KR100834556B1

KR100834556B1 - 골수의 동결 보관방법, 이로부터 동결절편 슬라이드의제작방법 및 이에 사용되는 용기

Info

Publication number: KR100834556B1
Application number: KR1020060069060A
Authority: KR
Inventors: 한경자
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2006-07-24
Filing date: 2006-07-24
Publication date: 2008-06-02
Also published as: KR20080009457A

Abstract

본 발명은 골수를 동결보관하는 방법, 이로부터 동결절편 슬라이드를 제작하는 방법 및 이에 사용되는 용기를 제공한다.

골수를 흡입·채취한 다음 골수냉동 용기에 넣어 냉동시키고, 냉동된 골수 블록을 냉동골수보관용기 내에 안착하고, 냉동골수보관용기 내에 안착된 골수 블록의 상부 및 골수 블록이 안착되지 않은 여백부를 동결 절편 제작용 매질로 충진하든가, 혹은 골수를 흡입·채취한 다음 동결 절편 제작용 매질에 직접 접종시켜 동결 보관하며, 슬라이드 제작이 필요할 때 동결 절편 제작기를 이용하여 박절시키고 자연 건조 후 염색시켜 슬라이드를 제작한다.

본 발명의 방법에 따르면, 일상적인 형태학적 관찰을 위한 골수 조직 절편 슬라이드를 제조함에 있어 응고와 고정 단계에 필요한 시간이 필요없기 때문에 단시간에 골수 조직 슬라이드를 제작할 수 있을 뿐 아니라 DNA, RNA, 단백질 등 고분자 물질들의 파괴를 막을 수 있고, 모든 종류의 항원을 면역조직염색으로 검출할 수 있도록 보관할 수 있으며, 나아가 골수조직 관찰에 방해가 되는 적혈구들이 제거되어 깨끗한 시야를 확보할 수 있다는 잇점을 갖는다.

골수, 동결, 절편, 매질, 슬라이드

Description

골수의 동결 보관방법, 이로부터 동결절편 슬라이드의 제작방법 및 이에 사용되는 용기{A method for cryopreservation of bone marrow, a method for manufacturing frozen section slide from frozen bone marrow, and a container for bone marrow cryopreservation}

도 1은 본 발명에서 사용되는 용기들을 나타내는 사시도로서, (a)는 골수냉동 용기(100), (b)는 냉동골수보관용기(200), 그리고 (c)는 냉동 플레이트(400)를 각각 도시한 도면이다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 의한 골수 동결 보관방법을 단계별 도시한 도면으로서, (a)는 냉동골수보관용기(200)의 안착부(210)에 동결 골수블록(130)을 안착시킨 단계, (b)는 냉동골수보관용기(200)에 안착된 동결 골수블록(130)의 상부와 골수 블록(130)이 안착되지 않은 여백부에 동결 절편 제작용 매질(180)을 충진하는 단계, 그리고 (c)는 필름(230)을 씌운 냉동골수보관용기(200)의 표면을 실링 처리하여 밀폐시킨 다음 냉동처리한 단면,을 각각 도시한 도면이다.

도 3은 본 발명의 일 실시 형태에 의해 얻어진 슬라이드의 평면도이다.

도 4는 도 3의 I-I선에 따른 단면도이다.

도 5는 골수검체 현미경 사진으로서, (a)는 본 발명의 실시예에 의한 골수검체를, (b)는 종래 방법에 의한 골수검체,를 도시한 도면이다.

*도면의 주요 부위에 대한 간단한 부호의 설명*

100... 골수냉동용기 본체 110... 골수 충진부

120... 바닥부 130... 동결 골수 블록

140... 입구부 150... 입구부 요홈

160... 골수냉동용기용 캡 170... 골수냉동용기용 캡 요홈

180... 동결 절편 제작용 매질 200.. 냉동골수보관용기

210... 안착부 220... 안착부 요홈

230... 냉동골수보관용기 밀폐용 필름

300... 슬라이드 글라스 400... 냉동 플레이트

410... 철판 420... 손잡이

430... 고무판 440,450... 손잡이 끼움돌기

본 발명은 골수를 동결 보관하는 방법, 이로부터 동결절편 슬라이드를 제작하는 방법, 및 이에 사용되는 용기에 관한 것으로, 보다 상세하게는 골수를 동결 보관하는 것이 가능할 뿐 아니라 이로부터 박절판을 제작해냄으로써 결과적으로 효과적으로 이용가능한 골수 조직을 얻을 수 있고 또한 골수 슬라이드를 제작할 수 있는 방법에 관한 것이다.

