KR100863283B1 - 세포내 과정의 관측 방법 및 그를 위해 사용되는 재조합유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포 내에서 특정 단백질의 이동과 공간적 분포의 형성에 관련된 특이적 특성을 형광 영상을 통하여 선별적으로 확인하는 방법 및 그 방법에 사용되는 재조합 유전자에 관한 것이다. 상기 방법은, (a) 세포내 특정 소기관으로의 위치이동을 제어하는 부분을 포함하는 신호단백질을 코딩(coding)하는 유전자와 형광을 나타내는 형광단백질을 코딩하는 유전자가 각각 하나 또는 둘 이상 연결된 재조합 유전자를 준비하는 단계; (b) 상기 재조합 유전자가 세포 내에서 발현될 수 있도록 프로모터(promoter) 부분과 터미네이터(terminator) 부분을 포함하여 구성된 혼성 플라스미드를 준비하는 단계; (c) 상기 (b)단계에서 준비한 혼성 플라스미드 1종 또는 2종 이상을 세포 내에 주입하여 형질전환세포를 준비하는 단계; (d) 상기 형질전환세포에서 신호단백질과 형광단백질이 연결된 리포터 단백질이 발현되도록 하는 단계; 및 (e) 상기 형질전환세포 내에서 발현되는 리포터 단백질의 분포를 발현 중, 이동 중, 또는 그 후에 형광영상 측정을 통하여 관측하는 단계를 포함하여 구성된다.

형질전환, 세포내 소기관, 신호단백질, 형광단백질, 리포터 단백질, 트래피킹

Description

세포내 과정의 관측 방법 및 그를 위해 사용되는 재조합 유전자{A METHOD FOR INTRACELLULAR PROCESS MONITORING AND RECOMBINANT GENE USED THEREFOR}

도1은 본 발명에서 그룹 I로서 분류한, 막으로 구성된 세포내 소기관으로 이동하는 리포터 단백질들의 구성 모식도이다.

도2는 상기 그룹 I으로 분류한 리포터 단백질들의 세포 내 발현을 보여주는 신호 영상으로서,

a)는 AtOEP7:GFP가 엽록체 막에 위치하고 있음을 나타내는 사진으로서, 붉은색은 원래 엽록체가 내는 형광이고, 엽록체 막과 상기 단백질이 내는 초록색의 형광이 겹쳐 보이는 부분은 노란색의 형광으로 나타나며,

b)는 a)와 동일한 결과를 필터에 의해 엽록체의 붉은 형광을 제거한 사진이며,

c)는 루비스코 복합단백질이 엽록체의 스트로마(stroma)에 위치하는 것을 나타내는 사진이며,

d)는 Cab:GFP가 엽록체에서 발광하는 것을 나타내는 사진이고,

e)는 GFP에 연결한 루비스코 활성단백질(RA)이 엽록체에 위치하는 것을 나타내는 사진이고,

f)는 GFP에 연결한 F1-H+-ATPase-가 미토콘드리아에 위치하는 것을 나타내는 사진이며,

g)는 GFP에 연결한 퍼록시좀 이동 모티브(SKL)가 퍼록시좀의 막에 위치하는 것을 나타내는 사진이고,

h)는 GFP에 연결한 핵 위치신호(NLS)가 핵에 위치하는 것을 나타내는 사진이다.

도3은 발현된 AtOEP7:GFP에 대한 웨스턴 블랏(Western blot) 사진으로서, T, S, 및 M은 각각 전체 추출물, 용액 부분, 및 막 부분을 나타낸다.

도4는 본 발명에서 그룹 II로서 분류한, 엔도소말 트래피킹(endosomal trafficking)에 의해 세포내 소기관으로 이동하는 리포터 단백질들의 구성 모식도이다.

도5는 상기 그룹 II로 분류한 리포터단 백질들의 세포 내 발현을 보여주는 신호 영상으로서,

a)는 H+-ATPase:GFP가 플라즈마 막에 위치하고 있음을 나타내는 사진이고,

b)는 시알기전환효소(ST)가 골지체에서 형광을 나타낸 사진인데, 이 중 적색 형광은 엽록체의 자연 형광에 의한 것이며,

c)는 리포터 단백질 BiP:RFP가 소포체의 루멘(lumen)을 나타내는 사진이며,

d)는 500:GFP:KKXX가 소포체의 막을 나타내는 사진이며,

e)는 526:GFP가 저장액포를 나타내는 사진이며,

f)는 Chi-n:RFP:Chi-c에 의하여 저장액포가 형광을 나타내는 사진이며,

g)는 신호단백질로 키티나제(chitinase)를 사용하되 카르복시 부분을 연결하 지 않은 Chi-n:RFP는 저장액포에 도달하지 못하고 소포체에 점의 형태로 존재함을 나타내는 사진이고,

h)는 SPO:GFP에 의한 형광이 용해성 액포 전체에 고루 분포함을 나타내는 사진이다.

도6은 본 발명에서 그룹 III으로서 분류한, 인지질에 특이적으로 결합하는 리포터 단백질들의 구성 모식도이다.

도7은 본 발명에서 도7은 상기 그룹 III으로 분류한 리포터 단백질들의 세포 내 발현을 보여주는 신호 영상으로서,

a)는 리포터 단백질 GFP:EBD가 각 액포들의 외벽에 형광을 나타내어 이들이 3-인산 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol 3-phosphate; PI(3)P)을 포함하는 위치로 파악되었으며,

b) 및 c)는 각각, GFP:FAPP1과 GFP:PH가 각각 4-인산 포스파티딜이노시톨 (phosphatidylinositol 4-phosphate; PI(4)P) 및 4,5-이인산 포스파티딜이노시톨 (phosphatidylinositol 4,5-diphosphate; PI(4,5)P2)이 분포하는 플라즈마 막에 형광을 나타냄을 도시하는 사진이다.

도8은 본 발명에 따라 그룹 I로 분류된 리포터 단백질의 세포내 이동(trafficking)에 대한 약물의 저해 효과를 나타내는 사진으로서, 3-인산화 포스파티딜이노시톨(PI(3)P) 및 4-인산화 포스파티딜이노시톨(PI(4)P)의 저해제인 워트마닌의 RbcS:GFP의 수송에 대한 영향을 나타내는 사진으로서,

a)는 정상 대조군에서는 RbcS:GFP의 녹색 형광이 예상대로 RbcS:GFP가 수송 되어야 하는 엽록체 내로 이동된 것이 관찰된 사진이고,

b)와 c)는 모두 워트마닌 존재 시 녹색 형광이 엽록체 내로 수송되지 못하고 작은 반점 혹은 엉킨 형태로 관찰된 것을 나타내는 사진이다.

도9는 본 발명에 따라 그룹 II로 분류된 리포터 단백질의 세포내 이동(trafficking)에 대한 약물의 저해 효과를 나타내는 사진으로서,

a) 및 b)는 정상 대조군에서 500:GFP:KKXX의 녹색 형광이 수많은 네트웍 형태로 관찰되는 것을 나타내는 사진이며,

c) 및 d)는 각각 BafA1 존재 시 녹색 형광이 플라즈마막과 액포막에서 고리 모양으로 나타나는 것이 관찰된 사진이다.

도10은 두 가지 리포터 단백질의 동시 발현 시 특이적인 저해제에 의한 변화를 나타내는 사진으로서,

a) 및 b)는 정상 대조군에서 각각 녹색과 적색의 형광을 나타내는 사진이고,

d)는 브레펠딘 A를 처리하였을 때 BiP에 대한 영향은 없음을 나타내는 사진이며,

e)는 브레펠딘 A를 처리하였을 때 골지체의 파괴로 인하여 ST가 골지체에 존재하지 못하고 소포체로 이동하였음을 나타내는 사진이고,

c) 및 f)는 각각 브레펠딘 A로 처리하지 않은 상기 대조군들과 브레펠딘 A를 처리하였을 때의 결과가 형광 현미경 하에서 뚜렷한 차이를 나타냄을 보여주는 사진들이다.

도11은 소기관의 구조를 파괴하는 BFA의 작용을 시각적으로 비교할 수 있는 사진으로서,

a)는 정상 대조군에서는 BiP:RFP의 적색 형광이 소포체의 구조를 따라 분포하고 있음을 나타내는 사진이고,

c)는 BFA를 첨가하였을 때 소포체의 구조가 파괴되고 있음을 가시적으로 보여주는 사진이며,

b) 및 d)는 상기 a) 및 c)의 시료에 대하여, 리포터 단백질에 의한 형광을 사용하지 않고, 광학 현미경으로 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.

도12는, 본 발명에서 그룹 III으로 분류되는 리포터 단백질들에 대한 약물의 저해 작용을 나타내는 도면으로서,

a)의 사진들은 각각, 약물을 처리하지 않은 대조군 세포에서는 EBD가 결합하는 인지질 PI(3)P의 분포를 따라서 각 액포의 막에서 녹색의 형광이 나타나는 것을 볼 수 있으나, 저해제 워트마닌과 LY294002를 처리한 세포에서는 세포질 전체에 형광이 고루 분포함을 나타내는 것이고,

b)의 사진들은 각각, EBD의 1358번째 아미노산에 변이가 생긴 GFP:EBDC1358S를 대상으로 동일한 실험을 실시하였을 때는 세포 내의 형광 분포에 영향을 주지 못하는 것을 나타내는 사진들이다.

도13은 단백질 발현 저해제에 의한 형광 강도의 변화를 나타내는 사진들로서,

a)는, 정상 대조군(b)에 비하여, 시클로헥시미드(cycloheximide)를 처리한 세포에서의 녹색 형광의 강도가 감소한 것을 나타내는 사진이고,

c) 및 d)는 세포 내에 있는 엽록체에 의한 자연 형광으로서, 세포의 성장 및 대사 상태를 상대적으로 비교하기 위하여 관측한 사진이다.

