KR100887045B1

KR100887045B1 - 구조적으로 강제된 ｓｍａｃ 유사물 및 이들의 용도

Info

Publication number: KR100887045B1
Application number: KR1020067016479A
Authority: KR
Inventors: 샤오멩 왕; 헤이잉 선; 자네타 니코로프스카-솔레스카; 차오-이에 양; 리앙 슈
Original assignee: 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미시간
Priority date: 2004-01-16
Filing date: 2005-01-18
Publication date: 2009-03-04
Also published as: KR20070021130A

Abstract

본 발명은 세포 자멸(apoptosis) 단백질의 억제제의 억제제로서 작용하는 Smac의 구조적으로 강제된 유사물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 아폽토틱(apoptotic) 세포 괴멸을 유도하고 아폽토시스 유발제에 대해 세포를 민감화하기 위한 Smac 유사물의 용도에 관한 것이다.

Description

구조적으로 강제된 ＳＭＡＣ 유사물 및 이들의 용도{CONFORMATIONALLY CONSTRAINED SMAC MIMETICS AND THE USES THEREOF}

본 발명은 의약 화학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 세포 자멸(apoptosis) 단백질의 억제제의 억제제로서 작용하는 Smac의 구조적으로 강제된 유사물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 아폽토틱(apoptotic) 세포 괴멸 유도에 대하여 세포를 민감화하기 위한 상기한 유사물의 용도에 관한 것이다.

공격성 암 세포 표현형은 세포간 신호전달 경로의 조절이상에 의하여 야기되는 다양한 유전적 및 후생유전적 변형의 결과이다(Ponder, Nature 411:336 (2001)). 그러나 모든 암 세포는 세포 자멸 프로그램 수행 실패라는 공통점을 지니며, 정상적인 세포 아폽토시스(apoptosis) 기전의 결함에 기인한 적절한 세포 자멸의 결핍은 암의 특징이 된다(Lowe et al ., Carcinogeraesis 21:485 (2000)). 화학 요법제, 방사선, 면역요법을 포함하는 대부분 현재의 항암 요법은 간접적으로 암 세포의 세포 자멸을 유도함으로써 작용하게 된다. 따라서, 정상적인 세포 자멸 기전의 결함에 기인한 암 세포의 적절한 세포 자멸 프로그램의 수행 불능은 종종 화 학요법, 방사선 또는 면역요법 유도성 세포 자멸에 대한 내성을 증가시키는 것과 관련되어있다. 세포 자멸 결함에 기인하는 현재의 치료 프로토콜에 대한 서로 다른 기원의 인간 암의 원발 또는 후천적 내성은 현재의 항암 요법의 주요 문제점으로 대두된다(Lowe et al ., Carcinogenesis 21:485 (2000); Nicholson, Nature 407:810 (2000)). 따라서, 생존성 및 삶의 질을 향상시키기 위한 새로운 분자 표적 특이성 항암 요법을 설계하고 발전시키기 위한 현재 및 미래의 노력은 세포 자멸에 저항하는 암 세포를 특이적으로 표적화하는 전략을 포함해야만 한다. 이러한 관점에서, 암 세포 내의 세포 자멸을 직접 억제하는데 중추 역할을 하는 결정적인 음성 조절인자(negative regulator)를 표적화 하는 것이 신형 항암제 설계에 있어서 매우 전도 유망한 치료 전략이 될 것이다.

세포 자멸의 중추적 음성 조절 인자는 두 클래스로 분류되었다. 조절인자의 제1 클래스는 2개의 유력한 항 세포 자멸 분자인, Bcl-2 및 BCl-X_L 단백질로 입증된 단백질의 Bcl-2 족이다(Adams et al ., Science 281:1322 (1998); Reed, Adv . Plarmacol. 41:501 (1997); Reed et al ., J. Cell . Biochem . 60:23 (1996)). 암 세포의 민감성을 회복하고 세포 자멸에 대한 암 세포의 내성을 극복하기 위한 암의 Bcl-2 및 Bcl-X_L를 표적화하는 치료 전략은 광범위하게 연구되어 왔다(Adams et al., Science 281:1322 (1998); Reed, Adv . Pharmacol . 41:501 (1997); Reed et al., J. Cell . Biochem . 60:23 (1996)). 현재, Bcl-2 안티센스(antisense) 요법은 고형 및 비고형 종양 치료를 위한 3 단계 임상시험에 있다. 일부 연구소에서는 Bcl-2 및 Bcl-X_L의 소형 분자 억제제를 설계하는 것에 관심을 기울이고 있다.

세포 자멸의 중추적 음성 조절인자의 제2 클래스는 세포 자멸 단백질 억제제(IAPs)이다(Deveraux et al ., Genes Dev . 13:239 (1999); Salvesen et al ., Nat . Rev. Mol . Cell . Biol . 3:401 (2002)). IAP 단백질은 화학요법제, 방사선 및 면역요법을 포함하는 암 세포 내의 매우 다양한 세포 자멸 자극에 의하여 유도된 세포 자멸을 효과적으로 억제한다.

X-연결(linked) IAP (XIAP)는 모든 IAP 멤버 중에서 세포 자멸을 억제하는 가장 유력한 억제제이다(Holcik et al ., Apoptosis 6:253 (2001); LaCasse et al ., Oncogene 17:3247 (1998); Takahashi et al ., J. Biol . Chem . 273:7787 (1998); Deveraux et al ., Nature 388:300 (1997); Sun et al ., Nature 401:818 (1999); Deveraux et al ., EMBO J. 18:5242 (1999); Asselin et al ., Cancer Res. 61:1862 (2001)). XIAP는 사망 수용체 매개 경로 및 미토콘드리아 매개 경로 양자의 세포 자멸에 대한 음성 조절에 있어서 결정적인 역할을 한다. XIAP는 카스파아제(caspase)족 효소의 세 멤버인 카스파아제-3, -7, 및 -9에 직접 결합하여 효과적으로 억제함으로써 효과적인 내인성 세포 자멸 억제제로서 작용한다(Takahashi et al., J. Biol . Chem . 273:7787 (1998); Deveraux et al ., Nature 388:300 (1997); Sun et al ., Nature 401:818 (1999); Deveraux et al ., EMBO J. 18:5242 (1999); Asselin et al ., Cancer Res . 61:1862 (2001); Riedl et al ., Cell 104:791 (2001); Chai et al ., Cell 104:769 (2001); Huang et al ., Cell 104:781 (2001)). XIAP는 3개의 바큘로바이러스(baculovirus) 억제제의 세포 자멸 반복(BIR) 도메인 및 C-종결 고리 핑거(RING finger)를 포함한다. 제3 BIR 도메인(BIR3)은 미토콘드리아 경로 내의 억제제 카스파아제인 카스파아제-9을 선별적으로 표적화하는 반면, BIR1 및 BIR2 사이의 링커(linker) 영역은 카스파아제 -3 및 카스파아제 -7 모두를 억제한다(Salvesen et al ., Nat . Rev . Mol . Cell . Biol . 3:401 (2002)). XIAP에 결합함으로써 3종의 카스파아제 모두의 활성화를 방지하는 경우, 카스파아제 -9과의 상호기작은 이들의 세포 자멸 억제에 가장 중요한 것이라는 사실은 분명하다(Ekert et al ., J. Cell Biol . 152:483 (2001); Srinivasula et al ., Natice 410:112 (2001)). XIAP가 다중 신호 경로가 수렴되는 지점인 다운 스트림 효과기 단계(down-stream effector phase)에서 세포 자멸을 차단하기 때문에, XIAP를 표적화하는 전략은 세포 자멸에 대한 암 세포의 내성을 극복하는데 특히 효과적이라는 것이 입증되었다(Fulda et al ., Nature Med . 8:808 (2002); Arnt et al ., J. Biol . Chem, 277:44236 (2002)).

각종 유형별 암에 있어서의 XIAP의 정확한 역할을 완전히 이해하고 있지는 않더라도, XIAP가 많은 유형의 암에 있어서 과도하게 발현되며, 현재의 다양한 치료제에 대한 암 세포의 내성에 있어서 중요한 역할을 한다는 사실을 나타내는 증거가 있다(Holcik et al ., Apoptosis 6:253 (2001); LaCasse et al ., Oncogene 17:3247 (1998)).

XIAP 단백질은 대부분의 NCI 60 인간 암 세포조에서 발현된다고 알려져 있다(Tamm et al ., Clin . Cancer Res . 6:1796 (2000)). 사전에 치료하지 않은 78명의 환자의 종양 시료의 분석 결과는 XIAP 농도가 낮은 사람들이 상당히 더 오래 생존하였다는 것을 보여준다(Tamm et al ., Clin . Cancer Res . 6:1796 (2000)). XIAP는인간 악성 신경아교종에서 발현된다고 알려졌다(Wagenknecht et al ., Cell Death Differ. 6:370 (1999); Fulda et al ., Nature Med . 8:808 (2002)). XIAP는 인간 전립선 암세포에서도 발현된다고 알려져 있으며, 미토콘드리아 활성의 존재하의 전립선 암 세포의 리간드 매개 세포 자멸을 포함하는 Apo2 리간드/종양 괴사 인자 연관 세포 자멸을 차단한다(McEleny et al ., Prostate 51:133 (2002); Ng et al ., Mol . Cancer Ther . 1:1051 (2002)). XIAP는 환자의 비소세포 폐암(NSCLC)에서 과다 발현되며, NSCLC의 발병요인과 연관되어 있다 (Hofmann et al ., J. Cancer Res . Clin . Oncol. 128:554 (2002)). 시스플라틴(cisplatin)에 의한 치료에 있어서 XIAP의 발현 및 XIAP의 하향 조절 부재는 인간 난소암의 시스플라틴 내성과 관련되어 있다 (Li et al ., Endocrinology 142:370 (2001); Cheng et al ., Drug Resist . Update 5:131 (2002)). 이들 모두를 취합해보면, 이러한 데이터는 XIAP가 일부 인간 암의 현재 치료제에 대한 내성에 대하여 중요한 역할을 한다는 사실을 보여준다.

최근, Smac/DIABLO (카스파아제의 제2 미토콘드리아 유도성 활성제)는 세포 자멸 신호에 대한 응답으로 미토콘드리아에서 세포질로 분비되는 단백질로 밝혀졌다 (Budihardjo et al ., Annu . Rev . Cell Dev . Biol . 15:269 (1999); Du et al ., Cell 102:33 (2000)). Smac은 숙성 폴리펩티드로 숙성되는 과정에서 단백질분해에 의하여 제거된 N-종결 미토콘드리아 표적 서열과 함께 합성된다. Smac은 XIAP 및 그 밖의 IAPs와 직접적으로 상호작용하는 것으로 알려져 있으며, 이들의 카스파아 제와의 결합을 분해하여 카스파아제 활성을 촉진시킨다. Smac은 효과적인 XIAP의 내인성 억제제이다.

Smac 단백질 및 펩티드와 복합체를 이루는 XIAP의 BIR3 도메인의 고해상도 실험적 3차원(3D)구조가 최근 측정되었다 (Sun et al ., J. Biol . Chem . 275:36152 (2000); Wu et al ., Nature 408:1008 (2000))(도 1). Smac의 N-종결 테트라펩타이드 (Ala-Val-Pro-Ile, 또는 AVPI (SEQ ID NO : 1) )는 몇 개의 수소결합 상호작용 및 반데르발스 접촉을 통한 XIAP의 BIR3 도메인 상의 표면 홈(groove)에 의하여 인식된다. 또한 BIR3 및 카스파아제 -9 간의 상호작용은 BIR3 도메인 상의 동일한 표면 홈에 대한 카스파아제-9의 작은 서브유닛의 아미노 말단 상의 4개의 잔기 (Ala-Thr-Pro-Phe, 또는 ATPF (SEQ ID NO : 2))와 관련있다고 알려져 있다. 최근 일부 연구 결과에 의하면 Smac이 BIR3 도메인의 표면상의 동일한 결합 홈에 대하여 카스파아제-9과 경쟁함으로써 카스파아제-9의 촉매활성을 촉진시킨다는 것을 확실히 입증하였다(Ekert et al ., J Cell Biol . 152:483 (2001); Srinivasula et al ., Nature 410:112 (2001)).

대부분의 단백질-단백질 상호작용과는 달리, Smac-XIAP 상호작용은 Smac 단백질 상의 오직 4개의 아미노산 잔기와 XIAP의 BIR3 도메인 상의 잘 정의된 표면 홈에 의하여 매개된다. XIAP (K_d = 0.4 μM)에 대한 Smac 펩티드 AVPI (SEQ ID NO : 1)의 K_d 값은 필수적으로 숙성 Smac 단백질 (K_d = 0.42 μM)과 동일하다. 이러한 잘알려진 상호작용 자리(site)는 Smac의 XIAP에 대한 결합을 모방하는 비 펩티드성 약물 유사 소형 분자를 설계하는데 이상적이다.

세포간 전달을 촉진하기위한 캐리어 펩티드에 고정된 Smac의 N-말단의 최초 4개의 아미노산 잔기(AVPI (SEQ ID NO : 1))로 구성된 세포 투과성 Smac 펩티드는 다양한 생체 외 종양 세포 및 생체 내 악성 신경아교종 세포를 사망 수용체 결착 또는 세포독성제에 의하여 유도된 세포 자멸에 민감하게 한다(Fulda et al., Nature Med. 8:808 (2002)). 중요한 것은, 이 Smac 펩티드가 두개내(intracranial) 악성 신경아교종 생체 내 이종이식 모델의 Apo2L/TRAIL의 항종양 활성을 크게 증진시킨다는 점이다. Smac 펩티드 및 Apo2L/TRAIL의 복합 치료를 한 경우에만 확인된 종양을 완전히 치료할 수 있으며 마우스의 생존율을 높일 수 있다. Smac 펩티드는 정상 뇌 조직에 검출가능한 독성을 갖지 않는다는 것이 중요하다.

최근 2번째의 독립적인 연구는 서로 다른 캐리어 펩티드에 고정된 Smac의 N-말단의 최초 4개에서 8개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드가 세포 자멸 유도를 증진시키며, 파크리탁셀(paclitaxel), 에토포사이드(etoposide), SN-38, 및 MCF-7와 그밖의 인간 유방암 세포주 내의 독소루비신(doxorubicin)을 포함하는 다양한 화학요법제의 장기간의 항증식 효과를 증진시킨다는 사실을 보여주었다 (Arnt et al., J. Biol . Chem . 277: 44236 (2002). 이 연구는 결론적으로 XIAP 및 cIAP-1가 세포 내의 이러한 펩티드에 대한 1차 분자 표적이라는 것을 보여준다.

제3의 연구는 폴리아르기닌에 고정된 최초 7개의 N-말단 잔기의 Smac 펩티드가 에이팝토좀(apoptosome)의 활성을 회복시키고, 비소세포폐암 H460 세포의 세포 자멸 내성을 감소시킨다는 것을 보여주었다 (Yang et al ., Caizcer Res . 63 : 831 (2003)). XIAP는 에이팝토좀 활성의 결합 및 H460 세포의 카스파아제 활성의 억제의 원인이 된다는 사실을 보여주었다. 화학요법과 조합하여 사용하는 경우, 세포 투과성 Smac 펩티드는 마우스에 있어서 생체 내 종양 성장을 늦추면서도 독성이 거의 없었다. 이들을 취합하여보면, 이러한 최근의 독립적인 연구 결과는 효과적이고 안정한 세포 투과성 Smac 유사물이 인간 유방암 및 다른 유형의 암 치료에 유용한 치료제로서의 잠재성을 갖는다는 사실을 강하게 시사하고 있다.

