 있는 부산물 (암모니아, 락테이트), 저산소증(hypoxia)과 같은 것들에 의해서 야기된다. Furthermore, various problems in the long-term culture of animal cell lines make it difficult to continuously produce EPO. These problems are caused by things like cell-to-cell contact inhibition, lowering pH, oxidative stress, toxic by-products (ammonia, lactate), hypoxia, and so on.

이런 문제점들을 해결하기 위해서, 종래에는 새로운 배양액으로 교체하여 주거나 교반(agitation) 혹은 산소의 인위적인 공급으로 이를 극복하려는 시도가 이루어졌었다. 또한 에너지로 이용되는 주된 대사산물을 달리함으로써 세포의 장기배양 시에 야기될 수 있는 문제점을 일부 극복하려는 시도가 진행되었었다. In order to solve these problems, in the past, attempts have been made to overcome this by replacing with a new culture or by agitation or artificial supply of oxygen. Attempts have also been made to overcome some of the problems caused by long-term culture of cells by varying the main metabolites used for energy.

그러나 이와 같은 방법으로 문제점들을 해결하는 것은 유용단백질인 EPO를 생산하는 데 한계가 있고 이런 문제점들을 근본적으로 해결할 수 없었다. 본 발명자들은 상기 문제점들을 근본적으로 해결하기 위해 세포사멸 저항성 세포의 개발을 시도하게 되었다. 즉, 유용 단백질인 EPO를 생산하는 동물세포의 대량 배양시 배양액의 산성화 유도로 생산성을 감소시키는 젖산의 생성을 억제하고, 모든 호기성 생물의 대사과정에서 생성되는 과산화음이온(superoxide radical anion), 수산화기(hydroxyl radical), 과산화수소(hydogen peroxide) 등을 포함하는 활성산소종 (Reactive Oxygen Species, ROS)에 의한 손상이나 생산 세포주의 사멸을 억제할 수 있는 세포주 개발을 시도하게 되었다. However, solving the problems in this way is limited in producing EPO, a useful protein, and these problems cannot be fundamentally solved. The present inventors have attempted to develop apoptosis resistant cells to fundamentally solve the above problems. In other words, during mass cultivation of animal cells producing useful protein EPO, it inhibits the production of lactic acid, which reduces productivity by inducing acidification of culture medium, and superoxide radical anion and hydroxyl group produced during metabolic processes of all aerobic organisms. Attempts have been made to develop cell lines that can inhibit damage caused by Reactive Oxygen Species (ROS) or the death of production cell lines, including hydroxyl radicals and hydrogen peroxide.

한편, 동물세포들은 배지 내에서 부유시키거나 담체에 부착시켜 배양할 수 있다. 부유성 세포는 세포가 단독으로 배지 중에 부유한 상태에서 증식할 수 있으나, 부착성 세포인 경우 고체 표면에 부착해야만 증식이 가능하다. 따라서 스케일-업(scale-up)할 때 단위 부피당 최고의 세포밀도를 유지하기 위해 보통 부유성 세포를 주로 이용한다. 일반적으로 생물의약품의 생산에 많이 사용되는 CHO 세포는 원래 부착성 세포이지만 부유성 세포로 적응시킬 수 있다. 부착성 세포를 부유성 세포로 적응시켰을 경우 스케일-업(scale-up)의 용이성과 고밀도의 세포농도를 유 지할 수 있는 장점이 있다. On the other hand, animal cells can be cultured by floating in the medium or attached to the carrier. Suspended cells can proliferate in a state where the cells are suspended in the medium alone, but in the case of adherent cells, they can proliferate only when they adhere to a solid surface. Therefore, floating cells are usually used mainly to maintain the highest cell density per unit volume when scale-up. Generally, CHO cells, which are widely used for the production of biopharmaceuticals, are originally adherent cells but can be adapted to floating cells. Adaptation of adherent cells to floating cells has the advantage of maintaining scale density and ease of scale-up.

본 발명은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 EPO를 생산하는 동물세포의 대량 배양시 배양액의 산성화 유도로 생산성을 감소시키는 젖산의 생성을 억제할 수 있는 유전자 및 활성산소종을 제거할 수 있는 항산화 효소의 유전자를 포함하여 EPO 생산성이 증대된 세포주를 제공하는 것이다. The present invention has been made to solve the problems of the prior art, an object of the present invention is a gene and activity that can inhibit the production of lactic acid to reduce the productivity by inducing acidification of the culture medium in the mass culture of animal cells producing EPO It provides a cell line with enhanced EPO productivity, including genes of antioxidant enzymes capable of removing oxygen species.

본 발명은 또한 부착성 세포인 CHO 세포를 무혈청 배지에서의 배양으로 부유성 세포로 적응시켜, 산업화를 위한 대량생산을 위해 스케일-업(scale-up)의 용이성을 가지는 부유성 CHO 세포를 개발, 제공하는 것을 목적으로 한다.The present invention also adapts CHO cells, which are adherent cells, to floating cells by culturing in serum-free medium to develop floating CHO cells with ease of scale-up for mass production for industrialization. It aims to provide.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 세포내 젖산을 생산하는 효소인 젖산 탈수소효소(Lactate dehydrogenase, 이하 ‘LDH’라고 약칭함)의 안티센스 mRNA가 유도되고 항산화 효소인 망간 과산소 항돌연변이 효소(Manganese Superoxide dismutase, 이하 ‘MnSOD’라고 약칭함) 유전자를 CHO 세포주에 도입함을 통하여 배양액에 축적되는 젖산 생산이 억제되고 세포주의 항산화능이 높아져 세포주의 수명이 연장됨으로써 EPO 생산성이 증대되는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.In order to achieve the above object, the present inventors induced antisense mRNA of lactate dehydrogenase, which is an enzyme producing intracellular lactic acid (hereinafter referred to as 'LDH'), and an antioxidant enzyme, manganese peroxyantimutant enzyme (Manganese). By introducing a superoxide dismutase (hereinafter abbreviated as 'MnSOD') gene into the CHO cell line, the production of lactic acid accumulated in the culture medium is suppressed and the antioxidant capacity of the cell line is increased, thereby prolonging the life of the cell line, thereby confirming that the EPO productivity is increased. To complete.