본 발명은 세포분자유전학 분야의 기술로서 세포 내에서 특정 단백질이 특정 세포내 소기관으로 이동하는 과정을 선별적으로 관찰할 수 있게 하고, 또한 상기 특정 단백질의 발현 과정 또는 세포내 이동 과정에 영향을 미치는 신약 물질을 선별적으로 검색할 수 있도록 하는 기술이며, 특히 형광단백질로 표지된 리포터단백질(reporter protein)이 발현될 수 있도록 준비한 형질전환세포를 이용하는 세포 기반의 검출시스템에 관한 기술이다.

최근의 생명과학분야 기술의 급속한 발전은 생명체의 전체 유전자 서열 또는 전체 단백질의 발현 양상에 대한 일차적 정보를 수집하는 것을 가능하게 하여, 이러한 총괄적 일차 정보들을 대상으로 유용유전자나 유용단백질을 찾아내거나, 이러한 대량의 생명정보들 사이의 상호 연관관계를 밝히고 이를 이용하고자 하는 유전체학(Genomics)과 단백질체학(Proteomics)이라는 새로운 기술개발 분야의 중요성이 부각되고 있다. 막대한 양의 총괄적 생명정보로부터 이러한 유용 정보들을 발굴하고 이용하기 위해서는 본 발명에서 구현한 바와 같은 복잡한 생명현상의 세부적 과정들을 보다 선별적으로 분리하여 빠르게 관측할 수 있는 기술의 개발이 필요불가결하며, 최근의 여러 종래 기술들에서도 이러한 기술개발 경향이 다양하게 나타나 고 있다.

유전체학 및 단백질체학 분야의 발전에서 비롯될 방대한 양의 유용 생명정보들의 가장 대표적인 사용처는 신약 개발 분야라고 할 수 있다. 이러한 유용 생명정보들에 근거한 효율적이고도 선별적인 신약 검색 시스템의 구축은 향후의 생명과학기술 분야의 발전에 주도적 역할을 할 것으로 기대되고 있으며, 이에 따라 새로운 신약 검색 시스템의 구축을 위한 기술개발 연구들이 최근 들어 아주 활발하게 추진되고 있다.

신약 검색법의 개발은 기본적으로 (1) 질병의 원인 또는 생명현상 제어와 관련된 특이적인 타겟(target)의 발견 및 설정, (2) 상기 특이적인 목표에 미치는 약물의 영향을 선별적으로 구분하여 판정할 수 있는 분석 방법의 개발 및 최적화로 이루어진다. 따라서, 효율적인 신약 검색법의 개발을 위해서는 대량의 유전 정보와 단백질 정보에 의해 나타나는 복잡한 생명현상 중에서 특정 현상의 원인을 제공하는 구체적인 요인, 즉 유전 정보나 단백질 정보, 또는 이들의 기능과 연관된 세포내(intracellular) 또는 세포간(intercellular) 과정을 선별적으로 구분하여 관측할 수 있는 기술의 개발이 선행되어야 한다. 이러한 선별적 관측을 가능하게 하는 기술은 특정 현상의 발현을 일어나게 하는 구체적 생명 정보 요인, 즉 신약 검색의 세부적 타겟을 발견하는 것을 용이하게 할 뿐만 아니라, 신약 검색 기술을 보다 선별적 수준에서 실시할 수 있는 체계화된 분석 방법을 구축할 수 있는 기반을 제공하게 된다.

상기 특이적 타겟을 대상으로 약물의 영향을 판정하기 위한 분석 방법은 다 음과 같은 3가지로 구분할 수 있다. 즉, 질병의 발현 메카니즘에 결정적인 기여를 하는 효소나 수용체들의 활성에 대한 약물의 직접적인 영향을 관찰하여 판정하는 단백질 (또는 분자) 기반의 방법; 생명체 개체의 형태학적 또는 생화학적 특성에 미치는 약물의 영향을 관찰하여 판정하는 개체 기반의 방법; 그리고, 세포나 세포내 소기관의 형태, 세포내 단백질의 발현, 이동 및 대사 등에 미치는 약물의 영향을 관찰하고 판정하는 세포 기반의 방법으로 구분할 수 있다. 단백질 (또는 분자) 기반 방법의 경우, 정확한 목표 단백질을 대상으로 분석을 수행할 수 있다는 장점이 있지만, 시험관 내(in vitro)에서 수행되므로 세포내의 여러 가지 복합적인 요인들에 의한 영향을 고려할 수 없기 때문에 신약후보물질을 생체에 적용하기 위해서는 장시간을 요하는 많은 추가적인 실험들이 필요하게 된다. 그런 반면, 개체 기반 또는 세포 기반의 방법은, 개체 수준 또는 세포 수준에서 일어나는 종합적인 변화를 관찰할 수는 있으나, 약물의 영향이 정확한 목표 유전자 또는 목표 단백질에 대해 미치는 선별적 결과임을 확인하기 위해서는, 단백질 기반의 방법과 마찬가지로 장시간을 요하는 추가실험이 필수적이게 된다.

이러한 종래의 신약 검색법들의 문제점들을 극복하기 위한 방안으로서 분자유전학적 형질전환 기법을 이용한 새로운 기술들이 개발되고 있다. 형질전환에 의하여 특이적으로 나타나는 개체 또는 세포 수준에서의 변화를 관찰함으로써, 특정 유전자의 유전적 기능 및 이로부터 발현된 단백질의 생물학적 기능을 밝히고, 이러한 형질전환개체 또는 형질전환세포를 대상으로 형질전환에 의해 일어나는 특이 현상에 미치는 약물 후보물질의 영향을 관측함으로써 신약물질을 보다 선별적으로 검 색할 수 있게 된다.

개체 또는 세포에서 일어나는 특정 현상을 선별적으로 관측하기 위하여 전통적으로 동위원소 표지법이 많이 사용되어 왔으나, 최근 들어 세포 내에서 발현이 가능한 녹색 형광단백질(Green Fluorescent Protein; GFP)과 적색 형광단백질(Red Fluorescent Protein; RFP)이 개발되고(Morise 등, 1974), 상기 형광단백질들의 여러 변이체들이 개발됨에 따라(Evans, WO98/21355), 세포 내에서의 형광단백질의 발현을 이용하는 다양한 연구결과들이 보고되고 있다. 형광단백질을 사용한 연구 예로서, 유전자의 발현 및 단백질의 세포내 분포에 관한 연구를 비롯하여(Chalfie와 Prasher, US5491084), 세포내 기관의 가시화(Kost 등, 1998), 분비경로에 따른 단백질 수송의 가시화(Kaether와 Gerdes, 1995), 식물세포에서의 단백질의 발현 양상의 가시화(Hu와 Cheng, 1995), 초파리 배아에서의 단백질의 발현 양상의 가시화(Davis와 Viestra, 1998) 등이 있다. 형광단백질 발현을 이용한 신약 검색 방법으로는, 돌연변이 탐색을 위하여 변형된 GFP가 발현되게 형질전환한 개체를 이용하는 방법(Ward와 Chalfie, WO95/21191), 세포외 신호를 세포내로 도입하는 것을 검출하기 위하여, 세포 표면 수용체의 활성에 관여하는 전사조절인자와 형광단백질이 연결된 혼성단백질이 발현되게 형질전환한 세포를 이용하는 방법(Harpold 등, US5401629) 및 단백질 인산화효소의 활성부위를 가지는 단백질과 형광단백질이 연결된 혼성단백질이 발현되게 형질전환한 세포를 이용하여, 인산화효소와 관련된 세포내 과정에 영향을 미치는 생물학적 활성물질을 검색하는 방법(Thastrup 등, WO96/23898) 등이 있다.

형광단백질의 발현을 이용하는 이러한 다양한 연구들 중에서 특정 단백질이 세포내에서 발현되고 이동되는 과정을 형광영상을 통하여 가시화함으로써, 복잡한 세포내 과정들 중에서 특정 단백질과 관련된 세포내 과정을 선별적으로 용이하게 확인할 수 있는 예들이 제시되고 있는데(Ward와 Chalfie, WO95/21191; Kost 등, 1998; Gillooly 등, 2000; Pih 등, 2000), 이러한 연구결과들은 특정 세포내 과정에 영향을 미치는 약물을 선별적으로 검색할 수 있는 방안을 제공한다. 종래의 다양한 연구들을 통하여 특정 세포내 소기관으로 이동되는 특성을 지닌 단백질들이 다수 알려져 있다. 즉, 엽록소 결합 단백질은 엽록체로 이동하며, SV40의 핵 위치신호 부위(NLS domain)는 핵으로 이동하며(Goldfarb 등, 1986), 프록시좀(peroxisome) 표지단백질인 SKL은 퍼록시좀으로 이동하며(Davis와 Viestra, 1998), F1-H+-ATPase-:RFP는 미토콘드리아로 이동하는 (Niwa 등, 1999) 등 대부분의 단백질은 그 기능과 연관된 특정 세포내 소기관으로 이동하게 된다. 따라서, 이와 같이 세포 내에서 특이적 이동 특성을 나타내는 단백질에 형광단백질이 연결된 혼성단백질이 세포 내에서 발현되게 함으로써, 특정 단백질의 세포내 이동 특성을 가시화하여 관찰하는 것을 용이하게 할 수 있으며(Harpold 등, US5401629; Kost 등, 1998), 상기 특정 세포내 과정에 미치는 약물의 영향을 선별적으로 관찰하고 평가하는 것을 가능하게 할 수 있다(Morinaga 등, 1999). 또 다른 예로서 특정 인지질과 특이적으로 결합하는 것으로 알려진 단백질에 형광단백질이 연결된 혼성단백질이 세포 내에서 발현되게 함으로써 인지질 특이적 세포내 과정의 관찰을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어 PLC-Delta PH(Stauffer 등, 1998), AtPH 및 FAPP1(Dowler 등, 2000) 구역들은 PI(4,5)P2, PI(3)P 및 PI(4)P 인지질과 각각 특이적으로 결합하는 것으로 알려져 있는데, PH 구역과 GFP를 포함하는 혼성단백질을 세포 내에서 발현시킴으로써 이 혼성단백질이 플라스마 막으로 이동한다는 것을 밝힌 예가 있다 (Kost 등, 1998).

