KR100856938B1 - 불포화 고급지방산의 페길화 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 불포화 고급지방산의 페길화 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 용매나 촉매를 쓰지 않는 온도 처리의 간단한 방법으로 불포화 고급지방산을 PEGylation 시킬 수 있고, 페길화 고급지방산에 의해 반응 전 불포화 고급지방산이 갖는 고유한 성질은 유지시키면서 세포에 대한 독성을 줄였으며, 제조된 페길화 고급지방산은 core-shell 특성을 가진 나노입자를 형성함으로써 약물의 방출 조절과 안정성을 높일 수 있으므로 페길화에 의해 안정화되고 반추위 미생물들에 의한 이성화 방지가 가능한 신규한 페길화 고급지방산을 제공할 수 있는 매우 뛰어난 효과가 있다.
불포화 고급지방산, CLA, 공액 리놀레산, 페길화, 지방산, 반추위, 폴리에틸렌글리콜
Description
도 1a는 CLA의 1H NMR 스펙트럼 결과이다.
도 1b는 PCLA의 1H NMR 스펙트럼 결과이다.
도 2a는 PCLA의 TEM 사진이다.
도 2b는 PCLA의 나노입자 평균 크기를 측정한 결과이다.
도 3a는 37℃ pH 7.4에서 PCLA의 half life을 측정한 결과이다.
도 3b는 37℃ pH 2에서 PCLA의 half life을 측정한 결과이다.
도 4는 CLA와 PCLA의 세포 주기(cell cycle) 및 아폽토시스(apoptosis)를 측정한 결과를 나타낸다.
본 발명은 불포화 고급지방산의 페길화 방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 용매나 촉매를 쓰지 않는 온도 처리의 간단한 방법으로 불포화 고급지방산을 페길화시킬 수 있고, 페길화 고급지방산에 의해 반응 전 불포화 고급지방산이 갖는 고 유한 성질은 유지시키면서 세포에 대한 독성을 줄일 수 있는 신규한 페길화 고급지방산 제조방법에 관한 것이다.
지방산(脂肪酸, fatty acid)은 식물·동물·미생물에 있는 지질(살아 있는 세포의 구성성분)의 중요한 성분이다. 일반적으로 지방산은 짝수 개의 탄소원자와, 사슬의 길이를 따라 각 탄소원자에 결합된 수소원자, 그리고 사슬의 한쪽 끝은 사슬과 결합되어 있으며, 나머지 끝은 지방산이 산성(카르복시산)을 띠게 하는 카르복시기(－COOH)로 이루어진 곧은 사슬 화합물이다. 탄소-탄소 결합이 모두 단일결합인 화합물은 포화지방산, 이중결합 또는 삼중결합을 가진 화합물은 불포화지방산으로 포화지방산보다 반응성이 크다. 가장 널리 분포되어 있는 지방산은 올레산으로, 식물성기름(예를 들면 올리브씨·야자씨·땅콩씨·해바라기씨 등)에 풍부하며 체내 지방의 약 46％를 차지한다. 대부분의 동물은 한 가지 이상의 지방산을 합성할 수 없으며, 반드시 식품으로 섭취해야 한다. 이런 종류의 유도 지방산으로는 리놀레산과 리놀렌산이 있다.
