KR100847708B1

KR100847708B1 - 포유류 질병에 관여하는 신장 특이적 유전자 ｈｍｍ07

Info

Publication number: KR100847708B1
Application number: KR1020070018064A
Authority: KR
Inventors: 허철구; 문제선; 박종훈; 최서희; 박소영; 노승재; 김정선; 백효정; 최준경; 권석윤
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2007-02-22
Filing date: 2007-02-22
Publication date: 2008-07-23

Abstract

본 발명은 신장 낭종(cyst)의 발병에 관여하며, 신장 조직에서 특이적으로 발현되는 HMM07 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 유전자를 포함하는 신장 낭종 발병을 진단하기 위한 마커 및 마이크로어레이, 상기 단백질에 대한 항체 및 이를 포함하는 마이크로어레이, 및 상기 유전자를 이용하여 포유류의 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.

신장 낭종, HMM07 단백질, 마커, 마이크로어레이

Description

포유류 질병에 관여하는 신장 특이적 유전자 ＨＭＭ07{Kidney-specific gene HMM07 associated with development of kidney cyst}

도 1은 낭종의 발병에 대한 유전자를 분석하기 위한 시스템을 도식화한 것이다.

도 2는 HMM07 유전자의 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 STRING을 이용하여 작성한 HMM07 유전자의 단백질 상호작용 정보를 나타낸 것이다.

본 발명은 포유류 질병, 특히 신장 낭종(cyst)의 발병에 관여하며, 신장 조직에서 특이적으로 발현되는 HMM07 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 유전자를 포함하는 신장 낭종 발병을 진단하기 위한 마커 및 마이크로어레이, 상기 단백질에 대한 항체 및 이를 포함하는 마이크로어레이, 및 상기 유전자를 이용하여 포유류의 신장 낭종을 치료하는 방법에 관한 것이다.

낭종(cyst)은 상피 세포의 비정상적인 증식에 의해 주머니 모양의 공간이 생기고 체액이 차게 되어 낭종이 기관의 전체로 번져 기능을 상실하며, 말기 신부전증 및 심혈관계 질환 등과 같은 여러 심각한 합병증을 유발하게 된다. Boletta, A. et al., Mol Cell 6(5):1267-73 (2000)의 연구에 의하면, 신장에 낭종이 형성되는 것은 PKD (Polycystic Kidney Disease)에 의해 발생하는데, PKD는 나이, 인종, 성별 지리적 위치 및 사회경제적 환경에 관계없이 동일하게 발생하는 매우 흔한 유전성 질환으로, 신장의 네프론에서 근위세관(proximal tubule)과 집합관(collecting duct)에서 낭종이 형성되어 신장 기능에 이상을 일으키고 말기 신부전증으로 이어진다.

PKD는 신장 양쪽에 낭종이 생기는 유전성 질환으로, 다낭성신질환 또는 다낭종신이라고도 한다. 소아형과 성인형 2가지가 있는데 소아형은 상염색체 열성 유전에 의한 것이고, 성인형은 상염색체 우성 유전에 의한 것이다. 성인형은 인구 200~1,000명당 1명 정도의 높은 빈도로 발생한다. 또한 환자의 약 50％가 만성 신부전으로 진행하며 평균 사망 연령은 50세 정도이다. 소아형은 신생아 때 진단받은 환자의 86％는 생후 3개월 이상 생존하고, 약 50％는 10세 이후까지 생존하며, 1세 이후에 진단받은 환자는 15세까지의 생존율이 80％ 정도인 것으로 알려져 있다. 2가지 유형 모두 특별한 치료법은 없고, 각종 증세나 합병증에 대한 대증요법만 가능하다.

이미 치료제 발굴을 위한 PKD의 낭종형성(cystogenesis) 기작에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으나, 아직까지 PKD의 낭종 형성에 관한 기작은 완전히 밝혀지지 않고 있으며, 현재까지 밝혀진 낭종 형성 기작은 같은 PKD 유전자에 의해 일어나는 두 가지 질병인 ADPKD(Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease)와 ARPKD(Autosomal Recessive polycystic kidney disease)의 두 질병 모두를 설명하기는 어렵다.

