KR100858512B1 - 헥소스아미니데이즈 활성 저해 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 헥소스아미니데이즈 활성 저해 방법에 관한 것으로서, 이 저해 방법은 곤충 세포주에서 헥소스아미니데이즈 효소의 활성을 억제하는 공정을 포함한다.

본 발명의 헥소스아미니데이즈 효소 활성 저해 방법은 2-아세트아미도-1,2-디데옥시노지리마이신 첨가 등의 공정을 포함하며, 이에 따라 곤충 세포주에서 헥소스아미니데이즈 효소의 활성을 억제함에 따라 곤충 세포에서 발현되는 단순한 당잔기 구조를 복합 구조로 변경시킬 수 있다.

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Description

헥소스아미니데이즈 활성 저해 방법{METHOD OF INHIBITING ACTIVITY OF HEXOSAMINIDASE}

도 1은 본 발명의 실시예 1에 따라 pMT/Bip/hEPO 플라스미드 벡터를 초파리 S2 세포주에 주입하여 형질전환된 세포주에서, CuSO₄를 도입한 실험군 1 및 도입하지 않은 대조군 1의 배양 기간동안의 세포의 개수를 나타낸 그래프.

도 2는 본 발명의 실시예 1에 따라 pMT/Bip/hEPO 플라스미드 벡터를 초파리 S2 세포주에 주입하여 형질전환한 세포주에서, CuSO₄를 도입한 실험군 1 및 도입하지 않은 대조군 1의 배양 기간동안의 세포의 생존율을 나타낸 그래프.

도 3은 본 발명의 실시예 1에 따른 초파리 S2 세포주에서 발현된 hEPO를 His-태그 금속 친화도 크로마토그래피를 이용하여 분리한 정제 전 시료(Lane 1 및2) 및 정제 후 시료(Lane 3 및 4)의 웨스턴 블랏을 실시한 결과를 나타낸 사진.

도 4는 본 발명의 실시예 2에 따른 실험군 2의 hEPO에 2-아세트아미도-1,2-디데옥시노지리마이신을 첨가한 후(Lane 1 및 2) 발현된 hEPO와 2-아세트아미도-1,2-디데옥시노지리마이신을 첨가하지 않은 대조군 2의 발현된 hEPO를 웨스턴 블랏을 실시한 결과(Lane 3 및 4)를 나타낸 사진.

도 5는 대조군 2의 발현된 hEPO에서 분리한 당잔기를 MALDI-TOF MS로 분석한 결과를 나타낸 그래프.

도 6은 본 발명의 실험군 2에 따라 발현된 hEPO에서 분리한 당잔기를 MALDI-TOF MS로 분석한 그래프.

[산업상 이용 분야]

본 발명은 헥소스아미니데이즈 활성 저해 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 곤충 세포주에서 헥소스아미니데이즈 활성을 저해하는 방법에 관한 것이다.

[종래 기술]

초파리 S2(Drosophila melanogaster Schneider line 2) 세포주는 곤충 세포주의 한 종류로써, 생산성이 높고 세포가 파괴되지 않은 상태에서 지속적인 단백질 생산이 가능하므로 외래 단백질 생산에 많이 사용되는 세포주이다.

그러나 의약을 생산하는데 사용되는 의약 단백질은 대부분 당이 단백질에 결합된 당단백질이나, 이때 초파리 S2로부터 생산된 당단백질은 인간 세포에서와는 다른 단순한 형태의 당잔기가 결합된 당단백질이 얻어지게 된다. 즉, 당이 단백질에 결합될 때 인간 세포에서와는 다른 형태의 당화 반응이 일어나게 된다.

이러한 당잔기의 구조는 당단백질의 기능 및 안정성에 매우 중요한 영향을 끼치므로 치료의 목적으로 사용되는 의약 단백질인 당단백질은 초파리 S2 세포를 사용하여 제조하는 경우 굉장히 제한적으로만 사용되어야 하므로 그 생산이 매우 어려웠다.