따라서 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 안티센스 젖산 탈수소효소(LDH) mRNA를 유도할 수 있는 유전자 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 망간 과산소 항돌연변이 효소 MnSOD 유전자를 포함하는 벡터 및 이에 의해 형질전환되어 인간 에리트로포이에틴을 고효율로 발현시키는 재조합 세포주를 제공한다.Accordingly, the present invention provides a vector comprising a gene capable of inducing antisense lactic acid dehydrogenase (LDH) mRNA having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a manganese peroxyantimutant enzyme MnSOD gene having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and thereby Transformed to provide a recombinant cell line that expresses human erythropoietin with high efficiency.

바람직하게는, 상기 벡터는 DHFR(dihydrofolate reductase) 유전자를 더 포함하며, 상기 세포주는 CHO 세포주이며, 무혈청 배지에서 배양된 부유성 세포주이다.Preferably, the vector further comprises a dihydrofolate reductase (DHFR) gene, wherein the cell line is a CHO cell line and is a floating cell line cultured in serum-free medium.

또한 본 발명은 상기 재조합 세포주를 배양하는 단계를 포함하는 인간 에리트로포이에틴을 제조하는 방법을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a method for producing human erythropoietin comprising the step of culturing the recombinant cell line.

이하, 본 발명의 구성을 상세하게 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the configuration of the present invention in detail.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 안티센스 젖산 탈수소효소(LDH) mRNA를 유도할 수 있는 유전자, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 망간 과산소 항돌연변이 효소 MnSOD 유전자 및 DHFR 유전자를 포함하는 벡터에 의해 형질전환되어 인간 에리트로포이에틴을 고효율로 발현시키는 재조합 세포주를 제공한다.The present invention relates to a vector comprising a gene capable of inducing antisense lactic acid dehydrogenase (LDH) mRNA having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, a manganese peroxygen mutant enzyme MnSOD gene having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and a DHFR gene. And transformed to provide a recombinant cell line that expresses human erythropoietin with high efficiency.

본 발명의 벡터로 형질전환되어 인간 에리트로포이에틴을 생성하는 능력을 갖는 재조합 세포주로는 BHK, COS-7, CHO 등을 예로 들 수 있고, CHO가 바람직하다.Recombinant cell lines having the ability to be transformed with the vector of the present invention to produce human erythropoietin include BHK, COS-7, CHO, and the like, with CHO being preferred.

본 발명에서는 부착성 세포인 CHO 세포를 무혈청 배지에서의 배양으로 부유성 세포로 적응시켜, 산업화를 위한 대량생산을 위해 스케일-업(scale-up)의 용이성을 가지는 부유성 CHO 세포주를 제공한다.In the present invention, CHO cells, which are adherent cells, are adapted to floating cells by culturing in serum-free medium, thereby providing a floating CHO cell line having the ease of scale-up for mass production for industrialization. .

특정 유전자의 발현 억제는 안티센스 올리고머를 배아나 세포내로 직접 도입하는 방법을 이용하는데, 이 방법은 일시적인 효과를 볼 수는 있지만 연속적인 효 과를 기대하기는 어렵다. 배아나 세포내로 도입된 올리고머는 분해될 뿐만 아니라 세포분열에 따른 딸세포로의 전달이 이루어지지 않는다. 따라서 특정 유전자의 발현을 억제하기 위해서는 매번 안티센스 올리고머를 도입하여야 하고 이 올리고머를 새로이 고안하여야 한다. 이런 결과는 경제성 및 시간의 효율성이 떨어지는 결과를 초래한다. 또한, 박테리아의 발현 벡터에 비해서 동물세포에 적용되는 벡터의 유전자 발현은 매우 낮다. 박테리아는 특정 유전자를 포함한 플라스미드를 도입하였을 때 세포내에서 복제함으로써 유전자의 카피 수가 증가될 수 있고, 세포분열 시에 세포막을 통해서 딸세포로 전달된다. 그러나 동물 세포주에서 특정 유전자의 발현에 이용되는 벡터는 박테리아와 같이 플라스미드의 복제나 딸세포로의 전달이 이루어지지 않는다. 또한 동물세포에 이용되는 벡터는 박테리아가 이용하는 프로모터 보다 훨씬 효율이 떨어진다. Inhibition of expression of specific genes involves the direct introduction of antisense oligomers into embryos or cells, which may have a temporary effect but cannot be expected to be continuous. Oligomers introduced into embryos or cells are not only degraded but also delivered to daughter cells due to cell division. Therefore, in order to suppress the expression of a specific gene, an antisense oligomer must be introduced every time and this oligomer must be newly designed. This results in a decrease in economy and time efficiency. In addition, gene expression of vectors applied to animal cells is very low compared to bacterial expression vectors. Bacteria can increase the copy number of a gene by replicating it intracellularly when a plasmid containing a specific gene is introduced, and is transferred to the daughter cell through the cell membrane during cell division. However, vectors used for expression of specific genes in animal cell lines do not replicate plasmids or transfer to daughter cells like bacteria. Vectors used in animal cells are also much less efficient than promoters used by bacteria.

따라서 본 발명자들은 동물세포에서의 유전자의 카피 수를 증가시키기 위해 DHFR 유전자를 도입하였고, 세포내의 젖산 생성의 감소를 위해 안티센스 LDH mRNA를 유도할 수 있는 유전자를 융합하여 도입하는 방법을 사용하였다. 뿐만 아니라 세포 내에서 자발적으로 생성될 수 있는 활성산소종을 제거할 수 있는 항산화 효소인 망간 과산소 항돌연변이 효소(MnSOD) 유전자를 도입함으로서 anti-LDH와 MnSOD 서로 간의 상승작용을 이용한 항산화 능이 높은 세포주를 개발하게 되었다.Therefore, the present inventors introduced the DHFR gene to increase the copy number of genes in animal cells, and used a method of fusion introducing a gene capable of inducing antisense LDH mRNA to reduce lactic acid production in cells. In addition, by introducing the manganese peroxygen mutant enzyme (MnSOD) gene, an antioxidant enzyme that can remove free radical species that can be spontaneously generated in cells, a cell line with high antioxidant capacity using synergy between anti-LDH and MnSOD. Was developed.

