KR100863325B1 - Detection and quantification of Microcystis and potentially toxic Microcystis using specific primer sets and probes in eutrophic lakes - Google Patents
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Abstract
본 발명은 수체에 존재하는 마이크로시스티스 속과 독성 마이크로시스티스 속을 동시에 검출 및 정량화하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 마이크로시스티스 속과 독성 마이크로시스티스 속을 동시에 검출하기 위한 특정 프라이머 쌍(primer set)으로 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)에 적용하여 한 번의 반응으로 동시에 마이크로시스티스 속(Microcystis spp.)의 존재와 그 중에서 독성 마이크로시스티스 속의 존재를 확인할 수 있고, 프라이머 쌍 사이의 염기서열을 기본으로 하여 발명된 유전자 탐침(probe)을 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)에 적용함으로써 수체에 존재하는 마이크로시스티스 속과 독성 마이크로시스티스 속의 정량화를 가능하게 함으로써 효율적으로 마이크로시스티스 속과 독성 마이크로시스티스 속을 분석할 수 있는 검출 및 정량화 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for simultaneously detecting and quantifying a microcistis genus and a toxic microcistis genus present in a water body, and more particularly, a specific primer pair for simultaneously detecting a microcistis genus and a toxic microcistis genus. (primer set) applied to multiplex PCR to confirm the presence of the microcystis spp. and the toxic microcistis genes in one reaction at the same time. By applying the invention gene probe based on the nucleotide sequence of to real-time PCR, it is possible to efficiently quantify the microcistis genera and toxic microcistis genera present in the water body. To analyze the microcistis genus and the toxic microcistis genus It relates to the Exodus and quantification methods.
마이크로시스티스 속, 검출, 정량화, 프라이머 쌍, 유전자 탐침(probe) Genus microsis, detection, quantification, primer pairs, gene probe
Description
도 1은 본 발명의 프라이머 쌍들의 특이성을 확인하기 위해 모든 독성과 비독성 마이크로시스티스 속과 마이크로시스틴을 생성하는 아나배나 속(Anabaena sp.)과 플란크토트릭스(Planktothrix sp.) 균주를 이용하여 각 프라이머 쌍에 의한 증폭산물의 생성과 크기를 도식화하여 나타낸 것이다. 1 is a genus of Anabaena that produces all the toxic and nontoxic microcistis genes and microcystine to identify the specificity of the primer pairs of the present invention. sp.) and Planktothrix sp.) shows the production and size of the amplification products by each primer pair using the strain.
도 2는 본 발명의 유전자 탐침을 적용하기 위한 사전실험으로 세포 수에 따른 DNA 농도와의 관계를 나타낸 것이다. Figure 2 shows the relationship between the DNA concentration according to the number of cells as a pre-test for applying the gene probe of the present invention.
도 3은 본 발명의 유전자 탐침 중에서 마이크로시스티스 속 검출에 특이적으로 작용하는 유전자 탐침에 대한 특이성 및 표준 곡선을 얻기 위해 도식화하여 나타낸 것이다. Figure 3 is a schematic diagram to obtain the specificity and the standard curve for the gene probe that specifically acts in the detection of the genus microsis among the gene probe of the present invention.
도 4는 본 발명의 유전자 탐침 중에서 독성 마이크로시스티스 속 검출에 특이적으로 작용하는 유전자 탐침에 대한 특이성 및 표준 곡선을 얻기 위해 도식화하여 나타낸 것이다. Figure 4 is a schematic diagram to obtain the specificity and standard curves for gene probes that specifically act to detect the genus of toxic microsis among the gene probes of the present invention.
도 5는 본 발명의 프라이머 쌍들을 현장 시료에 적용하여 마이크로시스티스 속과 그 중에서 독성 마이크로시스티스 속의 존재를 생성된 증폭산물을 통하여 확인하기 위하여 도식화한 것이다. Figure 5 is a schematic of the application of the primer pairs of the present invention to the field sample to confirm the presence of the microcistis genera and toxic microcistises from the generated amplification products.
도 6은 본 발명의 유전자 탐침들을 이용하여 현장 시료에 존재하는 마이크로시스티스 속의 정량화 및 그 중에서 독성 마이크로시스티스 속의 비율을 도식화하여 나타낸 것이다. Figure 6 shows the quantification of the microcistis genera present in the field sample using the gene probes of the present invention and the ratio of the toxic microcistis genes among them.