따라서 이러한 문제점을 개선하기 위해 지속적인 연구들이 이루어져 왔으나, 아직 만족할만한 성과가 이루어지지 않고 있다.

본 발명의 목적은 의약 단백질로 유용하게 사용할 수 있도록 곤충 세포주에서 헥소스아미니데이즈의 활성을 저해하는 헥소스아미니데이즈 활성 저해 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 곤충 세포주에서 헥소스아미니데이즈 효소의 활성을 억제하는 공정을 포함하는 헥소스아미니데이즈 효소 활성 저해 방법을 제공한다.

상기 억제 공정은 효소 활성 억제제를 사용하여 실시하거나 RNAi 방법 또는 유전자 넉-아웃 방법(Gene Knock-Out)으로 실시할 수 있다.

상기 효소 활성 억제제로는 2-아세트아미도-1,2-디데옥시노지리마이신을 사용할 수 있다.

또한 상기 RNAi 방법은 dsRNA를 상기 곤충 세포주에 주입시켜 이에 대응하는 mRNA가 특이적으로 분해되는 공정으로 실시할 수 있다.

상기 유전자 넉-아웃 방법은 동족체 재조합(homologous recombination)에 의해 유전자의 발현을 억제하는 방법을 말한다.

상기 곤충 세포주의 헥소스아미니데이즈 효소 활성을 억제하면, 이 곤충 세포주로부터 얻는 당단백질은 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine) 잔기를 갖 는다.

이하 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에 언급된 문헌들은 모두 본 발명을 설명하기 위한 문헌으로 본 명세서에 포함된다.

본 발명은 곤충 세포주에서 발현되는 헥소스아미니데이즈 효소의 기능을 억제하여 개선된 형태의 당화반응을 만들어 내는 것을 목적으로 하고 있다.

특히 외래 단백질을 생산하는 대표적인 세포주인 초파리 세포, 즉 Drosopila S2 세포주에서 생산되는 단백질을 의약 단백질로 이용하기 위해서는 단백질에 당(carbohydrates)이 결합된 당단백질을 형성하여야 한다. 이때 결합되는 당잔기가 만노즈(mannose)와 같이 매우 단순한 형태로만 제한되어 결과적으로 당이 결합하는 당화 반응이 인간 세포로부터 얻어지는 인간 당당백질 형성시 일어나는 당화 반응에 비하여 매우 제한적인 문제를 해결하기 위한 것이다.

본 발명은 곤충 세포주로부터 인간 세포주와 유사한 당단백질을 제조할 수 있도록 곤충 세포주의 헥소스아미니데이즈 효소의 활성을 억제하는 공정을 포함하는 헥소스아미니데이즈 효소 활성 저해 방법을 제공한다.

상기 곤충은 초파리 또는 나방일 수 있다. 곤충 세포주로 가장 바람직한 것은 생산성이 높고 세포가 파괴되지 않은 상태에서 지속적인 단백질 생산이 가능한 초파리 S2 세포주이다.

본 발명에서 상기 헥소스아미니데이즈 효소의 활성을 억제하는 제1 실시 형 태는 효소 활성 억제제를 사용하여 억제할 수 있다.

상기 효소 활성 억제제로는 2-아세트아미도-1,2-디데옥시노지리마이신(2-acetamido-1,2-dideoxynojirimycin, 2-AND)을 사용할 수 있다.

상기 효소 활성 억제제의 첨가량은 세포주 3 X 10⁶ 내지 10 X 10⁶개당 0.3 내지 1.0mM이 바람직하다. 상기 효소 활성 억제제의 첨가량이 상기 범위보다 작을 경우에는 효소 활성 억제 효과가 미미하며, 1.0mM을 사용하면 충분한 효과를 얻을 수 있고, 더 과량으로 사용함에 따른 효과 증가가 미미하며, 경제적이지 않으므로 1.0mM보다 과량을 사용할 필요는 없다.

본 발명에서 상기 효소의 활성을 억제하는 제2 실시 형태는 RNAi 방법으로 실시할 수 있다.