종래의 방법에서는 동결한 골수시료로부터 형상이 유지되는 생명과학의 연구에 이용할 수 있는 얇은 박절판 (예를 들어, 두께 2∼10μm)을 슬라이드 글라스상에 제작할 수 없었다.

현재 골수 흡입액을 이용하여 골수조직 절편을 제작하기 위해서는 다음과 같은 과정을 거쳐서 슬라이드를 제작하고 있다:

1. 골수를 흡입 채취하여 응고되도록 방치한다.

2. 포르말린 등의 고정액에 담구어 수 시간 내지 하루 정도 고정시킨다.

3. 고정액을 세척한 후 파라핀에 포매하여 블록을 제작한다.

4. 파라핀 블록을 마이크로톰 (Microtome) 등을 사용하여 절편을 만들어 조직 슬라이드를 제작한 후 파라핀 제거 과정을 거친다.

5. 염색한다.

그러나 상기 방법에 따르면, 다음과 같은 4가지 문제점이 발생하게 된다.

첫째, 슬라이드를 관찰하기까지 시간이 많이 소요되어 골수 검사 당일에 골수조직을 관찰하기가 어렵다. 참조로, 소요시간이 대략 24시간 이상이다.

둘째, 포르말린 등의 고정액에 노출되고 탈 파라핀 과정을 거치면서 DNA, RNA, 단백질 등 고분자 물질들의 파괴가 심하다.

셋째, 포르말린 등의 고정액에 노출되고 탈 파라핀 과정을 거쳐야 하므로 여러 가지 항원의 손실이 있어서 면역 조직염색 시행시 검출 가능한 항원의 종류에 한계가 있다. 　　　　　

넷째, 많은 양의 적혈구가 동시에 슬라이드 상에서 관찰되므로 종종 이들과 섞여있는 골수 조직 형태를 관찰하는데 방해가 된다.

이에 본 발명자는 골수 조직 절편을 가능한 빨리 제작하여 골수 도말 슬라이드를 관찰함과 동시에 골수 조직을 관찰할 수 있는 해결책으로서 동결 절편 제작에 착안하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 목적은 동결 보관으로 DNA, RNA, 단백질 등 고분자 물질들이 파괴되지 않도록 하여 추후에 검사나 연구가 가능하고 빠른 시간 내에 골수 조직 형태를 관찰할 수 있는 경제적인 방법을 제공하려는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 모든 종류의 항원을 면역조직염색으로 검출할 수 있도록 보 관하는 방법을 제공하려는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 골수조직 관찰에 방해가 되는 적혈구들이 제거됨으로써 골수 조직을 관찰시 방해되지 않는 슬라이드 제작 방법을 제공하려는데 있다.　

본 발명의 또 다른 목적은 동결 보관 및 슬라이드 제작시 사용하기 적절한 용기들을 제공하려는데 있다. 　

본 발명의 제1견지에 의하면,

골수냉동용기에 흡입·채취한 골수를 충진시키는 제1 단계:

상기 골수냉동용기를 -20 ∼ -90℃의 온도 범위내에서 1차 냉동시키는 제2 단계;

상기 1차 냉동된 골수블록을 골수냉동용기에서 꺼내어 얻어진 동결 골수블록을 냉동골수보관용기 내에 안착하는 제3 단계; 및

상기 냉동골수보관용기 내에 안착된 동결 골수블록의 상부와 동결 골수블록이 안착되지 않은 여백부를 동결 절편 제작용 매질로 충진한 다음 -20 ∼ -90℃의 온도 범위내에서 2차 냉동시키는 제4 단계; 를 포함하여 이루어지는 골수를 동결 보관하는 방법이 제공된다.

본 발명의 제2견지에 의하면,

냉동골수보관용기에 미리 동결 절편 제작용 매질을 담고, 골수를 흡입·채취하여 동결 절편 제작용 매질에 혼합되지 않을 정도의 저속으로 접종하는 단계; 및

상기 접종된 골수와 매질을 -20 ∼ -90℃의 온도 범위내에서 냉동시키는 단계; 를 포함하여 이루어지는 골수를 동결 보관하는 방법이 제공된다.