공액 리놀레산(Conjugated linoleic acid; CLA)은 리놀레산(linoleic acid; LA)의 이성체로서 우유, 치즈 및 건강식품에 다량 함유되어져 있다(Y. Park, et al., Effect of conjugated linoleic acid on body composition in mice, Lipids 32, 1997, 853-858). 또한, CLA는 항암, 항비만, 항당뇨 및 여러 가지 면역작용들에 작용한다고 보고되어지고 있으며(Y. L. Ha et al., Anticarcinogenesis from fried ground beef : heat-altered derivatives of linoleic acid, Carcinogenesis 8, 1997, 1881-1887; C. Liew, et al., Protection of conjugated linoleic acids against 2-amino-3-methyl-limidazo[4,5-f] quinoline-induced colon carcinogenesis in the F244 rat : a study of inhibitory mechanisms, Carcinigenesis 16, 1995, 3037-3034; K. N. Lee et al., Conjugated linoleic acid and atherosclerosis in rabbits, Atherosclerosis 108, 1994, 19-25; M. E. Cook et al., Immune modulation by altered nutrient metabolism: nutritional control of immune-induced growth depression, Poult. Sci. 72, 1993, 1301-1305; C. C. Miller et al., Feeding conjugated linoleic acid to animals partially overcomes catabolic responses due to endotoxin injection, Biochem. Biophys. Res. Commun. 19, 1994, 1107-1112), 특히, 항비만에 관여하는 CLA는 trans10, cis12 이성체로서 lipoprotein lipase(LPL)를 감소시키고, 지방분해를 증가시키며, 3T3-L1 지방전구세포의 중성지방 함량을 감소시킨다고 보고되어져 왔다(Y. Park et al., Evidence that the trans-10, cis-12 isomer of conjugated linoleic acid induces body composition changes in mice, Lipids 34, 1999, 235-241; M. Evans et al., Conjugated linoleic acid suppresses triglyceride content and induces apoptosis in 3T3-L1 preadipocytes. Lipids. 35, 2000, 899-910; Y. Choi et al., The trans-10, cis-12 isomer of conjugated linoleic acid downregulates stearoyl-CoA desaturase 1 gene expression in 3T3-L1 adipocytes. J. Nutr . 130, 1999, 1920-1924). 그러나, CLA와 같은 대부분의 불포화 지방산들은 반추위 미생물들에 의해 이성화가 일어나 포화지방산이 되기 때문에 건강상에 문제가 생기므로(R. J. Mansbridge et al., Nutritional factors affecting the fatty acid composition of bovine milk. Br. J. Nutr . 78, 1997, S37-47) 반추위내의 CLA를 안정화시킬 수 있는 방법의 개발에 대한 연구가 필요하다. 또한, CLA가 다량 함유된 식물성 오일에서도 수소화 과정으로 CLA를 생산하는데, 이러한 과정은 생산 효율이 낮고 경제성이 떨어지므로(M. O. Jung et al., Effects of temperature and agitation rate on the formation of conjugated linoleic acid in soybean oil during hydrogenation process. J. Agric . Food Chem . 49, 2001, 3010-3016) 생산효율을 극대화할 수 있는 방법의 개발이 필요한 실정이다. 최근 칼슘화 및 포름알데하이드화 CLA를 이용한 우유지방 감소의 연구가 진행되어져 왔는데(M. J. de Veth et al., Comparison of calcium salts and formaldehyde-protected conjugated linoleic acid in including milk fat depresion. J. Dairy SCI. 88, 2005, 1685-1693), 이러한 방법은 작업공정이 복잡하고, 경제성이 떨어지며, 사용된 용매의 안전성에 문제가 생기고, 생산 효율이 떨어진다는 단점이 있다. 그러므로, 생산효율을 높이고, 산폐를 방지하고, 보습성을 유지시키고, 생체 흡수효율을 높일 수 있는 새로운 형태의 CLA 개발이 필요하다. 또한, WTO 가입이후 국내 쇠고기 시장의 개방시대에 외국산 쇠고기와의 품질의 차별화를 통한 경쟁력 확보 측면에서 고급 우육의 생산이 필요하다.
폴리에틸렌글리콜(PEG)은 물에 대한 용해성을 높여주고 안전성을 증가시키며 독성을 줄여주는 효과가 있어 약물 합성에 많이 사용되는 고분자이다(T. M. Allen. Long-circulating(sterically stabilized) liposomes for targeted drug delivery. Trends Pharmacol. Sci. 15, 1994, 215-220; R. B. Greenwald et al., Effective drug delivery by PEGylated drug conjugates. Adv . Drug Delivery. Rev. 55, 2003, 217-250). 또한, PEG는 인체에 무해한 이유로 FDA의 승인을 받았다(M. Tobio et al., The role of PEG on the stability in digestive fluids and in vivo fate of PEG-PLA nanoparticles following oral administration. Colloid. Surface. B. 18, 2000, 315-323). PEGylated 항암약물이나 PEGylated 치료용 단백질은 물에 대한 용해도가 증가하고, 약의 혈액에서의 반감기가 증가되고, 약의 체내 체류시간이 길어지고, 효소에 의하여 분해되는 것이 감소되고, 단백질 면역성이 감소되는 많은 장점으로 이미 10 종류이상의 의약품이 미국의 FDA에서 상품화가 허가되었다(A. Abuchowski et al., Effect of covalent attachment of polyethylene glycol on immunogenicity and circulating life of bovine liver catalase. J. Biol . Chem . 252, 1997, 3582-3586; A. Abuchowski et al., Alteration of immunological properties of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol. J. Biol . Chem . 252, 1997, 3578-3581; C. Li et al., Synthesis and evaluation of water-soluble polyethylene glycol-paclitaxel conjugate as a paclitaxel prodrug. Anticaner Drugs 7, 1996, 642-648; E. Teske et al., Polyethylene glycol-L-asparaginase versus native L-asparaginase in canine non-Hodgkin's lymphoma. Eur . J. Cancer 26, 1990, 891-895; J. M. Harris. Poly (ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications. New York: Plenum. 1992; A. Kichler. Gene transfer with modified polyethylenimines. J. Gene Medi . 6, 2004, S3-S10). 또한, PEG는 신장의 사구체 에 의해 자연적으로 체내에서 방출이 되므로 약물학적인 측면에서도 안정성이 보고되어지고 있다(M. D. Scott et al., Beyond the red cell: pegylation of other blood cells and tissues au-dela du GR: Traitement par PEG des cellules sanguines et autres tissue. Transfus . Clin . Biol . 11, 2004, 40-46).