상기 RNAi 방법은 RNA 간섭(RNA interference) 방법으로서, 헥소스아미니데이즈 효소 유전자의 염기 서열에 해당하는 dsRNA(double-strand)를 곤충 체내에 주입하면, dsRNA에 의해 서열 특이적으로 이에 대응되는 mRNA가 분해되어 그 결과 유전자 발현이 억제되는(즉 gene silencing) 방법을 말한다.

또한 상기 dsRNA는 400 내지 700bp(base pair)의 유전자 길이를 갖는 것이 바람직하다. 상기 dsRNA의 유전자 길이가 400bp 미만인 경우에는 헥소스아미니데이즈 효소 억제 효과가 낮으며, 700bp를 초과하는 경우에는 세포로 dsRNA를 넣을 때에 효율이 낮아지는 문제가 있다.

상기 dsRNA는 다이서(dicer)라는 효소에 의해 절단되어 siRNA(short interfering RNA)로 생성되며(processing), 이 siRNA에 의해 서열 특이성을 갖게 된다. 이 siRNA는 21 내지 23nt(nucleotide)를 갖으며 5' 말단에는 모노포스페이트 또는 OH기가 존재하고 3' 말단에는 OH기가 존재한다.

본 발명에서 활성을 억제하는 제3 실시 형태로는 유전자 넉-아웃(Gene Knock-out) 방법을 들 수 있다.

상기 유전자 넉-아웃 방법은 동족체 재조합(homologous recombination)에 의해 유전자의 발현을 억제하는 방법을 말한다.

상기 곤충 세포주의 헥소스아미니데이즈 효소 활성을 억제하면, 이곤충 세포주로부터 얻는 당단백질은 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine) 잔기가 제거되지 않고 보존될 수 있다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 그러나 본 발명의 바람직한 실시예는 본 발명의 일 실시예일뿐 본 발명이 하기한 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: S2 세포에서의 hEPO 발현 및 분리정제

인간 에리트로포이에틴(human erythropoietin: hEPO)의 유전자로 pMT/Bip/hEPO(H. S. Shin and H. J. Cha, 2003, Protein Expression and Purification, 28, 331-339) 플라스미드를 사용하였으며, 이 플라스미드 벡터로 Drosophila S2 세포를 형질전환하여 hEPO를 안정적으로 발현시키는 세포주를 구축하였다.

10% 농도의 곤충 배지 보충물(insect medium supplement: IMS)이 첨가된 M3(Sigma, 미국) 배지에 분리정제가 용이하도록 헥사-히스티딘 태그(Hexa-histidine tag)를 사용하여 상기 세포주를 27℃의 환경조건에서 구리 설페이트 유도제를 사용하여 10일간 배양하였다. 배양하는 동안 매일 세포의 개수와 생존율을 측정하여 그 결과를 도 1 및 2에 각각 나타내었다. 도 1 및 도 2에서 ●는 형질전환된 세포주에서, CuSO₄를 도입한 실험군 1이고, ○는 도입하지 않은 대조군 1의 결과이다.

배양이 완료된 후, 배지를 회수하여 세포 밖으로 분비된 hEPO를 분리하였다.

이어서, 분리된 hEPO에는 헥사-히스티딘 태그(hexa-histidine tag: His-tag)가 붙어있으므로, Ni-NTA 아가로즈(agarose, Qiagen)를 이용해 다음과 같은 His-태그 금속 친화 크로마토그래피(His-tag metal affinity chromatography) 방법으로 hEPO를 정제하여 분리하였다.

먼저, 회수한 배지를 초여과(ultrafiltration) 방법으로 10배 농축한 후, 투석을 통해 분리하기 좋은 조건을 맞추기 위하여, 10mM 저농도의 이미다졸 혼합 용액(용매: 소디움 포스페이트 완충 용액, 염화나트륨 포함)을 첨가하였다. 이어서, 얻어진 생성물을 Ni-NTA 컬럼에 흘려준 후 30mM 농도의 이미다졸 용액으로 세척하고, 다시 100mM 농도의 이미다졸을 상기 컬럼에 흘려 넣어서 시료를 얻었다. 이때, Ni 이온이 히스티딘의 이미다졸링과 친화도를 갖고 있어, 히스티딘이 결합된 hEPO가 금속 이온으로부터 분리되어 얻어졌다.