본 발명은 수체에 존재하는 마이크로시스티스 속과 독성 마이크로시스티스 속을 동시에 검출 및 정량화하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 마이크로시스티스 속과 독성 마이크로시스티스 속을 동시에 검출하기 위한 특정 프라이머 쌍으로 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)에 적용하여 한 번의 반응으로 동시에 마이크로시스티스 속( Microcystis sp.)의 존재와 그 중에서 독성 마이크로시스티스 속의 존재를 확인할 수 있고, 프라이머 쌍 사이의 염기서열을 기본으로 하여 발명된 유전자 탐침(probe)을 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)에 적용함으로써 수체에 존재하는 마이크로시스티스 속과 독성 마이크로시스티스 속의 정량화를 가능하게 함으로써 효율적으로 마이크로시스티스 속과 독성 마이크로시스티스 속을 분석할 수 있는 검출 및 정량화 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for simultaneously detecting and quantifying a microcistis genus and a toxic microcistis genus present in a water body, and more particularly, a specific primer pair for simultaneously detecting a microcistis genus and a toxic microcistis genus. the nucleotide sequence between the multiple polymerase chain reaction (multiplex PCR) in which when the micro at the same time with one reaction seutiseu applied to (Microcystis sp.) exists and that in may determine the toxic micro during seutiseu in the present, the primer pair By applying the gene probe invented on the basis of real-time PCR, the microcistis genera can be efficiently quantified by allowing the quantification of the microcistis and virulence microcissus species present in the water body. Detection and definition to analyze the genus of hypertoxic microsis It relates to a quantification method.
마이크로시스티스 속(Microcystis sp.)은 수화현상을 일으키는 남조류 중에서 가장 대표적인 속으로서, 간독소로 작용하는 마이크로시스틴(microcystin)을 생성한다. 그러나, 모든 마이크로시스티스 속이 독소를 생성하는 것은 아니며 독성과 비독성 마이크로시스티스 속으로 구분된다. 마이크로시스티스 속이 발생하는 수체는 상수원으로 이용될 수 있고, 독성 마이크로시스티스 속에 의해 생성된 마이크로시스틴이 인간에게 노출될 가능성이 있으므로 상수원을 대상으로 마이크로시스티스 속의 현황파악 및 지속적인 모니터링이 필요하다. 그렇기 때문에 독성과 비독성 마이크로시스티스 속의 존재 및 구분은 중요하다. 일반적으로 마이크로시스티스 속은 마이크로시스티스 애루지노사(M. aeruginosa), 마이크로시스티스 이크티오블라베(M. ichthyoblabe), 마이크로시스티스 노바세키(M. novacekii), 마이크로시스티스 비리디스(M. viridis), 마이크로시스티스 웨센베르지(M. wesenbergii)로 구분된다. 이러한 마이크로시스티스 속의 분류는 세포크기, 군체의 형태, 점액질의 특성 등에 의해서 분류되었다. 그러나, 동일 수체내에 다양한 마이크로시스티스 속이 존재하기 때문에 이러한 형태적 특징들에 의한 분류는 조사자들에 따라서 오차가 발생할 수 있다. 또한, 독성과 비독성 마이크로시스티스 속이 서로 공존하고 있는 경우도 존재하는 것으로 알려져 있지만 독성과 비독성 마이크로시스티스 속의 형태적 유사성으로 인하여 현미경 하의 관찰에서는 분류가 불가능하다. 그러므로, 분자적 방법을 이용한 마이크로시스티스 속과 독성 마이크로시스티스 속의 분류는 주관적인 견해에 의해서 발생할 수 있는 실험적 오차를 없앨 수 있는 객관적인 방법이 요구되고 있는 실정이다. 또 한, 현재까지 많은 연구자들에 의하여 독성 마이크로시스티스 속 및 마이크로시스티스 속을 검출하기 위한 프라이머가 개발되었지만, 본 발명과 같이 동시에 검출할 수 있는 프라이머는 아직까지 연구된 바 없다. Microcystis sp. Is the most representative genus of cyanobacteria that cause hydration, producing microcystin, which acts as a hepatoxin. However, not all microcistis genera produce toxins and are divided into toxic and non-toxic microcistis genus. Microsis Generating water bodies can be used as a source of water, and microcystine produced by the genus of toxic microsis is likely to be exposed to humans. As such, the presence and differentiation of the genus of toxic and nontoxic microsis is important. Typically, when micro-micro seutiseu when seutiseu deceived her labor Rouge (M. aeruginosa), micro-hour seutiseu Blake Tio Blige Entebbe (M. ichthyoblabe), micro-hour seutiseu Nova Seki (M. novacekii), micro-disk corruption during seutiseu (M. viridis) , and microcistis Wesenbergii . The microcistis genus was classified by cell size, colony type, and mucous characteristics. However, because of the presence of various microcistis genera in the same body of water, the classification by these morphological features may cause errors depending on investigators. It is also known that coexisting toxic and non-toxic microcistis genes exist. However, due to the morphological similarity between toxic and non-toxic microcistis genes, it is impossible to classify them under a microscope. Therefore, the classification of the microcistis genus and the toxic microcistis genus using molecular methods requires an objective method to eliminate the experimental error that may be caused by the subjective view. In addition, to date, many researchers have developed primers for detecting the toxic microcistis genera and microcistis genera, but primers which can be detected simultaneously as in the present invention have not been studied until now.