이에 본 발명자는 상기와 같은 점을 고려하여 반추위에서 미생물에 의해 수소화가 되어 포화지방산이 되고 물에 녹지 않아 생체흡수율이 낮고 오일 형태로 취급하기가 어렵고 제조시 생산효율이 떨어지는 단점이 있는 CLA와 같은 불포화 고급지방산을 생체적합성이 우수하고 가격이 저렴하며 안전성에 문제가 없는 폴리에틸렌글리콜(PEG)를 간단한 온도처리로 화학적으로 결합시켜 새로운 지방산 유도체를 제조하고 이를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 생체적합성이 우수하고 가격이 저렴하며 안전성에 문제가 없는 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 용매를 쓰지 않고 간단하게 온도의 가열만으로 CLA와 같은 불포화 고급지방산에 화학적으로 결합시켜 반추위 미생물들에 의해 이성화가 일어날 수 있는 여지를 방지하고 안정한 신규의 페길화 고급지방산을 제조하는 것을 그 목적으로 한다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.
본 발명은 불포화 고급지방산의 페길화 방법을 제공한다.
본 발명의 불포화 고급지방산의 페길화 방법은 불포화 고급지방산과 폴리에 틸렌글리콜을 60℃ 내지 200℃에서 30분 내지 10시간 동안 교반하면서 반응시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 불포화 고급지방산의 페길화 반응은 하기 반응식 1과 같이 이루어진다.
상기 반응식에서, R은 불포화 고급지방산의 말단에 위치한 -COOH기를 제외한 나머지 부분을 의미하며 R은 불포화 고급지방산에 따라 달라지며 각각의 불포화 고급지방산의 구조는 당업계에 알려져 있는 일반사항이다.
본 발명에서 페길화 반응을 수행하여 페길화 고급지방산 유도체를 제조할 수 있는 불포화 고급지방산은 탄소수 18개 내지 22개 범위가 바람직하다. 상기 탄소수 범위 밖이어도 페길화가 이루어질 수 있으나 당업계에 알려진 건강식품으로서의 생리활성을 가지는 불포화 고급지방산의 탄소 수 범위가 주로 18개 내지 22개 범위이다. 구체적인 불포화 고급지방산의 예로는 하기 지방산들을 들 수 있다.
1. 알파-리놀레산(Alpha-linolenic acid) (탄소수: 18개)
2. 에이코사펜타노익산(Eicosapentaenoic aicd) (20개)
3. 도코사헥사노익산(Docosahexaenoic acid) (22개)
4. 공액 리놀레산(Conjugated linoleic acid) (18개)
5. 리놀레산(Linoleic acid) (18개)
6. 감마-리놀레닉산(Gamma-linolenic acid) (18개)
7. 아라키돈산(Arachidonic acid) (20개)
8. 팀노돈산(Timnodonic acid) (20개)
9. 세르보닉산(Cervonic acid) (22개)
10. 리놀레닉산(Linolenic acid) (18개)
11. 올레익산(Oleic acid) (18개)
이하, 본 발명을 실시예 에 대해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: CLA와 PEG의 합성
탄소수 12개부터 20개를 갖는 불포화지방산 및 폴리에테르가 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 2원 공중합체, 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 3원 공중합체, 폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 4원공중합체, 폴리에테르는 분자량이 1,000-20,000의 범위이고, 폴리에테르에서 OH기가 1개부터 8개를 갖는 물질로, 일본의 NOF 사에서 구입한 옥타-폴리에틸렌 글리콜 에테르(octa-polyethylene glycol ether)을 사용하였다. propidium iodide (시그마, 미국), DNase-free RNase (Intron, 경기도, 한국)를 사용하였으며, 폴리에틸렌글리콜(PG)는 시그마알드리치사(Sigma-aldrich, 미국)에서, 공액리놀레산(Conjugated linoleic acid; CLA)는 리포젠(평택, 대한민국)에서 구입하여 사용하였다.