펩티드-기초 억제제는 IAPs의 항 세포 자멸 기능 및 화학요법제에 대한 암 세포의 응답에 있어서의 IAPs의 역할을 밝히는 유용한 툴이다. 그러나 일반적으로 펩티드-기초 억제제는 잠제적으로 유용한 치료제로서 내제적 제한이 있다. 이러한 제한에는 낮은 세포 투과성 및 생체 내 안전성이 포함된다. 물론, 이러한 공지된 연구결과에서, Smac-기초 펩티드 억제제를 사용하는 경우, 이 펩티드가 캐리어 펩티드에 결합되어 상대적으로 세포 투과적이 되도록 하여야한다.

펩티드-기초 억제제의 이러한 내재적 제한을 극복하기 위하여 본 발명은 Smac 펩티드 및 XIAP BIR3 도메인과 복합체를 형성하는 Smac의 고해상도 실험적 3차원 구조에 기초한 비펩티드 유사물을 설계하는 것과 관련되어 있다.

발명의 요약

유전적 장애 또는 세포 자멸 유발제(inducer)(항암제 및 방사선 등)에 노출되어 세포 자멸을 하는 암 세포 또는 이들의 지지 세포(supporting cell)의 불활성이 암 발병 및 진행의 주요 인자라는 것이 일반적으로 알려져있다. 암 세포 또는 이들의 지지 세포(예컨대, 종양 혈관계의 신생혈관 세포)의 세포 자멸 유도는 사실상 현재 업계 또는 시술시 모든 효과적인 암 치료제 또는 방사선 요법 작용의 보편적인 기작으로 여겨진다. 세포가 세포 자멸이 불활성화되는 하나의 이유는 IAPs의 과다 발현 및 축적이다.

본 발명은 암을 지닌 동물에 IAPs 기능을 억제하는 치료적 유효량의 약물(들)(예컨대, 소형 분자)을 노출시켜 암 세포 또는 이들의 지지 세포를 완전히 제거(이들 중 계속해서 생존하는 세포는 IAPs의 과다활성에 달려있음)하고 및/또는 이러한 세포가 집단으로 암 치료제 또는 방사선 요법의 세포사 유도 활성에 민감하게 만들도록 고려되었다. 본 발명은 IAPs의 억제제가 여러 암 유형의 치료를 위한 달성되지 않은 수요를 만족시키도록 고안되었다. IAP의 기능에 의존하는 암 세포의 세포 자멸을 유도하기 위하여 단일 요법으로 투여되거나 그 밖의 세포사 유도 암 치료제 또는 방사선 요법과 관련하여 일시적으로 투여되는 경우에는 암 치료제 또는 방사선 요법으로 동물을 단독으로 치료한 경우의 상응하는 비율에 비하여 한 암 세포 또는 지지 세포의 상당 비율이 세포 자멸 프로그램을 수행하기 쉽도록 한다.

본 발명의 특정 실시 상태에서, 치료적 유효량의 본 발명의 화합물과 일단의 항암제 또는 방사선과 함께 동물을 복합 치료하는 것이 이 화합물 또는 항암제/방사선 단독으로 치료하는 경우에 비하여 더 많은 종양 응답성 및 임상적 이득을 얻게 된다. 다른 방안으로써, 상기 화합물은 IAPs를 발현하여 모든 세포의 세포 자멸 역치를 낮추기 때문에 항암제/방사선의 세포 자멸 유도 활성에 대한 응답으로 세포 자멸 프로그램을 성공적으로 수행하는 세포의 비율이 증가된다. 대안적으로, 본 발 명의 화합물은 종래의 항암제 및/또는 방사선 단독의 투여량과 동일한 종양 응답성/임상적 이익을 얻기 위하여 항암제 및/또는 방사선의 투여량을 적게 투여할 수 있으며, 따라서 독성이 적으며, 더 용인하기 쉽다. 모든 승인된 항암제 및 방사선 치료법의 투여량은 잘 알려져 있기 때문에, 본 발명은 이들과 본 발명의 화합물의 다양한 조합이 가능하도록 고안되었다. 또한 본 발명의 화합물은 적어도 부분적으로 IAPs를 억제함으로써 작용하기 때문에, 치료적 유효량의 상기 화합물을 암 세포 및 지지 세포에 노출시키면 항암제 또는 방사선 요법에 대한 응답으로 세포가 세포 자멸 프로그램을 수행하려는 시도와 동시에 일시적으로 연결된다. 따라서, 어떤 실시 상태에서는, 특정한 일시적 관계와 함께 본 발명의 화합물의 투여하는 것이 특히 효과적인 치료 방법을 제공하게 된다.

본 발명은 IAP 단백질 활성을 억제하고 아폽토시스 유발제에 대한 세포의 민감성을 증가시키는데 유용한 Smac 유사물에 관한 것이다. 하나의 특별한 양태에 있어서, Smac 유사물은 다음 화학식 1로 표시되는 화합물, 약제학적으로 허용가능한 이들의 염 또는 이들의 전구약물이다.

상기 식에서,

R₁은 C₁ _-2 알킬 또는 C₁ _-2 할로알킬이고;

R₂는 측쇄가 있거나 또는 측쇄가 없는 알킬 또는 시클로알킬이거나 치환되거나 치환되지 않은 아릴, 알킬아릴, 헤테로아릴 또는 알킬헤테로아릴이고;

X는 CONH, CH₂O, CH₂NH, CH₂S, 또는 (CH₂)_1-3이고;

Y₁은 (CH₂)_1-5이고, 여기에서 1 이상의 탄소는 산소, 황 및 질소 중에서 선택되는 1 이상의 이종원자로 치환될 수 있으며, CH₂ 그룹 중의 1 이상의 수소는 측쇄가 있거나 또는 측쇄가 없는 알킬 또는 시클릭 알킬 또는 치환되거나 치환되지 않은 아릴, 알킬아릴, 헤테로아릴 또는 알킬헤테로아릴로 치환될 수 있으며;

Y₂는 (CH₂)_1-5이고, 여기에서 1 이상의 탄소는 산소, 황 및 질소 중에서 선택되는 1 이상의 이종원자로 치환될 수 있으며, CH₂ 그룹 중의 1 이상의 수소는 측쇄가 있거나 또는 측쇄가 없는 알킬 또는 시클릭 알킬 또는 치환되거나 치환되지 않은 아릴, 알킬아릴, 헤테로아릴 또는 알킬헤테로아릴로 치환될 수 있으며;

Z는 CONH, CH₂0, NHCO, (CH₂)_1-4, (CH₂)_1-3CONH(CH₂)_0-3, (CH₂)_1-3S(CH₂)_0-3, (CH₂)_1-3NH(CH₂)_0-3, (CH₂)_1-3NHCO(CH₂)_0-3, (CH₂)_1-3NHSO₂(CH₂)_0-3, (CH₂)_1-3NHC(0)NH(CH₂)_0-3, (CH₂)_1-3NHC(S)NH(CH₂)_0-3, (CH₂)_1-3NR'(CH₂)_0-3, 여기에서 R'은 측쇄가 있거나 또는 측쇄가 없는 알킬 또는 시클로알킬이거나 치환되거나 치환되지 않은 아릴, 알킬아릴, 헤테로아릴 또는 알킬헤테로아릴이다.이다.

본 발명은 IAP 단백질의 억제제인 화학식 I로 대표되는 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 세포의 세포 자멸을 유도하기 위한 화합물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 세포가 세포 자멸 유발제에 민감하게 하기 위한 본 발명의 화합물의 용도에 관한 것이다. 상기 화합물은 세포 아폽토시스 유도에 대응하는 질환, 예컨대, 암과 같은 과다증식 질환을 포함하는 세포 자멸 조절관란으로 인한 질환의 치료, 완화 또는 예방에 유용하다. 특정 실시 상태에서, 상기 화합물은 암 치료에 내성이 있는 암의 치료, 완화 또는 예방에 사용될 수 있다(예컨대, 화학 내성, 방사선 내성, 호르몬 내성 및 이와 유사한 것). 또 다른 실시 상태에서, 상기 화합물은 IAPs의 과다발현에 의한 과다증식질환을 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 세포의 세포 자멸을 유도하고, 세포가 세포 자멸 유발제에 민감하게 하기 위하여 치료학적 유효량의 화학식 1의 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 추가로 화학식 1의 화합물 및 이 화합물을 동물에 투여하기 위한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 필요에 따라 다른 치료제, 예컨대, 항암제를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

도 1은 Smac 펩티드와 XIAP BIR3의 모델화한 복합체를 나타낸다.

도 2는 FP-기초 분석의 포화 결합 곡선을 나타낸다.

도 3은 FP-기초 분석의 펩티드 결합을 나타낸다.

도 4는 표 2의 화합물 1과 XIAP BIR3의 모델화한 복합체를 나타낸다.

도 5는 표 2의 화합물 19와 XIAP BIR3의 모델화한 복합체를 나타낸다.

도 6는 표 2의 화합물 21과 XIAP BIR3의 모델화한 복합체를 나타낸다.

도 7은 FP-기초 분석에서의 Smac 유사물 결합을 나타낸다.

도 8은 표 4의 화합물 34와 XIAP BIR3의 모델화한 복합체를 나타낸다.

도 9는 다양한 세포주 내의 XIAP, cIAP-1/2, 설비빈(survivin) 및 Smac의 웨스턴 블롯 분석의 결과를 나타낸다.

도 10A 및 10B는 시스플라틴 (CDDP) 및 Smac 유사물에 대한 응답으로 PC-3 세포의 세포 자멸 유도를 보여준다.

도 11은 CDDP 및 Smac 유사물에 대한 응답으로 PC-3 세포의 세포 자멸 유도를 보여준다.

도 12는 CDDP 및 Smac 유사물에 대한 응답으로 PC-3 세포의 세포 자멸 유도를 보여준다.

도 13은 TAXOTERE 및 Smac 유사물에 대한 응답으로 PC-3 세포의 세포 자멸 유도를 보여준다.

도 14는 CDDP 및 Smac 유사물에 대한 응답으로 MDA-231 세포의 세포 자멸 유도를 보여준다.

도 15는 에토포사이드(etoposide) 및 Smac 유사물에 대한 반응에서 XIAP를 과다발현하는 Jurkat 세포 내의 세포 아폽토시스 유도를 나타낸다.

도 16은 에톱사이드 및 Smac 유사물에 대한 응답으로 XIAP-Bir3를 과다발현하는 Jurkat 세포 내의 세포 자멸 유도를 나타낸다.

도 17은 방사선 및 Smac 유사물에 대한 응답으로 인한 콜로니 성장의 억제를 나타낸다.

도 18A 내지 18C는 Smac 유사물에 대한 응답으로 인한 유방암 세포 성장의 억제를 나타낸다.

본 발명은 Smac의 유사물이며 IAPs의 억제제로서 작용하는 화학식 1로 표시되는 구조적으로 강제된 화합물에 관한 것이다. IAPs를 억제함으로써, 이러한 화합물은 세포 자멸 유발제에 민감하게 하며, 어느 정도는 그 자체가 세포 아폽토시스를 유도하게 된다. 따라서, 본 발명은 화학식 1의 화합물을 단독 또는 세포 아폽토시스 유발제와 조합하여 세포에 접촉시킴으로써 세포를 세포 아폽토시스 유발제에 민감하게 하는 방법 및 세포의 세포 아폽토시스 유도 방법에 관한 것이다.

본 발명은 추가적으로 화학식 I의 화합물 및 세포 자멸 유발자를 동물에 투여하는 것을 포함하여 세포 자멸 유도에 관한 동물의 질병을 치료, 완화 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 이러한 질환은 아폽토시스의 이상조절 및 IAPs의 과다발현으로 특정화되는 질환을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 "IAP 단백질"이라는 용어는 XIAP, cIAP-1, cIAP-2, 및 ML-IAP을 포함하나 이에 한정되지 않는 세포 자멸 단백질족의 억제제의 알려진 구성원을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 "IAPs의 과다발현"이라는 용어는 단백질을 코드화한 mRNAs를 기초 농도로 발현하거나 또는 기초 농도의 IAP 단백질을 지닌 상응하는 비병리학적 세포에 비하여 세포 내의 IAP 단백질(들)을 코드화한 mRNAs의 증가된 농도 (예컨대, 이상 농도), 및/또는 IAP 단백질(들)의 증가된 농도를 의미한다. 세포 내의 IAP 단백질을 코드화한 mRNAs의 농도 또는 IAP 단백질의 농도를 검출하는 방법에는 IAP 단백질 항체를 사용한 웨스턴 블로팅, 면역조직화학법 및 핵산증폭법 또는 직접 RNA 검출 등이 있으나 이에 한정되지 않는다. 세포 내 IAP 단백질의 절대 농도만큼 중요한 것은 이들이 과다발현하는 IAP 단백질을 측정하는 것이므로, 이러한 세포내의 다른 전-세포 자멸(pro-apoptotic) 신호 분자(예컨대, 전-세포 자멸 Bcl-2류 단백질)에 대한 IAP 단백질의 상대 농도이다. 이러한 양자 간의 균형은 IAP 단백질의 농도가 아니라면, 전-세포 자멸 신호 분자는 아폽토시스 프로그램 수행하기 충분하여 사멸하게 되며, 상기 세포는 이들의 생존을 위한 IAP 단백질에 의존적이 된다. 이러한 세포 내에서, IAP 단백질 억제제의 억제 유효량을 노출시키면 세포가 세포 자멸 프로그램을 수행하도록 하며 사멸하게 된다. 따라서, "IAP 단백질의 과다발현"이라는 용어는 전-세포 자멸 신호 및 항-세포 자멸 신호의 상대적 농도에 기인하여, IAP 단백질의 기능을 억제하는 화합물의 억제 유효량에 응답하여 세포 자멸을 하게 되는 세포를 의미하게 된다.

본 명세서에서 사용된 "항암제" 및 "항암 약물"이라는 용어는 (예컨대, 포유류에서의) 암과 같은 과다증식 질환의 치료에 사용되는 모든 치료제 (예컨대, 화학요법 화합물 및/또는 분자요법 화합물), 방사선 요법, 또는 외과 시술을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 "전구약물"이라는 용어는 표적 생리적 시스템 내에서 분비하기 위하여 (예컨대, 자발적 또는 효소적으로) 생체변화를 필요로 하는 모"약물"분자의 약학적 비활성 유도체 또는 (예컨대, 효소적으로, 기계적으로 또는 전자기적으로) 전구체를 활성 약물로 전환하는 것을 의미한다. 전구체는 안정성, 독성, 특이성(specificity) 부재 또는 제한된 생활성과 관계된 문제점을 극복하기 위하여 설계된다. 예시적인 전구약물로는 활성 약물 분자 자체 및 화학적 차폐기(masking group)(예컨대, 약물의 활성을 가역적으로 억제하는 기)를 포함한다. 선호되는 전구체는 대사 상태하에서 분해가능한 기를 가진 화합물의 변이체 또는 유도체이다. 예시적인 전구체는 생리적 조건 하에서 가용매분해, 효소 분해 또는 그 밖의 생화학적 전환(예컨대, 인산화, 수소화반응, 탈수소화반응, 글리콜화)되는 경우 생체 내 또는 생체 외에서의 약학적 활성을 가지게 된다. 전구약물은 종종 용해도, 조직 적합성 또는 포유류 기관에서의 지연 방출의 이점을 제공한다(Bundgard, Design of Prodrugs, pp.7-9,21-24, Elsevier, Amsterdam (1985); 및 Silverman, The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action, pp. 352-401, Academic Press, San Diego, CA (1992) 참조). 일반적인 전구약물에는 모산(parent acids)과 적합한 알콜(예컨대 저급 알칸올)의 반응에 의하여 제조된 에스테르 등의 산 유도체, 모산 화합물과 아민의 반응에 의하여 제조된 아미드 또는 아실화 염기 유도체를 형성하기 위한 염기성 기(예컨대, 저급 알킬아미드)를 포함한다.