본 발명의 제3견지에 의하면,

상기 제1견지에 사용되는 골수냉동용기로서, 입구부, 골수 충진부, 및 바닥부를 구비하며,

상기 골수 충진부는 상방이 개방되고 내부가 비어있는 형상을 갖으며, 그리고

상기 바닥부는 상기 냉동골수보관용기 내에 안착가능한 형상을 갖는 것을 특징으로 하는 골수냉동용기가 제공된다.

본 발명의 제4견지에 의하면,

상기 제2견지에 사용되는 냉동골수보관용기로서,

상기 제3견지의 골수냉동용기의 바닥부 저면과 대응되는 형상을 이루어 냉동 골수 블록이 안착되는 안착부를 구비하는 것을 특징으로 하는 냉동골수보관용기가 제공된다.

본 발명의 제5견지에 의하면,

상기 제1 또는 제2 견지에 의해 얻어진 동결된 골수를 그 박절면을 따라 박절하여 동결 절편을 제작하는 단계; 및

상기 동결 절편을 슬라이드 글라스 상에서 자연건조시킨 후 염색하는 단계; 를 포함하여 이루어지는 동결 절편 슬라이드를 제작하는 방법이 제공된다.

본 발명의 제6견지에 의하면,

냉동 플레이트로서, 그 상부 철판과 하부 고무판을 두께가 0.5∼2cm 이내인 일체형이 되도록 접착시켜 제작하고, 상기 상부 철판의 양측에는 손잡이 끼움 돌기를 이용하여 손잡이를 배설하는 것을 특징으로 하는 냉동 플레이트가 제공된다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

우선, 골수를 흡입·채취하여 골수냉동 용기에 충진시킨다. 상기 골수냉동 용기에 있어 그 바닥면 형상은 추후 동결 골수블록을 제작한 다음 냉동골수보관용기 내에 안착하는 후속 공정을 고려할 때 골수냉동 용기의 바닥부 저면 형상은 추후 사용할 냉동골수보관용기 내 골수 보관용기 안착부에 안착될 수 있도록 편평하여 서로 대응되는 형상을 갖는 것이 좋다.

이를 구체적으로 살펴보면, 상기 골수냉동 용기의 형태는 이에 한정하는 것은 아니나, 흡입·채취하여 냉동시킬 수 있으면 어떠한 형상이든 사용할 수 있는 것으로, 일 예로서 실린더, 튜브, 상자, 시험관 형상 등이 모두 가능한 것이다.

상기 골수냉동 용기의 재질은 보관의 간편성 등을 감안하여 폴리프로필렌과 같은 합성수지 재질 혹은 파라핀 재질을 사용하여도 좋으나, 추후 동결 골수 블록 제작시 용기로부터 쉽게 분리가능하면서 또한 냉동시 파손되지 않는 재질이면 어떠한 재질(라텍스, 실리콘 고무, 폴리 계열 등)을 사용하여도 무방하다. 더 나아가 용기로부터 별도로 분리해낼 필요없이 용기채 절단가능한 재질이라면 더욱 바람직하다.

따라서, 본 발명에서 사용하기 적합한 골수냉동 용기는 입구부, 골수 충진부 및 바닥부를 구비하며, 상기 골수 충진부는 상방이 개방되거나 캡이 구비되고 그 내부는 비어있는 형상을 갖으며, 상기 바닥부는 추후 사용될 냉동골수보관용기 내에 안착가능한 형상을 갖고 쓰러지지 않는 형상을 갖는 용기들이다.

상기 용기의 깊이(높이)는 0.5 cm이상 자유롭게 제작 가능하나 가로와 세로는 각각 0.5 cm 이상 3 cm이하가 적당하다. 높이가 바닥에서 0.5 cm 이상 3 cm에 윗부분과 쉽게 분리시킬 수 있는 장치를 만들 수도 있다.

또한 상기 입구부에는 밀폐가능하도록 캡을 형성하는 것이 보다 바람직하며, 이때 상기 캡은 상기 골수냉동 용기와 분리형으로 혹은 일체형으로 형성될 수 있는 것으로, 용기를 밀폐시킬 수 있다면 그 형태는 어느 것이라도 좋고, 재질 또한 이에 한정하는 것은 아니나 상기 골수 냉동용기와 일치하는 재질(라텍스, 실리콘 고무, 폴리계열등)을 갖는 것이 좋다.