한국공개특허 제2005-0061501호에는 낭종 섬유증 트랜스막 전도도 조절기 단백질(CFTR)-매개 질환 및 상태의 연구 및 치료에 유용한 CFTR 억제용 조성물, 약제학적 제제 및 억제방법이 기재되어 있으나, 본 발명의 유전자에 대한 기재는 없다.

이에 본 발명자들은 낭종의 형성 기작에 관해 연구하던 중, 낭종의 발병에 관여하는 HMM07 유전자가 신장 조직에서 특이적으로 발현되는 것을 밝히고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 신장 조직에서 특이적으로 발현되는 HMM07 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 마커 및 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 단백질에 대한 항체 및 상기 항체를 포함하는 마이크 로어레이를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 이용하여 포유류의 신장 낭종을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 신장 낭종(낭종)의 발병에 관여하며, 신장 조직에서 특이적으로 발현되는 HMM07 단백질을 제공한다.

DNA 칩과 같은 방법을 통하여 낭종의 형성 기작에 관여하는 유전자의 후보군을 추출해도 그 후보군을 모두 녹아웃시키면서 조사하기 전까지는 실제로 낭종의 형성 기작에 관여하는 유전자인지, housekeeping 유전자인지 또는 실험적인 오류에 의한 것인지 구별이 불가능하다. 그러나 EST(Expressed Sequence Tag)를 기반으로 Audic-Claverie Test를 수행하거나 RT-PCR과 같은 실험을 이용하여 후보군이 조직 특이적 유전자로 밝혀질 경우, 유전적 영향을 주는 요인으로 판단이 가능함으로 후보군에 대한 신뢰성이 증가하게 된다. 본 발명가는 낭종 발생에 관여하는 유전자의 후보군을 조사하고, 그것들이 조직 특이적 정보를 포함하는지 조사함으로써 낭종 발생에 관여하는 유전자의 후보군에 대한 보다 높은 신뢰성을 제공했다.

낭종은 세포의 비정상적인 증식에 의해 조직에 빈 공간이 생기고 체액이 채워져 조직이 기능을 상실하는 질병으로써 현재까지도 발병원인이 정확하게 밝혀지지 않고 있다. 본 발명가는 신장에서 발생한 낭종의 발병원인을 알아내기 위하여 낭종이 발 생한 6개월, 12개월, 18개월 생 마우스를 이용하여 DNA 칩 실험으로 유전자의 발현 상태를 조사하고, UniProt 데이터베이스를 이용하여 기능을 분석하며, STRING 데이터베이스에서 단백질-단백질 상호작용에 대한 정보를 추출했다. 본 발명가는 각각의 발현 시점에서 유의하게 발현된 유전자의 EST 정보를 Audic-Claverie Test를 이용하여 신장 특이적 유전자의 후보군으로 110개의 유전자를 선별했다. 이 유전자들 중에서 HMM07 유전자가 실제로 신장 특이적 유전자임을 RT-PCR 실험을 통해 검증하였다. 도 1은 낭종의 발병에 대한 유전자를 분석하기 위한 시스템을 도식화한 것이다. 본 시스템의 목적은 낭종 발생 6개월, 12개월, 18개월의 DNA 칩 실험으로부터 나온 시간별 유의한 유전자가 실제로 조직 특이적 유전자인지 확인하고, 단백질-단백질 상호작용에 대한 정보를 분석하는 것이다.