이에, 본 발명자들은 모든 마이크로시스티스 속 유전자형에 특이적으로 작용하는 프라이머와 독성 마이크로시스티스 속에 특이적으로 작용하는 프라이머를 각각 발명하여 동일한 중합효소연쇄반응 조건을 가짐으로써 현장 시료에서 추출한 DNA를 이용하여 한 번의 반응을 통하여 동시에 마이크로시스티스 속과 독성 마이크로시스티스 속의 존재를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. 또한, 본 발명에 의해 생성되는 증폭산물의 크기가 각각 약 200 bp와 300 bp 정도로 군집분석을 위해 이용되는 DGGE나 정량화에 이용되는 실시간 PCR에 효율적으로 이용될 수 있다. Thus, we believe that all microcistis genus Invented primers that specifically act on genotypes and primers that act specifically on toxic microcistis and have the same polymerase chain reaction conditions, thereby simultaneously using microsystemis in one reaction using DNA extracted from field samples. The present invention was completed by identifying the presence of the genus and genus of toxic microsis. In addition, the size of the amplification products produced by the present invention can be effectively used for DGGE used for clustering or real-time PCR used for quantification at about 200 bp and 300 bp, respectively.
따라서, 본 발명은 수체에 존재하는 다양한 남조류 중에서 특히 마이크로시스티스 속과 독성 마이크로시스티스 속만을 특이적으로 검출하는데 이용될 수 있는 프라이머 쌍을 제공하는데 그 목적이 있다.It is therefore an object of the present invention to provide a primer pair that can be used to specifically detect only the microcistis genus and the toxic microcistis genus among various cyanobacteria present in the water bodies.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 쌍과 유전자 탐침을 이용하여 독성과 비독성 마이크로시스티스 속의 검출 및 정량화 방법을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.Another object of the present invention is to provide a method for detecting and quantifying a genus of toxic and nontoxic microcistises using the primer pair and the gene probe.
본 발명은 서열번호 1과 서열번호 2로 표시되는 마이크로시스티스 속(Microcystis sp.) 검출용 프라이머 쌍과, 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 독성 마이크로시스티스 속(Microcystis sp.) 검출용 프라이머 쌍을 그 특징으로 한다.The present invention in a micro when seutiseu shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 (Microcystis sp.) Upon detection primer pair and, toxic micro shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 for in seutiseu (Microcystis sp.) For detecting Primer pairs are featured.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 쌍으로 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)을 수행하여 조류를 포함하는 시료로부터 마이크로시스티스 속(Microcystis sp.)과 독성 마이크로시스티스 속(Microcystis sp.)을 동시에 검출하는 방법과,In addition, the present invention detects a micro when seutiseu in (Microcystis sp.) And toxic micro during seutiseu in (Microcystis sp.) From the sample containing the algae to perform multiple polymerase chain reaction (multiplex PCR) with the primers at the same time How to,
상기 프라이머 쌍과 서열번호 5와 6의 유전자 탐침(probe)으로 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 수행하여 조류를 포함하는 시료로부터 마이크로시스티스 속(Microcystis sp.)과 독성 마이크로시스티스 속(Microcystis sp.)을 동시에 정량화하는 방법을 또 다른 특징으로 한다.Real-time PCR was performed with the primer pairs and the gene probes of SEQ ID NOs: 5 and 6 to perform microcystis sp. And toxic microcistises from samples containing algae. Another feature is the method of simultaneous quantification of the genus Microcystis sp.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.Referring to the present invention in more detail as follows.
본 발명은 마이크로시스티스 속과 독성 마이크로시스티스 속을 동시에 검출하기 위한 특정 프라이머 쌍으로 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)에 적용하여 한 번의 반응으로 동시에 마이크로시스티스 속(Microcystis sp.)의 존재와 그 중에서 독성 마이크로시스티스 속의 존재를 확인할 수 있고, 프라이머 쌍 사이의 염기서열을 기본으로 하여 발명된 유전자 탐침(probe)을 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)에 적용함으로써 수체에 존재하는 마이크로시스티스 속과 독성 마이크로시스티스 속의 정량화를 가능하게 함으로써 효율적으로 마이크로시스티스 속과 독성 마이크로시스티스 속을 분석할 수 있는 검출 및 정량화 방법에 관한 것 이다. The present invention is applied to multiplex PCR with specific primer pairs for the simultaneous detection of the genus Microcystis and the genus Microcistis , and the presence of Microcystis sp. Among them, the presence of the genus toxic microsis can be confirmed, and the gene probes invented based on the nucleotide sequence between the primer pairs are applied to the real-time PCR. The present invention relates to a method for detecting and quantifying microcis and genus microcistis by efficiently quantifying the microcis and genus microcistis.