본 명세서에서 "약학적으로 허용가능한 염"이라는 용어는 표적 동물(예컨대, 포유류)가 생리학적으로 수인가능한 본 발명의 화합물의 모든 (예컨대, 산 또는 염기와 반응하여 얻은)염을 의미한다. 본 발명 화합물의 염은 유기 또는 무기 산 및 염기로부터 유도될 수 있다. 산의 예로서는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-황산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 그 자체로는 약학적으로 허용할 수 없지만 옥살산 등의 그 밖의 산 또한 본 발명의 화합물 및 이들의 약학적으로 허용가능한 첨가염을 획득하기 위한 중간체로서 유용한 염의 제조시 사용될 수 있다.

염기의 예에는 알칼리 금속(예컨대, 나트륨) 수산화물, 알칼리 토금속(예컨대, 마그네슘) 수산화물, 암모니아 및 화학식 NW₄ ⁺의 화합물 포함하나 이에 한정되지않는다. 여기서, W는 C_l _-4의 알킬, 및 이와 유사한 것이다.

염의 예에는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파레이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 플루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말레이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 옥살렌이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 토실레이트, 언데카노에이트 및 이와 유사한 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다 그 밖의 염의 예에는 Na⁺, NH₄ ⁺, 및 NW₄ ⁺ (여기서 W는 C_l _-4의 알킬기이다), 및 이와 유사한 적절한 양이온과 화합하는 본 발명 화합물의 음이온이 포함된다. 치료용으로 사용되기 위하여, 본 발명 화합물의 염은 약학적으로 허용가능하도록 고려되었다. 그러나 약학적으로 허용불가한 산 및 염기의 염도 예컨대, 약학적으로 허용가능한 화합물의 제조 또는 정제에 사용될 수 있다.

본 명세서에서 "치료적 유효량"이라는 용어는 질환의 하나 이상의 증상을 완화 또는 진행의 예방 또는 감소시키는 결과를 나타내기에 충분한 치료제의 양을 의미한다. 예를 들어, 암 치료의 경우, 치료적 유효량은 종양 성장 속도, 종양 크기, 전이 수의 감소 및 종양 진행 시간, 생존 기간의 증가를 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100% 변화시키는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 "민감하다" 및 "민감한"이라는 용어는 최초 약제(예컨대, 화학식 I의 화합물) 투여를 통하여 동물 또는 동물의 세포가 2차 약물 투여의 생물학적 영향(예컨대, 세포 성장, 증식, 침입, 혈관생성 또는 세포 자멸등을 포함하나 이에 제한되지 않는 세포 기능적 특징을 증진 또는 지연시키는)에 더 민감하거나 또는 더 잘 반응하는 것을 의미한다. 표적 세포에 대한 제1 투여의 민감 효과는 제2차 투여 및 미투여시의 의도한 생물학적 영향 (예컨대, 세포 성장, 증식, 침입, 혈관생성 또는 세포 자멸등을 포함하나 이에 제한되지 않는 세포 기능적 특징을 증진 또는 지연시키는)간의 차이에 의하여 측정될 수 있다.

민감 세포의 응답성은 적어도 제1 투여 부재시의 경우보다 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 350%, 적어도 300%, 적어도 350%, 적어도 400%, 적어도 450%, 또는 적어도 500% 증가될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "세포 자멸의 조절곤란"이라는 용어는 세포 자멸을 통한 세포사를 하게되는 세포 작용(예컨대, 소인(predisposition)의 변이를 의미한다. 세포 자멸의 조절곤란은 자가면역 질환(예컨대, 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 이식대숙주병, 중증근무력증, 또는 쇼그랜증후군), 만성 염증 질환 (예컨대, 건선, 천식 또는 크론병), 과다증식성 질환(예컨대, 종양, B 세포 림프종, 또는 T 세포 림프종), 바이러스 감염 (예컨대, 헤르페스, 파필로마 또는 HIV), 및 골관절염 및 죽상동맥경화증 등의 질환등을 포함하는 다양한 질환과 관계되어있는 또는 이에 의하여 유도된 것이다. 바이러스 감염에 관계된 또는 이에 의하여 유도된 조절곤란의 경우, 바이러스 감염은 조절곤란이 발생 또는 관찰되는 시간에 검출 될 수도 있고 안될 수도 있다는 사실에 주의하여야 한다. 즉, 바이러스 유도성 조절곤란은 바이러스 감염의 증상이 사라진 후에 발생할 수도 있다.

본 명세서에서 사용된 "과다증식 질환"이라는 용어는 동물 세포의 국부 증식량이 정상 성장의 일반적 제한에 의하여 조절되지 않는 것을 의미한다. 과다증식 질환의 예에는 종양, 신생물(neoplasms), 림프종 및 이와 유사한 것이 포함된다. 신생물은 침입 또는 전이시에는 양성이 되며 이들의 경우 악성이 된다. "전이성" 세포는 이웃하는 체구조에 침입 및 파괴하는 세포를 의미한다. 과다형성(hyperplasia)은 구조 또는 기능의 중대한 분화없이 기관 또는 조직내에서 세포 수가 증가하는 세포 증식의 한 형태이다. 화생(Metaplasia)은 안 종류의 완전 분화된 세포가 다른 형태의 분화 세포로 대치되는 조절된 세포 성장의 일 형태이다.

활성화된 림프 세포의 병리학적 성장은 자가면역 질환 또는 만성 염증 질환이 된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "자가면역 질환"은 개체 자체 분자, 세포 또는 조직을 인식하는 항체 또는 면역 세포를 생성하는 모든 질환을 의미한다. 자가 면역 질환의 비제한적 예에는 자가면역성 용혈빈혈, 자가면역 간염, 버거씨병 또는 IgA 신장병, 비열대스프루, 만성 피로 증후군, 크론병, 피부근육염, 섬유근육통, 이식대숙주병, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 특발성 저혈소판 자색반증, 편평태선, 다발경화증, 중증근무력증, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 공피증, 쇼그랜증후군, 전신성 홍반성 루프스, 타입 1 당뇨, 궤양대장염, 백반증 및 이와 유사한 것이 포함된다.

본 명세서에서 사용하는 "신생물병(neoplastic disease)"이라는 용어는 양성(비암성) 또는 악성 (암성)이 될 수 있는 비정상적 세포성장을 의미한다.

본 명세서에서 사용하는 "항-신생물제"라는 용어는 표적(예컨대, 악성)신생물의 증식, 성장 또는 전파를 지연시키는 모든 화합물을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"이라는 용어는 동물의 병리학적 세포 (예컨대, 과다증식 또는 신생물 세포)의 발생을 감소시켜주는 것을 의미한다.

예방은 대상체 내에서 병리학적 세포의 완전한 부재로 완성된다. 예방은 부분적이 되어 대상체 내에서 병리학적 세포의 발생이 본 발명의 투여가 없는 경우보다 낮아지는 것이다.

본 발명의 IAPs 억제제는 다음 화학식 1로 표시되는 화합물, 약제학적으로 허용가능한 이들의 염 또는 이들의 전구약물이다.

화학식 1

상기 식에서,

R₁은 C₁ _-2 알킬 또는 C₁ _-2 할로알킬이고;

X는 CONH, CH₂O, CH₂NH, CH₂S, 또는 (CH₂)_1-3이고;

Z는 CONH, CH₂0, NHCO, (CH₂)_1-4, (CH₂)_1-3CONH(CH₂)_0-3, (CH₂)_1-3S(CH₂)_0-3, (CH₂)_1-3NH(CH₂)_0-3, (CH₂)_1-3NHCO(CH₂)_0-3, (CH₂)_1-3NHSO₂(CH₂)_0-3, (CH₂)_1-3NHC(0)NH(CH₂)_0-3, (CH₂)_1-3NHC(S)NH(CH₂)_0-3, (CH₂)_1-3NR'(CH₂)_0-3, 여기에서 R'은 측쇄가 있거나 또는 측쇄가 없는 알킬 또는 시클로알킬이거나 치환되거나 치환되지 않은 아릴, 알킬아릴, 헤테로아릴 또는 알킬헤테로아릴이다.

유용한 알킬기에는 직쇄형 또는 가지형 C₁ _-10 알킬기, 특히 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, t-부틸, sec-부틸, 3-펜틸, 아다만틸, 노르보닐, 및 3-헥실기가 포함된다.

유용한 아릴기에는 C₆ _-14 아릴, 특히 페닐, 나프틸, 페난트레닐, 안트라세닐, 인데닐, 아주레닐, 바이페닐, 바이페닐레닐, 및 프루오레닐기가 포함된다.

유용한 헤테로아릴기에는 티에닐, 벤조[b]티에닐, 나프토[2,3-b]티에닐, 시안트레닐, 퓨릴, 퓨라닐, 이소벤조푸라닐, 크로메닐, 잔테닐, 페노잔테닐, 2H-파이롤릴, 파이롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 피리딜, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 인돌리지닐, 이소인돌릴, 3H-인돌릴, 인돌릴, 인다졸릴, 퓨리닐, 4H-퀴놀리지닐, 이소퀴놀릴, 퀴놀릴, 프탈지닐, 나프타리디닐, 퀴노잘리닐, 시놀리닐,프테리디닐, 카바졸릴, β-카보리닐, 페난트리디닐, 아크리디닐, 페리미디닐, 페난트롤리닐, 페나지닐, 이소티아졸릴, 페노티아졸릴, 이소옥사졸릴, 퓨라자닐, 페녹사지닐, 1,4-디하이드로퀴녹살린-2,3-디온d, 7-아미노이소코마린, 피리도 [1,2-a] 피리미딘-4-온, 1, 2-벤조이소옥사졸-3-릴, 벤즈이미다졸릴, 2-옥사인돌릴, 및 2-옥소벤즈이미다졸릴이 포함된다. 헤테로아릴기는 고리에 질소 원자를 포함하며, 이러한 질소 원자는 N-산화물, 예컨대, 피리딜 N-산화물, 피라지닐 N-산화물, 피리미디닐 N-산화물, 및 이와 유사한 것들의 형태가 될 수 있다

선택적 치환체로서는 하나 이상의 알킬 ; 할로; 할로알킬 ; 시클로알킬 ; 하나 이상의 저급 알킬, 할로, 할로알킬 또는 헤테로아릴기로 필요에 따라 치환된 아릴; 하나 이상의 저급 알킬, 할로알킬, 또는 헤테로아릴기로 필요에 따라 치환된 아릴옥시; 하나 이상의 저급 알킬, 할로알킬, 및 아릴기로 필요에 따라 치환된 아르알킬, 헤테로아릴; 하나 이상의 저급 알킬, 할로알킬, 및 아릴기로 필요에 따라 치환된 헤테로아릴옥시; 알콕시; 알킬티오; 아릴티오; 아미노 ; 아실옥시; 하나 이상의 저급 알킬, 할로알킬 및 아릴기로 필요에 따라 치환된 아릴아실옥시; 하나 이상의 저급 알킬, 할로 또는 할로알킬기로 필요에 따라 치환된 디페닐포스피닐옥시; 하나 이상의 저급 알킬, 할로알킬, 및 아릴기로 필요에 따라 치환된 헤테로시클로; 하나 이상의 저급 알킬, 할로알킬, 및 아릴기로 필요에 따라 치환된 헤테로시클로알콕시; 하나 이상의 저급 알킬, 할로알킬, 및 아릴기로 필요에 따라 치환된 부분적으로 불포화된 헤테로시클로알킬; 또는 하나 이상의 저급 알킬, 할로알킬, 및 아릴기로 필요에 따라 치환된 부분적으로 불포화된 헤테로시클로알킬옥시를 포함한다.

유용한 시클로알킬기는 C₃ _-8 시클로알킬이다. 전형적인 시클로알킬기는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 및 시클로헵틸을 포함한다.

유용한 포화 또는 부분적으로 포화 카보고리형기는 상기 정의된 시클로알킬기 및 시클로펜테닐, 시클로헵테닐 및 시클로옥테닐 등의 시클로알케닐기이다.

유용한 할로 또는 할로겐기에는 불소, 염소, 브롬 및 요오드가 포함된다.

유용한 아릴알킬기에는 전술한 C₆ _- ₁₄아릴기에 의하여 치환된 전술한 모든 C₁ _-10 알킬기가 포함된다. 유용한 것으로서는 벤질, 페네틸 및 나프틸메틸이 있다.

유용한 할로알킬기에는 하나 이상의 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 치환된 C_1-10 알킬기, 예컨대, 프루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 펜타플루오로에틸, 1,1-디플루오로에틸, 클로로메틸, 클로로플루오로메틸 및 트리클로로메틸기를 포함한다.

유용한 알콕시기에는 전술한 C₁ _-10 알킬기 중의 하나로 치환된 산소를 포함한다.

유용한 알킬티오기에는 전술한 C₁ _-10 알킬기 중의 하나로 치환된 황이 포함된다. 또한 이러한 알킬티오기의 설폭사이드 및 설폰이 포함된다.

유용한 아미도기에는 카르보닐아미도 및 아미노 질소에 결합된 모든 C_1-6 아실 (알칸올), 예컨대, 아세트아미도, 프로피온아미도, 부타노일아미도, 펜타노일아미도, 헥사노일아미도 및 아실기로 치환된 아릴-치환 C_2-6가 포함된다.

유용한 아실옥시기에는 옥시 (--O--)기에 결합된 모든 C_1-6 아실 (알카노일), 예컨대, 포밀옥시, 아세트옥시, 프로피오노일옥시, 부타노일옥시, 펜타노일옥시, 헥사노일옥시 및 이와 유사한 것들이 포함된다.

유용한 아릴아실옥시기에는 전술한 아실옥시기 중의 하나로 치환된 전술한 아릴기, 예컨대, 2,6- 디클로로벤조일옥시, 2,6-디플루오로벤조일옥시 및 2, 6-디-(트리플루오로메틸)-벤조일옥시 기가 포함된다.

유용한 아미노기에는 --NH₂,--NHR₁₁, 및 --NR₁₁R₁₂, 여기서 R₁₁ 및 R₁₂는 상기 정의된 C_l _- ₁₀ 의 알킬 또는 시클로알킬기가 포함된다.

유용한 포화 또는 부분적으로 포화된 헤테로고리형기에는 테트라하이드로퓨라닐, 퓨라닐, 피페리디닐, 피페리지닐, 파이롤리디닐, 이미다졸리디닐, 이미다졸리닐, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 퀴뉴클리디닐, 몰포리닐, 이소크로마닐, 크로마닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 테트로노일 및 테트라모일기가 포함된다.

특정한 본 발명의 화합물은 광학 이성질체를 포함하는 입체 이성질체로 존재할 수 있다. 본 발명은 모든 입체 이성질체 및 이러한 입체 이성질체의 라세미 혼합물과 기술분야의 숙련자라면 잘 알고 있는 방법에 따라 분리할 수 있는 개개의 에난시오머를 포함한다

일 실시 상태에서, 본 발명의 화합물은 다음의 화학식 2의 입체화학물질을 가지게되며, 여기서 변수들은 전술한 바와 동일하다.

본 발명에 따른 임의의 양태에 있어서, 화학식 1의 화합물은 이하의 화합물을 포함한다:

본 발명의 화합물은 기술분야의 숙련자라면 잘 알고 있는 방법에 따라 제조될 수 있다. 특히, 화학식 1의 화합물은 실시예의 예시적인 반응에 의해 설명된 바와 같이 제조될 수 있다.