본 발명에서는 먼저 DHFR 유전자 및 LDH 안티센스 mRNA의 발현을 유도할 수 있는 유전자(서열번호 1; GenBank accession #; AF344174)를 포함하는 LDH 안티센스 mRNA의 발현을 유도하여 락테이트 생성 감소로 세포내 독성이 억제된 동물 세포 주인 CHO/dhfr +/anti-LDH(도 1c 참조)를 제작한다.In the present invention, first, the expression of the LDH antisense mRNA including the gene capable of inducing the expression of the DHFR gene and the LDH antisense mRNA (SEQ ID NO: 1; GenBank accession #; AF344174) induces the inhibition of intracellular toxicity by reducing lactate production. The animal cell host CHO / dhfr + / anti-LDH (see FIG. 1C) was constructed.

다음, 인간 EPO 유전자를 서브클로닝하기 위해서 pCIneo (Promega) 벡터의 XhoI 와 XbaI 제한 효소로 자른 부위를 EPO cDNA의 XhoI 와 XbaI 부위의 끝과 연결시키고, 이로 인해 얻어진 플라스미드 pCIneo/EPO를 상기 CHO/dhfr +/anti-LDH 세포주에 도입시켜 CHO/dhfr +/anti-LDH/EPO(도 2) 세포주를 얻을 수 있다.Next, in order to subclones the human EPO gene, the sites cut by the XhoI and XbaI restriction enzymes of the pCIneo (Promega) vector were linked to the ends of the XhoI and XbaI sites of the EPO cDNA, and the resulting plasmid pCIneo / EPO was linked to the CHO / dhfr. It can be introduced into the + / anti-LDH cell line to obtain a CHO / dhfr + / anti-LDH / EPO (FIG. 2) cell line.

상기 망간 과산소 항돌연변이 효소 MnSOD 유전자를 포함하는 벡터는 EcoRI으로 자른 1.0kb 이하의 인간 MnSOD 유전자(ATCC #59946)를 EcoRI로 자른 pZeoSV2(+) (Invitrogen)벡터에 클로닝하여 얻을 수 있고 이렇게 얻어진 서열번호 2의 염기서열을 갖는 플라스미드는 도 3에 나타나 있다(pZeoSV2(+)/MnSOD).The vector containing the manganese peroxyantimutant enzyme MnSOD gene can be obtained by cloning a human MnSOD gene (ATCC # 59946) of 1.0 kb or less cut by EcoRI into a pZeoSV2 (+) (Invitrogen) vector cut by Eco RI. The plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is shown in FIG. 3 (pZeoSV2 (+) / MnSOD).

앞서 구축된 CHO/dhfr +/anti-LDH/EPO 세포주에 lipofectamine system (LipofectAmineTM 2000 reagent)(Gibco-BRL)을 이용하여 상기 pZeoSV2(+)/MnSOD를 도입하여 CHO/dhfr +/anti-LDH/EPO/MnSOD 세포주를 구축할 수 있다(기탁번호 KCLRF-BP-00155).Using the lipofectamine system (LipofectAmine TM 2000 reagent) (Gibco-BRL) in the above construction CHO / dhfr + / anti-LDH / EPO cell line by introducing the pZeoSV2 (+) / MnSOD CHO / dhfr + / anti-LDH / EPO / MnSOD cell lines can be constructed (Accession No. KCLRF-BP-00155).

본 발명에 의해 LDH 안티센스 mRNA의 발현을 유도할 수 있는 유전자와 MnSOD 유전자가 포함된 CHO/dhf +/anti-LDH/EPO/MnSOD 세포주는 세포 내에서의 EPO 발현양 및 세포 밖으로 분비되는 EPO 발현양이 CHO/dhfr -/EPO, CHO/dhfr -/pZeoSV2, CHO/dhf +/anti-LDH/EPO에 비해 증대된다(도 4 및 도 5 참조).The CHO / dhf + / anti-LDH / EPO / MnSOD cell line containing the gene capable of inducing the expression of LDH antisense mRNA and the MnSOD gene according to the present invention and the amount of EPO expressed in and out of the cell It is increased relative to / pZeoSV2, CHO / dhf + / anti-LDH / EPO ( see Fig. 4 and 5) the CHO / dhfr - / EPO, CHO / dhfr.

또한, 본 발명에 의한 CHO/dhf +/anti-LDH/EPO/MnSOD 세포주는 CHO/dhfr - /EPO, CHO/dhfr -/pZeoSV2, CHO/dhf +/anti-LDH/EPO, CHO/dhfr -/EPO/MnSOD에 비해 EPO의 생물학적 활성도 우수한 것으로 나타났다(도 6 참조).In addition, CHO / dhf + / anti- LDH / EPO / MnSOD cell line according to the invention is CHO / dhfr - / EPO, CHO / dhfr - / pZeoSV2, CHO / dhf + / anti-LDH / EPO, CHO / dhfr - / The biological activity of EPO was also shown to be superior to that of EPO / MnSOD (see FIG. 6).

따라서 본 발명에 의한 LDH 안티센스 mRNA의 발현을 유도할 수 있는 유전자와 MnSOD 유전자가 포함된 CHO/dhf +/anti-LDH/EPO/MnSOD 세포주를 이용하면 인간 EPO 제조방법에 있어서 EPO를 효율적으로 대량 생산할 수 있다.Therefore, by using the CHO / dhf + / anti-LDH / EPO / MnSOD cell line containing the gene capable of inducing the expression of LDH antisense mRNA and the MnSOD gene according to the present invention, EPO can be efficiently mass-produced in human EPO preparation method. Can be.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it is to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. Will be self-evident.

실시예Example 1.  One. LDHLDH 안티센스Antisense mRNAmRNA 의 발현을 유도할 수 있는 유전자와 Genes that can induce the expression of MnSODMnSOD 유전자가 포함된  Gene CHOCHO /Of dhfrdhfr ++ /Of antianti -- LDHLDH /Of EPOEPO /Of MnSODMnSOD 세포주의 구축 Cell line construction

먼저, LDH 안티센스 mRNA의 발현을 유도하여 락테이트 생성 감소로 세포내 독성이 억제된 동물 세포주인 CHO/dhfr +/anti-LDH(도 1c 참조)를 제작한다(대한민국 특허출원 제10-2002-0003820 참조).First, the production of CHO / dhfr + / anti-LDH (see FIG. 1C), an animal cell line in which intracellular toxicity is suppressed by reducing lactate production by inducing the expression of LDH antisense mRNA (see Korean Patent Application No. 10-2002-0003820) Reference).