상기 기술된 내용에서 예시된 바와 같이, 특정 단백질의 세포내에서의 이동 및 분포 특성을 형광단백질로 표지하여 관측함으로써 세포내 과정의 세부적 규명 및 이에 근거한 선별적 신약 검색이 가능하다고 할 수 있다. 그러나, 수천에서 수만 가지 이상에 이르는 단백질들이 관여하는 대단히 복잡한 세포내 과정들을 선별적으로 체계화하여 관측할 수 있는 실질적 방안을 마련하기 위해서는, 다양한 세포내 과정들을 선별적으로 관측할 수 있는 형광단백질로 표지된 다수의 혼성단백질들을 준비하는 방법이 개발되어야 하고, 이러한 혼성단백질들이 세포 내에서 일으키는 특이적 특성들의 규명이 선행되어야 한다. 또한, 이러한 혼성단백질의 발현이 세포내에서 효율적으로 일어나도록 형질전환세포를 준비하는 방법 및 혼성단백질로부터 방출되는 형광신호를 효율적으로 영상화하고 분석할 수 있는 구체적이고도 규격화된 방안이 마련되어야 한다.

상기와 같은 요구에 따라, 본 발명은 복잡하고도 다양한 세포내 과정들을 선별적으로 관측하는 방법 및 이러한 방법에 근거하여 특정 세포내 과정에 영향을 미치는 약물을 판정하는 선별적 신약 검색 방법을 구체화하여 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

첫째, 본 발명에서는 세포내 특정 소기관으로의 위치이동을 제어하는 신호를 가진 특정 신호단백질과 형광을 나타내는 형광단백질이 연결된 리포터 단백질이 발현될 수 있도록 형질전환된 세포를 효율적으로 준비할 수 있는 방안을 제공하고자 한다.

둘째, 본 발명은 신호단백질을 코딩(coding)하는 유전자와 형광단백질을 코딩하는 유전자가 각각 하나 또는 둘 이상 연결된 다양한 재조합 유전자를 제조할 수 있는 구체적 방법들을 제공하며, 이러한 재조합 유전자가 세포 내에서 효율적으로 발현되도록 하는 혼성 플라스미드의 제조 방법을 제공하고자 한다.

또한, 상기 혼성 플라스미드를 사용하여 형질전환세포를 준비하고, 상기 형질전환세포 내에서 리포터 단백질을 효율적으로 발현시킬 수 있는 체계적인 방법을 제공하고자 한다. 나아가, 상기 리포터 단백질들의 발현 과정 및 이동 과정에서 나타나는 리포터 단백질의 세포 내에서의 세부적 분포를 형광영상을 통하여 상기 세포가 살아있는 상태를 유지하면서 계속하여, 또는 단계별로 관측할 수 있는 구체적 방법을 제공하고자 한다.

이와 같이 형질전환세포를 준비하여 특정 단백질의 세포 내에서의 발현과 이동에 따른 특이적 공간적 분포를 측정할 수 있는 체계화된 효율적인 방법을 제공함에 더하여, 본 발명에서는 이러한 형질전환세포를 이용하여 특정 세포내 과정에 영향을 미치는 약물을 판정할 수 있는 선별적 신약 검색법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기 선별적 세포내 과정의 관측법 및 이에 근거한 선별적 신약 물질 검색법의 활용 효율을 보다 구체화시키고 다양화시키기 위하여, 본 발명에서는 또한 핵, 미토콘드리아, 엽록체, 퍼록시좀(peroxisome), 세포막, 소포체, 골지체, 저장액포(storage vacuole), 용해성 액포(lytic vacuole), 및 전액포(prevacuolar compartment) 등의 다양한 세포내 소기관으로 특이적으로 이동하는 특성을 지닌 다양한 신호단백질을 대상으로 한 재조합 유전자를 제공하고자 한다. 또한, 상기 재조합 유전자의 제조에서부터 형질전환세포의 준비에 이르는 전반적인 과정들을 최적화하여 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 첫번째 측면에서는,

세포 내에서 특정 단백질의 이동과 공간적 분포에 관한 특이적 특성을 확인하는 방법으로서,

(a) 세포내 특정 소기관으로의 위치이동을 제어하는 부분을 포함하는 신호단백질을 코딩(coding)하는 유전자와 형광을 나타내는 형광단백질을 코딩하는 유전자가 각각 하나 또는 둘 이상 연결된 재조합 유전자를 준비하는 단계와;

(b) 상기 재조합유전자가 세포 내에서 발현될 수 있도록 프로모터(promoter) 부분과 터미네이터(terminator) 부분을 포함하여 구성된 혼성 플라스미드를 준비하는 단계와;

(c) 상기 (b)단계에서 준비한 혼성 플라스미드 1종 또는 2종 이상을 세포 내에 주입하여 형질전환세포를 준비하는 단계와;

(d) 상기 형질전환세포에서 신호단백질과 형광단백질이 연결된 리포터 단백질이 발현되도록 하는 단계; 및

(e) 상기 형질전환세포 내에서 발현되는 리포터 단백질의 분포를 발현 중, 이동 중, 또는 그 후에 형광영상 측정을 통하여 관측하는 단계를 포함하여 구성되는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 두번째 측면에서는,

세포 내에서 특정 단백질의 이동과 공간적 분포 형성에 관련된 특이적 특성에 영향을 미치는 화학물질을 검색하는 방법으로서,

(a) 세포내 특정 소기관으로의 위치이동을 제어하는 부분을 포함하는 신호단백질을 코딩(coding)하는 유전자와 형광을 나타내는 형광단백질을 코딩하는 유전자가 각각 하나 또는 둘 이상 연결된 재조합 유전자를 준비하는 단계;

(b) 상기 재조합 유전자가 세포 내에서 발현될 수 있도록 프로모터(promoter) 부분과 터미네이터(terminator) 부분을 포함하여 구성된 혼성플라스미드를 준비하는 단계;

(c) 상기 (b)단계에서 준비한 혼성플라스미드 1종 또는 2종 이상을 세포내에 주입하여 형질전환세포를 준비하는 단계;

(d) 상기 형질전환세포에서 신호단백질과 형광단백질이 연결된 리포터단백질이 발현되도록 하되, 상기 리포터단백질이 발현되기 전, 후 또는 동시에, 생물학적 활성을 가질 것으로 추정되는 화학물질로 상기 형질전환세포를 처리하는 단계;

(e) 상기 화학물질로 처리된 형질전환 세포 내에서 발현되는 리포터단백질의 분포를 발현 중, 이동 중, 또는 그 후에 형광영상 측정을 통하여 관측하는 단계; 및

(f) 상기 (e)단계에서 측정한 형광영상을, 화학물질로 처리하지 않은 대조군의 형광영상과 비교하여 화학물질의 영향을 판정하는 단계를 포함하여 구성되는 방법을 제공한다.

본 발명의 세번째 측면에서는, 상기 방법들에서 사용되며 세포내 특정 소기관으로 이동하여 세포내 단백질의 이동 및 세포내 소기관의 공간적 분포를 가시화할 수 있도록, 그것이 주입된 형질전환된 세포 내에서 발현되는 리포터 단백질을 코딩(coding)하는 재조합 유전자를 제공하는데, 상기 재조합유전자는 세포내 특정 소기관으로의 위치 이동을 제어하는 부분을 포함하는 신호단백질을 코딩하는 유전자와 형광을 나타내는 형광단백질을 코딩하는 유전자가 각각 하나 또는 둘 이상 연결되어 제조되는 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 구성을 구체적으로 설명하면, 본원 발명은 핵, 미토콘드리아, 엽록체, 퍼록시좀(peroxisome), 세포막, 소포체, 골지체, 저장액포(storage vacuole), 용해성 액포(lytic vacuole), 및 전액포(prevacuolar compartment) 등의 세포내 소기관과 3종의 인지질로 각각 이동하는 특이적 특성을 가진 NLS(핵 위치 신호 서열), AtOEP7, Cab (엽록소 a/b 결합 단백질), SKL(퍼록시좀 이동 모티브), RbcS(루비스코 스몰 서브유닛), RA (루비스코 액티바제) 및 F1- H+-ATPase, H+-ATPase, BiP(샤프론 결합단백질), ST (시알릴트랜스퍼라제), Chi(키티나제), 혼성클론 526, 클론 491, 클론 500, AtVTI1a, SPO(스포라민), EBD, AtPH, FAPP, 및 PH 등의 신호단백질들을 선정하고, 이들을 대상으로 형광단백질로 표지된 리포터 단백질이 발현될 수 있는 형질전환세포를 준비하는 방법을 제공한다. 그리고, 상기 형질전환세포를 이용한 선별적 세포내 과정의 관측법 및 이에 근거한 선별적 신약 검색법을 규격화하여 구현하였다.