본 발명의 프라이머 쌍 중에서 마이크로시스티스 속에 특이적으로 작용하는 프라이머쌍은 GenBank의 DNA 염기서열 데이터베이스로부터 138개의 서로 다른 마이크로시스티스 속 균주들의 cpcBA-IGS 유전자의 염기서열을 얻어 나열하고, 여기에서 특이적으로 보존력있는 부분을 찾아 제작하였으며, cpcBA-IGS 유전자의 57 - 80(bp) 및 334 - 356에 위치하는 것이다. 또한, 독성 마이크로시스티스 속에 특이적으로 작용하는 프라이머 쌍도 GeneBank의 DNA 염기서열 데이터베이스로부터 11개의 서로 다른 마이크로시스티스 속 균주들의 mcyJ 염기서열을 얻어 나열하고, 이를 통하여 특이적으로 작용하는 부분을 찾아 제작하였으며, mcyJ 유전자의 117 - 136 및 340 - 359에 위치하는 것이다. 그리고, 마이크로시스티스 속 검출용 유전자 탐침의 경우 마이크로시스티스 속만을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 쌍 사이에 존재하는 염기서열 중에서 마이크로시스티스 속만을 특이적으로 검출할 수 있는 부분을 선택하였고 cpcBA-IGS 유전자의 196-214에 위치하였고, 독성 마이크로시스티스 속에 대한 유전자 탐침도 프라이머 쌍 사이의 염기서열 중에서 독성 마이크로시스티스 속만을 특이적으로 검출할 수 있는 부분만을 찾아 선택하였으며, mcyJ 유전자의 265-284에 위치하였다. Among the primer pairs of the present invention, primer pairs that specifically function in microcistis are listed by obtaining the base sequence of cpcBA- IGS genes of 138 different microcistis strains from GenBank's DNA sequencing database. The conservative regions were constructed and located at 57-80 (bp) and 334-356 of the cpcBA- IGS gene. In addition, primer pairs that specifically act in virulence microcistis are also listed by obtaining mcyJ sequences of 11 different microcistis strains from GeneBank's DNA sequencing database. And 117-136 and 340-359 of the mcyJ gene. In addition, in the case of the gene probe for detecting the microcistis genus, a portion capable of specifically detecting the microcistis genus was selected among the base sequences present between the primer pairs capable of specifically detecting the microcistis genus and cpcBA. -196-214 of the -IGS gene, the gene probe for the genus of toxic microcistis was also selected from the base sequences between the primer pairs to detect only the toxic microcistis genus specifically, and 265 of the mcyJ gene. Located at -284.
본 발명의 마이크로시스티스 속 검출용 프라이머 쌍의 염기서열을 서열번호 1(cpc57F) 및 2(cpc356R)와 독성 마이크로시스티스 속 검출용 프라이머의 염기서열을 서열번호 3(mcyJF) 및 4(mcyJR)로 나타내었고, 마이크로시스티스 속 검출용 유전자 탐침의 경우 서열번호 5(cpc probe), 독성 마이크로시스티스 속 검출용 유전 자 탐침의 경우 6 (mcyJ probe)으로 나타내었다. The base sequences of the primer pairs for detecting the genus of microcistine of the present invention are SEQ ID NOs: 1 (cpc57F) and 2 (cpc356R), and the base sequences of the primers for detecting the genus of toxic microcistus are SEQ ID NOs: 3 (mcyJF) and 4 (mcyJR). The gene probe for detecting the genus of microcistis is shown as SEQ ID No. 5 (cpc probe) and 6 (mcyJ probe) for the gene probe for detecting the toxic microcistis genus.
서열번호 1: 5'-AACCTATGTAGCTTTAGGAGTACC-3'SEQ ID NO: 5'-AACCTATGTAGCTTTAGGAGTACC-3 '
서열번호 2: 5'-CTTAAGAAACGACCTTGAGAATC-3'SEQ ID NO: 5'-CTTAAGAAACGACCTTGAGAATC-3 '
서열번호 3: 5'-TAGCTAAAGCAGGGTTATCG-3'SEQ ID NO: 5'-TAGCTAAAGCAGGGTTATCG-3 '
서열번호 4: 5'-TCTTACTATTAACCCGCAGC-3' SEQ ID NO: 5'-TCTTACTATTAACCCGCAGC-3 '
서열번호 5: 5'-AGCTACTTCGACCGCGCCG-3'SEQ ID NO: 5'-AGCTACTTCGACCGCGCCG-3 '
서열번호 6: 5'-TCGAGTTTTGCAGCCCGGTG-3'SEQ ID NO: 5'-TCGAGTTTTGCAGCCCGGTG-3 '
기존의 분자 생물학적 방법을 이용한 마이크로시스티스 속에 대한 모니터링은 16S rDNA 유전자, mcy 유전자를 대상으로 한 프라이머를 이용하였으나 이러한 검출 방법은 독성 마이크로시스티스 속에 국한되어 비독성 마이크로시스티스 속을 검출하는 데에는 한계가 있었다. 그러나, 본 발명의 프라이머 쌍들을 이용하게 되면 한 번의 중합효소연쇄반응을 통하여 동시에 마이크로시스티스 속의 존재와 그 중에서 독성 마이크로시스티스 속의 존재 여부를 확인할 수 있다. 그리고, 유전자 탐침의 발명에 의해서 수체에 존재하는 독성과 비독성 마이크로시스티스 속의 정량화 및 구성 비율을 실시간 중합효소연쇄반응에 적용하여 확인할 수 있었다. Conventional monitoring of the genus of microcistis was carried out using primers targeting 16S rDNA gene and mcy gene. However, the detection method is limited to toxic microcistis and thus limited to detecting non-toxic microcistis genus. There was. However, using the primer pairs of the present invention, it is possible to confirm the presence of the microcistis genus and the presence of the toxic microcistis genus in one polymerase chain reaction at the same time. In addition, the invention of the gene probe was able to confirm the quantification and composition ratio of the toxic and non-toxic microcistis in the water body by applying to the real-time polymerase chain reaction.