따라서, 본 발명은 신장 낭종(cyst)의 발병에 관여하며, 신장 조직에서 특이적으로 발현되는 HMM07 단백질을 제공한다. 본 발명에 따른 HMM07 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명에 따른 HMM07 단백질은 바람직하게는 마우스 유래이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 HMM07 단백질은 신장 낭종에 대한 치료 약물의 타겟으로 이용될 수 있다. 낭종 증상에 대한 치료제로 약물을 설계할 경우에, HMM07 단백질로 약물 타겟을 축소할 수 있으므로 낭종 발병 초기에 보다 빠른 치료가 가능할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 HMM07 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 HMM07 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 동물 발현 벡터이다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명에 있어서, 발현 벡터의 프로모터에는 종래 알려진 임의의 프로모터가 사용될 수 있다. 예를 들면, 사이토메갈로 바이러스의 즉시 초기형 프로모터, SV40의 프로모터 (SV 40 후기형 프로모터 및 SV 40 초기형 프로모터), HSV (herpes simplex virus)의 tk 프로모터, 아데노바이러스 2 주요 후기형 프로모터(Adeno 2 major late promoter PAdml), 아데노바이러스 2 초기형 프로모터(PAdE2), AAV (human parvo virus-associated virus)의 p19 프로모터 및 마우스의 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터, MT 프로모터 및 MMTV LTR 프로모터 등을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 발현 벡터의 전사 종결인자는 종래 알려진 임의의 전사 종결인자가 포함될 수 있다. 예를 들면, 인간 성장 호르몬 폴리아데닐레이션 신호, 소 성장 호르몬 폴리아데닐레이션 신호 및 SV40 바이러스 폴리아데닐레이션 신호가 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 상기 형질전환체는 바람직하게는 포유류이다. 바람직하게는 인간이지만, 개나 고양이 같은 애완 동물, 소, 양, 돼지, 말 같은 가축, 그리고 쥐, 백서, 기니 피그 등과 같은 실험 동물도 포함될 수 있다. 본 발명에 있어서, 재조합 벡터로 포유류를 형질전환하는 방법은 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질전환법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 HMM07 유전자를 포함하는, 신장 낭종 발병을 진단하기 위한 마커를 제공한다. 본 발명의 HMM07 유전자는 낭종 유발의 유전적 경향을 파악하거나 진단을 위한 마커로서 이용이 가능하기 때문에, 이와 같은 정보를 이용하여 낭종이 발생하기 이전에 진단을 하여 미리 치료를 수행할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 포함하는 신장 낭종 발병을 진단하기 위한 키트를 제공할 수 있다. 상기 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 낭종 발병을 진단할 수 있는 것이다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 키트는 또한, 상기 유전자에 상보적인 프로브를 포함할 수 있다. 상기 유전자와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 낭종 발병을 진단할 수 있는 것이다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 HMM07 유전자를 포함하는, 신장 낭종 발병을 진단하기 위한 마이크로어레이를 제공한다. 본 발명의 마이크로어레이는 본 발명의 마커를 이용하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조 방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, "마이크로어레이"란 기판 상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함되어진다.

용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건하에 올리고뉴클레오티드 프로브가 커플링될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스) 또는 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용 또는 고정 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH₂ 기, SH 기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 바이오틴, 합텐 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 HMM07 단백질을 대한 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 HMM07 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩타이드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩타이드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 HMM07 단백질의 항체를 포함하는, 신장 낭종 발병을 진단하기 위한 마이크로어레이를 제공한다. 본 발명의 마이크로어레이는 마이크로어레이에 폴리뉴클레오티드 대신 본 발명의 항체가 고정된 것을 제외하고는, 전술한 마이크로어레이를 참고할 수 있다.

본 발명은 또한, 포유류에서 본 발명에 따른 HMM07 유전자의 발현을 억제함으로써 포유류의 신장 낭종을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하게는 상기 포유류는 인간이지만, 개나 고양이 같은 애완 동물, 소, 양, 돼지, 말 같은 가축, 그리고 쥐, 백서, 기니 피그 등과 같은 실험 동물 등의 비인간 동물도 포함될 수 있다.

포유류에서 HMM07 유전자의 발현을 억제하는 방법으로는 당업계에 공지된 여러 가지 방법을 이용할 수 있다. 상기 "유전자의 발현 억제"에는 유전자 전사의 억제 및 단백질로의 번역 억제가 포함된다. 또한, 유전자 발현이 완전히 정지된 것뿐만 아니라 발현이 감소된 것도 포함된다.