보다 구체적으로, 상기 본 발명의 방법은, 세포 내에서 특정 위치로 이동하는 단백질들을 선정하여 그 단백질의 전부 또는 위치이동의 정보를 포함하고 있는 일부분에 해당하는 유전자를 합성하고, 이들 신호단백질과 함께 연결되어 위치를 시각화 할 수 있도록 형광을 나타내는 형광단백질의 유전자를 합성하여, 이들이 각각 하나 또는 둘 이상 연결된 재조합 유전자를 제조하는 과정을 포함한다. 신호단백질과 형광단백질이 결합하는 방법에 따라 신호단백질의 기능에 차이가 발생하며, 본 발명에서는 신호단백질이 정확한 위치이동을 할 수 있는 구성을 밝혀내고 그 제조법을 확립하였다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 유전자가 세포 내에서 발현이 가능하도록 혼성 플라스미드를 제조하는 과정을 포함한다. 이는 프로모터를 포함하는 핵산 운반체에 상기 재조합 유전자를 연결하는 방법으로 구성될 수 있다. 혼성 플라스미드를 주입하여 세포를 형질전환시키는 방법은 당 분야의 통상의 지식을 가진 기술자들에게 잘 알려진 바와 같이, PEG(polyethylene glycol), 인산칼슘, DEAE-덱스트란 등의 화학물질을 이용하는 방법, 양이온성 지질을 이용하는 라이포펙션(lipofection) 방법, 마이크로인젝션법, 일렉트로포레이션법, 일렉트로퓨젼법 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다. 이 때 도입되는 혼성 플라즈미드는 1종을 사용할 수도 있고 2종 이상을 사용하여 두 가지 이상의 단백질이 동시에 발현될 수 있도록 할 수도 있다. 형질전환된 세포에서 신호단백질과 형광단백질이 연결된 리포터 단백질이 효율적으로 발현되도록 조건을 최적화할 필요가 있는데, 이는 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 각 신호단백질 및 형광단백질의 종류에 따라 적절히 조절하여 선택할 수 있을 것이며, 본원 발명의 경우, 이후 설명하는 실시예에서 그들의 구체적인 아미노산 서열이나 그에 해당하는 유전자 서열을 나타내는 혼성 플라스미드의 구성을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 리포터 단백질을 구성함에 있어서, 세포 내에서 단백질이 각 소기관으로 이동하는 여러 가지 방법에 대하여 공통적으로 적용될 수 있음을 보이기 위하여, 신호단백질을 단백질 이동신호 체계에 근거하여 세가지 그룹으로 분류하였다. 즉, 신호단백질의 특정 부위가 세포 내에서의 이동을 위한 직접적 인지 신호로 작용하는 체계에 해당하는 세포내 소기관들인 핵, 엽록체, 미토콘드리아 등에 특이적인 단백질들(이하, 본원 명세서에서 편의상 그룹 I로 분류하기로 한다. 도1 참조)과, 신호단백질의 특정 부위가 소포(vesicle)에 포획되는 신호로 작용하여 소포에 둘러싸여 이동하는 엔도소말 이동(endosomal trafficking) 체계에 해당하는 세포내 소기관들인 소포체, 골지체, 용해성 액포, 저장액포, 세포막 등에 특이적인 단백질들(이하, 본원 명세서에서 편의상 그룹 II라고 한다. 도4 참조)로 세분하여, 그들이 각 기관별로 이동하는 과정과 그 공간적 분포를 가시화 할 수 있도록 하는 구체적 방안을 제시하였다. 이와 함께, 세포내 신호전달 과정에 관여하는 인지질에 특이적인 결합을 하는 단백질들(이하, 본원 명세서에서 편의상 그룹 III 이라고 한다. 도6 참조)을 선정함으로써 특정 인지질이 존재하는 세포내 부위를 관측할 수 있는 방안도 제시하였다.

이들 신호단백질은 세포 내의 각 소기관으로 이동할 때 그 작용과 관련하여, 세포 내에서의 위치가 각 소기관의 막, 내부, 외부까지 특이적으로 표시될 수 있도록 구성되었으며, 두 가지 이상의 단백질의 위치를 동시에 확인할 수 있도록 두 가지 이상 색깔의 형광을 각각 사용하는 방안도 제시하고 있다.

이후 설명하는 본 발명의 실시예에서는 리포터 단백질을 구성함에 있어서 위치를 가시화하기 위한 형광단백질로 녹색 형광단백질(GFP, Davis와 Viestra, 1998) 및 적색 형광단백질(RFP)을 사용하였으나, 이 외에 다른 형광단백질을 사용하여 동일한 방법으로 본 발명에 따른 리포터 단백질을 구성할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 기술자라면 충분히 이해할 수 있을 것이다.

상기 형질전환된 세포에서 발현되는 리포터 단백질로부터 방출되는 특정 파장의 형광을 형광현미경을 사용하여 상기 세포가 살아있는 상태에서 계속하여 영상화할 수 있게 함으로써, 세포 내에서의 리포터 단백질의 발현과정 및 이동과정을 단계별로 세밀하게 가시화할 수 있었다.

특정 단백질이 발현되어 특정 소기관으로 이동하는 과정과 그 공간적 분포를 확인할 수 있게 됨에 따라, 이를 이용하여 특정 단백질의 세포내 이동을 저해 또는 촉진하는 화학물질을 효율적으로 검색할 수 있는 선별적 신약 검색 시스템을 구축할 수 있었다. 즉, 생물학적 활성을 가지고 있을 것으로 추정되는 화학물질을, 상기 본 발명에 따른 형질전환세포 내에서 상기와 같은 리포터 단백질이 발현되기 전, 후 또는 발현과 동시에 상기 형질전환세포에 처리하고, 이들이 단백질의 이동에 미치는 영향에 의하여 나타나는 세포내 단백질의 분포를, 그러한 화학물질을 처리하지 않은 대조군과 비교함으로써, 처리한 화학물질의 영향을 확인할 수 있음을 보여 주었다.

동일한 방법에 의하여, 리포터단백질의 형광신호의 증감에 따라 발현되는 정도를 비교할 수도 있으므로, 세포 내에서의 단백질의 전사과정(transcription) 또는 번역과정(translation)을 저해 또는 촉진하는 물질의 검색에도 사용할 수 있음을 보여 주었다.

또한, 상기 리포터단백질의 형광신호의 분포 및 형태에 따라, 처리한 화학물질에 의한 세포내 소기관의 변형, 손상, 파괴 등과 같은 형태 변화를 관찰할 수 있으므로, 이와 같은 세포내 기관의 변화를 유발하는 세포독성을 나타내는 물질들을 선별할 수 있음도 보여 주었다.

상기 본 발명에서 제시하는 선별적 신약 검색 시스템이 실질적으로 적용될 수 있음을 보이기 위하여, 이후 실시예에서 상세히 나타낸 바와 같이, 바필로마이신 A1, 워트마닌 및 브레펠딘 A 등의 기지의 세포내 기능 저해제를 사용하여 단백질의 세포내 이동과정과 발현과정이 저해되는 경우 및 세포내 소기관의 변형을 초래하는 세포독성이 나타나는 경우를 실질적으로 관측할 수 있음을 확인하였다. 또한 이후 실시예에서, 단백질의 이동 방법에 따른 차이에 대하여 선별적으로 확인하기 위하여, 상기에서 정의한 그룹 I, II, III에 해당하는 단백질에 대하여 각각 실시하여 그 결과를 확인하였다.

본 발명의 구성 및 그 유용성은 첨부된 도면과 함께 본 발명의 바람직한 실시예에서 상세히 설명된다. 그와 같은 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며 발명을 한정하기 위한 것이 아니다. 본 발명에 속한 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본원 명세서에 첨부된 도면, 발명의 상세한 설명 및 특허청구범위에 기재된 내용로부터 본 발명의 다른 목적 및 장점을 쉽게 인식할 수 있을 것이다.

(실시예)

<실시예 1> 막을 통하여 소기관으로 이동되는 단백질들(그룹 I)을 발현시키기 위한 혼성 플라즈미드 제조

F1-H+-ATPase- (접속번호 D88374)의 트랜짓 펩티드(transit peptide)는 두 개의 특이 프라이머 (CTTTAATCAATGGCAATG와 CCATGGCCTGAACTGCTCTAAGCTT)를 이용하여 람다잽II(λZAPII) cDNA 라이브러리를 대상으로 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의하여 증폭하여 녹색 형광단백질 (GFP)의 아미노 말단과 접합하여 F1-H+-ATPase-:RFP (Niwa et al., 1999)를 제조하였다. 연결된 융합 유전자는 pBluescript에 도입하여 35S 프로모터의 조절유전자의 영향에 들도록 F1-ATPase:RFP 혼성 플라스미드를 제조하였는데, 이후의 혼성 플라스미드를 형질전환하기 위한 과정에서도 이와 같은 방법을 실시하였다.

루비스코(rubisco; ribulose bisphosphate carboxylase) 복합단백질에 대한 리포터단백질을 발현시키기 위하여, 람다잽II cDNA 라이브러리를 대상으로 두개의 특이 프라이머 (CCTCAGTCACACAAAGAG와 ACTCGAGGGAATCGGTAAGGTCAG)를 사용하여 PCR 을 실시하여 루비스코의 스몰서브유닛(small subunit)의 트랜짓 펩티드를 증폭시켰다. PCR 생성물은 pBluescript에 서브클론하여 GFP 및 적색형광단백질(RFP)의 아미노 말단에 프레임이 맞도록 접합시켜 각각 RbcS:GFP 또는 RbcS:RFP를 제조하였다.

엽록소a/b-결합 단백질을 위하여 람다잽II cDNA 라이브러리를 대상으로 두개의 특이 프라이머(TAGAGAGAAACGATGGCG 및 GGATCCCGTTTGGGAGTGGAACTCC)를 사용하여 PCR 증폭하여 제조한 유전자를 도입하여 Cab:GFP 혼성플라스미드를 제조하였다.