본 발명의 프라이머 쌍과 유전자 탐침의 이용은 다양한 종류의 남조류가 존재하는 호수나 강의 환경 시료로부터 마이크로시스티스 속과 그 중에서 독성 마이크로시스티스 속의 존재도 함께 다중 중합효소연쇄반응을 이용하여 동시에 검출할 수 있고, 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하여 각각의 정량화와 비율을 확인할 수 있다. The use of the primer pair and gene probe of the present invention can simultaneously detect the presence of microcistis and toxic microcistis from multiple samples of lakes or rivers in which various kinds of cyanobacteria exist, using multiple polymerase chain reaction. Real-time polymerase chain reaction can be used to determine the respective quantification and ratio.
이하, 다음 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples, but the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 1 : 특이성 확인을 위한 참고 균주들에 대한 원형 DNA 추출Example 1 Circular DNA Extraction of Reference Strains for Specificity Verification
참고 균주들은 the Culture Collection of the University of Texas (UTEX, Austin, USA), the National Institue for Environmental Studies (NIES, Tsukuba, Japan), the Pasteur Culture Collection (PCC, Paris, France), the Norwegian Institute for Water Research (NIVA, Oslo, Norway), the Department of Applied Chemistry and Microbiology (University of Helsinki, Helsinki, Finland), the Korean Collection for Type Cultures (KCTC, Daejeon, Korea)에서 29개의 남조류 균주를 분양받아 알렌(Allen) 배지에서 배양하였고, 성장변화가 없는 단계(stationary phase)에 원심분리를 통해 세포를 수집한 후, DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen, Germany)를 사용하여 모든 참고 균주에서 DNA를 추출하였다. 그리고, 추출한 DNA의 농도는 NanoDrop(ND-1000 UV/Vis, NanoDrop Technologies, Wilmington, DE)을 이용하여 농도를 측정하였다. 참고 균주에서 추출한 DNA를 이용하여 각 프라이머 쌍에 의한 증폭산물에 대한 결과는 다음 표 1에 나타내었다. Reference strains include the Culture Collection of the University of Texas (UTEX, Austin, USA), the National Institue for Environmental Studies (NIES, Tsukuba, Japan), the Pasteur Culture Collection (PCC, Paris, France), the Norwegian Institute for Water Allen (Allen) received 29 cyanobacteria strains from Research (NIVA, Oslo, Norway), the Department of Applied Chemistry and Microbiology (University of Helsinki, Helsinki, Finland), the Korean Collection for Type Cultures (KCTC, Daejeon, Korea) ), The cells were collected by centrifugation in a stationary phase without growth change, and then DNA was extracted from all reference strains using the DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Germany). The concentration of the extracted DNA was measured using NanoDrop (ND-1000 UV / Vis, NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). The results of the amplification products by each primer pair using DNA extracted from the reference strain are shown in Table 1 below.
실시예Example 2 : 각 참고 균주들에 대한 독소 생산 여부 조사( 2: investigation of toxin production for each reference strain ( HPLCHPLC 및 And PPIAPPIA 를 이용한 분석)Analysis)
참고 균주들에 대한 독소 생산 여부를 정확히 판단하기 위해서 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)와 PPIA(Protein Phosphatase Inhibition Assay) 방법을 이용하여 확인하였다. In order to accurately determine the toxin production for the reference strains were confirmed using HPLC (High Performance Liquid Chromatography) and Protein Phosphatase Inhibition Assay (PPIA) method.
분석과정은 이전에 보고된 분석방법을 이용하였다[Oh et al., 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67: 1484-1489]. 그 결과도 상기 표 1에 나타낸 바와 같다. The analytical process used previously reported analytical methods [Oh et al., 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67: 1484-1489. The results are also shown in Table 1 above.
실시예 3: 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)으로 검출 확인Example 3: Confirmation of Detection by Multiplex PCR
상기 실시예 1에서 얻은 참고 균주들의 DNA를 이용하여 각 프라이머 쌍으로 서열번호 1과 2, 3과 4를 동시에 사용하여 PCR를 수행한 후 그 반응 생성물을 전기영동하여 나타내었고, 도 1은 그 중에서도 독성과 비독성이 포함된 마이크로시스티스 속과 마이크로시스틴을 생성하는 것으로 확인된 아나배나 속(Anabaena sp.), 플란크토쓰릭스 속(Planktothrix sp.)을 나타낸 것이다. Using the DNA of the reference strain obtained in Example 1 and performing the PCR using each SEQ ID NO: 1 and 2, 3 and 4 simultaneously with each primer pair, the reaction product was shown by electrophoresis, Figure 1 is shown the found to produce a micro-toxicity and when seutiseu in the Microcystin containing a non-toxic analog times shows in (Anabaena sp.), flan greater tosseu Riggs in (Planktothrix sp.).
다중 중합효소연쇄반응은 다음과 같은 조건으로 수행하였다. Multiple polymerase chain reaction was performed under the following conditions.