본 발명의 중요한 특징은 화학식I의 화합물이 세포 자멸을 유도하고 세포 자멸 유도 싱호에 대한 응답으로 세포 자멸 유도를 촉발시킨다. 따라서, 이 화합물은 이러한 유발제에 대한 내성이 있는 세포를 포함하여 세포가 세포 자멸 유발제에 민감하도록 한다. 본 발명의 IAP 억제제는 세포 자멸 유도에 의하여 모든 질환의 치 료, 완화 또는 예방하가 위한 세포 자멸 유도에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 IAP 단백질을 과다 발현하는 동물을 표적화하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일 실시 상태에서, 세포는 (예컨대, 암 세포) 비병리학적 시료(예컨대, 비암성 세포)에 비하여 IAP 단백질 농도가 증가됨을 보여준다. 또 다른 실시 상태에서, 세포는 세포 자멸 프로그램을 수행하여 IAP 단백질 농도를 높이고 화학식I의 화합물의 억제 유효량에 대한 응답으로 사멸된다. 상기 응답은 적어도 부분적으로는 이러한 세포의 생존을 위한 IAP 단백질 기능에 대한 의존성에 기인한다.

일 실시 상태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 질병이 있는 세포, 조직, 기관 또는 병리학적 상태 및/또는 동물(예컨대, 인간 및 가축을 포함하나 이에 한정되지 않는 포유류 대상체)의 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 다양한 질환 및 병리상태는 본 조성물 및 방법을 사용하여 치료 또는 예방을 할 수 있다. 이러한 질병 및 질환을 비제한적으로 열거하면: 유방암, 전립선암, 림프종, 피부암, 최장암, 결장암, 흑색종, 악성 흑색종, 난소암, 뇌암, 원발 뇌암종, 두경부암, 신경아교종, 아교모세포종, 간암, 방광암, 비소세포폐암, 두부 또는 경부 암종, 유방 암종, 난소 암종, 폐 암종, 소세포폐 암종, 윌름 종양, 경부 암종, 고환 암종, 방광 암종, 췌장 암종, 위 암종, 결장 암종, 전립선 암종, 비뇨기 암종, 갑상선 암종, 식도 암종, 골수종, 다발 골수종, 부신 암종, 신장 세포 암종, 자궁 내막 암종, 부신 피질 암종, 악성 취장 인슐린종, 악성 카르시노이드 암종, 융모암종, 균상식육종, 악성 고칼슘혈증, 경부 과다형성증, 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 과립성 백혈 병, 급성 과립성 백혈병, 털세포 백혈병, 신경모세포종, 횡문근육종, 카포시육종, 필수 혈소판 증가증, 호지킨병, 비호지킨림프종, 연조직 육종, 골육종, 원발 고분자글로블린혈증 및 망막모세포종, 및 이와 유사한 것, T 및 B 세포 매개 자가면역 질환; 염증 질환; 감염; 과다증식 질환; AIDS; 퇴행성 질환, 혈관계 질환, 및 이와 유사한 것이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 일 실시 상태에서, 치료되는 암 세포는 전이된 것이며, 또 다른 실시 상태에서, 치료되는 암 세포는 항암제 내성이 있는 것이다.

일 실시 상태에서, 본 발명의 조성물 및 방법으로 치료하기에 적합한 감염 질환은 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 미코플라스마, 프리온 및 이와 유사한 것이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시 상태에서는 적어도 1종의 추가 치료제(화학요법 항 신생물제, 항생제, 항바이러스제, 항곰팡이제 및 항염증제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.) 및/또는 치료 기법 (예컨대, 외과 시술 및/또는 방사선 요법)과 함께 화학식I의 화합물의 유효량을 투여하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 사용할 수 있는 적합한 많은 항암제가 고려된다. 물론, 본 발명은 수많은 항암제 예컨대: 세포 자멸 유도 약물; 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 안티센스, 리보자임, siRNA); 폴리펩티드 (예컨대, 효소 및 항체); 생물학적 유사물 (예컨대, 고시폴(gossypol) 또는 BH3 유사물); Bax 등의 Bcl-2 족 단백질과 결합하는 약물(예컨대, 올리고머라이즈 또는 복합체); 알카로이드; 알킬화제; 항종양 항생제; 항대사물질; 호르몬; 백금 화합물; 단세포군 또는 다세포군 항체 (예컨대, 항암제, 독소, 디페신과 접합한 항체), 독소; 방사성뉴클라이드(radionuclides); 생물학적 응답 변형제 (예컨대, 인터페론(예컨대, IFN-a) 및 인터류킨(예컨대, IL- 2) ); 입양 면역요법제; 조혈 성장 인자; 종양 세포 분화 유도제(예컨대, all-trans-레티노산); 유전자 요법 시약(예컨대, 안티센스 요법 시약 및 뉴클레오타이드); 종양 백신; 혈관 생성 억제제 ; 프로테오좀 억제제: NF-KB 모듈레이터; 항-CDK 화합물; HDAC 억제제s; 및 이와 유사한 물질을 투여하도록 고려되었으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 화합물과 공동투여하기에 적합한 많은 여타의 화학 요법 화합물 및 항암 요법은 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다.

양호한 실시 상태에서, 항암제는 세포 자멸을 유도 또는 자극하는 약물을 포함한다. 세포 자멸을 유도하는 약물에는 방사선 (예컨대, X-레이, 감마 레이, UV); 키나아제 억제제 (예컨대, 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 키나아제 억제제, 혈관 성장 인자 수용체 (VGFR) 키나아제 억제제, 섬유모세포 성장 안자 수용체 (FGFR) 키나아제 억제제, 혈소판 유도 성장 안자 수용체 (PDGFR) 키나아제 억제제, 및 Bcr-Abl 키나아제 억제제 (예컨대, GLEEVEC)); 안티센스 분자; 항체 (예컨대, HERCEPTIN, RITUXAN, ZEVALIN, 및 AVASTIN); 항 에스트로겐 (예컨대, 라록시펜(raloxifene) 및 타목시펜(tamoxifen)); 항 안드로겐 (예컨대, 플루트아미드, 비칼루트아미드, 피나스테라이드, 아미노글루테스아미드, 케토코나졸, 및 코르티코스테로이드) ; 시클로옥시다아제 2 (COX-2) 억제제 (예컨대, 셀레콕시브(celecoxib), 멜록시캄(meloxicam), NS-398, 및 비스테로이드성 항염증제(NSAIDs)) ; 항 염증제 (예컨대, 부타졸리딘(butazolidin), DECADRON, DELTASONE, 덱사메타 손(dexamethasone), 덱사메타손 인텐솔(dexamethasone intensol), DEXONE, HEXADROL, 하이드로옥시클로로퀴네(hydroxychloroquine), METICORTEN, ORADEXON, ORASONE, 옥시펜부타존(oxyphenbutazone), PEDIAPRED, 페닐부타존(phenylbutazone), PLAQUENIL, 프레드니솔론(prednisolone), 프레드니손(prednisone), PRELONE, 및 TANDEARIL); 및 암 화학 요법 약물 (예컨대, 이리노테칸(irinotecan) (CAMPTOSAR), CPT-11, 플루다라빈(fludarabine) (FLUDARA), 데카바진(dacarbazine) (DTIC), 덱사메타손(dexamethasone), 미톡산트론(mitoxantrone), MYLOTARG, VP-16, 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 5-FU, 독소루비신(doxorubicin), 겜시타빈(gemcitabine), 보테조미브(bortezomib), 게피티닙(gefitinib), 베카시주맙(bevacizumab), TAXOTERE 또는 TAXOL); 세포간 신호 분자; 세라미드 및 사이토카인; 스타우로스포린 및 이와 유사한 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

또 다른 실시 상태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 화학식I의 화합물 및 알킬화제, 항 대사물질 및 천연 물질(예컨대, 허브 및 그 밖의 식물 및/또는 동물 유도 화합물)로부터 선택된 적어도 1종의 항 과다증식제 또는 항신생물제를 제공한다.

본 발명의 조성물 및 방법에 적합한 알킬화제에는 : 1) 질소 머스터드 (예컨대, 메클로르에타민(mechlorethamine), 시클로포스포아미드, 이포스파미드, 멜팔란(L-사르콜리신); 및 클로람부실); 2) 에틸렌이민 및 메틸멜라민 (예컨대, 헥사 메틸릴멜라민 및 티오테파); 3) 알킬 설포네이트 (예컨대, 부설판(busulfan)) ; 4) 니트로소레아스(nitrosoureas) (예컨대, 카르무스틴(carmustine) (BCNU); 로무스틴(lomustine) (CCNU); 세무스틴(semustine) (메틸-CCNU); 및 스트렙토조신 (스트렙토조토신(streptozotocin))) ; 및 5) 트리아젠(triazenes) (예컨대, 다카르바진(dacarbazine) (DTIC; 디메틸트리아제노이미드-아조레카복스아미드)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

일 실시 상태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 적합한 항대사산물은 : 1) 폴산(folic acid) 유사체 (예컨대, 메토트렉세이트 (아메톱테린(amethopterin))); 2) 피리미딘 유사체 (예컨대, 플루오로우라실 (5-플루오로우라실; 5-FU), 플루옥스우리딘 (플루오로디-옥시우리딘; FudR), 및 사이타라빈 (사이토신 아라비노사이드(cytosin arabinoside)) ); 및 3) 퓨린 유사체 (예컨대, 머캅토퓨립 (6-머캅토퓨립; 6-MP), 티오구아닌 (6-티오구아닌; TG), 및 펜토스타틴 (2'-디옥시코포르마이신))를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

또 다른 실시 상태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 적합한 화학요법제에는: 1) 빈카 알카로이드 (예컨대, 빈블라스틴(vinblastine) (VLB), 빈크리스틴(vincristine)) ; 2) 에피포도필로톡신 (예컨대, 에토포사이드(etoposide) 및 테니포사이드(teniposide)); 3) 항생제 (예컨대, 닥티노마이신 (악티노마이신 D), 다우노루비신 (다우노마이신; 엠비도마이신), 독소루비신, 블레오마이신, 플리카마이신 (미트라마이신), 및 미토마이신 (미토마이신 C)) ; 4) 효소 (예컨대, L-아스파라기나아제); 5) 생물학적 응답 변형제 (예컨대, 인터페론-alfa) ; 6) 백금 조절 복합체 (예컨대, 시스플라틴 (cis-DDP) 및 카보플라틴); 7) 안트라센디온 (예컨대, 미톡산트론); 8) 치환된 우레아 (예컨대, 하이드록시우레아); 9) 메틸하이드라진 유도체 (예컨대, 프로카바진 (N-메틸히드라진; MIH) ) ; 10) 아드레노코르티코 억제제(예컨대, 미토탄 (o,p'-DDD) 및 아미노글루테트이미드); 11) 아드레노코르티코스테로이드 (예컨대, 프레드니손); 12) 프로게스틴 (예컨대, 하이드록시 프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 및 메게스트롤 아세테이트); 13) 에스트로겐 (예컨대, 디에틸스틸베스트롤 및 에티닐 에스트라디올); 14) 항에스트로겐 (예컨대, 타목시펜) ; 15) 안드로겐 (예컨대, 테스토스테론 프로피오네이트 및 플루옥시메스테론); 16) 항 안드로겐 (예컨대, 플루트아미드) : 및 17) 고나도트로핀-분비 호르몬 유사체 (예컨대, 루프롤라이드)를 포함하나 이에 한정되지 않는다..

암 치료에 일반적으로 사용되는 종양제(oncolytic agent)가 본 발명의 조성물 및 방법에 사용된다. 예를 들어, 미국 식품 의약 안전청(U. S. Food and Drug Administration)은 미국 내에서 종양제 처방전을 사용하도록 유지하였으며. U. S. F. D. A.의 국제적인 대응 기관에서는 유사한 처방전을 유지하였다. 표 1은 미국에서 허용하는 항신생물제의 예시를 열거하였다. 이 분야의 숙련된 기술자라면 미국에서 승인한 화학요법제에 요구되는 "제품 라벨"이 예시된 약제에 대한 승인된 지침, 복용 정보, 독성 데이터 등을 설명한다는 것을 알 수 있다.

본 발명에 따른 화합물과 함께 투여되는 전통적인 항암제는 아드리아마이신, 5-플로로우라실, 에토포사이드(etoposide), 캄포토테신(campotothecin), 엑티노마이신 D(actinomycin D), 미토마이신 C(mitomycin C), 시스플라틴(cisplatin), 도세탁셀(docetaxel), 겜시타바인(gemcitabine), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 보르테조밉(bortezomib), 저피티닙(gefitinib), 및 베바시주맙(bevacizumab) 등을 포함하나 이에 한정하는 것은 아니다. 상기한 제제들을 제조하여 단독으로, 병용된 치료 조성물과 함께, 키트로, 또는 면역치료제 등과 병용하는 방법 등으로 사용될 수 있다.

항암제 및 다른 치료제에 대한 보다 상세한 설명을 위해, Physician`s Desk Reference 및 Goodman과 Gilman의 "Pharmaceutical Basis of Therapeutics" ninth edition, Eds.Hardman et al., 1996과 같은 기술매뉴얼이 참조되나 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명은 방사선 치료와 함께 화학식 I의 화합물을 투여하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 동물에게 방사선의 치료적 투여량을 전달하기 위하여 사용되는 전달 및 투여 시스템 또는 총량, 종류에 의하여 제한되지 아니한다. 예를 들어, 동물은 광방사선치료, 입자 빔 방사선 치료, 다른 종류의 방사선치료, 및 이들의 결합에 의한 치료를 받을 수 있다. 일부 양태로서, 방사선은 선형 가속기를 이용하여 동물에게 전달된다. 다른 양태로서, 방사선은 감마 나이프(gamma knife)를 이용하여 전달된다.

방사선의 소스는 동물의 외부 또는 내부에 있을 수 있다. 외부 방사선 치료는 가장 일반적이며 선형 가속기를 사용하여 고 에너지의 방사선을 피부를 통과하여 종양 부위에 투사하는 것을 포함한다. 방사선 빔이 종양 부위에 위치하는 동안에 정상적이고 건강한 조직이 노출되는 것을 피하는 것은 불가능한 것이 아니다. 그러나, 환자들은 외부 방사선에 대하여 내성이 있는 것이 일반적이다. 내부 방사선 치료법은 신체 내부의 종양 부위에 표적 암 세포에 특이적인 전달시스템(예컨대, 암 세포 결합 리간드에 결합되는 입자를 사용하는 것)을 사용하여 비드, 와이어, 팔렛, 캡슐, 입자 등의 방사선 방출 소스를 이식하는 것을 포함한다. 이러한 이식체는 상응하는 치료법 또는 신체를 불활성시키는 방법으로 제거하는 것이 가능하다. 내부 방사선 치료법의 종류는 근접치료, 근접 방사선 조사, 강내 방사선 조사, 방사선면역치료법 등이 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

동물은 방사선 민감제 또는 방사선 보호제를 선택적으로 받을 수 있다. 상기 방사선 민감제로는 멘트로니다졸(metronidazole), 미소니다졸(misonidazole), 인트라-아터리얼 Budr(intra-arterial Budr), 정맥아이오도데옥시유리딘(intravenous iododeoxyuridine (IudR)), 니트로이미다졸(nitroimidazole), 5-치환-4-니트로이미다졸(5-substituted-4- nitroimidazoles), 2H-이소인돌레디온(2H- isoindolediones), [[(2-브로모에틸)-아미노]메틸]-니트로-1H-니트로이미다졸-1-에탄올([[(2-bromoethyl)- amino]methyl-nitro-1 H-imidazole-1-ethanol], 니트로아닐린 유도체(nitroaniline derivatives), DNA-친화 하이폭시아 선택 사이토톡신(DNA-affnic hypoxia selective cytotoxins), 할로겐화된 DNA 리간드(halogenated DNA ligand), 1,2,4-벤조트리아진 옥사이드(1,2,4 benzotriazine oxides), 2-니트로이미다졸 유도체(2- nitroimidazole derivatives), 플루오린 포함된 니트로아졸 유도체(fluorine-containing nitroazole derivatives), 벤자마이드(benzamide), 니토틴아마이드(nicotinamide), 아크리딘-인터캘래터(acridine-intercalator), 5-티오트레트라졸 유도체(5-thiotretrazole derivative), 3-니트로-1,2,4-트리아졸(3-nitro-1,2,4- triazole), 4,5-디니트로이미다졸 유도체(4,5-dinitroimidazole derivative), 하이드록실레이티드 텍사프린(hydroxylated texaphrins), 시스플라틴(cisplatin), 미토마이신(mitomycin), 티리파자민(tiripazamine), 니트로소우레아(nitrosourea), 메캅도퓨린(mercaptopurine), 메소트렉세이트(methotrexate), 플루오우라실(fluorouracil), 브레오마이신(bleomycin), 빈크리스틴(vincristine), 카보플라틴(carboplatin), 에피루비신(epirubicin), 독소루비신(doxorubicin), 사이크로포스파마이드(cyclophosphamide), 빈데사인(vindesine), 에톱포사이드(etoposide), 파클리탁셀(paclitaxel), 온열요법 등이 있고, 상기 방사선 보호제로는 시스테아민(cysteamine), 아미노알킬 디하이드로젠 포스포로티오에이트(aminoalkyl dihydrogen phosphorothioates), 아미포스틴(amifostine (WR 2721)), IL-1, IL-6, 등이 있다. 방사선민감제는 종양세포의 사멸을 강화한다. 방사선보호제는 건강한 조직을 방사선의 유해한 영향으로부터 보호한다.