포유류에서 특정의 내재성 유전자의 발현을 억제하는 방법으로는 안티센스 분자를 이용하는 것이 가장 보편적이다. 안티센스 분자가 표적 유전자의 발현을 억제하는 작용으로는 삼중쇄 형성에 의한 전사개시 저해, RNA 중합효소에 의해 국부적인 개상 루프 구조가 만들어진 부위에서 하이브리드 형성에 의한 전사 억제, 합성이 진행되고 있는 RNA에서 하이브리드 형성에 의한 전사 저해, 인트론과 엑손과의 접합점에서 하이브리드 형성에 의한 스플라이싱 억제, 스플라이소좀 형성 부위에서 하이브리드 형성에 의한 스플라이싱 억제, mRNA와의 하이브리드 형성에 의한 핵으로부터 세포질로의 이행 억제, 번역 개시인자 결합 부위에서 하이브리드 형성에 의한 번역개시 억제 등이 있다. 이들은 전사, 스플라이싱 또는 번역 과정을 저해하여 표적 유전자의 발현을 억제한다.

본 발명에 사용되는 안티센스 분자는 상기의 어느 작용으로든지 표적 유전자의 발현을 억제해도 좋다. 대표적인 안티센스 분자로는 3중제, 리보자임 (ribozyme), RNAi, 또는 안티센스 핵산 등이 포함된다. 3중제는 이중 나선 DNA 주변을 감아 3 본쇄 나선을 형성하도록 함으로써 전사 개시가 억제되도록 한다(Maher et al., Antisense Res. and Dev., 1(3):227, 1991; Helene, C., Anticancer Drug Design, 6(6):569, 1991). 리보자임은 1 본쇄 RNA를 특이적으로 절단하는 능력을 보유한 RNA 분자이다. 리보자임은 RNA 분자 내 특정 뉴클레오티드 서열을 인식하여 부위 특이적으로 절단하도록 조작될 수 있다(Cech, J. Amer. Med. Assn., 260:3030, 1998). 따라서, 이 방법의 주요 장점은 이들이 서열 특이적이기 때문에 특정 서열을 갖는 mRNA만이 불활성화된다는 것이다. RNAi는 염기서열 특이적으로 작용하는 헤어핀형태의 소분자의 RNA를 사용하여 전사 수준 혹은 전사 후 수준에서 유전자 발현을 억제시키는 방법이다(Mette et al., EMBO J., 19: 5194-5201, 2000). 안티센스 핵산은 특정 mRNA 분자와 적어도 일부분이 상보적인 DNA 또는 RNA 분자를 말한다(Weintraub, Scientific American, 262:40, 1990). 세포 내에서, 안티센스 핵산은 이에 상응하는 mRNA와 하이브리드화하여 2 본쇄 분자를 형성한다. 이로 인해 mRNA의 해독이 저해된다(Marcus-Sakura, Anal. Biochem., 172:289, 1988).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예

실시예 1: DNA 칩 실험

Zoja, C. Cytogenet Genome Res 105(2-4):479-8 (2004)에 의하면, 6개월 생 마우스의 신장에서 낭종이 생기고 시간이 지남에 따라 점점 낭종 크기가 증가하여 18개월 생 마우스의 경우 낭종의 크기가 매우 크고 수도 여러 개가 발생하는 것이 관찰되 었다. 낭종의 변화에 관련된 유전자를 관찰하기 위하여 CodeLink Bioarray : UniSet Mouse 20K I Bioarray (GE Healthcare; hppt://www.gehealthcare.com)를 사용해 DNA 칩 실험을 수행하고, Quintet (Choe, J.K. LNCS 3642:392 (2005))를 사용하여 낭종의 변화에 따른 6개월, 12개월, 18개월 상태의 유의한 유전자 리스트를 추출하였다.

하기 표 1은 DNA 칩 실험 결과로서, 시간에 따른 유의한 유전자의 수를 나타낸 것이다.

시간	유의한 유전자 (TG/WT)	신장 특이적 관련 유의한 유전자
6개월	1521(845/676)	67
12개월	1220(639/581)	51
18개월	1533(720/813)	45

상기 표 1에서, TG는 낭종이 발생한 마우스이며, WT은 낭종이 발생하지 않은 마우스를 나타낸다.