반응 혼합물의 구성:Composition of reaction mixture:
원형 DNA 1 ㎕1 μl round DNA
10 pmol cpc57F 2 ㎕10 pmol
10 pmol cpc356R 2 ㎕10 pmol
10 pmol mcyJF 2 ㎕10 pmol
10 pmol mcyJR 2 ㎕10 pmol
10 mM dNTP 혼합물 4 ㎕4 μl of 10 mM dNTP mixture
10 X PCR 완충액 5 ㎕5 μl of 10 X PCR buffer
Taq DNA polymerase 2.5 U (Takara, Japan)Taq DNA polymerase 2.5 U (Takara, Japan)
3차 증류수 31.5 ㎕31.5 μl of distilled water
반응 조건(초기 변성 및 최종 연장과정을 제외하고 30 반복):Reaction conditions (30 repetitions except for initial denaturation and final extension):
초기 변성 과정 - 95 ℃ 5분Initial denaturation process-95
변성 과정 - 94 ℃ 1분Denaturation process-94
어닐링 과정 - 60 ℃ 1분Annealing Process-60 ℃ 1min
중합 과정 - 72 ℃ 1분Polymerization process-72
최종 연장 과정 - 72 ℃ 5분Final extension process-72 °
도 1에서 각 레인은 좌측으로부터 M 마커(100 bp ladder); 1, 마이크로시스티스 애루지노사 UTEX 2388 (Toxic); 2, 마이크로시스티스 애루지노사 PCC 7806 (Toxic); 3. 마이크로시스티스 애루지노사 UTEX 2666 (Toxic); 4, 마이크로시스티스 애루지노사 NIES 90 (Toxic); 5, 마이크로시스티스 비리디스 NIES 102 (Toxic); 6, 마이크로시스티스 웨센베르지 NIES 107 (Toxic); 7, 마이크로시스티스 비리디스 NIES 1058 (Toxic); 8, 마이크로시스티스 웨센베르지 NIES 1067 (Non-toxic); 9, 마이크로시스티스 애루지노사 NIES 1075 (Non-toxic); 10, 마이크로시스티스 애루지노사 NIES 1182 (Non-toxic); 11, 아나배나 플로스-아퀴애 NIVA 83-1 (Toxic); 12, 플란크토쓰릭스 아카드히(Planktothrix agardhii) NIVA 126 (Toxic); 13, 플란크토쓰릭스 아카드히 NIVA 127을 나타낸다.In FIG. 1, each lane is an M marker from the left (100 bp ladder); 1, microcystis aeruginosa UTEX 2388 (Toxic); 2, microsistis aruginosa PCC 7806 (Toxic); 3. Microsistis Aruginosa UTEX 2666 (Toxic); 4, microcystis aeruginosa NIES 90 (Toxic); 5, microcistis viridis NIES 102 (Toxic); 6, microcystis weesenberg NIES 107 (Toxic); 7, Microcistis Viridis NIES 1058 (Toxic); 8, microcystis wesenberg NIES 1067 (Non-toxic); 9, microcystis aeruginosa NIES 1075 (Non-toxic); 10, microcystis aeruginosa NIES 1182 (Non-toxic); 11, Anabana floss-Aquiae NIVA 83-1 (Toxic); 12, Planktothrix agardhii NIVA 126 (Toxic); 13, Planck toxrixi Acadhi NIVA 127.
도 1에서 나타낸 바와 같이, 모든 10개의 마이크로시스티스 속 균주들은 모든 마이크로시스티스 속을 검출하기 위해 발명된 프라이머 쌍 cpc57F와 cpc356R에 의해서 300 bp 정도 크기의 증폭산물을 형성하였고, 도 1에 이용된 균주들에 대한 독성의 유무는 HPLC와 PPIA에 의해서 확인되었고, 독성 마이크로시스티스 속으로 확인된 7개의 균주들은 모두 독성 마이크로시스티스를 검출하기 위해 발명된 mcyJF와 mcyJR 프라이머 쌍에 의해서 200 bp 정도 크기의 증폭산물을 형성하였다. As shown in FIG. 1, all 10 microcistis genera strains formed an amplification product about 300 bp by the primer pairs cpc57F and cpc356R invented to detect all microcistis genera, and used in FIG. 1. The presence or absence of toxicity against the strains was confirmed by HPLC and PPIA, and all seven strains identified as toxic microsis were about 200 bp in size by the mcyJF and mcyJR primer pairs invented to detect toxic microsis. An amplification product of was formed.
실시예 4: 유전자 탐침을 이용한Example 4 Using Genetic Probes 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)Real-time PCR
유전자 탐침의 특이성을 확인하기 위하여 표준 균주로 독성 마이크로시스티스 속인 마이크로시스티스 애루지노사 PCC 7806(Microcystis aeruginosa PCC 7806)을 이용하였다. When the micro seutiseu seutiseu Ke Rouge labor PCC 7806 (Microcystis aeruginosa PCC 7806) lay toxic to micro-type strain to determine the specificity of gene probes were used.