방사선 투사량이 허용불가능한 음성 부작용 없이 환자가 수용할 수 있는 한, 임의의 방사선 종류를 환자에게 투여할 수 있다. 예를 들어, 적당한 방사선 치료법의 종류로는 이온화 방사선 치료법(예컨대, X-레이 또는 감마-레이) 또는 입자 빔 방사선 치료법(예컨대, 고 선형 에너지 방사선)을 포함한다. 이온화 방사선은 이온화 생산 즉, 전자의 이득 또는 손실에 충분한 에너지를 갖는 입자 또는 광자로 구성된 방사선으로 정의된다(예컨대, US 5,770,581). 방사선의 영향은 임상의학자에 의하여 부분적으로 조절될 수 있다. 방사선의 투여량은 가장 효과적인 표적 세포 노출을 위하여 세분화되고 독성을 감소한다.

동물에게 투여되는 방사선의 총 투사량은 약 0.01 Gy 내지는 약 100 Gy 인 것이 바람직하다. 약 10 Gy 내지는 약 65 Gy (예컨대, 약 15 Gy, 20 Gy, 25 Gy, 30 Gy, 35 Gy, 40 Gy, 45 Gy, 50 Gy, 55 Gy, 또는 60 Gy)가 치료과정을 통하여 투여되는 것이 보다 바람직하다. 일부 양태의 경우, 완전한 방사선의 투사량이 하루의 과정을 거치며 투여될 수 있는 반면, 여러 날을 거치며 전체 투사량이 이상적으로 세분화되거나 투여된다. 바람직하게는, 방사선 치료는 약 3일 과정(예컨대, 최소한 5, 7, 10, 14, 17, 21, 25, 28, 32 ,35, 38, 42, 46, 52, 또는 56일 약1-8주) 동안 투여된다. 따라서, 방사선의 하루 투사량은 대략 1 내지 5 Gy (예컨대, 약 1 Gy, 1.5 Gy, 1.8 Gy, 2 Gy, 2.5 Gy, 2.8 Gy, 3 Gy, 3.2 Gy, 3.5 Gy, 3.8 Gy, 4 Gy, 4.2 Gy, 또는 4.5 Gy), 바람직하게는 1-2 Gy(예컨대, 1.5-2 Gy)로 구성될 것이다. 방사선의 하루 투사량은 표적 세포의 파괴를 야기할 정도로 충분해야 한다. 만약 기간을 넘는다면, 방사선은 매일 투여되지 않는다. 그것에 의하여 동물의 휴식 및 치료효과의 인식을 허락하게 된다. 예를 들어, 각 치료의 일주일에 있어서, 연속 5일 동안 방사선을 투여하고 2일 동안 방사선을 투여하지 않으면, 그것에 의하여 일주일에 2일의 휴식을 허락한다. 그러나, 방사선은 동물의 반응 및 어떤 잠재적인 부작용에 의존하여 1일/주, 2일/주, 3일/주, 4일/주, 5일/주, 6일/주, 또는 모든 7일/주로 투여할 수 있다. 방사선 치료법은 치료기간 내에 언제든지 시작될 수 있다. 바람직하게는, 방사선은 1주 또는 2주내에 시작되며, 치료기간의 남은 기간 동안 투여된다. 예를 들어, 고형 종양의 치료를 위한 6주간의 치료기간의 1내지 6주 내 또는 2내지 6주 내에 방사선이 투여된다. 대안적으로, 방사선은 5주간의 치료기간의 1내지 5주 내 또는 2내지 5주 내에 방사선이 투여된다. 이러한 예시적인 방사선 치료법 투여 스케줄이 본 발명의 권리범위를 제한하기 위한 것은 아님은 물론이다.

본 발명에서는 항균 치료제 또한 치료 제제로써 사용될 수 있다. 미생물의 기능을 약화시키거나, 억제 또는 소멸시킬 수 있는 제제들은 이러한 활성이 고려되는 한 다양하게 사용될 수 있다. 항균제는 천연 및 합성 항생제, 디펜신과 같은 억제단백질, 안티센스 핵산, 막 파괴 제제 등의 단독 또는 결합 형태를 포함하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 나아가, 항생제의 종류도 항박테리아 제제, 항바이러스 제제, 항진균제 등을 포함하여 사용될 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 일부 양태에 의하면, 화학식 I의 화합물 및 하나 이상의 치료제 또는 항암제는 다른 주기성, 다른 기간, 다른 농도, 다른 투여 경로 등과 같은 하나 이상의 조건하에서 동물에게 투여된다. 일부 양태에 의하면, 화합물은 치료제 또는 항암제에 보다 먼저(예컨대, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12, 또는 18 시간 전, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 전, 1, 2, 3, 또는 4주 전)투여된다. 다른 양태에 의하면, 화합물은 치료제 또는 항암제 보다 나중에(예컨대, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12, 또는 18 시간 후, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 후, 1, 2, 3, 또는 4주 후) 투여된다. 또 다른 양태에 의하면, 상기 화합물과 치료제 또는 항암제는 동시에 그러나 다른 스케쥴로 즉, 치료제 또는 항암제는 1주일에 1번, 2주일에 1번, 3주일에 1번, 4주일에 1번 꼴로 투여되지만 화합물은 매일 투여되는 스케줄로 투여될 수 있다. 또 다른 양태에 의하면, 화합물은 1주일에 한번 투여되지만, 치료제 또는 항암제는 매일, 1주일에 1번, 2주일에 1번, 3주일에 1번, 4주일에 1번 꼴로 투여된다.

본 발명의 범위에 속하는 조성물은 발명의 목적 달성을 위하여 효과적인 양으로 이루어지는 본 발명의 화합물의 모든 조성을 포함한다. 개개인의 요구는 다양하지만, 각 구성요소의 효과적인 양의 최적범위를 결정하는 것은 기술분야에 속한다. 일반적으로, 화합물은 포유류 즉, 인간에 대하여 0.0025 내지 50 mg/kg, 또는 이와 동등한 양의 약학적으로 허용가능한 염을 아포프토시스(apoptosis)의 유도에 잘 반응하는 질환치료를 받는 포유류의 체중의 일일당 경구 투여될 수 있다. 바람직하게는, 약 0.01 내지 약 10 mg/kg 이 이러한 질환을 치료, 약화 또는 예방하기 위해 경구 투여되는 것이다. 근육내 주입을 위하여, 투여량은 일반적으로 구강 투여의 약 절반이다. 예를 들어, 알맞은 근육내 투여는 약 0.0025 내지 약 25mg/kg, 가장 바람직하게는 약 0.01 내지 약 5 mg/kg일 수 있다.

단위 경구 투여량은 약 0.01 내지 약 50 mg, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 10 mg의 화합물로 구성될 수 있다. 단위 투여량은 하루에 한 번 이상 투여될 수 있으며, 약 0.1 내지 약 10, 편리하게는 약 0.25 내지 50mg의 화합물 또는 그것의 용매화합물을 포함하는 하나 이상의 알약 또는 캡슐로써 투여될 수 있다.

국소 제제의 경우, 화합물은 담체의 그램 당 약 0.01 내지 100 mg의 농도로 제조될 수 있다. 바람직한 양태에 의하면, 화합물은 약 0.07 내지 1.0 mg/ml, 더 바람직하게는, 약 0.1 내지 0.5 mg/ml, 가장 바람직하게는, 약 0.4 mg/ml의 농도로 제조된다.

정제되지 않은 화학물질로써의 화합물을 투여하는 것에 부가하여, 본 발명에 따른 화합물은 약학적으로 사용 가능한 약제로 화합물의 프로세스를 촉진시키는 부형제 및 보조제로 구성된 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학제제의 일부로써 투여될 수 있다. 바람직하게는, 상기 약제, 특히 경구 또는 국부적으로 투여되는 약제 및, 알약, 당제, 슬로우 일리즈 로젠지 및 캡슐, 마우스 린스 및 마우스 워시, 젤, 액상 서스펜션, 헤어 린스, 헤어 젤, 샴푸와 같이 투여의 보다 나은 종류를 위해 사용되는 약제 및, 국부 또는 경구 주입에 의한 투여를 위한 알맞은 솔루션(solution) 뿐만 아니라 서포지토리(suppositories)와 같은 직장 투여가 가능한 약제는 부형제와 함께 약 0.01 내지 99%, 더 바람직하게는 약 0.25 내지 75%의 활성 성분을 포함한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 동물에게 투여되며, 상기 동물은 본 발명에 따른 화합물의 유리한 효과를 경험하게 될 것이다. 상기 동물 중 주요한 것으로는 포유류(예컨대, 인간)가 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 또한 상기 동물은 소, 양, 돼지, 말, 개, 고양이와 같은 가축 동물을 포함한다.

화합물 및 그것의 약학적 조성물은 본 발명의 목적 달성을 위하여 다양한 수단으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 비경구, 피하조직, 정맥, 근육내, 복망내, 경피, 볼(buccal), 경막내, 머리속, 비강내 또는 국소경로 등을 통하여 투여될 수 있다. 선택적으로 또는 동시에, 투여는 경구에 의할 수도 있다. 투여량은 환자의 나이, 건강 및 몸무게, 동시치료의 종류에 의존하며 치료의 빈도 및 치료효과의 성격이 무엇이든지 간에 동시치료의 종류에 의존한다.

본 발명에 따른 약학적 제제는 통상적인 방법에 의하여 제조된다. 예를 들어, 전통적인 믹싱(mixing), 조립(granulating), 당제제조(dragee-making), 용해(dissolving), 또는 동결건조처리(lyophilizing processes)와 같은 수단이 사용될 수 있다. 따라서, 경구 용법을 위한 약학적 제제는 활성 성분과 고체 부형제를 혼합하여 얻을 수 있으며, 필요하다면, 알약 또는 당제를 얻기 위해 적당한 보조제를 첨가한 후, 선택적으로 결과 혼합물을 글라인딩(grinding) 및 과립 혼합물을 프로세싱(processing)함으로서 얻을 수 있다. 특히, 적당한 부형제는 당류와 같은 충전제, 예컨대, 락토즈 또는 수크로스, 맨니톨 또는 소비톨, 셀룰로스 약제 및/또는 칼슘 포스페이트, 예컨대, 트리칼슘 포스페이트 또는 칼슘 하이드로젠 포스페이트, 및 결합체 예컨대, 전분 페이스트, 예컨대, 옥수수전분, 밀전분, 쌀전분, 감자전분, 젤라틴, 트래거캔스, 메틸셀룰로스, 하이드록시플로필메틸셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 및/또는 폴리비닐 피로리돈(polyvinyl pyrrolidone)이다. 필요에 따라, 관심이 없는 약제를 첨가할 수 있다. 예컨대, 상술한 전분 및 카르복실메틸전분, 크로스링크드 폴리비닐 피로리돈(cross linked polyvinyl pyrrolidone), 우무(agar), 또는 아르기닉 산 또는 소듐 알지네이트와 같은 그의 염을 첨가할 수 있다. 또한, 보조제는 흐름조절제(flow-regulating agents) 및 윤활제(lubricant), 예컨대, 실리카, 활석, 스테아르 산 또는 그의 염, 예컨대, 마그네슘, 스테아르 또는 칼슘 스테아르, 및/또는 폴리에틸렌 글리콜이다. 당제핵은, 필요하다면, 위산에 내성을 갖는 적당한 코팅과 함께 제공된다. 이를 위해, 농축된 전분 용액이 사용될 수 있으며, 선택적으로 아라비아검, 활석, 폴리비닐 피로리돈, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 티타늄 다이옥사이드, 래커 용액 및 알맞은 유기 용매 또는 용매 혼합물 등이 포함될 수 있다. 위산에 내성을 갖는 코팅을 생산하기 위하여, 적당한 셀룰로스 약제의 용액, 예컨대, 아세틸셀룰로스 프탈레이트(acetylcellulose phthalate) 또는 하이드록시프로필메틸-셀룰로스 프탈레이트(hydroxypropylmethyl-cellulose phthalate) 등이 사용될 수 있다. 색소 원료 또는 도료는 알약 또는 당제 코팅의 확인을 위하여 또는 활성 성분의 조합을 특성화하기 위하여 첨가될 수 있다.

경구 투여로 사용되는 다른 약학 제제는 젤라틴으로 만든 소프트(soft), 밀봉된 캡슐 및 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 가소제뿐만 아니라 젤라틴으로 만든 푸쉬-핏 캡슐을 포함한다. 상기 푸쉬-핏 캡슐은 과립 형태의 활성 화합물을 포함할 수 있으며, 락토즈와 같은 충전제, 전분과 같은 결합체, 및/또는 활석 또는 마그네슘 스테아르와 같은 윤활제 및 선택적으로, 안정화제와 혼합될 수 있다. 소프트 캡슐에 있어서, 활성 화합물은 적당한 액체, 예컨대, 지방 오일, 또는 리퀴드 파라핀 등에서 용해 또는 부유하는 것이 바람직하다. 나아가, 안정화제가 첨가될 수 있다.

직장 투여로 사용되는 가능한 약학 제제는 예컨대, 좌약을 포함하며, 하나 이상의 활성 화합물과 좌약 기제(base)의 조합으로 구성된다. 적당한 좌약 기제로는 예컨대, 천연 또는 합성 트리글리세라이드, 또는 파라핀 하이드로카본 등이 있다. 나아가, 활성 화합물과 기제의 조합으로 구성된 젤라틴 직장 캡슐을 사용하는 것 또한 가능하다. 가능한 기제 물질로는 예컨대, 리퀴드 트리글리세라이드, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 파라핀 하이드로카보 등을 포함한다.

비경구적 투여를 위한 적당한 제제는 수용성 형태의 활성 화합물 수용액, 예컨대, 수용성 염 및 알칼라인 용액을 포함한다. 나아가, 적합한 기름진 주입 현탁액으로써의 활성 화합물의 현탁액이 투여될 수 있다. 적당한 친지질성 용매 또는 매개체는 지방 오일, 예컨대, 참깨기름, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대, 에틸 올레이산 염 또는 트리글리세라이드 또는 폴리에틸렌 글리콜-400 등을 포함한다. 수용성 주입 현탁액은 현탁액의 점성을 증가시키는 물질, 예컨대, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 및/또는 덱스트란 등을 포함한다. 또한, 선택적으로 현탁액은 안정화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 국소 조성물은 기름, 크림, 로션, 연고 등 적합한 담체의 선택에 의하여 조제되는 것이 바람직하다. 적합한 담체는 야채 또는 미네랄 오일, 화이트 바셀린(white petrolatum), 브렌치 체인 지방(branched-chain fats) 또는 오일, 동물 지방 및 고 분자량 알코올(C12보다 큰 것) 등을 포함한다. 바람직한 담체로는 활성 성분이 용해될 수 있는 것이다. 유화제, 안정화제, 습윤제 및 항산화제 역시 포함되며, 아울러 색채 또는 향기를 부여하는 약제도 필요에 따라 포함될 수 있다. 나아가, 경피 침투 강화제는 이러한 국소 제제에 채택될 수 있으며, 이러한 강화제는 U.S.3,989,816 및 4,444,762에 개시되어 있다.