루비스코 액티바제(rubisco activase, RA)의 트랜짓 펩타이드는 두 개의 특이 프라이머(TCTAGAATGGCCGCCGCAGTTTCC와 GGATCCATCTGTCTCCATCGGTTTG)를 이용하여 람다잽II cDNA 라이브러리를 대상으로 PCR 증폭하여, GFP 또는 RFP의 5' 말단과 접합시켜 RA:GFP 및 RA:RFP를 제조하였다.

완두콩의 OEP14와 유사한 애기장대의 외막 단백질 AtOEP7에 대한 유전자를 제조하기 위하여, AtOEP7 코딩 부위를 애기장대의 유전체 DNA를 대상으로 자연적으로 존재하는 종료 신호를 제거하도록 고안된 두 개의 특이 프라이머(OEP7-F: GACGACGACGCAGCGATG 와 OEP7-R: GGATCCCCAAACCCTCTTTGGATGT)를 이용하여 PCR 증폭하였다. GFP 또는 RFP의 5' 말단과 접합하여 각각 AtOEP7:GFP 및 AtOEP:RFP를 제조하였다.

핵 위치 신호(nuclear location signal; NLS)에 대한 혼성단백질 NLS:GFP는 전에 기술한 방법으로 제조하였다(Pih et al., 2000). NLS:RFP는 NLS:GFP에서 GFP의 코딩부분을 RFP로 치환하여 제조하였다.

프록시좀(peroxisome)에 대한 이동 모티브 SKL(serine, lysine, leucine)에 대한 리포터 단백질인 GFP:SKL을 제조하기 위하여, 326GFP(Davis and Viestra, 1998)를 템플레이트(template)로 두 개의 특이 프라이머(CCGTATGTTACATCACC와 ACTCGAGGGAATCGGTAAGGTCAG)를 사용하여 PCR 증폭하여 혼성 플라스미드를 제조하였다.

상기의 방법으로 제조한 혼성 플라스미드를 발현시킨 각 리포터단백질의 모식도를 도1에 표시하였다.

<실시예 2> 프로토플래스트의 제조 및 혼성 플라스미드에 의한 세포의 형질전환

a) 프로토플래스트의 제조

온실 내 토양에서 배양된 3-4주 된 애기장대의 잎 조직(5 g)을 5-10 mm²의 크기로 새 면도날로 잘게 자른 후, 이를 효소용액(0.25% 마세로자임(Macerozyme) R-10, 1.0% 셀룰라제(Cellulase) R-10, 400 mM 만니톨(mannitol), 8 mM CaCl2, 5 mM Mes-KOH, pH 5.6) 50 ml를 이용하여 22℃에서 천천히 진탕(50-75 rpm)하면서 방치하였다. 프로토플래스트 현탁액은 100 μm 메시로 여과한 후 46 xg 에서 5분간 원심분리하여 회수하였다. 프로토플래스트는 W5용액 (154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl, 5 mM 글루코즈(glucose), 1.5 mM Mes-KOH, pH 5.6) 5-10 ml로 재현탁하여, 21% 수크로즈 20 ml 위에 얹어 78 xg 에서 5분간 원심분리하였다. 손상되지 않은 온전한 프로토플래스트를 층간에서부터 회수하여 20ml의 W5용액에 담구었다. 프로토플래스트는 다시 55xg 에서 5분간 원심분리하고, 이를 20 ml의 W5용액에 다시 재현탁하여 얼음 위에 30분간 방치하였다.

b) 혼성 플라스미드 DNA의 분리 및 형질전환

혼성 플라스미드는 퀴아젠 컬럼 (Valencia, CA)을 이용하여 제조사의 추천 방법에 따라 분리하였다. DNA를 프로토플래스트로 삽입하기 위하여 프로토플래스트를 다시 46xg 에서 5분간 원심분리한 후, MaMg용액 (400 mM 만니톨(Mannitol), 15 mM MgCl2, 5 mM Mes-KOH, pH 5.6)에 5x106 프로토플래스트/ml 의 밀도로 재현탁하였다. 혼성 플라스미드 클론은 PEG 매개 형질전환법으로 애기장대의 프로토플래스트에 삽입시켰다(Kim 등, 2001; Jin 등, 2001). 약 20-50μg의 플라즈미드 DNA(2 μg/ml)를 프로토플래스트 현탁액 300 ml과 혼합한 후, 325 ml의 PEG 용액(400 mM 만니톨(Mannitol), 100 mM Ca(NO3)2, 40% PEG 4000)을 가하고 부드럽게 혼합하였다. 혼합액은 실온에서 30분간 방치하고 W5 용액 10 ml로 희석하였다. 프로토플래스트는 50 xg 에서 5분간 원심분리하여 희석하고, W5 용액 3 ml로 재현탁하여 22℃의 암실에 방치하였다.

<실시예 3> 그룹 I 리포터 단백질들의 세포 내 발현 및 위치 관찰

실시예 1에서 제조한 혼성 플라스미드를 실시예 2의 방법으로 세포에 형질전환 후 시간 변화에 따른 리포터 단백질들의 발현을 형광현미경(독일Zeiss, Axioplan fluorescence microscope)과 냉각형 CCD 카메라를 사용하여 영상을 잡아 관찰하였다. 사용된 필터는 XF116(exciter: 474AF20, dichroic: 500DRLP, emitter: 510AF23), XF33/E(exciter: 535DF35, dichroic: 570DRLP, emitter: 605DF50), 및 XF137 (exciter: 540AF30, dichroic: 570DRLP, emitter: 585ALP)(Omega, Inc., Brattleboro, VT)이며, 각각 GFP, RFP 및 엽록소의 자체 형광을 관찰하기 위하여 사용되었다. 결과는 Adobe (Mountain View, CA) Photoshop 소프트웨어를 사용하여 분석하여 위색상으로 나타내었다.

a) 엽록체로 이동하는 리포터 단백질들의 위치

리포터단백질 AtOEP7:GFP의 녹색 형광은 엽록체 막의 외부에서 관찰되었다. 도 2의 a)에서 적색 형광은 엽록체 본래의 형광이므로 이를 필터로 제거한 결과가 도2의 b)에 나타나 있다. 본 결과는 이러한 엽록체 막으로의 이동 신호를 가진 신호단백질과 형광의 표지 단백질을 포함한 혼성단백질이 모두 엽록체 막으로 수송되었음을 나타낸다.

리포터단백질 RbcS:GFP, Cab:GFP 및 RA:GFP의 혼성 단백질의 녹색 형광이 나타나는 위치를 분석한 결과는 각각 도2의 c), d), 및 e)와 같았다. 상기 도면에 나타난 바와 같이, 루비스코 복합 단백질은 엽록체의 스트로마(stroma)에 위치하며, Cab:GFP는 엽록체에서 발광하였다. 이러한 결과는 RbcS, Cab 및 RA가 가지는 이동 신호와 형광의 표지 단백질을 포함한 혼성단백질이 모두 엽록체 내로 이동하였음을 나타낸다.

b) F1-H+-ATPase-:RFP 의 미토콘드리아로의 이동

리포터단백질 F1-H+-ATPase-:RFP에 의한 적색 형광이 미토콘드리아 내에서 관찰되었다(도2의 f)). 이 결과는 미토콘드리아 내로의 이동 신호를 가진 신호단 백질과 형광단백질을 포함한 단백질이 모두 미토콘드리아 내로 이동하였음을 나타낸다.

c) GFP:SKL의 퍼록시좀으로의 수송

GFP:SKL 혼성단백질의 녹색형광이 나타나는 위치를 분석한 결과, 도2의 g)와 같이 GFP:SKL의 녹색 형광이 퍼록시좀으로 이동함이 관찰되었다. 본 결과는 이러한 퍼록시좀으로의 이동 신호 SKL(serine, lysine, leucine)와 형광의 표지 단백질을 포함한 혼성단백질이 모두 퍼록시좀으로 이동하였음을 나타낸다.

d) NLS:GFP의 핵으로의 수송

혼성단백질의 녹색형광이 나타나는 위치를 분석한 결과, 도2의 h)와 같이 NLS:GFP의 녹색 형광이 핵 내로 이동함이 관찰되었다. 본 결과는 이러한 핵 내로의 이동 신호와 형광의 표지 단백질을 포함한 혼성단백질이 핵 내로 수송되었음을 나타낸다.

<실시예 4> 웨스턴 블랏 분석법으로 AtOEP7:GFP의 엽록체 막으로의 수송 확인

AtOEP7:GFP의 혼성 플라즈미드는 실시예 1과 같이 제조하였다. 제조된 혼성 플라즈미드를 실시예 2에서의 방법으로 형질전환하고, 24시간 방치하였다. 세포액 5 ml를 원심분리한 후 4℃의 마쇄용액(10mM EDTA, 50 mm HEPES-KOH, 0.33 M 소르비톨(sorbitol), 0.5 g/l BSA, 5 mM 소디움 아스코로베이트(sodium ascorbate)) 5 ml에 현탁시켜서, 호모게나이저(homogenizer)로 3초 간격으로 20분간 처리하여 전체 단백질 용액을 제조하였다. 전체 단백질 용액을 100,000xg로 원심분리하여 액상 부 분과 막 부분을 각각 분리하였다. 각각의 시료를 SDS를 포함하는 7.5% 폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동하였으며, 전개된 젤을 PVDF 나일론 막에 붙여서 단백질을 이동시킨 후, 이를 폴리클로날 앤티-(polyclonal anti-)GFP 항체로 결합시켰다.