먼저, 표준 균주를 이용하여 세포 수에 따라 5가지로 희석한 후 실시예 1과 같은 방법으로 원형 DNA를 추출하였다. 여기에서 세포 수는 현미경 하에서 혈구계산기(hemocytometer, Fuchs-Rosenthal, Paul Marienfeld GmbH & CO., Lauda-Kㅦnigshofen, Germany)를 이용하여 계수하였다. 추출된 DNA의 농도를 NanoDrop를 이용하여 측정한 후에 세포수와의 관계를 알아보았다. 그 결과 높은 상관관계를 나타내었다(y = 8.8610-6x + 239.60 (R 2=0.99). 본 결과로부터 단위 세포당 DNA 농도를 확인할 수 있었다(1.0910-5 ng/cell). 도 2는 세포 수에 따라 추출된 DNA 농도와의 관계를 나타낸 그림이다. 본 결과를 바탕으로 미지의 현장 시료 이용 시 유전자 탐침에 의해 검출되는 DNA 농도에 따라서 세포수를 구할 수 있었다. First, after diluting to five kinds according to the number of cells using a standard strain, circular DNA was extracted in the same manner as in Example 1. Here, the cell number was counted using a hemocytometer (hemocytometer, Fuchs-Rosenthal, Paul Marienfeld GmbH & CO., Lauda-Knigshofen, Germany) under a microscope. The concentration of the extracted DNA was measured using NanoDrop, and then the relationship with the number of cells was examined. The result showed a high correlation (y = 8.8610 -6 x + 239.60 ( R 2 = 0.99). From this result, the DNA concentration per unit cell was confirmed (1.0910 -5 ng / cell). Figure 2 shows the relationship between the extracted DNA concentration and the cell number based on the DNA concentration detected by the gene probe.
발명된 유전자 탐침들에 대한 특이성을 확인하게 위해서 표준 균주의 DNA 농도를 5가지로 희석한 후에 Ct(threshold cycle)과 농도 사이의 표준 곡선을 각각 구하였다. 도 3은 마이크로시스티스 속의 정량화를 위해 이용된 cpc probe에 의한 표준 곡선을 나타내었고, 도 4는 독성 마이크로시스티스 속의 정량화를 위해 이용된 mcyJ probe에 의한 표준 곡선을 나타내었다. 도 3과 4에서 보이는 바와 같이, 각각의 유전자 탐침이 DNA 농도와 Ct 사이에 높은 상관관계를 보이는 때문에 마이크로시스티스 속과 독성 마이크로시스티스 속에 특이적으로 작용하는 것을 확인할 수 있었다. 도 3, 4에서의 e는 증폭효율을 나타낸다(e = 10-1/S-1, S = slope). In order to confirm the specificity of the gene probes invented, after diluting the DNA concentration of the standard strain to five, the standard curve between the C t (threshold cycle) and the concentration was obtained. FIG. 3 shows the standard curve by cpc probe used for quantification of the genus Microcistis, and FIG. 4 shows the standard curve by mcyJ probe used for quantification of the genus Microcistis. As shown in Figures 3 and 4, each gene probe has a high correlation between the DNA concentration and C t it was confirmed that the specific activity in the microcistis and toxic microcistis. 3 in Fig. 3 and 4 indicate amplification efficiency (e = 10 -1 / S -1, S = slope).
현장 시료 이용 시 검출되는 Ct에 의해서 표준 곡선으로부터 검출된 농도를 구할 수 있고, 또한 이 농도로부터 세포의 정량화를 확인할 수 있다. The concentration detected from the standard curve can be determined by the C t detected when using the field sample, and the quantification of cells can be confirmed from this concentration.
실시간 중합효소연쇄반응은 다음과 같은 조건으로 수행하였다. Real time polymerase chain reaction was performed under the following conditions.
마이크로시스티스 속을 검출하기 위한 반응 혼합물의 구성:Composition of the reaction mixture for detecting the microcistis genus:
원형 DNA 1 ㎕1 μl round DNA
10 pmol cpc57F 0.5 ㎕10 pmol cpc57F 0.5 μl
10 pmol cpc356R 0.5 ㎕10 pmol cpc356R 0.5 μl
10 pmol cpc probe 0.5 ㎕10 pmol cpc probe 0.5 μl
DYNAMO probe QPCR kit (FINNZYMES) 10 ㎕DYNAMO probe QPCR kit (FINNZYMES) 10 μl
3차 증류수 7.5 ㎕7.5 μl of distilled water
독성 마이크로시스티스 속을 검출하기 위한 반응 혼합물의 구성:Composition of reaction mixture to detect toxic microcistis genus:
원형 DNA 1 ㎕1 μl round DNA
10 pmol mcyJF 0.5 ㎕10 pmol mcyJF 0.5 μl
10 pmol mcyJR 0.5 ㎕10 pmol mcyJR 0.5 μl
10 pmol mcyJ probe 0.5 ㎕10 pmol mcyJ probe 0.5 μl
DYNAMO probe QPCR kit (FINNZYMES) 10 ㎕DYNAMO probe QPCR kit (FINNZYMES) 10 μl
3차 증류수 7.5 ㎕7.5 μl of distilled water
반응 조건(초기 변성 과정을 제외하고 50 반복):Reaction conditions (50 repetitions except for initial denaturation):
초기 변성 과정 - 95 ℃ 15분Initial denaturation process-95
변성 과정 - 94 ℃ 20초Denaturation process-94 ℃ 20 seconds
어닐링 과정 - 60 ℃ 1분Annealing Process-60 ℃ 1min
실험예 1 : 현장 시료에 존재하는 마이크로시스티스 속 및 독성 마이크로시스티스 속의 존재 확인과 구성 비율 및 정량화Experimental Example 1 Identification, Composition, and Quantification of Microsis and Toxicity
현장 시료를 적용하기 위해서 2006년 6월 7일부터 2006년 10월 25일까지 일주인 간격으로 총 21회의 현장 시료를 대청호 선착장 부근에서 채취하였다. 현장 시료에서의 DNA 추출은 실시예 1과 같이 수행하였다. 또한, 정량화를 위해서 각 시료마다의 농축 부피를 확인하였다. To apply the site samples, a total of 21 field samples were taken from Daecheong Lake Dock near June 7, 2006 to October 25, 2006 at a weekly interval. DNA extraction from field samples was performed as in Example 1. In addition, the concentration volume for each sample was confirmed for quantification.