크림은 미네랄 오일, 자가 유화 밀납 및 물의 혼합물로부터 조제되며, 이러한 혼합물에 아몬드 오일과 같은 소량의 오일에 용해된 활성 요소가 첨가된다. 이러한 크림의 전형적인 예시는 약 40 중량부(parts)의 물, 약 20 중량부의 밀납, 약 40 중량부의 미네랄 오일 및 약 1 중량부의 아몬드 오일을 포함한다.

연고는 아몬드 오일과 같은 야채 오일의 활성 요소의 용액과 따뜻한 소프트 파라핀을 혼합시키고 상기 혼합물을 차갑게 함으로써 조제된다. 이러한 연고의 전형적인 예시는 약 30 중량% 아몬드 오일 및 약 70 중량% 화이트 소프트 파라핀(white soft paraffin)을 포함한다.

로션은 활성 성분을 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 고분자 알코올에 용해시킴으로써 간편하게 제조된다.

이하의 실시예는 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 특정의 실시예에 한정되지 아니한다. 즉, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자라면, 본 발명에 대한 다수의 변경 및 수정이 가능하며, 그러한 모든 적절한 변경 및 수정의 균등물들도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주되어야 할 것이다.

실시예 1 형광 편광 검출법의 개발

형광 편광을 사용한 시험관내 정량 바인딩 에세이가 개발되었다. Smac이 XIAP에 결합하는 것은 Smac의 N-말단에 위치한 소수의 아미노산 잔기에 의하여 매개된다(도 1). 두 개의 다른 형광 프로브 즉, 천연 9-mer Smac 펩타이드(AVPIAQKSEK (SEQ ID NO:3)) 및 돌연변이 5-mer Smac 펩타이드(AbuRPFK, 여기서 Abu = 2- aminobutyric acid (SEQ ID NO:4))가 합성되었다. 각각의 프로브는 형광 태그(AVPIAQKSEK-FAM, termed S9F and AbuRPFK-FAM, termed SM5F, respectively)로써 6-카르복시플루오레세인 숙시니미딜 에스테르(FAM)가 표지되었다. 양성 대조군으로써, 표지되지 않은 9-mer 및 5-mer Smac 펩타이드(S9 및 SM5)가 사용되었다. His 태그가 부착된 인간 XIAP-BIR3 단백질(잔기 241-356)은 안정적이고 용해가 가능하며 결합 에세이(assay)로 사용되었다.

먼저, 형광 표지된 S9F 및 SM5F의 XIAP-BIR3에 대한 해리 상수 값은 펩타이드의 상수 농도(5nM)를 사용하고 단백질의 증가된 농도(0-40um)로 특히, 예상된 Kd 값 이상으로 적정시켜서 측정하였다. 도 2는 포화 실험을 위한 싱글-사이트 바인딩 모델(single-site binding model)에 알맞은 비선형 리스트 스퀘어(least squares)를 보여준다. S9F는 236mP±1.21mP의 최대 결합 범위로 0.24uM의 Kd 값을 갖는 것으로 측정되었다. SM5F 프로브의 경우 0.018uM(17.92nM)의 Kd 값과 276mP±0.75mP 최대 결합의 큰 동적 범위를 갖는 것으로 측정되었다. 에세이는 24시간 동안 안정적이었고, Kd 값 및 결합 범위는 변하지 않았으며, 4% DMSO는 영향이 없었다.

SM5F가 천연 Smac 펩타이드 S9F 에 비하여 큰 결합 친화도 (약 10배가 더 큼)와 큰 동적 범위를 갖기 때문에, 표지된 펩타이드가 경쟁 바인딩 에세이를 위하여 선택되었다. 사용된 에세이 조건은 5nM SM5F 및 0.030 uM XIAP-BIR3 단백질이며, 다음과 같은 고려사항에 기초하였다. 즉, 0.030 uM XIAP는 SM5F의 Kd 보다 약 2배가 크다; 5nM SM5F는 어떠한 억제제가 특정 레벨의 형광을 갖는 경우 배경 형광을 극복하기 위해 충분한 형광 강도를 갖는다. 이러한 조건 하에서, 표지자는 약 60%로 포화되었고, 에세이를 민감하게 만들었다. mP 범위(결합된 펩타이드의 mP-자유 펩타이드의 mP)는 88±2.43mP 였으며, 이것은 정확한 mP 변화의 검출을 위한 커다란 편광 신호 윈도우이다. 에세이의 질적 통계적 파라미터인 Z 인자는 0.88이었으며, 이것은 SM5F 프로브에 기초한 형광 편광 에세이가 고 수율 스크리닝을 위해 적당하다는 것을 확인시켜 준다.

에세이의 특이성은 상응하는 미표지 돌연변이 Smac 5-mer(SM5) 및 천연 Smec 9-mer(S9) 펩타이드를 사용한 경쟁 실험에 의하여 검증된다(도 3). 두 가지 경우에, 데이터는 미표지 펩타이드가 표지자의 결합을 방해할 수 있는 것을 나타낸다. S9에 대한 1.49±0.211lM (Ki = 0.54 0.15 uM) 및 SM5에 대한 0.22 0.011lM (Ki = 0.075 0.005 uM)의 IC50 값이 얻어졌다. 얻어진 IC50 값은 단백질/펩타이드 쌍의 Kd 값 보다 더 크다. 왜냐하면, S/N 비율을 최대로 하기 위하여 경쟁적 FP 바인딩 에세이의 단백질 농도가 결정된 Kd 값보다 크기 때문이다. 그러나, 두 개의 미표지 펩타이드의 IC50 값의 비율은 대응되는 표지 펩타이드의 Kd 값의 비율과 상관관계가 있다. 표지된 SM5F 및 S9F 사이의 Kd 값의 비율은 7.2 배(fold)인 것에 비해, 미표지된 SM5 및 S9의 IC50 값의 비율은 6.7 배이다. 이러한 이유 때문에, 디자인된 Smac 유사체의 경우, IC50 값은 결합 친화도의 적절한 대조를 위하여 같은 조건하에서 표지된 SM5F 및 S9F의 Kd 값과 천연 Smac 펩타이드(S9) 및 돌연변이 Smac 펩타이드(SM5)의 IC50 값이 함께 보고되었다. 나아가, 결합 에세이에 기초한 FP 내에서 억제제의 결합 친화도(Ki)를 계산하기 위한 새로운 수학 방정식이 개발되었고, 높은 IC50 값의 문제를 극복하였다. 직접 결합 실험에 의하여 결정된 표지된 펩타이드(SM5F 및 S9F)의 얻어진 Kd 값은 경쟁 에세이로 얻어지고 새로운 방정식으로 계산된 미표지 펩타이드의 Ki 값과 비슷하다.

에세이 조건의 검토를 위하여, XIAP-BIR3에 대하여 다른 결합 친화도를 갖는 두 개의 부가적인 공개된 Smac 테트라펩타이드를 테스트 하였다(도 3)(Kipp et al., Biochemistry 41:7344 (2002)). AVPI (SEQ ID NO:1), 천연 Smac 펩타이드는, 1.58±0.22uM(Ki=0.58±0.15uM)의 IC50 값을 가졌으며, 이는 천연 Smec 9-mer S9로서 본질적으로 같은 것이다. AVPI (SEQ ID NO:1) 보다 약한 친화력을 갖는 것으로 보고된 다른 펩타이드, AVER (SEQ ID NO:5)은, 이러한 에세이 조건 하에서 79.31±8.8uM(Ki=29.09±1.88uM)의 IC50 값을 갖는 것으로 측정되었다. 이러한 결합 실험에서, XIAP 단백질에 대한 얻어진 펩타이드 친화도의 순서는 공개된 결과와 잘 일치하였다(AbuRPFK (SEQ ID NO:4) > AVPI (SEQ ID NO:1) = AVPIAQKSEK (SEQ ID NO:3) > AVPR (SEQ ID NO:5)). 이러한 결과는 다양한 결합 친화도를 갖는 Smac 펩타이드의 결합 친화도를 정확하고 정량적으로 결정하기 위하여 FP 기반의 바인딩 에세이를 사용하는 것이 적당하다는 점을 암시한다.

실시예 2 실험 3D 구조에 기초한 Smac 와 XIZP BIR3간의 상호작용 분석

Smac 단백질 및 펩타이드의 복합체에서 XIZP BIR3 도메인의 고해상 실험 3차원 구조(도 1)는 유용한 Smac 유사체를 디자인하는데 있어서 고체 구조적 기초를 제공한다. 포지션 1(A1`)의 알라닌 아민 그룹은 Q319 및 E314의 사이드 체인 및 D309의 백본(backbone) 카르보닐 그룹과 4개의 수소결합을 형성한다. 알라닌의 메틸 그룹은 작지만 잘 정의된 소수성 포켓에 결합된다. 본 분석에 의하면 이러한 소수성 포켓은 메틸에 비하여 다소 큰 소수성 그룹을 수용할 수 있다는 것을 보여준다. 알라닌 잔기의 백본 카르보닐은 W323의 사이드 체인과 수소 결합을 형성하지만, 이러한 수소 결합은 최적화된 것이 아니며 그것의 기하학적 파라미터에 기초한다.

Smac내의 발린의 아미노 및 카르보닐 그룹은 T308의 백본 카르보닐 및 아미노 그룹에 최적의 수소결합을 각각 형성시킨다. 사이드 체인 이소프로필 그룹은 XIAP BIR3내의 잔기와 가까운 접촉을 피하기 위하여 나타나며, 그것은 XIAP BIR3내의 W323으로부터 대략 4-5 Å정도이다.

포지션 3(P3`)의 프롤린 잔기는 Smac 펩타이드의 입체형태를 조절하는데 있어서 중요한 역할을 담당하며, XIAP BIR3 내의 W323의 소수성 사이드 체인과 가깝게 접촉되어 있다. 그것의 백본 카르보닐 그룹은 용매를 향하는 경향을 보이고 단백질과 특별한 상호작용을 보이지는 않는다.

포지션 4(I4`)에 이소루이신 잔기의 소수성 사이드 체인은 XIAP BIR3 내의 잘 정의된 소수성 포켓에 결합한다. I4`의 아미노 그룹은 G306의 백본 카르보닐과 수소결합을 형성하며 카르보닐기는 단백질과 특별한 상호작용을 보이지는 않는다.

최근 측정된 캐스페이즈(caspase)-9 및 XIAP BIR3의 고해상 X-레이 구조에서 유사한 상호작용이 관찰되었음이 주목된다. 여기서 캐스페이즈(caspase)-9의 4개 잔기 ATPF(SEQ ID NO:2)가 XIAP BIR3과의 상호작용을 매개한다. 이러한 원자적 디테일, 고해상 실험 구조는 Smac 유사체를 디자인하는데 있어서 정교한 구조적 기초를 제공한다.

실시예 3 입체형태적으로 경직된 비-펩타이드 Smac 유사체의 디자인

Smac AVPI 펩타이드의 디자인 및 수정은 효과적인 단순 Smac 펩티도 유사체를 야기한다. 그러나, 이러한 Smac 유사체는 2-3의 천연 아미노산 및 1-2의 천연 펩타이드 결합을 가진다. 이러한 단순 Smac 유사체에서 펩타이드 특성을 더욱 감소시키기 위하여, 입체형태적으로 경직된 비-펩타이드 Smac 유사체를 3차원 복합체 구조 및 단순 Smac 펩티도 유사체로부터 얻어진 데이터를 기초로 디자인 및 합성하였다.

XIAP BIP3의 복합체에서 Smac의 실험 3차원 구조 및 이소루신이 벤질라민(benzylamine)(화합물1)으로 치환된 Smac AVPI(SEQ ID NO:1)을 위한 모델 구조는 Smac AVPI 펩타이드(SEQ ID NO:1)와 화합물 1에서 발린의 사이드 체인 및 프로린 링이 결합 그루브의 용매를 향하는 경향을 보여준다. 따라서, 이러한 두 잔기를 단백질과의 입체 충돌 없이 추가적 링 시스템의 형성을 통하여 환화시키는 것이 가능하다. 화합물 1(표 2)은 이러한 디자인 전략을 테스트하기 위하여 주형 분자로 사용된다. 새롭게 형성된 링에서는 탄소 원자의 수에 의존하여, 링 시스템의 다른 사이즈가 구성될 수 있다. 초기 디자인에서는 링 시스템의 3가지 사이즈, 즉, [5,5], [6,5], 및 [7,5] 바이사이클릭 링 시스템 등이 합성적으로 실현가능하기 때문에 디자인되었다.

이러한 환화 전략은 두개의 천연 아미노 산(발린 및 프롤린)이 비아미노 산, 바이사이클릭, 락탐 링 시스템으로 전환하게 하고 결과적인 Smac 유사체는 비-펩타이드 화합물이 된다.

각각의 링 시스템에는, 연결 탄소 원자에 키랄(chiral) 중심 생성에 기인하는 두가지 입체이성질체가 있다. 따라서 각 입체이성질체는 각 링 시스템을 위한 모델이다. [5,5] 바이사이클릭 링 시스템을 갖는 화합물 17 및 18(표 2참조)의 경우, 펩타이드 백본 및 AVIP(SEQ ID NO:1)내의 프로린 링에 대응되는 이러한 원자에 대하여 중요한 형태적 변이가 있다는 것이 발견된다. 결과적으로, Smac AVPI 펩타이드(SEQ ID NO:1) 및 화합물 1에서 관찰한 바와 같이, 화합물 17 및 18은 최적의 수소 결합 및 유리한 소수성 상호작용을 형성하지 못한다. 따라서, [5,5] 바이사이클릭 락탐 링 시스템을 갖는 화합물 17 및 18은 XIAP에 약하게 결합할 것으로 예측된다. 이러한 화합물의 합성실험은 수행하지 않았다.

[6,5] 바이사이클릭 링 시스템을 갖는 화합물 19(표 2참조)는 X-레이 구조에서의 Smac AVPI 펩타이드(SEQ ID NO:1)/XIAP와 모델 구조에서의 화합물 1/ XIAP BIR3의 상호작용과 수소 결합 및 소수성 상호작용 면에서 상당히 유사하였다. Smac AVPI 펩타이드(SEQ ID NO:1)/XIAP BIR3에 대조적으로 화합물 19를 위한 모델 복합체 구조는 도 5에 도시되었다. 도시된 바와 같이, X-레이 구조에서의 Smac AVPI 펩타이드(SEQ ID NO:1)에서 발견되는 모든 중요한 수소결합은 화합물 19와 XIAP BIR3사이에서 형성된다. 화합물 19내의 페닐 링은 I4` 소수성 사이드 체인 및 화합물 1의 페닐 링과 유사하게 소수성 포켓으로 삽입된다. Smac AVPI 펩타이드(SEQ ID NO:1)내의 프로린 링은 W323의 사이드 체인과 가깝게 접촉되는 것으로 발견된다(도 1). 그러나, 화합물 19의 5-멤버 링은 Smac AVPI 펩타이드(SEQ ID NO:1) 및 화합물 1의 프로린 링과 비교하여 바깥쪽으로 구부러지고 약간의 변이를 갖는다(도 5). 결국, 모델링 결과에 기초하여, 화합물 19는 XIAP BIR3에 적당한 결합 친화도를 갖는 것으로 볼 수 있다. 반면에, 입체이성질체 화합물 20(표 2 참조)는 효과적으로 XIAP BIR3와 상호작용할 수 없다. 비록 Smac AVPI 펩타이드(SEQ ID NO:1)내의 백본 및 프롤린 링에 대응되는 원자에 대한 형태적 특성이 화합물 20에서 여전히 유지되더라도, 새롭게 형성된 6-멤버 링은 XIAP의 W323 잔기와 반 데르 발스 힘을 갖는다. 따라서, 화합물 20은 XIAP에 약한 친화도를 갖는 것으로 볼 수 있다.