나아가 상기 바닥부는 추후 사용될 냉동골수보관용기내에 안착가능한 형상이면 특별히 한정하지 않으나, 편평한 형상 또는 실린더 형상을 갖는 것이 사용상 바람직하다.

상기 골수냉동 용기에 충진시킬 골수의 함량은 이에 한정하는 것은 아니나, 0.2∼2ml 정도를 사용하면 충분하며, 최대 사용량은 대략 0.1∼3ml 정도이다.

이와 같이 골수가 충진된 골수냉동 용기를 1차 냉동시킨다. 이때 1차 냉동 온도는 이에 한정하는 것은 아니나, 여러가지 항원들이 손실되지 않도록 -20 ∼ -90℃의 온도 범위내에서 급냉시키는 것이 바람직하다.

1차 냉동된 골수를 골수냉동 용기에서 꺼내어 얻어진 동결 골수블록을 냉동골수보관용기 내에 안착시킨다. 이때 냉동 플레이트를 사용하는 것이 바람직한데, 즉, -20℃이하로 냉동된 냉동 플레이트 상에 동결 골수블록과 냉동골수보관용기를 함께 올려놓고 상기 용기 내에 동결 골수블록을 안착시키는 작업을 수행하면 안착 작업이 완료될 때까지 동결 골수블록이 해동되지 않아 바람직한 것이다.

상기 냉동 플레이트는 철판으로된 상부판과 고무판으로된 하부판을 접착시켜 두께가 0.5∼2cm 이내인 일체형으로 제작된 것으로, 이동시 편리하게 사용할 수 있도록 상기 상부판의 양측에는 손잡이 끼움돌기를 사용하여 손잡이를 배설하는 것을 특징으로 한다. 상기 상부판은 철판뿐 아니라 스테인레스 철판 등 내구성을 부여할 수 있고 해동을 지연시킬 수 있는 재료라면 어떠한 것이라도 좋다. 그 크기는 필요에 따라 제작가능하나, 가로x세로 사이즈가 30x30cm 정도 크기이면 사용하기에 충분하다. 그 하부판에 사용되는 재질로는 이에 한정하는 것은 아니나, 미끄러지는 것을 방지할 수 있도록 고무판을 사용하면 좋다.

냉동 작업시 동결골수 블록이 해동되는 것을 지연하기 위하여, -20℃이하의 냉동고에 보관해두었다가 필요할 때 꺼내어 그 상부에 동결골수 블록등을 올려놓고 작업하면 30분 이상 해동을 방지할 수 있어 바람직하다.

또한, 관찰의 편리성을 감안하여 동결골수 블록을 프레임 내에 안착할 때에는 가급적 중앙부에 위치시키는 것이 좋으며, 상기 냉동골수보관용기는 그 상단부 중앙에 상술한 골수냉동 용기의 바닥부의 저면과 대응되는 형상을 이루어 골수냉동 용기가 안착되는 골수냉동 용기 안착부를 구비하는 것이 좋다.

상기 냉동골수보관용기 또한 밀폐가능하도록 그 상부에 필름을 씌워 실링 처리하는 것이 보다 바람직하며, 이때 상기 필름은 상기 냉동골수보관용기와 분리형으로 형성될 수 있으며, 용기를 밀폐시킬 수 있다면 그 형태는 어느 것이라도 좋으며, 사이즈는 전체 용기를 덮을 정도면 충분하다. 한편, 골수를 냉동골수보관용기에 직 접 주입할 때에는 냉동골수보관용기에 미리 동결 절편 제작용 매질을 담은 다음 필름을 씌워 실링한 채로 주사기 니들을 사용하여 직접 용기 내로 골수를 주입하여도 좋다.

상기 냉동골수보관용기 및 필름의 재질 또한 이에 한정하는 것은 아니나 합성수지, 실리콘 고무, 라텍스, 폴리 계열 중 1종을 사용하면 좋다.

또한, 상기 필름 대신 캡을 사용할 수도 있는데, 이때 캡은 냉동골수보관용기의 안착부 요홈에 밀착되어 밀폐될 수 있도록 요홈이 달린 형태이면 어떠한 형태라도 좋다. 그 재질 또한 이에 한정하는 것은 아니나 합성수지, 실리콘 고무, 라텍스, 폴리 계열 중 1종을 사용하면 좋다.