실시예 2: TISA 데이터베이스를 이용한 신장 특이적 유전자 후보군의 설정

Noh, S.J. DNA Res 13(5):229-43 (2006)는 유전자, 전사체 구조, Alternative Splicing events와 조직 특이성의 정보를 담고 있는 TISA (Tissue-specific Alternative Splicing) 데이터베이스를 발표했다. DNA 칩 실험을 통해 추출한 각 시간별 유의한 유전자들이 TISA에서 존재하는지를 살피기 위하여, TISA의 유전자들이 가지는 Refseq 정보가 DNA 칩 상의 프로브에 해당하는 Refseq와 같은가를 확인하여, DNA 칩과 TISA 데이터베이스를 연결함으로써 TISA에서 예측된 신장 특이적 유전자 중에서 DNA 칩 상에 유의하게 발현된 유전자가 있으면 이를 신장 특이적 유전자의 후보군으로 추출하였다.

실시예 3: 신장 특이적 유전자 후보군의 RT - PCR 실험

마우스는 9~10주령 B6 strain을 암, 수 3마리씩 사용하였다. 적출한 조직은 모두 20가지로 그 종류는 처녀 유방, 수유 중 유방, 수유 후 유방, 결장, 귀, 췌장, 신장, 간, 폐, 대뇌, 소뇌, 난소, 자궁, 고환, 가슴샘, 위, 비장, 피부, 심장 및 십이지장이다. 각 조직의 특성을 고려하여 지질성 조직인 유방, 대뇌 및 소뇌는 약 100mg을 TissueLyser (Qiagen, Valencia, CA, USA)로 분쇄하고, RNeasy 지질 조직 미니 키트 (Qiagen, Valencia, CA, USA)을 이용하여 RNA를 추출하였다. 나머지 조직은 약 30mg을 같은 균질기(homogenizer)로 분쇄하고, RNeasy 미니 키트 (Qiagen, Valencia, CA, USA)으로 RNA을 얻었다. 추출한 RNA 1ug으로부터 Standard Two-step RT-PCR-&GO™ (Q-biogene, Cat# RT2ST100)을 사용하여 RT-PCR을 수행하여 약 100ul의 cDNA을 얻었다. 신장 특이적 유전자를 확인하기 위해 상기 유전자에 대한 프라이머(정방향 프라이머: 5'-GTTGCCATTGGCTAGGAAGC-3'(서열번호 3) 및 역방향 프라이머: 5'-CCACCTGGTCGAACATACTTG-3'(서열번호 4)) (PCR 산물 크기 536bp)를 제작하고, 위에서 얻어진 20개 조직에 대한 cDNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 예비변성 95℃ 5min에 이어, 95℃ 1min, 어닐링 58℃ 1min, 연장 72℃ 1min의 30 사이클 후, 72℃ 5min 동안 최종 연장하였다. 1% 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 PCR 산물을 확인하였다.

도 2는 HMM07 유전자의 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다. 도 2의 각 레인에 대한 설명은 하기와 같다:

Br1 : 처녀 유방	Ce2 : 대뇌	Th : 가슴샘
Br2 : 수유 중 유방	Pa : 췌장	Ov : 난소
Br3 : 수유 후 유방	Ki : 신장	Li : 간
Co : 결장	Sk : 피부	Ut : 자궁
Ea : 귀	He : 심장	Sp : 비장
Du : 십이지장	Te : 고환	St : 위
Ce1 : 소뇌	Lu : 폐

도 2에서 알 수 있는 바와 같이, HMM07 유전자가 다른 조직에서는 거의 발현되지 않고, 신장에서 특이적으로 발현된다는 것을 알 수 있었다.