도 5는 cpc57F와 cpc356R, mcyJF와 mcyJR를 이용한 다중중합효소연쇄반응을 통하여 현장 시료에 존재하는 마이크로시스티스 속과 독성 마이크로시스티스 속의 존재를 나타내었다. 모든 현장 시료에서 마이크로시스티스 속이 존재하는 것으로 검출되었고, 또한 그 중에서 독성 마이크로시스티스 속도 존재하는 것으로 나타났다. 본 결과는 다음 표 2의 현미경을 이용한 계수 및 HPLC 분석을 통해 얻은 결과와 상응하였다. Figure 5 shows the presence of the microcistis genus and toxic microcistis genus present in the field sample through multiple polymerase chain reaction using cpc57F and cpc356R, mcyJF and mcyJR. All field samples were detected to have a microcistis genus, and among them, a toxic microcistis rate was found. The results corresponded to the results obtained by counting and HPLC analysis using a microscope of Table 2 below.
도 5에서 레인은 좌측으로부터 M, 마커(100 bp)를 나타내고 조사 날짜를 순서대로 나타내었다. In FIG. 5, lanes represent M from the left, a marker (100 bp), and the irradiation dates are sequentially shown.
도 6은 본 발명의 각각의 유전자 탐침을 이용하여 전체 마이크로시스티스 속과 그 안에 존재하는 독성 마이크로시스티스 속을 각각 정량화한 후에 전체 마이크로시스티스 속 안에서 독성 마이크로시스티스 속이 차지하는 비율을 나타내고 있다. 본 발명을 이용하여 현미경으로는 확인할 수 없었던 독성 마이크로시스티스 속을 정량화할 수 있었고, 또한 독성 마이크로시스티스 속의 구성 비율과 비율의 변화를 확인할 수 있었다. FIG. 6 shows the proportion of the toxic microcistis genus in the whole microcistis genus after quantifying the entire microcistis genus and the toxic microcistis genus present therein, using each gene probe of the present invention. By using the present invention it was possible to quantify the genus of toxic microcistis that could not be identified under the microscope, and also to determine the composition ratio and the change in the ratio of the genus of toxic microcities.
본 발명의 프라이머 쌍과 유전자 탐침은 마이크로시스티스 속뿐만 아니라 독소를 생산하는 독성 마이크로시스티스 속을 검출할 수 있는 표지 수단으로 이용될 수 있고, 다양한 종류의 남조류가 포함된 현장 시료에 적용되어 마이크로시스티스 속의 존재와 그 중에서 독성 마이크로시스티스 속의 존재를 확인할 수 있으며, 이러한 마이크로시스티스 속의 구성 비율과 정량화까지 가능하게 하는 수체 내의 모니터링에 획기적인 도움을 줄 수 있는 표지 수단으로 사용될 수 있다. 따라서, 향후 수자원 관리를 위해 이용될 수 있는 마이크로시스티스 검출 및 독성 마이크로시스티스 검출을 위한 키트 제작과 마이크로시스티스와 독성 마이크로시스티스의 정량화를 위한 키트 제작 등에 유용하리라 기대된다.Primer pairs and gene probes of the present invention can be used as a label means for detecting not only the microcis genera but also the toxin producing toxic microcistis genus, and applied to field samples containing various kinds of cyanobacteria The presence of cistis genera and toxic microcistis genera can be identified, and it can be used as a labeling means that can greatly help monitoring in the water body, which enables the composition ratio and quantification of such microcistis genera. Therefore, it is expected to be useful for preparing a kit for detecting microcistis and toxic microcistis which can be used for water management in the future, and for preparing a kit for quantification of microcistis and toxic microcistis.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
<120> Detection and quantification of Microcystis and potentially toxic
Microcystis using specific primer sets and probes in eutrophic
lakes
<160> 6
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> mcyJF
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tagctaaagc agggttatcg 20
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<212> DNA
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<220>
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Microcystis using specific primer sets and probes in eutrophic
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