[7,5] 바이사이클릭 링 시스템을 갖는 화합물 21의 경우(표 2참조), 수소 결합 및 소수성 상호작용 면에서 AVPI(SEQ ID NO:1) 및 화합물 1과 더 유사한 것으로 나타났다(도 6). 사실, 새롭게 형성된 7-멤버 링은 XIAP내의 W323 잔기와 추가적인 소수성 결합을 갖는 것으로 나타났다(도 6). 반면에, 다른 입체이성질체 화합물 22(표 2참조)은 모델 구조에서 XIAP BIR3와 수소 결합 및 소수성 상호작용이 유지되지 않는 것으로 밝혀졌다.

실시예 4

[6,5] 및 [7,5] 바이사이클릭 링 시스템을 갖는 Smac 유사체의 합성

일반적 방법 : 300 MHz 양성자 주파수의 NMR 스펙트라가 얻어진다. 수소 원자의 이동은 내부적 표준에 의하여 Me4Si (0.00 ppm), CHCl3 (7. 26 ppm) 또는 CD3HOD (3.31 ppm)로 알려져있다. 탄소 원자의 이동은 내부적 표준에 의하여 CDCl3 (77.00 ppm) or CD3OD (49.00 ppm)로 알려져 있다. 광회전은 실온에서 측정되었다.

일반적 절차 A (메틸 에스테르를 가수분해하기 위한 절차) :

1,4-다이옥신에 관한 기질의 잘 저어준 용액에 2N LiOH(2eq)를 상온에서 첨가한다. 모든 출발 물질이 소멸된 후, pH 5가 될 때까지 1N HCl을 첨가한다. 디클로로메탄은 생성물을 추출하기 위하여 사용되고, 결합된 유기 층은 염수로 세척하고 Na2SO4로 건조한다. 축합 후, 잔기는 생성물을 얻기 위해 실리카 겔상에서 크로마토그래피된다.

일반적 절차 B (아미드의 제조를 위한 절차) :

EDCI(1.2eq) 및 HOBt(1.2eq)와 같은 두 기질의 혼합물을 잘 저어주고 디이소프로필에틸아민을 상온에서 첨가한다. 혼합물을 하룻밤 동안 저어주고 축합시킨다. 잔기는 생성물을 얻기 위해 실리카 겔 상에서 크로마토그래피된다.

일반적 절차 C (Boc의 디프로텍션을 위한 절차) :

잘 저어준 기질 용액에 1,4 다이옥신(4eq)의 4.0M HCl 용액을 첨가한다. 하룻밤 동안 잘 저어준 후, 용액을 진공에서 축합한다. 잔기는 생성물을 얻기 위해 동결건조된다.

일반식 III의 화합물은 산을 얻기 위해 상기 절차 A에 따라 가수분해된다. 이러한 산은 일반식 IV의 아미드를 수득하는 상기 절차 B에 따라 아민과 함께 축합된다. 상기 C 절차에 따른 Boc 프로텍티브 그룹의 제거는 아미드 시리즈를 공급하는 상기 절차 B에 따라 상응하는 (L)-N-Boc-아미노 산과 축합을 거쳐 이루어진다. 이러한 아미드의 Boc 프로텍티브 그룹의 제거는 일반식 V의 화합물을 제공한다.

실시예 5

[8,5] 바이사이클릭 링 시스템을 갖는 Smac 유사체의 합성

화학식 VI의 화합물은 Harris et al., Org. Lett. 1847 (2003)에 따라 제조된다. 10% Pd-C에 의하여 촉매되는 수소화반응을 수반하여 화학식 VI의 이중 결합 환원은 화학식 VII의 화합물을 제공하게 된다. 아민과 축합을 거쳐 수행되는 화학식 VI의 에틸 에스테르의 가수분해는 화학식 VIII의 아민을 산출한다. 상응하는 아미노산과 축합을 거쳐 수행되는 화학식 VIII의 Boc 프로텍티브 그룹의 제거는 아미드 시리즈를 생산하게 된다. 이러한 아미드의 Boc 프로텍티브 그룹의 제거는 목적하는 화학식 IX의 화합물을 생산하게 된다. 화학식 XI는 VII로부터 동일한 절차에 따라 합성 가능하다.

실시예 6

[6,5] 바이사이클릭 링 시스템에서의 Smac 유사체의 결합 친화도

[6,5] 바이싸이클릭 링 시스템에서의 화합물 19는 실시예 4에서 기술한 것과 같이 합성되었다. 모델링 예측을 확인하기 위하여, 화합물 20이 또한 합성되었다. 이러한 두 개의 화합물은 FP-기반 결합 에세이에서 시험되었고, 결합 데이터는 표3에 제공되었다. 화합물 19는 10μM 보다 작은 Ki 값을 가지며, 화합물 20은 어떤 결합도 200μM 값에 이르지 않음을 발견하였다. 결합 데이터는 모델링 결과와 일치하였다.

화합물 19가 화합물 1과 Smac AVPI 펩타이드(서열번호 1)보다 대략 15배 적은 값을 가지는 것은 주목할 만한데, 이는 화합물 19의 5원환과 XIAP의 W323이 화합물 1의 프롤린 링과 Smac AVPI 펩타이드(서열번호 1)과 비교하였을 때, 덜 효과적인 상호작용을 하기 때문이다.

단일 Smac 유사체에 대한 연구는 A1'에서의 메틸 그룹을 에틸 그룹으로 교체하는 것이 화합물 19에 대한 결합을 향상시킬 것임을 암시한다. 화합물 31(표3) 은 그래서 화합물 19의 메틸 그룹을 에틸 그룹으로 교체하여 합성되었다. 단일 Smac 유사체는 또한 화합물 19의 벤질 그룹을 디페닐메틸 그룹으로 교체하는 것이 결합능력을 더욱 향상시킬 것임을 암시한다. 화합물 32(표 3)는 그렇게 합성되었다. 이러한 화합물들은 FP-기반 에세이에서 시험되었고, 그들의 결합 데이터는 표3에 제공되었다. 볼 수 있듯이, 화합물 31은 1.41μM이라는 Ki 값을 가지며, 화합물 19보다 3배 이상의 효능이 있다(도 7). 화합물 32는 Ki 값이 0.35μM인데, 이는 화합물 31보다 4배 이상 그리고 화합물 32보다 12 배 이상이 되는 값이다(도 7). 화합물 32는 천연 AVPI Smac 펩타이드(서열번호 1)과 단일 유사체 화합물 1과 같은 값을 가짐에 주목할만하다.

실시예 7

[7,5] 바이싸이클릭 링 시스템에서의 Smac 유사체의 결합 친화도

모델링 결과는 [7,5] 바이싸이클릭 링 시스템에서의 화합물 21이 [6,5] 바이싸이클릭 링 시스템에서의 화합물 19보다 XIAP BIR3에 대해 더 잘 결합할 것을 암시한다. 그래서 화합물 21이 합성되었다. 화합물 19와 20에 대한 결합 데이터에 기반을 두었을 때, 입체 이성체 19만이 활성이 있어 화합물 22는 합성되지 않았다.

화합물 21은 실시예 4에 기술된 방법을 사용하여 합성되었다. 화합물 21은 0.15μM이라는 Ki 값을 가지며, [6,5] 바이싸이클릭 링 시스템에서의 화합물 19와 비교하였을 때 그보다 30배 효능이 있음이 측정되었다(표4). 화합물 21은 사실 단일 Smac 유사체 화합물 1과 천연 Smac AVPI 펩타이드(서열번호 1)보다 2배 더 효능이 있으며, 이는 약속된 선구 화합물을 나타내는 것이고 모델링 예측과 계획된 전략을 확정하는 것이다.

화합물 21의 좋은 결합 능력에 고무되어, 화합물 33과 34가 화합물 21과 유사한 방법을 사용하여 디자인되고 합성되었다(표 4). 화합물 33은 0.66μM(60nM)이라는 Ki 값을 가지며, 반면 화합물 34는 0.02μM(20nM)이라는 Ki 값을 가진다(도 7). 그래서, 화합물 34는 매우 효능있는 비펩티드성 배좌의 강요된 Smac 유사체를 나타내는데, 이는 천연 Smac AVPI 펩타이드(서열번호 1)보다 29배 더 표능있는 결합 능력을 갖는다.

몇몇 다른 비-펩티드성 배좌의 강요된 Smac 유사체가 고안되고, 합성되었으며 FP-기반 결합 에세이에서 시험되었다. 결과는 표 5에서 볼 수 있다.

실시예 8

NMR 방법에 의한 XIAP에 대한 화합물 34의 결합 확인

화합물 34(표 4, 표 5의 SH-102와 동일한)가 Smac가 결합하는 XIAP BIR3의 결합 그루브에 결합하는지를 확인하기 위해 핵자기 공명(NMR) 방법을 이용하여 분석하였다. His-tag에 융합된 사람의 XIAP BIR3 도메인(241 내지 356 잔기)은 ¹⁵N으로 균일하게 표지된 단백질에 대해 ¹⁵N 암모늄 클로라이드를 함유하는 M9 배지에서 BL21(DE3) 세포로부터 발현되어 정제되었다. ¹⁵N Heteronuclear Single Quantum Coherence Spectroscopy (HSQC) NMR 스펙트럼은 30 ℃에서 100 μM의 화합물 34를 포함하거나 포함하지 않는 50 mM Tris (pH 7.2), 50 μM ZnCl₂, 1 mM DTT 중의 ¹⁵N 단백질 100 μM을 함유하는 샘플로 기록되었다. 화합물 34가 있는 그리고 화합물 34가 없는 사람의 XIAP의 BIR3 도메인에 대한 두 개의 ¹⁵N HSQC 스펙트럼의 오버레이는 화합물 34가 상기 단백질에 결합되어 XIAP BIR3의 몇 개 잔기 내에서 유발된 화학적 시프트를 일으키는 것을 나타내었다(도 8). 또한 일부 새로운 피크가 화합물 34를 이용한 스펙트럼에서 나타나서(도 8), XIAP BIR3와 Smac의 복잡한 구조 내에서 관찰되는 바와 같이 화합물 34와 접촉되었을 때 XIAP BIR3 내의 플렉시블 루프가 구조화되는 것을 암시하였다(Sun et al., J. Biol . Chem . 275:33777 (2000)).

XIAP BIR3 내의 잔기가 화합물 34에 의해 영향받는지를 확인하기 위해 ¹³C와 ¹⁵N으로 이중 표지된 XIAP BIR3를 제조하여 backbone atom resonance assignment를 만들기 위한 3D NMR 트리플 공명 실험을 수행하였다. HNCA, HNCACB, HN(CO)CBCA, HNCO, TOCSY-HSQC, C(CO)NH와 공개된 결과들(Sun et al., J. Biol . Chem . 275: 33777 (2000))을 이용하여 2개의 플렉시블 루프(276 내지 280 잔기)를 제외하고 backbone assignment를 거의 완성하였다. XIAP BIR3의 거의 완성된 backbone assignment에 기초하여, G306, W323, K297, L292 및 K299가 화합물 34에 의해 영향받는 것을 발견하였다(도 8). 또한, 이들 잔기는 NMR 분석에서 Smac AVPI 펩티드(SEQ ID NO:1)에 의해 영향을 받는 것으로 밝혀졌다. Smac/XIAP BIR3의 실험적 복합 구조에 근거하여(도 1), 화합물 34와 Smac AVPI 펩티드 (SEQ ID NO:1)에 의해 영향받는 XIAP BIR3 내의 상기한 잔기들은 Smac 펩티드와 직접적으로 접촉한다. 동일한 방법을 이용하여 화합물 34와 Smac AVPI 펩티드 (SEQ ID NO:1)에 의해 유발되는 것과 같이 화합물 32가 XIAP BIR3의 동일한 세트 잔기에 대해 화학적 시프트를 일으키는지를 측정한 결과, 상기한 Smac 유사물이 화합물 34와 Smac AVPI 펩티드 (SEQ ID NO:1)와 같은 결합 그루브에 결합하는 것으로 나타났다. 아울러, 화합물 32와 34 및 다른 Smac 유사물도 Smac가 결합하는 XIAP BIR3의 결합 그루브에 결합하는 것을 NMR 실험 결과로부터 최종 확인하였다. 이 실험은 또한 Smac 펩티드와 설계된 유사물이 단백질을 풀리게 하지는 않는 것으로 나타났다.

실시예 9

암 세포와 정상 세포에서 IAP류 단백질의 발현

설계된 Smac 유사물의 활성과 특이성을 연구하기 위해 수 종의 사람 암 세포주와 정상 세포에서 XIAP, cIAP-1/2, survivin 및 Smac 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다(도 9).

그 결과, 사람의 전립선암 PC-3 세포는 XIAP와 cIAP-1/2의 농도가 높고survivin의 농도는 낮았으며, 사람의 유방암 MDA-MB-231 세포는 cIAP-l의 농도는 높고 XIAP의 농도는 중정도였으며 cIAP-2와 survivin의 농도는 낮았고, 사람의 전립선암 DU-145 세포는 XIAP의 농도는 높고 cIAP-1/2와 survivin의 농도는 중정도였다.

정상적인 사람 섬유아세포 WI-38 세포는 XIAP, cIAP-1/2 및 survivin의 농도가 낮았고, 정상적인 전립선 상피세포(PrEC)는 PC-3와 DU-145 세포보다는 훨씬 낮지만 검출가능한 농도의 XIAP를 나타내었고 cIAP-1의 농도는 중정도였으며 cIAP-2와 survivin의 농도는 매우 낮았으며, 정상적인 사람 유방 상피세포주 MCF-1OA와 MCF-12A는 검출가능하지만 DU-145와 PC-3 보다는 매우 낮은 XIAP 농도를 나타내었고 cIAP-1의 농도는 검출가능하지만 PC-3와 MDA-231 보다는 매우 낮았으며 cIAP-2와 survivin의 농도는 매우 낮았다.

Jurkat 세포는 XIAP와 cIAP-2의 농도는 낮고 cIAP-1과 survivin의 농도는 중정도였다. 예상했던 바와 같이, XIAP 단백질로 트랜스펙트된 Jurkat 세포는 XIAP의 농도가 매우 높은 반면, 모세포주와 비교하여 다른 IAP 단백질은 변화되지 않았다. Smac 단백질의 농도는 여기에서 시험된 암 세포와 정상 세포 중에서 같은 것으로 나타났다.