얻어진 시료를 다시 투석을 통해 이미다졸을 제거하여 hEPO를 분리하였다. 분리된 hEPO를 웨스턴 블랏(Western blot) 방법으로 분석한 결과를 도 3에 나타내었다. 웨스턴 블랏 방법은 hEPO 항체를 사용하여 알칼리 포스파테이즈(Alkaline phosphatase) 발색법 공정으로 실시하였다. 도 3에서, M은 마커(marker)이고, Lane 1 및 2는 정제 전 시료를 나타내고, Lane 3 및 4는 정제 후 시료를 나타낸 것으로서, 좀더 자세히 나타내면, Lane 1은 회수 직후의 시료이며, Lane 2는 정제를 위한 버퍼로의 첫번째 투석 후의 시료이며, Lane 3은 정제 후의 시료이고, Lane 4는 증류수로의 두번째 투석후의 시료를 나타낸다. 도 3에 나타낸 것과 같이, 매우 높은 순도를 갖는 hEPO를 분리할 수 있었음을 알 수 있다.

실시예 2: 2-ADN을 추가한 후의 hEPO 발현

상기 실시예 1에서, CuSO₄를 도입하여 배양할 때, 1일 후 2-AND을 첨가한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 실시하여 hEPO를 분리하고, 다시 His-태그 금속 친화도 크로마토그래피법으로 정제 분리하여 실험군 2의 hEPO를 얻었다. 이때, 2-ADN의 첨가량은 세포주 3 내지 4 X 10⁶개당 0.3mM 농도로 하였다.

대조군 2로 2-ADN을 첨가하지 않은 배지를 사용하여 동일하게 hEPO를 배양하고 분리하고, 다시 다시 His-태그 금속 친화도 크로마토그래피법으로 정제 분리하여 대조군 2의 hEPO를 얻었다.

실험군 2 및 대조군 2에 따라 얻어진 hEPO를 웨스턴 블랏 방법으로 분석하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서, Lane 1은 실험군 2의 크로마토그래피법 정제전의 시료 결과를 나타내고, Lane 2는 실험군 2의 크로마토그래피법 정제 후 시료 결과를 나타내고, Lane 3은 대조군 2의 크로마토그래피법 정제전 시료 결과를 나타내고, Lane 4는 대조군 2의 크로마토그래피법 정제후 시료 결과이다.

도 4에 나타낸 것과 같이, 실험군 2와 대조군 2의 정제한 후의 hEPO 밴드(2 및 4)의 크기를 비교하면 큰 변화는 없으나, 2-ADN을 첨가한 실험군 2의 경우 대조군 2에 비하여 미세하게 위쪽으로 이동하였고 밴드의 넓이가 줄어든 것을 볼 수 있다. 밴드의 넓이는 당단백질에 결합하는 당의 다양성 때문에 나타나는 현상이므로, 도 4에 나타낸 결과에 따라 2-ADN이 첨가되면 당단백질에 결합하는 당이 좀 더 커지고 그에 따라 다양성이 줄어든다는 것을 확인하였다.

실시예 3: 분리정제된 hEPO에서의 당잔기 분리 및 구조분석

분리정제된 실험군 2 및 대조군 2의 hEPO를 다음과 같이 PNGase F(Roche, 독일) 효소 처리하여 N-당잔기를 떼어냈다.

hEPO와 PNGase F(2 mU), 소디움 도데실 설페이트 계면활성제와 Triton X-100의 혼합(SDS: 1%, Triton X-100: 2%) 버퍼를 혼합하고, 이 혼합물을 37℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 그 후 N-당잔기 정제 키트(Glyko, 미국)를 사용하여 당잔기만 분리해낸 후 분석의 용이성을 위해 태그로 많이 사용되는 2-아미노벤즈아미드(2-AB)를 당잔기에 붙였다. 2-AB가 결합된 N-당잔기를 다시 키트로 정제하였다. 분리된 hEPO의 당잔기의 분석은 한국기초과학지원연구소에 분석을 의뢰하여 분석하였다.