페길화 지방산(PEGylated CLA)은 다음과 같이 합성되어졌다. 먼저, 수평균 분자량 2,000의 PEG 5g을 10g의 CLA가 들어있는 라운드 플라스크에 같이 170℃의 온도에서 5시간 동안 교반시켰다. 그 후 합성된 PEGylated CLA에서 미반응의 CLA를 제거하기 위해 ether로 여러번 세척하였다. 마지막으로, 제조된 PCLA를 vaccum에서 24시간 동안 건조시켰다.
CLA와 PEG의 합성은 하기 반응식 2를 통해 설명되어 질 수 있다. 합성된 PCLA는 1H-NMR(AVAVCE 600 분광기; Bruker, Rheinstten, Germany; 600 MHz)을 통해 확인하였다(도 1). CLA가 갖는 탄소 9번과 11번 그리고 10번과 12번의 이중결합의 위치는 5.2 ~ 6.2 ppm에서 나타났으며, CLA의 결합량은 반응조건에 따라서 43mol%인 것으로 확인되었다.
실시예
2:
PCLA
의 형태와 나노입자 크기 측정
물에 녹여 자기조립된 PCLA의 형태는 TEM(JEM 1010, JEOL, Japan)으로, 나노입자의 크기는 Dynamic Light Scattering (DLS)으로 각각 측정하였다.
TEM과 DLS 측정을 통해 평균 100nm의 둥근 모양을 가진 나노입자가 만들어 졌음을 확인하였다(도 2). PCLA는 소수성 성격을 가진 CLA와 친수성의 PEG에 때문에 자기조립(self-assembly) 현상에 의해서 core-shell 특성을 가진 나노입자를 형성하였다. 이것은 소수성 성격을 가진 약물의 제조에서 나타나는 일반적인 현상으로(J. H. Lee et al., Polymeric nanoparticle composed of fatty acids and poly (ethylene glycol) as a drug carrier. Int . J. Pharm . 251, 2003, 23-32), 소수성의 CLA는 나노입자의 안쪽으로 그리고 친수성을 가진 PEG는 나노입자의 바깥쪽으로 둘러싸여 약물에 대한 보호 및 소수성 약물의 물에 대한 용해성을 높이게 된다. 일반적으로 나노입자는 체내 순환시간을 길게 해주며, 정맥으로의 유입이 쉽고, 여과기로 간단하게 멸균이 가능하다는 이점이 있다(G. F. Marcos et al., Design and characterization of new drug nanocarrier made from solid-liquid mixtures. J. Coll . Inter. Sci . 285, 2005, 590-598; M. N. Kumar et al., Pharmaceutical polymeric controlled drug delivery systems. Adv . Polym . Sci . 160, 2002, 45-117). 또한, 나노입자는 약물의 방출을 조절함으로써 세포 및 인체에 미치는 결점을 보완하는 역할을 할 수 있다(M. N. Kumar et al., Pharmaceutical polymeric controlled drug delivery systems. Adv . Polym . Sci . 160, 2002, 45-117). 그러므로, PCLA는 나노입자와 core-shell 구조를 갖는다는 점에서 안정된 약물의 수송체라고도 할 수 있다.
실시예
3: Half Life 측정
제조된 PCLA 500mg을 phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4)과 citric acid buffered saline (CBS, pH 2) 10ml에 각각 녹인 후 500ul 씩 1ml microtube에 옮겼다. 그 후 37℃ shaking incubator에서 60rpm으로 교반시켰다. 각각의 측정할 시간에 microtube를 10,000 rpm으로 centrifuge 시키고 상층액을 제거한 후 1ml chloroform을 넣고 입상체를 녹여 260nm에서 흡광도를 측정하였다.
In vitro half life 결과는 도 3을 통해 설명되어 질 수 있다. 합성된 PCLA의 half life는 pH 7.4에서는 50시간 그리고 pH 2에서는 35시간인 것으로 측정되었다. 또한, pH 7.4에서는 약 20시간 이후에 pH 2에서는 약 10시간 이후에 지속적으로 CLA가 방출되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 pH 7.4에서 PCLA의 소수성 성격이 강하다는 것과 나노입자안의 CLA의 분할이 더욱 높다는 것을 의미한다. 이러한 결과는 pH 변화에 따른 나노입자의 약물 방출 실험을 한 Sipahigil 등에 의해 증명되었으며, pH의 변화에 의해 약물의 방출 속도는 변하지만 약물이 담지된 양은 변하지 않는다고 보고하였다(O. Sipahigil et al., Release behaviour and biocompatibility of drug-loaded pH sensitive particles. Int . J. Pharm . 2006). 또한, Lee 등은 나노입자 안에 담지된 약물의 방출은 높은 표면 면적과 작은 크기 때문에 microsphere 보다 빠르며 carbon chain에 의해 약물의 방출이 조절된다고 보고하였다(J. H. Lee et al., Polymeric nanoparticle composed of fatty acids and poly (ethylene glycol) as a drug carrier. Int . J. Pharm . 251, 2003, 23-32; Y. Zhang et al., Synthesis and in vitro drug release behavior of amphiphilic triblock copolymer nanoparticles based on poly (ethylene glycol) and polycaprolactone. Biomaterials. 26, 2005, 6736-6742).