그 결과, 세포 내에서 발현된 신호단백질은 세포질에 존재하지 않고 모두 엽록체 엔벨롭 막으로 이동하였음을 보여주고 있다(도3). 이는 기존의 웨스턴 블랏 방법으로 확인하는 단백질의 분포를 본 발명에서 제시하는 방법으로 동일하게 확인할 수 있음을 나타낸다.

<실시예 5> 세포질 내에서 엔도소말 트래피킹(endosomal trafficking) 과정을 통하여 소기관으로 이동되는 단백질들(그룹 II)을 발현시키기 위한 혼성 플라스미드의 제조

H+-ATPase의 코딩 부위의 전범위(애기장대의 AHA2)를 두개의 특이 프라이머 (ACTCGAGGGAATCGGTAAGGTCAG 및 ACTCGAGGGAATCGGTAAGGTCAG)를 사용하여 위와 같은 방법으로 증폭하여, GFP의 5' 말단과 연결하였다. 연결된 융합 유전자는 pUC 벡터에 도입하여 35S 프로모터의 조절유전자의 영향에 들도록 혼성 플라스미드를 제조하였는데, 이는 이후의 실시예에서도 같은 방법으로 실시하였다.

애기장대의 전체 cDNA에서 두개의 특이적인 프라이머 BIP5(5'-TACGCAAAGTTTCC-GAT-3')와 BIP3(5'-CTAGAGCTCATCGTGAGA-3')을 사용하여 샤프론 결합단백질(BiP) 유전자(접속번호 D82817)를 증폭시켰다. 이 유전자의 아미노 말단 부위(44개 아미노 잔기)와 카복시 말단 부위(44 아미노 잔기)를 각각 GFP와 RFP의 아미노 말단과 카복시 말단에 연결하여 BiP:GFP와 BiP:RFP 융합유전자를 제조하였다.

시알기 전달효소(sialtransferase, ST)의 cDNA는 람다잽II cDNA 라이브러리를 대상으로 두 개의 특이 프라이머(ATGATTCATACCAACTTGAAG 와 GGATCCACAACGAATGTTCCGGAA)를 이용하여 증폭하였다. GFP 또는 RFP를 ST의 카복시 말단에 프레임에 맞게 접합시켜 ST:GFP 및 ST:RFP를 제조하였다.

키티나제(Chitinase)에 대한 혼성단백질 Chi-n:RFP:Chi-c를 제조하기 위하여 종료 신호를 제외한 RFP 코딩부위를 포함하는 DNA 조각을 콩의 키티나제 cDNA(접속번호 M13968)의 Sma I 및 EcoRV 사이트에 접합하였다.

액포 분류 수용체(vacuolar sorting receptor)로 작용하는 단백질 BP-80의 세포질 부위(cytoplasmic tail)를 제거한 클론 500을 발현시키기 위하여, 500:GFP의 혼성 플라즈미드는 종료 신호가 제거된 GFP코딩부위를 먼저 클론 500의 EcoRI 위치에 삽입시켜서 제조하였다(Kim 등, 2001).

BP-80의 세포질 부위가 TIP(tonoplast intrinsic protein)의 세포질 부위로 치환된 혼성클론 526을 위하여, 혼성클론 526의 EcoRI 위치에 GFP의 코딩부위를 삽입하여 526:GFP의 혼성플라즈미드를 제조하였다.

BP-80 단백질인 클론 491에 대한 리포터단백질을 발현시키기 위하여, 491:GFP 및 491:RFP는 각각 종료 신호가 제거된 GFP및 RFP의 5 말단에 클론 491을 삽입하여 혼성 플라즈미드를 구성하여 제조하였다.

500:GFP:KKXX는 다음과 같이 제조하였다. 종료 신호가 제거된 GFP코딩 부위 를 먼저 클론500의 EcoRI 위치에 삽입시킨 후(Jiang and Rogers, 1998), 두개의 특이 프라이머 (GGATCCTCTAGAGGATCGATCCGG 와 TTAGATGAGTTTCTTTTTCTCAAAGAAAGTTTTCAAAAGGAATCCCCCTCC)를 이용하여 PCR증폭함으로써 KKXX를 500:GFP의 말단에 접합시켰다.

트랜스 골지 네트웍에서 저장전액포로 이동하는 애기장대의 t-SNARE의 일종인 AtVTI1a(Zheng 등, 1999)를 발현시키기 위하여, RFP의 카복시 말단에 AtVTI1a의 코딩 유전자를 결합시켜 RFP:AtVTl1a를 제조하고, AtVTl1a의 카르복시 말단에 GFP의 코딩 부위를 접합시켜 혼성 플라즈미드 AtVTI1a:GFP의 재조합 유전자를 구성하여 혼성 플라즈미드를 제조하였다.

스포라민의 발현을 위하여 스포라민 B의 유전자 카복시 말단에 GFP를 연결하여 SPO:GFP 혼성단백질에 대한 혼성 플라즈미드를 구성하였다.

상기의 방법으로 제조한 혼성 플라스미드를 발현시킨 각 리포터 단백질의 모식도는 도4에 표시하였다.

<실시예 6> 그룹 II 리포터 단백질들의 세포내 발현 및 위치 관찰

H+-ATPase:GFP, ST:GFP, BiP:RFP, 526:GFP, Chi-n:RFP:Chi-c, 500:GFP:KKXX의 혼성 플라즈미드의 제조는 실시예 4에서와 같이 실시하였으며, 이들을 실시예 2의 방법으로 세포에 형질전환 후 시간 변화에 따른 리포터 단백질들의 발현을 실시예 3에 설명한 바와 같이 형광 현미경으로 관찰한 결과들 중 일부는 다음과 같다.

리포터단백질 H+-ATPase:GFP는 플라즈마 막에 형광이 나타났으며(도5의 a)), ST:GFP는 골지체에 형광을 나타내었는데(도5의 b)), 이들 결과 중 적색 형광은 엽록체의 자연 형광에 의한 것이다. 리포터단백질 BiP:RFP와 500:GFP:KKXX에 의하여 나타나는 형광의 위치는 소포체였는데, 이들은 각각 소포체 루멘(lumen)과 막을 표시하였다(도5의 c) 및 d)). 526:GFP에 의해서는 저장액포의 막이(도5의 e)), Chi-n:RFP:Chi-c에 의하여 저장액포(도5의 f))가 각각 형광을 나타내었다. 신호단백질로 키티나제(chitinase)를 사용할 때, 카르복시 부분을 연결하지 않은 Chi-n:RFP는 저장액포에 도달하지 못하고 소포체에 점의 형태로 존재하였다(도5의 g)). SPO:GFP에 의한 형광은 용해성 액포 전체에 고루 분포하고 있었다(도5의 h)).

<실시예 7> 인지질에 특이적인 단백질들(그룹 III)을 발현시키기 위한 혼성플라즈미드 제조

GFP:EBD 혼성유전자를 제조하기 위하여 사람의 초기 엔도소말 항원(early endosome antigen) 1 (EEA1)의 C-말단에 해당하는 코딩부위(아미노산 잔기 1257에서 1411) 유전자를 두 개의 프라이머 5'-GAATTCGTGGCAATCTAGTCAACGG-3' 및 5'-CTAATGTTAGTGTAATATTAC-3'와 함께 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 증폭하였으며, 이를 종료신호가 제거된 GFP 코딩 유전자의 C-말단에 연결하였다. 연결된 융합유전자는 pUC 벡터에 도입하여 35S 프로모터의 조절유전자의 영향에 들도록 혼성 플라스미드를 제조하였는데, 이는 이후의 실시예에서도 같은 방법으로 실시하였다.

EBD 변이체의 혼성 플라즈미드 구성을 위하여 GFP:EBDC1358S는 1358 위치에 아미노산이 세린(serine)으로 치환되도록 프라이머를 구성하여 제조하였다.

애기장대의 PH 구역(Pleckstrin homology domain)에 대한 혼성단백질 GFP:AtPH는 두개의 프라이머 5'-CCCGGGAAATGGAGAGTATGTGGCGA-3'와 5'-TAATCACCGCCTGTGATCATA-3'를 사용하였고, PH 구역을 포함하는 FAPP의 혼성단백질 GFP:FAPP는 두개의 프라이머 5'-CTCGAGATGGAGGGGGTTCTGTACAAG-3'와 5'-TCACGCTTTGGAGCTCCCAAGGGC-3'을 사용하여 PCR 증폭하였으며, PH:GFP는 Kost B 등의 방법(1998)으로 제조하였다.

상기의 방법으로 제조한 혼성 플라스미드를 발현시킨 각 리포터 단백질의 모식도는 도6에 표시하였다.

<실시예 8> 그룹 III 리포터 단백질들의 세포내 발현 및 위치 관찰

실시예 7의 방법으로 제조한 혼성 플라스미드 GFP:EBD, GFP:AtPH, GFP:FAPP, GFP:PH를 실시예 2의 방법으로 세포에 형질전환 후, 시간에 따른 리포터 단백질들의 발현을 실시예 3에서 설명한 바와 같이 형광현미경으로 관찰한 결과들 중 일부는 다음과 같다.

리포터단백질 GFP:EBD와 GFP:AtPH는 각 액포들의 외벽에 형광을 나타내어 이들이 3-인산 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol 3-phosphate; PI(3)P)를 포함하는 위치로 파악되었으며, GFP:FAPP와 GFP:PH는 각각 4-인산 포스파티딜이노시톨 (phosphatidylinositol 4-phosphate; PI4P)과 4,5-이인산 포스파티딜이노시톨 (phosphatidylinositol 4,5-diphosphate; PI(4,5)P2)이 분포하는 플라즈마 막에 형광을 나타내었다. 이는 인지질이 분포하는 곳으로 단백질을 이동시키기 위하여, 인지질에 특이적인 단백질의 전체 또는 일부를 신호단백질로 사용하는 것이 가능함을 보여주고 있다(도 7 참조).