당잔기 분석은 당잔기의 질량을 분석하는 장비인MALDI-TOF(Matrix-associated laser derosption ionization Time of Flight) MS를 사용하여 분석하였 으며, 그 결과를 도 5(대조군 2) 및 도 6(실험군 2)에 각각 나타내었다.

도 5에 나타낸 것과 같이, 2-ADN을 첨가하지 않은 대조군 2의 경우에는 1000 내지 1200 사이에서 주요한 피크가 나타났다. 또한 그 피크들의 구조를 분석하여, 그 결과 표 1에 나타낸 것과 같이 만노즈(mannose)가 2 내지 3개만 붙는 단순한 구조라는 것을 알 수 있었다. 하기 표 1에서, GlcNAc는 N-아세틸글루코사민을 나타내고, Man은 만노즈, Fuc는 푸코즈, α 는 알파 결합, β는 베타 결합을 의미하며, 숫자는 결합 위치를 나타낸다.

피크	구조	hEPO(상대량, %)
1	Manα6 Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc-PA	3
2b	Manα6 Fucα6 Manβ4GlcNAcβ4GlcNac-PA	8
3	Manα6 Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc-PA Manα3	21
4b	Manα6 Fucα6 Manβ4GlcNacβ4GlcNAc-PA Manα3	39

반면 도 6에 나타낸 것과 같이, 2-ADN을 첨가한 실험군 2의 경우에는 피크의 크기는 크지는 않지만 1400 부근에서 피크가 나타나는 것을 관찰할 수 있었고, 이 구조는 N-아세틸글루코사민(acetylglucosamine, 갈락토즈, galactose)가 붙는 구조였다.

이 결과에 따라, Drosophila S2 세포 내에서 헥소스아미니데이즈의 기능이 저해되어 당 끝에 붙는 N-아세틸글루코사민이 떨어지지 않고 붙어있음을 알 수 있고, 결과적으로 이후의 단계에 작용하는 효소들도 기능을 할 수 있음을 예측할 수 있다.

상기 실시예 결과에 따라 곤충 초파리 S2 세포주에서 헥소스아미니데이즈 효소를 저해하면 당단백질의 당잔기 구조가 복합구조 쪽으로 개선된다는 것을 알 수 있었다.

이상을 통해 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것이 아니고 특허청구범위와 발명의 상세한 설명 및 첨부한 도면의 범위 안에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고 이 또한 본 발명의 범위에 속하는 것은 당연하다.

본 발명의 헥소스아미니데이즈 효소 활성 저해 방법은 2-ADN 첨가 등의 공정을 포함하며, 이에 따라 곤충 세포주에서 헥소스아미니데이즈 효소의 활성을 억제함에 따라 곤충 세포에서 발현되는 단순한 당잔기 구조를 복합 구조로 변경시킬 수 있다.

Claims (8)

1. 곤충 세포주에 효소 활성 억제제로 2-아세트아미도-1,2-디데옥시노지리마이신을 첨가하여, 곤충 세포주에서 헥소스아미니데이즈 효소의 활성을 억제하는 공정

   을 포함하는 헥소스아미니데이즈 효소 활성 저해 방법.
2. 제1항에 있어서,

   상기 곤충은 초파리 및 나방으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 헥소스아미니데이즈 효소 활성 저해 방법.
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,

   상기 효소 활성 억제제의 첨가량은 세포주 3 X 10⁶ 내지 10 X 10⁶ 개당 0.3 내지 1.0 mM인 헥소스아미니데이즈 효소 활성 저해 방법.
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제

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