보다 구체적으로는 살펴보면 다음과 같다. 젖산을 생성하는 LDH는 A와 B의 두 가지의 단량체가 조합하여 이루어진 네개의 단량체로 구성된 효소이다. A 단량체는 주로 피루브산으로부터 젖산을 생성하는 기능을 가지고 B 단량체는 젖산을 피 루브산으로 전환하는 활성을 가진다. CHO 세포주에 존재하는 LDH 이소타입을 확인하기 위해 이 세포주로부터 획득한 세포질 단백질의 1 μg을 시그마 회사 (Sigma, U.S.A)로부터 구입한 LDH 진단 키트 (카탈로그 넘버; 705-A)에 명시된 절차에 따라 전 처리된 아가로스 (agarose) 겔에 적재한 후 전기이동으로 전개하였다. 전개된 아가로스 겔은 다시 LDH 진단키트의 절차에 따라 수행함으로써 발색하였다. 본 발명에 사용한 CHO dhfr - 세포의 LDH 이소타입은 A2B2와 A3B의 중간체였다 (도 1a). 이 세포에 존재하는 LDH 이소타입의 cDNA(도 1b)은 지금까지 다른 종에서 알려진 LDH DNA 염기서열을 바탕으로 제작한 올리고머 (P1; 5´-TCA AGG ACC AGC TGA TTG TGA AAT-3´; 서열번호 3, P2; 5´-CAG GAG TCA GTG TCA CCT TCA CA-3´; 서열번호 4)를 이용하여 RT-PCR 방법으로 얻었고, 이 cDNA의 염기서열을 분석하여 LDH 이소타입임을 결정하였다. RT-PCR로 획득한 LDH cDNA의 부분적인 염기서열은 GenBank에 등록된 accession #; AF344174이고, 본 명세서에서는 서열번호 1을 부여하였다. More specifically, look as follows. LDH, which produces lactic acid, is an enzyme consisting of four monomers consisting of two monomers, A and B. A monomer mainly has the function of producing lactic acid from pyruvic acid and B monomer has the activity of converting lactic acid to pyruvic acid. To identify LDH isotypes present in the CHO cell line, 1 μg of cytoplasmic protein obtained from this cell line was prepared according to the procedure specified in the LDH diagnostic kit (catalog number; 705-A) purchased from Sigma, USA. After loading on the treated agarose (agarose) gel was developed by electrophoresis. The developed agarose gel was again developed by following the procedure of LDH diagnostic kit. LDH isotypes of CHO dhfr - cells used in the present invention were intermediates of A 2 B 2 and A 3 B (FIG. 1A). The cDNA of the LDH isotype present in these cells (FIG. 1B) is an oligomer (P1; 5'-TCA AGG ACC AGC TGA TTG TGA AAT-3 '; No. 3, P2; 5′-CAG GAG TCA GTG TCA CCT TCA CA-3 ′; SEQ ID NO: 4) was obtained by RT-PCR method, and the base sequence of this cDNA was analyzed to determine that it is an LDH isotype. Partial sequencing of the LDH cDNA obtained by RT-PCR may include accession # registered in GenBank; AF344174, which is assigned SEQ ID NO: 1.

이 LDH cDNA를 pCR 2.1 클로닝 벡터로 도입한 후 이 유전자에 대한 제한효소 지도를 작성하였다. 유전자의 카피 수를 증가시킬 수 있고 안티센스 RNA를 유도할 수 있는 동물용 벡터를 구축하기 위해서 먼저 pSV2/dhfr (ATCC 37146)로부터 HindIII와 BglII 제한효소로 절단한 후 얻은 DHFR 유전자는 HindIII와 BamHI으로 절단한 pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen) 내로 프로모터 작동방향과 일치하게 도입하였다(도 1c). LDH의 5‘ 부위의 약 400 bp에 해당되는 안티센스 LDH mRNA가 유도될 수 있는 융합 유전자는 pCR 2.1에 LDH 유전자가 클로닝된 벡터로부터 EcoRV 제한효 소로 절단한 후 위의 실험 절차로 획득한 pcDNA 3.1(+)/dhfr 벡터를 EcoRV로 절단하여 클로닝하였다. LDH 유전자의 번역 감소는 원래 존재하는 LDH mRNA와 도입된 안티센스 LDH mRNA 사이의 안정화된 결합내에 위치한 P1과 P2 올리고머로 RT-PCR을 수행하여 확인하였다(도 1d).This LDH cDNA was introduced into the pCR 2.1 cloning vector and a restriction map for this gene was prepared. To construct an animal vector capable of increasing the number of copies of the gene and inducing antisense RNA, the DHFR gene obtained after digestion with HindIII and BglII restriction enzymes from pSV2 / dhfr (ATCC 37146) was first digested with HindIII and BamHI. Into pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen) was introduced in accordance with the promoter operating direction (Fig. 1c). The fusion gene from which the antisense LDH mRNA corresponding to about 400 bp of the 5 'region of the LDH can be induced was digested with EcoRV restriction enzyme from the vector cloned with the LDH gene in pCR 2.1 and then obtained by pcDNA 3.1 (see above). +) / dhfr vectors were cloned by cutting with EcoRV. The decrease in translation of the LDH gene was confirmed by performing RT-PCR with P1 and P2 oligomers located within a stabilized bond between the originally present LDH mRNA and the introduced antisense LDH mRNA (FIG. 1D).