<실시예 9> 워트마닌(wortmannin)이 RbcS:GFP의 수송에 미치는 영향

a) 혼성 플라스미드 제조, 형질전환 및 혼성 단백질의 발현

RbcS:GFP의 혼성 플라즈미드는 실시예 1과 같이 제조하였다. 혼성 플라즈미드의 분리, 프로토플래스트의 제조, 및 형질전환은 실시예 2와 같이 실시하였다. 프로토플래스트 현탁액에 워트마닌을 5 μg/ml 농도로 처리한 후 형질전환하고 암실에서 배양하였다. 혼성단백질의 발현 관찰은 실시예 3과 같이 실시하였다.

b) 화학물질 워트마닌이 혼성단백질의 세포내 이동에 미치는 영향

3-인산화 포스파티딜이노시톨(PI3P)과 4-인산화 포스파티딜이노시톨(PI4P)에 대하여 특이적으로 저해하는 워트마닌(Ui 등, 1995)이 RbcS:GFP의 수송에 미치는 영향을 검사하였다. 혼성단백질의 녹색형광이 나타나는 위치를, 화학물질을 처리하지 않은 정상 대조군과 워트마닌을 처리하였을 경우와 비교 분석하였다. 도8에 나타난 바와 같이, 정상 대조군에서는 RbcS:GFP의 녹색 형광이 예상대로 RbcS:GFP가 수송되어야 하는 엽록체 내로 이동된 것이 관찰되는 반면에(도8의 a)), 워트마닌 존재 시에는 녹색 형광이 엽록체 내로 수송되지 못하고 작은 반점 혹은 엉킨 형태로 관찰되었다(도8의 b) 및 c)). 본 결과는 워트마닌이 엽록체로 이동되어야 하는 단백질의 세포질에서 엽록체로의 이동을 저해함을 나타낸다.

<실시예 10> 액포형 H+-ATPase의 저해제인 바필로마이신 A1(bafilomycin A1, BafA1)의 500:GFP:KKXX의 역행성의 트래피킹(retrograde trafficking)에 미치는 영향

a) 혼성 플라스미드 제조, 형질전환 및 혼성단백질의 발현

500:GFP:KKXX의 혼성 플라즈미드는 실시예 5와 같이 제조하였고, 혼성 플라즈미드의 분리, 프로토플래스트의 제조, 및 형질전환은 실시예 2와 같이 실시하였다. 프로토플래스트 현탁액에 바필로마이신 A1를 5 μg/ml 농도로 처리한 후 형질전환하고 암실에서 배양하였으며, 혼성단백질의 발현관찰은 실시예 3와 같이 실시하였다.

b) 화학물질 바필로마이신 A1(BafA1)이 혼성단백질의 세포내 이동에 미치는 영향

혼성단백질의 녹색형광이 나타나는 위치를 화학물질을 처리하지 않은 정상 대조군과 BafA1를 처리하였을 경우와 비교 분석하였다. 도9에서 나타낸 바와 같이 정상 대조군에서는 500:GFP:KKXX 의 녹색 형광이 수많은 네트웍 형태로 관찰되는 반면(도9의 a)와 b)), BafA1 존재 시에는 녹색 형광이 플라즈마 막(도9의 c))과 액포막(도9의 d))에서 고리 모양으로 나타났다. 본 결과는 BafA1이 애기장대의 프로토플래스트에서 500:GFP:KKXX의 역행성의 트래피킹이 저해되고, 표지 형광단백질이 플라즈마 막 또는 액포막으로 이동됨을 나타낸다.

<실시예 11> 두 가지 리포터단백질의 동시 발현시 특이적인 저해제에 의한 변화

a) 혼성 플라스미드 제조, 형질전환 및 혼성단백질의 발현

각각 소포체와 골지체에 특이적인 리포터단백질 BiP:GFP와 ST:RFP의 혼성 플라즈미드는 실시예 5와 같이 제조하였다. 혼성 플라즈미드의 분리, 프로토플래스트의 제조, 및 형질전환은 실시예 2와 같이 실시하였다. 프로토플래스트 현탁액에 브레펠딘 A를 5 μg/ml 농도로 처리한 후, 형질전환하고 암실에서 배양하였다. 혼성단백질의 발현관찰은 실시예 3과 같이 실시하였다.

b) 두 가지 리포터 단백질이 내는 형광의 분포

브레펠딘 A(BFA)는 동물 세포에서 ADP-리보실레이션 인자(ribosylation factors)(Arfs)의 저해제로 알려져 있는 화학물질이다(Morinaga 등, 1999). 정상 대조군에서는 BiP:GFP에 의한 녹색 형광이 소포체에(도10의 a)), 그리고 ST:RFP에 의한 적색 형광이 골지체에(도10의 b)) 각각 나타났으나, BFA를 처리하였을 때, 골지체의 파괴로 인하여 ST가 골지체에 존재하지 못하고 소포체로 이동하였음을 관찰할 수 있었다(도10의 e)). 따라서 대조군과 화학물질을 처리한 결과는 형광 현미경 하에서 뚜렷한 차이를 나타내고(도10의 c)와 f)), 이는 두 가지 이상의 단백질 이동에 대한 결과를 두 가지 이상의 형광을 사용함으로써 동시에 측정할 수 있음을 보이고 있다. ST:RFP의 결과만으로 보면, 이 실험 결과는 골지체 구조 파괴 과정을 보여주는 결과이기도 하다.

<실시예 12> 화학물질 브레펠딘 A가 소포체의 형성 및 구조 유지에 미치는 영향

a) 혼성 플라스미드 제조, 형질전환 및 혼성단백질의 발현

BiP:RFP의 혼성 플라즈미드는 실시예 5와 같이 제조하였다. 혼성 플라스미드 의 분리, 프로토플래스트의 제조, 및 형질전환은 실시예 2와 같이 실시하였다. 프로토플래스트 현탁액에 브레펠딘 A(BFA)를 5 μg/ml 농도로 처리한 후, 형질전환하고 암실에서 배양하였다. 혼성단백질의 발현 관찰은 실시예 3과 같이 실시하였다.

b) 화학물질의 혼성단백질의 세포내 이동에 미치는 영향

혼성단백질의 적색형광이 나타나는 위치를 화학물질을 처리하지 않은 정상 대조군과 BFA를 처리하였을 경우와 비교 분석하였다. 도11의 a)에서와 같이, 정상 대조군에서는 BiP:RFP의 적색 형광이 소포체의 구조를 따라 분포하고 있으나, BFA를 첨가하였을 때, 소포체의 구조가 파괴되고 있음을 가시적으로 보여준다(도11의 c)). 상기 각각의 동일한 시료에 대한 결과를, 리포터단백질에 의한 형광을 사용하지 않고 광학 현미경으로 관찰한 결과(도 11의 b)와 d))와 비교하면, 각 소기관에 특이적인 결합에 의한 리포터 단백질에 의한 관찰의 효과를 알 수 있다.

<실시예 13> 인지질에 특이적인 단백질의 이동을 저해하는 실험

a) 혼성 플라스미드 제조, 형질전환 및 혼성단백질의 발현

리포터단백질 GFP:EBD와 GFP:EBDC1358S는 실시예 7과 같은 방법으로 구성한 혼성 플라스미드로부터 제조하여 사용하였다. 프로트플라스트에 구축한 재조합 DNA 운반체를 실시예2의 방법으로 도입하고, 워트마닌은 1.0 μg/ml, 포스파티딜이노시톨 3-키나제에 특이적 저해제인 2-(4-모폴리닐)-8-페닐-4H-1-벤조피란-4-온{2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-on}(LY294002, Vlahos 등, 1994)는 10 μg/ml의 농도로 각각 처리한 후, 22℃에서 배양하면서 시간별로 형광을 측정하였 다.

b) 화학물질의 혼성단백질의 세포내 분포에 미치는 영향

약물을 처리하지 않은 세포에서는 EBD가 결합하는 인지질 PI(3)P의 분포를 따라서 각 엔도솜(endosome)에서 녹색의 형광이 나타나지만, 저해제 워트마닌과 LY294002를 처리한 세포에서는 세포질 전체에 형광이 고루 분포함을 볼 수 있었다(도12의 a)). 한편, EBD의 1358번째 아미노산에 변이가 생긴 GFP:EBDC1358S를 대상으로 동일한 실험을 실시하였을 때는, 세포 내의 형광 분포에 영향을 주지 못하였다.

<실시예 14> 단백질의 발현 저해제 시클로헥시미드(cycloheximide)에 의한 발현의 변화

a) 혼성 플라스미드 제조, 형질전환 및 혼성단백질의 발현

RA:GFP의 혼성 플라즈미드는 실시예 1과 같이 제조하였다. 혼성 플라스미드의 분리, 프로토플래스트의 제조, 및 형질전환은 실시예 2와 같이 실시하였다. 프로토플래스트 현탁액에 시클로헥시미드(cycloheximide)를 5 μg/ml 농도로 처리한 후 형질전환하고, 22℃에서 암실에서 배양하였다. 혼성단백질의 발현 관찰은 실시예 3과 같이 실시하였다.

b) 화학물질의 혼성단백질의 발현에 미치는 영향

정상 대조군(도13의 b))에 비하여 시클로헥시미드를 처리한 세포에서의 녹색 형광의 강도가 감소하였다(도13의 a)). 이는 리포터 단백질의 발현이 저해되어 나 타난 현상으로, 화학물질이 단백질의 전이 및 번역 과정에 미치는 영향을 가시화할 수 있음을 나타낸다. 도13의 c)와 d)의 적색 형광은 세포 내에 있는 엽록체에 의한 자연 형광으로서, 세포의 성장 및 대사 상태를 상대적으로 비교하기 위하여 측정하였다.