실시예 10

전립선암 PC-3 세포에서 Smac 유사물의 Cisplatin으로 유도된 아폽토시스 강화작용

세포 투과성 Smac 펩티드가 신경교종, 흑색종, 유방, 및 비소세포 폐암 세포에서 다양한 화학요법제에 의해 유발된 암 세포의 아폽토시스를 증가시킬 수 있다는 것은 캐리어 펩티드에 융합된 짧은 Smac 펩티드를 이용한 이전의 연구들에서 설득력 있게 입증되었다(Fulda et al ., Nature Med . 8:808 (2002); Arnt et al., J. Biol. Chem . 277:44236 (2002); Yang et al ., Cancer Res . 63:831 (2003)). 상기한 연구들에는 몇 가지 공통적인 특징이 있다. 이러한 세포 투과성 Smac 펩티드는 그들 자체로는 암 세포에서 아폽토시스를 유발하는데 있어서 거의 효과가 없다. 아폽토시스를 유발하는데 화합요법제의 활성을 상당히 강화하기 위해서는 매우 높은 농도의 펩티드(50 내지 100 μM)가 사용되어야만 한다. 본 발명의 기본 전제는 강력한 비펩티드성 Smac 유사물이 세포투과성 Smac 펩티드보다 화학요법제에 의해 유발되는 암 세포의 아폽토시스를 증가시키는데 보다 효과적이라는 것이다. 앞선 실시예들은 Smac AVPI 펩티드 (SEQ ID NO:1)보다 10배 이상 우수한 결합 친화성을 가지는 강력한 비펩티드성 Smac 유사물인 화합물 33과 34에 대해 기재하고 있다. 알라닌의 측쇄가 에틸기로 치환되고 이소루이신이 디페닐메틸기로 치환된 펩티도-유사물, SH-97이 기본 전제를 시험하기 위해 사용되었다. 중요한 것은 SH-97이 여전히 2개의 천연 아미노산(발린과 프롤린)과 하나의 천연 펩티드 결합을 가진다는 것이다. 대조용 화합물로서, 이전에 공개된 세포 투과성 Smac 펩티드(Smac8-C) (Arnt et al ., J. Biol . Chem . 277:44236 (2002))가 양성 대조군으로 사용되었고, 캐리어 펩티드가 없는 Smac 펩티드 (AVPIAQKS) (SEQ ID NO:6)가 음성 대조군(Smac-8)으로 사용되었으며 비활성 화합물(SH-93, 표 5)이 또다른 음성 대조군으로 사용되었다. 이 실험에서는 MAP와 cIAP-1/2 단백질 및 화학요법제인 시스플라틴(cisplatin, CDDP)을 고 농도로 발현하는 PC-3 세포가 사용되었다. CDDP는 DNA 손상제이며 PC-3 세포에서 아폽토시스를 효과적으로 유발할 수 있고 임상적으로 사용되는 전립선암 화학요법제이다.

PC-3 세포는 CDDP, Smac 펩티드 및 유사물 만으로 처리하거나 42시간 동안 함께 처리하였고 Annexin V-FITC 스테이닝으로 아폽토시스를 분석하였다. 세포-투과성 Smac 펩티드를 이용한 이전의 연구와 일치하여 50 μM까지의 SH-97은 처리되지 않은 암 세포와 비교하여 상당히 많은 아폽토시스를 유발하지 않았던 반면, 25 μM CDDP는 대조용 세포와 비교하여 암 세포 12 내지 15%가 아폽토시스를 일으키도록 하였다(도 10A). 25 μM CDDP와 10 μM 또는 25 μM SH-97을 병용한 경우에는 각각 대조용 세포보다 29.3%±1.9% 및 35.8%±0 4%의 아폽토시스가 유발되었다(도 10A). 세포 투과성 Smac 펩티드가 높은 농도의 IAP 단백질을 가지는 다양한 암세포에서 화학요법제의 아폽토시스를 증가시킨다는 공개된 결과와 마찬가지로 25 μM CDDP와 100 μM Smac8-C를 병용하였을 때 대조용 세포에서보다 34% 아폽토시스가 증가된 반면, Smac8-C 자체는 의미있는 효과를 나타내지 않았다(도 10B).

유사한 실험을 SH-102로 실시하였다(표 5). 6-웰 플레이트 내의 PC-3 세포를 42시간 동안 SH-102와 CDDP 만으로 또는 이들을 병용하여 처리하였다. 세포를 수집하고 Annexin V- FITC와 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide)로 염색하였다. 각각 세포의 Annexin V-FITC와 프로피디움 아이오다이드의 형광을 유량 세포분석법에 의해 분석하였다. 100 μM까지의 SH-102는 처리되지 않은 암 세포와 비교하여 상당히 많은 아폽토시스를 유발하지 않았던 반면, 25 및 50 μM CDDP는 대조용 세포와 비교하여 각각 약 15% 및 25%의 암 세포가 아폽토시스를 일으켰다(도 11). 25 μM CDDP와 10 μM SH-102를 병용한 경우에는 대조용 세포와 비교하여 32%의 아폽토시스가 유발되었다(도 11). 상기한 바와 같이, 25 μM CDDP와 100 μM Smac8-C를 병용한 경우에는 대조용 세포와 비교하여 약 34%까지 아폽토시스가 증가된 반면, Smac8-C 자체만으로는 그다지 효과는 없었다(도 12).

또다른 암치료 화학요법제인 TAXOTERE (docetaxel)를 이용하여 동일한 실험을 실시하였다. 6-웰 플레이트 내의 PC-3 세포를 42시간 동안 SH-102와 TAXOTERE 만으로 또는 이들을 병용하여 처리하였다. 세포를 수집하고 Annexin V- FITC와 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide)로 염색하였다. 각각 세포의 Annexin V-FITC와 프로피디움 아이오다이드의 형광을 유량 세포분석법에 의해 분석하였다. 100 μM까지의 SH-102는 처리되지 않은 암 세포와 비교하여 상당히 많은 아폽토시스를 유발하지 않았던 반면, 10 및 20 μM TAXOTERE는 대조용 세포와 비교하여 각각 약 5% 및 8%의 암 세포가 아폽토시스를 일으켰다(도 13). 10 μM TAXOTERE와 10 μM SH-102를 병용한 경우에는 대조용 세포와 비교하여 약 18%의 아폽토시스가 유발되었다(도 13).

유방암 세포주 MDA-231을 이용하여 유사한 실험을 실시하였다. 6-웰 플레이트 내의 MDA-231 세포를 42시간 동안 SH-102와 CDDP 만으로 또는 이들을 병용하여 처리하였다. 세포를 수집하고 Annexin V- FITC와 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide)로 염색하였다. 각각 세포의 Annexin V-FITC와 프로피디움 아이오다이드의 형광을 유량 세포분석법에 의해 분석하였다. 25 μM과 50 μM CDDP는 대조용 세포와 비교하여 각각 약 25%와 42%의 MDA-231세포가 아폽토시스를 일으켰다(도 14). 25 μM의 SH-93과 25 및 50 μM CDDP를 병용한 경우 대조용 세포와 비교하여 그다지 의미있는 효과는 나타나지 않았다. 25와 50 μM CDDP와 10 μM SH-102를 병용한 경우에는 대조용 세포와 비교하여 각각 약 35%와 75%의 아폽토시스가 유발되었다(도 14). CDDP에 대해 세포를 민감화하는 10 μM SH-102의 작용능은 100 μM pSmac8-C와 동등하였다(도 14).

결과적으로, 상기한 결과는 강력한 Smac 유사물이 PC-3 세포와 MDA-231 세포에서 아폽토시스를 유발하는데 있어서 CDDP와 TAXOTERE의 활성을 강화하는데 효과적임을 나타낸다. 또한, 본 발명의 Smac 유사물은 이전의 연구에서 사용된 캐리어 펩티드에 융합된 Smac 펩티드(Smac8-C)보다 더욱 강력한 것으로 나타난 반면, 캐리어 펩티드 또는 비활성 Smac 유사물(SH-93)이 없는 Smac 펩티드는 PC-3 세포와 MDA-231 세포에서 아폽토시스를 유발하는데 있어서 CDDP의 활성을 강화할 수 없었다.

실시예 11

XIAP의 방어효능을 극복하는 SH-102

Smac 유사물이 XIAP의 농도가 상승된 세포에 대해 가지는 효능을 연구하기 위하여(많은 암세포들과 마찬가지로), Jurkat T 세포를 사람 XIAP를 발현하는 벡터 또는 대조용 벡터로 안정하게 트랜스펙트하였다. 대조용 벡터로 트랜스펙트된 Jurkat 세포(Jurkat-Vec)는 웨스턴 블롯에 의해 분석된 바와 같이 XIAP 단백질의 농도가 매우 낮았으며, 사람 XIAP를 코드하는 벡터로 안정하게 트랜스펙트된 Jurkat 세포(Jurkat-Vec)는 XIAP 단백질의 농도가 매우 높았다.

2개의 안정하게 트랜스펙트된 세포주를 암치료 화학요법제 에토포사이드(etoposide)와 SH-102 만으로, 또는 이들을 병용하여 15시간 동안 처리하였다. 세포를 수집하여 빙냉 하에 70% 에탄올에 고정시켰다. 원심분리한 후, 세포를 50 ㎍/ml의 프로피디움 아이오다이드와 0.1 ㎍/ml의 RNase A에서 염색하고 유량 세포분석법으로 분석하였다. 각 샘플은 5000 세포 이상 스캔되었다. 데이터를 분석하여 CellQuest 소프트웨어(Becton Dickinson)를 이용하는 서브-G1 세포(아폽토틱 세포)의 비율을 계산하였다. Jurkat-XIAP 세포는 Jurkat-Vec 세포(약 50%의 아폽토틱 세포)보다 10 μM 에토포사이드(약 10%의 아폽토틱 세포)에 대해 더 내성을 가진다(도 15). 에토포사이드와 병용한 10 μM SH-102는 약 15%의 아폽토시스를 유발하여 약물로 유발된 아폽토시스에 대한 XIAP의 방어효능이 Smac 유사물에 의해 극복될 수 있음을 나타내었다(도 15). 10 μM SH-102는 최소한 50 μM Smac8-C 보다 효과적이다(도 15).

Bir1과 Bir2 도메인이 제거된 사람 XIAP를 발현하는 안정하게 트랜스펙트된 또다른 Juekat 세포주(Jurkat- Bir3)를 제조하였다. 제거된 XIAP 단백질의 발현은 에토포사이드로 유발된 아폽토시스로부터 세포를 보호하였다. 20 μM 에토포사이드는 Jurkat-Bir3 세포에서 약 18%의 아폽토시스를 유발한 반면, 에토포사이드와 10 또는 20 μM SH-102를 병용한 경우는 각각 약 25%와 30%의 아폽토시스를 유발하여(도 16), SH-102가 약물로 유발된 아폽토시스에 대해 XIAP-Bir3의 방어효능을 극복할 수 있음을 나타내었고 Bir3 도메인이 SH-102의 세포 활성에 연관되어 있다는 것을 입증하였다.

실시예 12

클론원성 분석에서 X-선 조사에 대해 PC-3 세포를 감작화하는 SH-97

암 세포에서 XIAP와 다른 IAP 단백질의 과발현이 화학요법제 뿐만 아니라 방사능 조사에 의해 유발되는 아폽토시스를 억제하는 것으로 나타났다(Holcik et al., Oncogene 19:4174 (2000)). 그러므로, SH-97과 같은 강력한 세포 투과성 Smac 유사물로 PC-3 세포를 처리하는 것은 암 세포에 대한 IAP 단백질의 방어 효능을 직접적으로 극복시켜 X-선 조사에 대해 PC-3 세포를 민감하게 할 것으로 예상되었다.

이러한 예측을 시험하기 위해 PC-3 세포를 6-웰 플레이트에서 SH-97과 X-선 조사만으로, 또는 이들을 병용하여 표준 클론원성 분석을 이용하여 처리하였다. 세포 투과성 Smac 펩티드 (Smac8-C)가 다시 양성 대조군으로 사용되었다. 배양 10일 후에 상기 플레이트를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 50 세포 이상을 가지는 콜로니를 ColCount 콜로니 계수기로 계수하였다. 세포 생존곡선을 선형 2차 곡선 피팅으로 플로트하였다(도 17). 아폽토시스 실험과 마찬가지로 SH-97 또는 Smac8-C 자체는 의미있는 효능을 가지지 않았다. 10과 25 μM SH-97 또는 100 μM Smac8-C를 이용한 PC-3 세포의 처리는 방사능의 활성을 상당히 증가시켰다. 이로써 알 수 있는 바와 같이, 6 Gy의 방사능 투여량에서 SH-97 10 및 25 μM은 방사능 조사 단독일 때와 비교하여 콜로니 생성을 10배 이상 감소시켰다. 8 Gy의 방사능 투여량에서 SH-97 10 및 25 μM은 방사능 조사 단독일 때와 비교하여 콜로니 생성을 40배와 50배 이상 감소시켰다. 상기에서 언급된 SH-97과 CDDP의 병용 실험에서 얻어진 결과와 마찬가지로, 6 및 8 Gy 방사능 투여에서 10 μM SH-97 또한 100 μM의 세포 투과성 Smac 펩티드 Smac8-C 보다 더 효과적인 것으로 나타났다. 그러므로, 아폽토시스와 콜로니 생성 실험 모두에서 SH-97에 대한 예비 결과는 강력한 세포 투과성 펩티도 유사물 또는 비펩티드성 펩티드 유사물이 화학요법제와 방사능에 대한 XIAP와 다른 IAP 단백질의 농도가 높은 암 세포의 아폽토시스 내성을 극복하는데 있어서 세포 투과성 Smac 펩티드보다 효과적일 것이라는 기본 전제를 지지하는 증거를 제공한다.

실시예 13

사람 암 세포에서 SH-102에 의한 세포 성장 억제

사람 암 세포에서 세포 성장을 억제하는데 Smac 유사물 자체의 효과를 시험하기 위하여 SH-102를 3개의 상이한 유방암 세포주에 투여하였다. MDA-435, MDA-468, 및 T47D 세포는 96-웰 플레이트에 접종되어 SH-102, Smac8 또는 Smac8-C의 농도를 증가시켰다. 이 세포들을 37 ℃에서 5% CO₂ 하에 5일 동안 항온처리한 후 WST-8로 세포 생존능을 측정하였다. 처리되지 않은 세포는 100% 성장으로 사용되었다. SH-102는 각 세포주의 세포 성장을 억제하였고 약 30 내지 70 μM 범위의 IC₅₀을 나타내었다(도 18A 내지 18C). 한편, 세포 투과성 Smac 펩티드(Smac8-C)는 모든 상기한 세포주의 세포 성장을 억제하는데 있어서 SH-102 보다 저조했다(도 18A 내지 18C). 캐리어 펩티드가 없는 Smac 단백질 서열에서 유도된 천연 Smac 펩티드는 기본적으로 3가지 세포 모두에서 비효과적이었다(도 18A 내지 18C). 이러한 결과는 Smac 유사물질이 사람 암 세포에서 세포 성장을 억제할 수 있음을 시사한다.

상기에서 언급한 바와 같이 본 발명은 본 발명의 범위 또는 이들의 어떤 양태에도 영향을 주지 않으면서 조건, 형태 및 기타 매개변수들의 광범위하고 동등한 범위 내에서 수행될 수 있다는 것은 이 분야에 숙련된 사람들에게는 주지의 사실이 될 것이다. 본 발명에서 언급된 모든 특허, 특허출원 및 공개는 본 발명의 일부로 명세서 중에 충분히 삽입되었다.

Claims

다음 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 이들의 염.

상기 식에서,

R₁은 C_1-2 알킬이고;

R₂는 측쇄가 있는 C_1-6 알킬, 또는 치환되거나 치환되지 않은 페닐, (C_1-2 알킬)-(페닐) 또는 (C_1-2 알킬)-(C_5-8 헤테로 아릴)이고, 상기 치환은 C_1-3 알킬, 할로, 페닐, 및 CONH₂로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 이상으로 수행되며;

X는 CONH이고;

Y₁은 (CH₂)_2-3이고;

Y₂는 (CH₂)₂이고;

Z는 CONH이다.
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제1항에 있어서, 상기 화합물이 다음 화합물들로 이루어진 군에서 선택되는 것인 화합물.

및

.
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제1항의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
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제5항의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
제9항 또는 제15항에 있어서, 상기 약학 조성물이 항암제를 더 포함하는 약학 조성물.
암을 가진 대상에게 제9항 또는 제15항의 약학 조성물 및 상기 조성물을 투여하기 위한 지시서를 포함하는 키트.
제17항에 있어서, 상기 키트가 항암제를 더 포함하는 키트.
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