다음, 인간 EPO 유전자(고려대학교 김익환 세포배양공학연구실)를 서브클로닝하기 위해서 pCIneo (Promega) 벡터의 XhoI 와 XbaI 제한 효소로 자른 부위를 EPO cDNA의 XhoI 와 XbaI 부위의 끝과 연결시켰다. 이로 인해 얻어진 플라스미드 pCIneo/EPO를 상기 제작된 CHO/dhfr +/anti-LDH 세포주에 도입시켰고 이를 CHO/dhfr+/anti-LDH/EPO(도 2)라 명칭하였다.Next, in order to subclones the human EPO gene (Kim Ik-hwan Cell Culture Engineering Laboratory, Korea University), the sites cut by the XhoI and XbaI restriction enzymes of the pCIneo (Promega) vector were linked to the ends of the XhoI and XbaI sites of the EPO cDNA. The plasmid pCIneo / EPO thus obtained was introduced into the prepared CHO / dhfr + / anti-LDH cell line, which was named CHO / dhfr + / anti-LDH / EPO (Fig. 2).

또한 인간 MnSOD 유전자가 도입된 세포주를 구축하기 위하여 phMnSOD4 벡터(ATCC #59946)로부터 EcoRI으로 자른 1.0kb 이하의 인간 MnSOD 유전자를 EcoRI로 자른 pZeoSV2(+) (Invitrogen)벡터에 클로닝하였다. 이로 인해 얻어진 플라스미드는 pZeoSV2(+)/MnSOD (도 3)라고 명칭하였다. 상기 플라스미드에 포함된 MnSOD 유전자는 Genbank의 Y00985 염기서열 중 cDNA 부분으로 서열번호 2로 나타내었다.In addition, in order to construct a cell line into which the human MnSOD gene was introduced, a human MnSOD gene of 1.0 kb or less cut by EcoRI from a phMnSOD4 vector (ATCC # 59946) was cloned into a pZeoSV2 (+) (Invitrogen) vector cut by Eco RI. The resulting plasmid was named pZeoSV2 (+) / MnSOD (FIG. 3). The MnSOD gene included in the plasmid is represented by SEQ ID NO: 2 as a cDNA portion of the Y00985 nucleotide sequence of Genbank.

앞서 구축된 CHO/dhfr +/anti-LDH/EPO 세포주에 lipofectamine system (LipofectAmineTM 2000 reagent)(Gibco-BRL)을 이용하여 pZeoSV2(+)/MnSOD를 도입하여 CHO/dhfr +/anti-LDH/EPO/MnSOD 세포주를 구축하였고 G418과 제오신(Zeocin)으로 선별(selection)하였다. 상기 구축된 CHO/dhfr +/anti-LDH/EPO/MnSOD 세포주는 한국세포주연구재단(KCLRF: Korean Cell Line Research Foundation)에 2007년 4월 12일 자로 기탁되어 기탁번호 KCLRF-BP-00155를 부여받았다. In the above construction CHO / dhfr + / anti-LDH / EPO cell line lipofectamine system (LipofectAmine TM 2000 reagent) using (Gibco-BRL) pZeoSV2 (+ ) / the introduction of MnSOD CHO / dhfr + / anti-LDH / EPO / MnSOD cell line was constructed and selected with G418 and Zeocin. The constructed CHO / dhfr + / anti-LDH / EPO / MnSOD cell line was deposited with the Korean Cell Line Research Foundation (KCLRF) on April 12, 2007 and was given accession number KCLRF-BP-00155. .

한편, 비교실험을 위해 CHO/dhfr -/EPO/MnSOD 세포주(기탁번호 KCLRF-BP-00156)를 구축하였다. 더욱 상세하게는 상기에서 얻어진 플라스미드 pCIneo/EPO를 CHO dhfr - 세포주(ATCC #CRL-9096)에 도입시켜 CHO/dhfr -/EPO를 제작하고, 상기 CHO/dhfr -/EPO 세포주에 lipofectamine system (LipofectAmineTM 2000 reagent)(Gibco-BRL)을 이용하여 pZeoSV2(+)/MnSOD를 도입하여 CHO/dhfr -/EPO/MnSOD 세포주를 구축하였고 제오신(Zeocin)으로 선별(selection)하였다. Meanwhile, a CHO / dhfr − / EPO / MnSOD cell line (Accession No. KCLRF-BP-00156) was constructed for the comparative experiment. More specifically, the plasmid pCIneo / EPO obtained in the CHO dhfr - cell line (ATCC # CRL-9096) was introduced into the CHO / dhfr - / produced EPO, and the CHO / dhfr - on / EPO cell line lipofectamine system (LipofectAmine TM PZeoSV2 (+) / MnSOD was introduced using 2000 reagent) (Gibco-BRL) to construct a CHO / dhfr − / EPO / MnSOD cell line and selected with Zeocin.

실시예Example 2.  2. 웨스턴Weston 블럿Blot 분석법을 통한  Through analysis CHOCHO /Of dhfrdhfr +/+ / antianti -- LDHLDH /Of EPOEPO /Of MnSODMnSOD 세포주의 분석 Cell line analysis

EPO는 34 ~ 37kda의 당단백질로서 세포내에서 만들어지고 세포 밖으로 분비된다. 실시예 1에서 구축된 본 발명에 의한 CHO/dhfr+/anti-LDH/EPO/MnSOD 세포주에서 세포내에 존재하는 EPO의 양과 세포 밖으로 분비되는 EPO의 양을 다른 세포주와 비교 분석하였다.EPO is a 34-37 kda glycoprotein that is made intracellularly and secreted out of the cell. In the CHO / dhfr + / anti-LDH / EPO / MnSOD cell line according to the present invention constructed in Example 1, the amount of EPO present in the cell and the amount of EPO secreted out of the cell were compared with other cell lines.

보다 상세하게는 부착성 세포를 무혈청 배지인 CHO S-SFM Ⅱ(Gibco-BRL)에서의 배양으로 부유성 세포로 적응시켰고, 각 세포주는 얼음처럼 차가운(ice-cold) PBS로 두 번 세척(washing)한 후 각 세포주를 용해버퍼(lysis buffer, 10mM HEPES (pH 7.9), 10mM KCl, 0.1mN EDTA, 0.1mM EGTA, 10% NP-40)로 용해시킨 후, 브래드 포드(Bradford) 시약을 이용한 단백질 정량을 수행하였다.More specifically, adherent cells were adapted to floating cells by culturing in serum-free medium CHO S-SFM II (Gibco-BRL), and each cell line was washed twice with ice-cold PBS ( After washing, each cell line was lysed with a lysis buffer (10 mM HEPES (pH 7.9), 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 10% NP-40), followed by Bradford reagent. Protein quantitation was performed.