이상 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니다. 본 발명은 본원 명세서에 기재된 기술적 사상 및 본원 청구범위에 기재된 발명의 기본 구성을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 수정이 가능하며, 그와 같은 치환, 변경 및 수정은 본 발명의 범위에 속한다.

본 발명을 통하여 세포 내에서의 특정 단백질의 이동과 공간적 분포의 형성에 관련된 특이적 특성을 선별적으로 확인하는 방법 및 이러한 특정 단백질의 세포 내에서의 특이적 특성에 영향을 미치는 화학물질을 검색하는 선별적 신약 검색 방법을 체계화한 검출시스템을 구현하였다.

다양한 세포내 소기관으로 이동되는 특성을 가진 다수의 리포터단백질을 각각 발현할 수 있는 형질전환세포를 준비하는 구체화된 방법들을 제공함으로써 그 적용 대상을 확장하였으며, 이에 따라 상기 선별적 세포내 과정 관측법 및 이에 근거한 선별적 신약 검색법을 보다 체계적으로 종합하여 활용할 수 있는 기반을 마련하였다.

또한, 몇 가지 기지 약물들을 사용하여 이러한 약물들이 세포내 과정에 미치는 다양한 영향들의 구체적 예를 시험함으로써, 약물의 세부적 영향을 구분하여 판 정할 수 있는 방안을 마련하였다. 보다 구체적으로, (1) 특정 단백질이 발현되어 특정 소기관으로 이동하는 과정과 그 공간적 분포에 미치는 약물의 영향을 관측함으로써, 특정 단백질의 세포내 이동을 저해 또는 촉진하는 화학물질을 선별적으로 검색할 수 있는 방안을 제시하였으며; (2) 리포터단백질의 발현에 미치는 약물의 영향을 형광신호의 세기 변화로부터 관측함으로써, 세포내에서의 단백질의 전사과정(transcription) 또는 번역과정(translation)을 저해 또는 촉진하는 물질을 선별적으로 검색할 수 있는 방안을 제시하였고; (3) 세포내 소기관의 변형, 손상, 파괴 등을 유발하는 약물의 영향을 관측함으로써, 세포독성을 유발하는 물질을 선별적으로 검색할 수 있는 방안을 마련하였다.

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Claims (21)

1. 세포 내에서 특정 단백질의 이동과 공간적 분포에 관한 특이적 특성을 확인하는 방법으로서, 상기 방법은,

   (a) 핵, 미토콘드리아, 퍼록시좀, 세포막, 소포체, 골지체, 리보좀, 리소좀, 세포골격(cytoskeleton), 중심체, 용해성 액포(lytic vacuole), 및 전액포(prevacuolar compartment)로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포내 특정 소기관으로의 위치 이동이 일어나게 하는 이동신호를 가진 신호 단백질을 코딩(coding)하는 유전자와 형광을 나타내는 형광단백질을 코딩하는 유전자가 각각 하나 또는 둘 이상 연결된 재조합 유전자를 준비하는 단계;

   (b) 상기 재조합 유전자가 세포 내에서 발현될 수 있도록 프로모터(promoter) 부분과 터미네이터(terminator) 부분이 작동적으로 연결된 재조합 유전자를 포함하는 혼성 플라스미드를 준비하는 단계;

   (c) 상기 (b)단계에서 준비한 혼성 플라스미드 1종 또는 2종 이상을 세포 내에 주입하여 형질전환세포를 준비하는 단계;

   (d) 상기 형질전환세포에서 신호단백질과 형광단백질이 연결된 리포터 단백질을 발현시키는 단계; 및

   (e) 상기 형질전환세포 내에서 발현되는 리포터 단백질의 분포를 발현 중, 이동 중, 또는 그 후에 형광영상을 측정을 통하여 관측하는 단계를 포함하여 구성되는 방법.
2. 식물 세포 내에서 특정 단백질의 이동과 공간적 분포에 관한 특이적 특성을 확인하는 방법으로서, 상기 방법은,

   (a) 핵, 미토콘드리아, 퍼록시좀, 세포막, 소포체, 골지체, 리보좀, 리소좀, 세포골격(cytoskeleton), 중심체, 용해성 액포(lytic vacuole), 및 전액포(prevacuolar compartment)로 구성되는 군으로부터 선택되는 식물 세포내 특정 소기관으로의 위치 이동이 일어나게 하는 이동신호를 가진 신호 단백질을 코딩하는 유전자와 형광을 나타내는 형광단백질을 코딩하는 유전자가 각각 하나 또는 둘 이상 연결된 재조합 유전자를 준비하는 단계;

   (b) 상기 재조합 유전자가 세포 내에서 발현될 수 있도록 프로모터(promoter) 부분과 터미네이터(terminator) 부분이 작동적으로 연결된 재조합 유전자를 포함하는 혼성 플라스미드를 준비하는 단계;

   (c) 상기 (b)단계에서 준비한 적어도 혼성 플라스미드 1종 또는 2종 이상을 세포벽이 제거된 식물 세포의 프로토플래스트(protoplast) 내에 주입하여 형질전환세포를 준비하는 단계;

   (d) 상기 형질전환세포에서 신호단백질과 형광단백질이 연결된 리포터 단백질을 발현시키는 단계; 및

   (e) 상기 형질전환세포 내에서 발현되는 리포터 단백질의 분포를 발현 중, 이동 중, 또는 그 후에 형광영상 측정을 통하여 관측하는 단계를 포함하여 구성되는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 세포가 진핵 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 형광단백질이 녹색 형광단백질(Green Fluorescent Protein; GFP), 적색 형광단백질(Red Fluorescent Protein; RFP), 이들의 변형체 및 이들의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
5. 삭제
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 재조합 유전자가 포함하고 있는 신호단백질 코딩부분이 NLS(핵 위치 신호 서열), SKL(퍼록시좀 이동 모티브), 및 F1- H+-ATPase로 구성되는 군으로부터 선택되는 단백질의 전체 또는 위치이동 신호부분을 포함하는 그 단백질의 일부를 코딩하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 삭제
8. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 재조합 유전자가 포함하고 있는 신호단백질 코딩부분이 H+-ATPase, BiP(샤프론 결합단백질), ST(시알릴트랜스퍼라제), 클론 491, AtVTI1a, 및 SPO(스포라민)으로 구성되는 군으로부터 선 택되는 단백질의 전체 또는 위치이동 신호부분을 포함하는 그 단백질의 일부를 코딩하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 재조합 유전자가 포함하고 있는 신호단백질 코딩부분이 인지질에 특이적으로 결합하는 단백질을 코딩하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 재조합 유전자가 포함하고 있는 신호단백질 코딩부분이 인지질에 특이적으로 결합하는 특성을 가진 EBD 및 PH로 구성되는 군으로부터 선택되는 단백질의 전체 또는 위치이동 신호부분을 포함하는 그 단백질의 일부를 코딩하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 형광영상을 측정하기 위하여 특정 형광 파장을 선별적으로 통과시키는 광학 필터가 장착된 형광현미경을 사용하여 1개 또는 2개 이상의 형광 파장에 대한 형광영상을 각각 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 혼성 플라즈미드를 세포 내에 주입하는 방법이, PEG(polyethylene glycol), 인산칼슘, 및 DEAE-덱스트란(DEAE-Dextran)으로 구성된 군으로부터 선택되는 화학물질을 이용하 는 방법, 양이온성 지질을 이용한 라이포펙션(lipofection) 방법, 마이크로인젝션 방법, 일렉트로포레이션 방법 및 일렉트로퓨젼 방법으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 혼성 플라즈미드를 세포 내에 주입하기 위하여, 5% 내지 40%의 PEG를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 리포터 단백질의 발현 과정, 이동 과정 또는 이동 결과의 관측을 5분 내지 80시간의 범위 내에서 배양 후 또는 배양 중에 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. i) 세포막, 소포체, 골지체, 용해성 액포(lytic vacuole), 및 전액포(prevacuolar compartment)로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포내 소기관으로의 위치 이동을 제어하는 부분을 포함하는 단백질인 H⁺-ATPase, BiP(샤프론 결합단백질), 클론 491, AtVTI1a, SPO(스포라민) 및 ST(시알기 전달효소)로 구성되는 군으로부터 선택되는 단백질의 전체 또는 위치이동 신호부분을 포함하는 상기 단백질의 일부를 코딩하는 유전자 하나 또는 둘 이상과,

    ii) 녹색형광단백질(GFP), 적색형광단백질(RFP), 이들의 변형체 및 이들의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 형광단백질을 코딩하는 유전자 하나 또는 둘 이상이 연결된 재조합 유전자.
16. i) 세포내 인지질로의 위치이동을 제어하는 부분을 포함하는 EBD 또는 PH 단백질을 코딩하는 유전자 하나 또는 둘 이상과,

    ii) 녹색형광단백질(GFP), 적색형광단백질(RFP), 이들의 변형체 및 이들의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 형광단백질을 코딩하는 유전자 하나 또는 둘 이상이 연결된 재조합 유전자.
17. 삭제
18. 삭제
19. 제15항 또는 제16항의 재조합 유전자에 프로모터 및 터미네이터를 작동 가능하게 연결하여 세포 내에서 발현 가능하게 제조된 혼성 플라스미드.
20. 제19항의 혼성 플라스미드로부터 제조되는 혼성 단백질.
21. 제19항에 있어서, 상기 프로모터는 35S 프로모터인 것을 특징으로 하는 혼성 플라스미드.

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