실시예
4: 세포독성 실험
세포의 apoptosis 실험은 Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS)로 측정되어졌다. 3T3-L1 세포를 trypsin 처리를 하고 원심분리하여 회수한 후, 70% ethanol 500ul를 이용해 4℃에서 하루 동안 고정시켰다. 그 후 ethanol을 제거하고 세포의 DNA를 propidium iodide (PI)로 염색하고 동량의 DNase-free RNase를 첨가하여 45분 동안 반응을 시킨 후 FACS로 측정하였다.
PCLA의 독성 실험 결과는 도 4에 의해 설명되어 질 수 있다. 제조된 PCLA의 세포에 대한 독성 실험은 FACS를 통해 확인하였다. CLA는 중성지방 함량을 저해시키지만 높은 농도에 의해 세포의 apoptosis를 유발시킨다(M. Evans et al., Conjugated linoleic acid suppresses triglyceride content and induces apoptosis in 3T3-L1 preadipocytes. Lipids. 35, 2000, 899-910; Y. Choi et al., The trans-10, cis-12 isomer of conjugated linoleic acid downregulates stearoyl-CoA desaturase 1 gene expression in 3T3-L1 adipocytes. J. Nutr . 130, 1999, 1920-1924).
본 발명에서도 CLA의 농도가 증가함에 따라 세포주기의 G0/G1 단계를 차단시켜 세포의 apoptosis가 유발되는 것을 FACS 결과의 sub-G1을 통해 확인하였다. 그러나, PCLA는 농도의 증가에도 불구하고 세포의 apoptosis를 감소시키는 것으로 확인하였다. 세포에 대한 독성이 줄어드는 PCLA의 이러한 효과는 명확하진 않지만 PEG에 의한 것임을 생각할 수 있다. PEG는 물에 대한 용해성을 높여주며 세포에 대 한 독성을 줄인다(A. Kichler. Gene transfer with modified polyethylenimines. J. Gene Medi . 6, 2004, S3-S10). 또한, PEG는 약물에 대한 안정성과 약물이 갖는 독성을 줄여준다(F. P. Claudia. Safety assessment on poly (ethylene glycols) (PEGs) and their derivatives as used in cosmetic products. Toxicology. 214, 2005, 1-38). PEG의 이러한 성격은 인간에 대한 약물 적용에 한 발 더 가깝게 만들었으며 실제로 많은 약물들이 PEG를 통해 새롭게 제조되어질 수 있게 되었다(G. Garry. Stealth erythrocytes-a possible transfusion product for the new century. Vox Sang. 78, 2000, 143-147).
이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명 불포화 고급지방산의 페길화 방법은 용매나 촉매를 쓰지 않는 온도 처리의 간단한 방법으로 CLA와 같은 불포화 고급지방산을 페길화(PEGylation)시킬 수 있고, 페길화된 고급지방산에 의해 반응 전 불포화 고급지방산이 갖는 고유한 성질은 유지시키면서 세포에 대한 독성을 줄였으며, 제조된 페길화 고급지방산은 core-shell 특성을 가진 나노입자를 형성함으로써 약물의 방출 조절과 안정성을 높일 수 있으므로 PEGylation에 의해 안정화되고 반추위 미생물들에 의한 이성화 방지가 가능한 신규한 페길화 고급지방산을 제공할 수 있는 매우 뛰어난 효과가 있으므로 축산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
Claims (2)
- 탄소 수가 16개 내지 22개인 불포화 고급지방산과 폴리에틸렌글리콜을 60℃ 내지 200℃에서 30분 내지 10시간 동안 교반하면서 반응시키는 것을 특징으로 하는 불포화 고급지방산의 페길화 방법.
- 삭제
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| KR1020060039032A KR100856938B1 (ko) | 2006-04-28 | 2006-04-28 | 불포화 고급지방산의 페길화 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
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