실시예 4: UniProt 을 이용한 신장 특이적 유전자 후보군의 참조

UniProt (http://www.ebi.uniprot.org)은 2002년에 EBI/SIB Swiss-Prot, TrEMBL 데이터베이스 PIR-Protein Sequence Database(PIR-PSD)로 구분되어 제공되던 단백질 서열의 포함 범위나 주석의 내용을 UniProt 컨소시엄으로 합쳐 상호간의 협력으로 제공하는 방식을 말한다. 이 컨소시엄은 단백질 서열에 대한 정보를 포괄적이면서도 정확하게 제공하며, 많은 참조를 제공함에도 불구하고 접근하기 쉬운 인터페이스를 유지하고 있다.

신장에 특이적으로 나타나는 유전자 후보군이 UniProt 상에서 어떤 단백질과 연결되며, 기능은 무엇인지를 확인하기 위하여 신장 특이적 유전자 후보군의 서열 데이터를 UniProt의 Website에서 제공하는 BLAST alignment에 적용했고, 정확도를 위하여 동일성 95% 이상의 값을 가지는 자료만 채택했다.

실시예 5: STRING 을 이용한 신장 특이적 유전자 후보군의 단백질 상호작용 분석

STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Proteins; http://string.embl.de)은 단백질 상호작용에 관련된 종합적인 정보를 제공하는 데이터베이스로서, 2000년에 Snel B 2000 Nucleic Acids Res 28(18) 3442-4에 의해 발표된 이후 계속적인 업그레이드로 2007년에 version 7이 발표되었다.

신장 특이적 유전자 후보군이 가지는 단백질 상호작용의 정보를 확인하기 위하여, STRING에서의 마우스 서열을 우리의 후보군 데이터와 BLAST alignment (identity>=84% and coverage>=60%)를 통하여 단백질을 결정하고, 그에 해당하는 단백질 상호작용 정보를 추출하였다.

도 3은 STRING을 이용하여 작성한 HMM07 유전자의 단백질 상호작용 정보를 나타낸 것이다. 도 3에서, 붉은 색의 점이 HMM07과 BLAST alignment상에서 identity 100%, coverage 100%로 맞추어진 단백질을 나타낸다. HMM07 단백질과 상호작용하는 단백질들은 아미노산의 전달자 작용을 하는 단백질로서 이는 신장의 중요한 기능에 속한다.

낭종이 발생하는 증상의 원인을 알기 위해서는 낭종의 발생에 관여하는 단백질-단백질 상호작용, 경로 또는 조절 네트워크의 정보를 밝히는 것이 중요하다. 그러나 이러한 정보를 밝히기 위해 개별적인 유전자를 분석하여 생성하는 것은 실제로 낭 종의 발생에 관여하는 유전자를 밝히는데 매우 오랜 시간이 소모된다.

본 발명가는 낭종의 발생에 관여하는 HMM07 유전자가 신장 조직에서 특이적으로 발현하는 사실을 제공함으로써 연구자들이 낭종의 발생에 대한 단백질-단백질 네트워크나 경로와 같은 정보에 쉽게 접근할 수 있으며, HMM07 유전자가 신장 특이성 유전자라는 사실로 인하여 낭종 증상에 관한 연구에서 위양성(false positive)를 감소시킬 수 있다. 뿐만 아니라 낭종의 발병에 대한 진단에서 HMM07 유전자는 마커로서 사용이 가능함으로 보다 쉬운 진단을 할 수 있고, 낭종 증상에 대한 치료제로 약물을 설계할 경우, HMM07에 대한 단백질로 약물 타겟을 축소할 수 있으므로 낭종 발병 초기에 보다 빠른 치료가 가능하다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 신장 낭종(cyst)의 발병에 관여하며, 신장 조직에서만 우월적으로 발현되는 HMM07 단백질.
제1항에 있어서, 포유류 유래인 단백질.
제1항에 있어서, 신장 낭종에 대한 치료 약물의 타겟으로 이용되는 단백질.
제1항의 HMM07 단백질을 코딩하는 유전자.
제4항에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 유전자.
제4항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제6항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는, 신장 낭종 발병을 진단하기 위한 마커.
서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는, 신장 낭종 발병을 진단하기 위한 마이크로어레이.
제1항의 단백질에 대한 항체.
제10항의 항체를 포함하는, 신장 낭종 발병을 진단하기 위한 마이크로어레이.
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