단백질 정량 후 10μg을 취하여 10% SDS-PAGE 겔에서 90V에서 20분, 120V에서 1시간 20분 러닝(running) 하고, EPO에 특이성을 지니는 토끼 다항체 항-EPO 항체(rabbit polyclonal anti-EPO antibody, Santa cruz)로 웨스턴 블럿을 한 후 EPO의 양을 비교해 보았다. After quantification of the protein, 10 μg was taken and run for 20 minutes at 90V and 1 hour 20 minutes at 120V on a 10% SDS-PAGE gel, and a rabbit polyclonal anti-EPO antibody having specificity for EPO. Western blotting with Santa cruz) was used to compare the amount of EPO.

상기 웨스턴 블럿(Western blot) 분석 후 결과는 도 4에 나타냈다. 도 4에서 1열은 CHO/dhfr -/EPO 세포주, 2열은 CHO/dhfr -/pZeoSV2 세포주, 3열은 CHO/dhfr +/anti-LDH/EPO 세포주, 4열은 CHO/dhfr -/EPO/MnSOD 세포주, 5열은 CHO/dhfr +/EPO/anti-LDH/MnSOD 세포주를 나타낸다. 각 세포주의 단백질 정량이 동일함은 각 세포주의 세포추출액에 존재하는 β-액틴(β-actin)의 양을 통해서 확인하였다.The results after the Western blot analysis are shown in FIG. 4. Column 1 in Figure 4, CHO / dhfr - / EPO cell line, second column CHO / dhfr - / pZeoSV2 cell line, third column is CHO / dhfr + / anti-LDH / EPO cell line, column 4 is CHO / dhfr - / EPO / MnSOD cell line, column 5 represents CHO / dhfr + / EPO / anti-LDH / MnSOD cell line. The protein quantification of each cell line was confirmed by the amount of β-actin present in the cell extract of each cell line.

도 4에 나타난 바와 같이, 각 세포주의 세포내에 존재하는 EPO의 양은 CHO/dhfr -/EPO, CHO/dhfr -/pZeoSV2,CHO/dhfr +/anti-LDH/EPO에 비해 본 발명에 의한 CHO/dhfr +/anti-LDH/EPO/MnSOD에서 많이 발현되었다. 이로 인해 본 발명에 의한 CHO/dhfr +/anti-LDH/EPO/MnSOD 세포주가 유용단백질 EPO의 생산증대에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.4, the amount of EPO present in the cells of each cell line CHO / dhfr - / EPO, CHO / dhfr - / pZeoSV2, CHO / dhfr + / anti-LDH / EPO CHO / dhfr according to the present invention as compared to Highly expressed in + / anti-LDH / EPO / MnSOD. As a result, the CHO / dhfr + / anti-LDH / EPO / MnSOD cell line according to the present invention was found to be effective in increasing the production of useful protein EPO.

또한 각 세포주 별로 배양배지로 분비되어 나온 즉, 세포 밖으로 분비된 EPO의 양을 비교해보기 위해, 각 세포의 배양배지를 브래드포드(Bradford) 시약을 이용하여 단백질 정량을 한 후 위의 방법과 동일한 방법으로 EPO의 양을 비교해 보았 다. 그리고 웨스턴 블럿(western blot) 분석법을 이용하여 EPO 발현정도를 분석하였다. In addition, in order to compare the amount of EPO secreted into the culture medium by each cell line, that is, secreted out of the cells, the culture medium of each cell was quantified using a Bradford reagent and the same method as the above method. We compared the amount of EPO. And Western blot analysis was used to analyze the expression level of EPO.

상기 웨스턴 블럿(Western blot) 분석 후 결과는 도 5에 나타냈다. 도 5에서 1열은 CHO/dhfr -/EPO 세포주, 2열은 CHO/dhfr -/pZeoSV2 세포주, 3열은 CHO/dhfr +/anti-LDH/EPO 세포주, 4열은 CHO/dhfr -/EPO/MnSOD 세포주, 5열은 CHO/dhfr +/EPO/anti-LDH/MnSOD 세포주를 나타낸다. 도 5에 나타난 바와 같이, CHO/dhfr -/EPO, CHO/dhfr -/pZeoSV2, CHO/dhfr +/anti-LDH/EPO에 비해 본 발명에 의한 CHO/dhfr+/anti-LDH/EPO/MnSOD 세포주에서 많은 양의 EPO가 발현됨을 통해서 CHO/dhfr +/anti-LDH/EPO/MnSOD 세포주가 세포내에서 만들어져서 세포 밖으로 분비되는 EPO의 생산 증대에도 영향을 미침을 확인할 수 있었다.The results after the Western blot analysis are shown in FIG. 5. Column 1 in Fig. 5 CHO / dhfr - / EPO cell line, second column CHO / dhfr - / pZeoSV2 cell line, third column is CHO / dhfr + / anti-LDH / EPO cell line, column 4 is CHO / dhfr - / EPO / MnSOD cell line, column 5 represents CHO / dhfr + / EPO / anti-LDH / MnSOD cell line. As shown in Figure 5, CHO / dhfr - / EPO , CHO / dhfr - / pZeoSV2, CHO / dhfr + / anti-LDH / as compared to EPO in CHO / dhfr + / anti-LDH / EPO / MnSOD cell line according to the invention Expression of a large amount of EPO was confirmed that the CHO / dhfr + / anti-LDH / EPO / MnSOD cell line is produced in the cell and also affects the production of EPO secreted out of the cell.

실시예Example 3.  3. CHOCHO /Of dhfrdhfr ++ /Of antianti -- LDHLDH /Of EPOEPO /Of MnSODMnSOD 세포주의  Cell line EPOEPO 생물학적 활성에 대한 효과 Effect on Biological Activity

본 발명에 의한 CHO/dhfr +/anti-LDH/EPO/MnSOD 세포주로 인한 EPO의 생물학적 활성은 EPO 존재 하에서만 자랄 수 있는 EPO-의존적 인간 세포주(EPO-dependent human cell line)인 F-36E 세포(Riken Cell Bank RCB0776, Japan)로 측정할 수 있었다. The biological activity of EPO due to the CHO / dhfr + / anti-LDH / EPO / MnSOD cell line according to the present invention is an EPO-dependent human cell line that can grow only in the presence of EPO. Riken Cell Bank RCB0776, Japan).