이와 같이 하여 냉동골수보관용기 내에 안착된 동결 골수블록의 상부와 동결 골수블록이 안착되지 않은 여백부를 모두 동결 절편 제작용 매질로 충진시킨다. 이때 동결 절편 제작용 매질로는 통상 사용되는 SAKURA^® 사의 Tissue-Tek ™ O.C.T. compound (이하, "O.C.T.compound" 라 한다.) 혹은 THE RNA COMPANY ™ Ambion^® 사의 RNAlater 등을 사용할 수 있다. 이 단계에서 동결된 골수의 해동을 막기 위해 냉동 플레이트 상에서 작업하는 것이 권장된다.

그런 다음 동결된 골수가 녹기 전에 상기 급냉시와 동일한 온도조건, 즉 -20 ∼ -90℃의 온도 범위하에 2차 냉동시켜 보관하게 된다.

한편, 골수냉동 용기를 사용하지 않고 냉동골수보관용기내에 동결 절편 제작용 매질을 담고 골수 0.2∼2ml를 직접 동결 절편 제작용 매질에 접종하고 냉동시킬 수도 있다. 이때 사용할 수 있는 동결 절편 제작용 매질로는 상술한 바와 같은 O.C.T. compound 혹은 RNAlater 등을 사용할 수 있으며, 골수를 동결 절편 제작용 매질에 혼합되지 않을 정도의 저속으로 접종하는 것이 바람직하다.

상기 냉동시 온도범위는 상기와 동일한 -20 ∼ -90℃의 온도 범위 내에서 급냉시키면 충분하다.

이와 같이 하여 골수를 동결보관하다가 슬라이드 제작이 필요할 때 그 박절면을 따라 210μm 두께의 절편을 제작한 다음 슬라이드 글라스 상에서 약 1분 이상 자연 건조 후 연구목적에 따라 적절한 염색시료를 사용하여 염색시켜 슬라이드를 제작할 수 있다. 한편, DNA나 RNA 추출 목적인 경우에 절편 두께는 상기 두께 범위보다 두꺼운 것이 좋다. 상기 절단시에는 통상적으로 입수가능한 동결절편제작기 (cryotome) 등을 사용하면 충분하다.

이와 같은 방법에 따르면, 골수 조직 절편을 단시간에 제작할 수 있을 뿐 아니라 DNA, RNA, 단백질 등 고분자 물질들의 파괴를 막을 수 있고, 모든 종류의 항원을 면역조직염색으로 검출할 수 있도록 보관할 수 있으며, 나아가 골수조직 관찰에 방 해가 되는 적혈구들이 제거된다는 잇점을 갖는다.

이하, 본 발명의 실시예를 도면을 참조하여 상세하게 설명한다. 본 실시예는 본 발명을 예시하고자 하는 것으로, 본 발명을 이에 한정하려는 것은 아니다.

<실시예>

실시예 1-골수 동결보관

도 1(a)에 도시한, 직경 0.5 cm x 높이 5cm의 원통형 폴리프로필렌 재질의 골수냉동 용기(100)의 입구부(140)를 통해 흡입·채취한 골수 1ml 정도를 골수 충진부(110)내에 충진시켰다.

그런 다음 상기 골수 냉동용기(100)를 약-70℃의 온도에서 1차 냉동시켰다. 1차 냉동된 골수 블록을 골수 냉동용기(100)로부터 분리해낸 다음, -20℃로 냉동된 도 1(c)에 도시한, 냉동판(400)의 철판(410) 상부에 도 1(b)에 도시한, 냉동골수보관용기(200)와 함께 놓고 안착시키는 작업을 수행하였다.

즉, 상기 골수 냉동용기(100)의 바닥부(120)의 저면과 대응되는 형상을 이루어 냉동골수보관용기(200)내에 형성된 안착부(210) 내에 안착시켰다(도 1(b), 1(c), 2(a) 참조). 그런 다음 도 2(b)에 도시한 바와 같이, 냉동골수보관용기(200)내에 안착시킨 동결 골수블록(130)의 상부 및 용기(200) 내에 동결 골수블록(130)이 안착되지 않은 주위 여백부 전체를 동결 절편 제작용 매질(180)로서 O.C.T. compound을 사용하여 충진시켰다.