96-웰 플레이트(96-well plate) 각 웰(well)에 1×105 cell/mL F-36E 세포를 넣고 표준(standard) EPO와 각 세포주를 일주일간 배양하면서 매일 거둔 상층액을 F-36E 세포 배양액(cell broth)으로 연속 희석(serial dilution) 시켰고 96 웰 플레이트에 웰(well)마다 100㎕씩 분주하였다. EPO의 생물학적 활성 측정하기 위해 F36E 셀(cell)의 생균세포 농도(viable cell density)를 MTT방법(Hansen et al., J immunol Methods, 119, 2, 1989)으로 측정했다. 96-well plate Add 1 × 10 5 cell / mL F-36E cells to each well and incubate the standard EPO and each cell line for a week to cultivate the supernatant collected daily. Serial dilution was carried out with cell broth and 100 μl was dispensed per well into 96 well plates. Viable cell density of F36E cells was measured by MTT method (Hansen et al., J immunol Methods, 119, 2, 1989) to measure the biological activity of EPO.

상기 MTT 방법은 구체적으로 96 웰 플레이트(well plate)에서 배양 샘플(cultured sample) 100㎕에 5 mg/mL 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드(3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT) 10㎕를 첨가한 후 37℃, 3시간 동안 더 배양했다. 다음 0.04M HCl 이소-프로필 알콜(iso-propyl alcohol) 100㎕를 각 웰에 첨가한 후 불용성 블루 포르마잔 크리스탈(insoluble blue formazan crystal)을 녹여주기 위해 혼합물을 피펫팅(pipetting) 하였다. 블루 포르마잔(Blue formazan)이 있는 플레이트를 620nm를 테스트(test) 파장으로 하여 570nm에서의 O.D.를 측정하였다.The MTT method is specifically 5 mg / mL 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl tetra in 100 μl cultured sample in a 96 well plate. 10 µl of solium bromide (3- [4,5-Dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) was added thereto, followed by further incubation for 3 hours at 37 ° C. Next, 100 μl of 0.04 M HCl iso-propyl alcohol was added to each well, and the mixture was pipetted to dissolve insoluble blue formazan crystals. Plates with blue formazan were measured at 570 nm with 620 nm as the test wavelength.

그 측정결과를 도 6에 나타냈으며, 도 6에서 C는 CHO/dhfr -/EPO 세포주를, P는 CHO/dhfr -/pZeoSV2 세포주를, A는 CHO/dhfr +/anti-LDH/EPO 세포주를, M은 CHO/dhfr -/EPO/MnSOD 세포주를, A/M은 CHO/dhfr+/anti-LDH/EPO/MnSOD 세포주를 나타낸다. 도 6에 나타난 바와 같이 CHO/dhfr -/EPO, CHO/dhfr -/pZeoSV2,CHO/dhfr+/anti-LDH/EPO, CHO/dhfr -/EPO/MnSOD 세포주에 비해 본 발명에 의한 CHO/dhfr +/anti-LDH/EPO/MnSOD 세포주에서 EPO의 생물학적 활성이 증가되었고, 특히 CHO/dhfr+/anti-LDH/EPO/MnSOD 세포주의 경우 CHO/dhfr -/EPO CHO/dhfr -/pZeoSV2, CHO/dhfr +/anti-LDH/EPO 세포주에 비해 약 2~3배 증가되었고, CHO/dhfr -/EPO/MnSOD 세포주에서보다는 약 1.5배 증가하였음을 확인할 수 있었다.The measurement results are shown in FIG. 6, in which C represents a CHO / dhfr − / EPO cell line, P represents a CHO / dhfr − / pZeoSV2 cell line, and A represents a CHO / dhfr + / anti-LDH / EPO cell line, M represents a CHO / dhfr − / EPO / MnSOD cell line, and A / M represents a CHO / dhfr + / anti-LDH / EPO / MnSOD cell line. FIG CHO / dhfr as shown in 6 - / EPO, CHO / dhfr - / pZeoSV2, CHO / dhfr + / anti-LDH / EPO, CHO / dhfr - / EPO / compared to the MnSOD cell line CHO according to the invention / dhfr + / anti-LDH / EPO / in MnSOD cell lines was increased the biological activity of EPO, especially CHO / dhfr + / anti-LDH / EPO / for MnSOD cell line CHO / dhfr - / EPO CHO / dhfr - / pZeoSV2, CHO / dhfr + / anti-LDH / EPO cell line was compared to increase by two to three times, CHO / dhfr - was found to increase about 1.5 times than hayeoteum / EPO / MnSOD in cell lines.

상술한 바와 같이, 본 발명은 세포내 젖산을 생산하는 효소인 LDH의 안티센스 mRNA가 유도되고 항산화 효소인 망간 과산소 항돌연변이 효소MnSOD 유전자를 CHO 세포주에 도입된 세포주를 제공하여, 배양액에 축적되는 젖산 생산을 억제하고 세포주의 항산화능을 높여 세포주의 수명을 연장함으로써 EPO 생산성을 증대시키는 효과를 도모할 수 있다. 본 발명은 EPO 단백질 제재에 대한 생산 기술을 개발함과 동시에 유용 단백질 재제의 국내 산업화에 커다란 기여를 할 수 있는 유용한 발명이라고 할 수 있다. As described above, the present invention provides a cell line in which antisense mRNA of LDH, an enzyme producing intracellular lactic acid, is induced, and an antioxidant enzyme, a manganese peroxygen-antimutant enzyme, MnSOD gene, is introduced into a CHO cell line, and accumulated in culture medium. By suppressing production and increasing the cell line's antioxidant capacity, prolonging the cell line's lifespan can increase the EPO productivity. The present invention can be said to be a useful invention that can make a great contribution to the domestic industrialization of useful protein preparations while developing a production technology for EPO protein preparations.

<110> Korea University Industrial and Academic Collaboration Foundation <120> Suspension adapted cell for overproducing recombinant Human Erythropoietin using antisense LDH mRNA expression and MnSOD overexpression <130> P11-070509-02 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 381 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 1 accagctgat tgtgaatcta cttaaggaag aacagacccc ccagaacaag attacgattg 60 ttggggttgg tgctgttggc atggcttgtg ccatcagtat cctcatgaag gacttagcag 120 atgagcttgc ccttgttgat gtcatggaag acaagctgaa gggggaaatg atggatctcc 180 agcatggcag ccttttcctc agaacaccaa aaattgtctc tggcaaagac tatagtgtga 240 cagcaaactc caagctggtc attgtcacag cgggggcccg tcagcaacag ggagagagcc 300 gactcaatct ggtccagcga aacgtgaaca tcttcaagtt catcattccc aacgttgtga 360 aatacagtcc agactgcaag c 381 <210> 2 <211> 669 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgttgagcc gggcagtgtg cggcaccagc aggcagctgg ctccggcttt ggggtatctg 60 ggctccaggc agaagcacag cctccccgac ctgccctacg actacggcgc cctggaacct 120 cacatcaacg cgcagatcat gcagctgcac cacagcaagc accacgcggc ctacgtgaac 180 aacctgaacg tcaccgagga gaagtaccag gaggcgttgg ccaagggaga tgttacagcc 240 cagacagctc ttcagcctgc actgaagttc aatggtggtg gtcatatcaa tcatagcatt 300 ttctggacaa acctcagccc taacggtggt ggagaaccca aaggggagtt gctggaagcc 360 atcaaacgtg actttggttc ctttgacaag tttaaggaga agctgacggc tgcatctgtt 420 ggtgtccaag gctcaggttg gggttggctt ggtttcaata aggaacgggg acacttacaa 480 attgctgctt gtccaaatca ggatccactg caaggaacaa caggccttat tccactgctg 540 gggattgatg tgtgggagca cgcttactac cttcagtata aaaatgtcag gcctgattat 600 ctaaaagcta tttggaatgt aatcaactgg gagaatgtaa ctgaaagata catggcttgc 660 aaaaagtaa 669 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 3 tcaaggacca gctgattgtg aaat 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 4 caggagtcag tgtcaccttc aca 23 <110> Korea University Industrial and Academic Collaboration Foundation <120> Suspension adapted cell for overproducing recombinant Human          Erythropoietin using antisense LDH mRNA expression and MnSOD          overexpression <130> P11-070509-02 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 381 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 1 accagctgat tgtgaatcta cttaaggaag aacagacccc ccagaacaag attacgattg 60 ttggggttgg tgctgttggc atggcttgtg ccatcagtat cctcatgaag gacttagcag 120 atgagcttgc ccttgttgat gtcatggaag acaagctgaa gggggaaatg atggatctcc 180 agcatggcag ccttttcctc agaacaccaa aaattgtctc tggcaaagac tatagtgtga 240 cagcaaactc caagctggtc attgtcacag cgggggcccg tcagcaacag ggagagagcc 300 gactcaatct ggtccagcga aacgtgaaca tcttcaagtt catcattccc aacgttgtga 360 aatacagtcc agactgcaag c 381 <210> 2 <211> 669 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgttgagcc gggcagtgtg cggcaccagc aggcagctgg ctccggcttt ggggtatctg 60 ggctccaggc agaagcacag cctccccgac ctgccctacg actacggcgc cctggaacct 120 cacatcaacg cgcagatcat gcagctgcac cacagcaagc accacgcggc ctacgtgaac 180 aacctgaacg tcaccgagga gaagtaccag gaggcgttgg ccaagggaga tgttacagcc 240 cagacagctc ttcagcctgc actgaagttc aatggtggtg gtcatatcaa tcatagcatt 300 ttctggacaa acctcagccc taacggtggt ggagaaccca aaggggagtt gctggaagcc 360 atcaaacgtg actttggttc ctttgacaag tttaaggaga agctgacggc tgcatctgtt 420 ggtgtccaag gctcaggttg gggttggctt ggtttcaata aggaacgggg acacttacaa 480 attgctgctt gtccaaatca ggatccactg caaggaacaa caggccttat tccactgctg 540 gggattgatg tgtgggagca cgcttactac cttcagtata aaaatgtcag gcctgattat 600 ctaaaagcta tttggaatgt aatcaactgg gagaatgtaa ctgaaagata catggcttgc 660 aaaaagtaa 669 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 3 tcaaggacca gctgattgtg aaat 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 4 caggagtcag tgtcaccttc aca 23  

Claims (7)

인간 에리트로포이에틴 게놈 유전자, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 안티센스 젖산 탈수소효소(LDH) mRNA를 유도할 수 있는 유전자, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 망간 과산소 항돌연변이 효소 MnSOD 유전자 및 DHFR(dihydrofolate reductase) 유전자를 포함하는 벡터에 의해 형질전환하고 무혈청 배지에서 배양하여 부유성 세포로 적응시킨 인간 에리트로포이에틴을 고효율로 발현시키는 재조합 CHO 세포주(기탁번호 KCLRF-BP-00155).Human erythropoietin genomic gene, a gene capable of inducing antisense lactate dehydrogenase (LDH) mRNA having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, a manganese peroxyantimutant enzyme MnSOD gene having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and a dihydrofolate (DHFR) Recombinant CHO cell line (Accession No. KCLRF-BP-00155) which efficiently transforms human erythropoietin, which is transformed with a vector containing a reductase) gene and cultured in a serum-free medium and adapted to floating cells. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항 기재의 세포주(기탁번호 KCLRF-BP-00155)를 무혈청 배지에서 배양하여 부유성 세포로 적응시킨 후 배양하여 그 세포주로부터 인간 에리트로포이에틴을 분리, 정제함을 특징으로 하는 인간 에리트로포이에틴을 제조하는 방법.A human erythropoie characterized by culturing the cell line described in claim 1 (Accession No. KCLRF-BP-00155) in a serum-free medium to adapt to floating cells, followed by culturing to isolate and purify human erythropoietin from the cell line. How to prepare ethyne. 삭제delete 삭제delete
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