이어서, 상기 냉동골수보관용기(200)의 안착부 요홈(220)보다 사이즈가 큰 필름(230)을 씌워 실링하고 도 2(c)에 도시된 형태를 얻은 다음 약-70℃의 온도에서 2차 냉각시켜 보관하였다. 총 소요시간은 3시간 정도였다.

실시예 2-골수 동결보관

상기 실시예 1과는 별도로, 도 1(b)에 도시한 냉동골수보관용기(200) 내에 동결 절편 제작용 매질(130)로서 O.C.T. compound을 약 2 ml 담고 골수 0.5ml를 직접 이 매질에 접종시켰다.

이어서 상기 접종된 골수를 매질과 완전 혼합되기 전에 약-70℃의 온도에서 냉각시킨 다음 또한 필름(230)을 덮어 실링하였다.

실시예 3-슬라이드 제작 및 관찰실험

상기 실시예 1 및 2로부터 얻어진 각각의 동결 보관된 골수로부터 동결절편제작기(cryotome)를 이용하여 그 박절면을 따라 약 5μm 두께의 절편을 제작하였다.

그런 다음 약 1분간 공기 건조후 Hematoxylin Eosin 염색시켜 슬라이드를 각각 제작하였으며, 제작된 슬라이드를 현미경하에서 관찰하고 얻어진 결과를 도 5(a)로서 나타내었다.

비교예 -슬라이드 제작 및 관찰실험

종래 기술에 따라, 골수를 흡입 채취하여 2시간 동안 응고되도록 상온에 방치하였다. 이때 골수로는 상기 실시예에서 사용한 것과 동일한 골수를 사용하였다.

방치한 골수 1 mL를 95% 알코올 고정액에 담구어 3시간정도 고정시켰다. 그런다음 Tissue processor 장비를 이용하여 파라핀 포매 블록을 제작하였다(총 12시간 소요). 얻어진 파라핀 블록을 마이크로톰(microtome)으로 5μm 두께의 절편을 만들어 조직 슬라이드를 제작하였다. 슬라이드로부터 파라핀 제거과정을 Hematoxylin Eosin 염색을 실시하였다(총 24시간 소요).

종래 기술에 의해 제작한 골수 검체 현미경 소견을 도 5(b)로서 도시하였다.

상기 도 5(a)와 5(b)를 비교한 결과, 본 발명에서 제시한 방법으로 제작한 검체에서는 DNA, RNA, 단백질등 고분자 물질들의 파괴가 적을 뿐만 아니라 항원의 소실이 적으며, 나아가 골수조직 관찰에 방해가 되는 적혈구가 제거되는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 방법에 따르면, 골수로부터 얻어진 슬라이드를 관찰할 수 있기까지 시간 이 적게 소요되어 골수 검사 당일에 골수 도말 표면과 함께 골수 조직관찰이 가능하며, 포르말린 등의 고정액에 노출되지 않고 탈 파라핀 과정을 거치지 않아도 되므로 DNA, RNA, 단백질 등의 고분자 물질들의 파괴가 적을 뿐만 아니라 항원의 소실이 적어서 면역조직염색 시행시 거의 모든 항원에 대하여 검사할 수 있고, 골수조직 관찰에 방해가 되는 적혈구가 냉동 처리로 인하여 제거되므로 매우 깨끗한 시야를 확보할 수 있다는 효과를 갖는다.

Claims

골수냉동 용기에 골수를 충진시키는 제1 단계:

상기 골수냉동 용기를 -20 ∼ -90℃의 온도 범위 내에서 1차 냉동시키는 제2 단계;

상기 1차 냉동된 골수 블록을 골수냉동 용기에서 꺼내어 냉동골수보관용기 내에 안착하는 제3 단계; 및

상기 냉동골수보관용기 내에 안착된 동결 골수블록의 상부와 동결 골수블록이 안착되지 않은 프레임 여백부를 동결 절편 제작용 매질로 충진한 다음 -20 ∼ -90℃의 온도 범위내에서 2차 냉동시키는 제4 단계; 를 포함하여 이루어지는 골수의 동결 보관방법
냉동골수보관용기에 담긴 동결 절편 제작용 매질에 혼합되지 않을 정도의 저속으로 골수를 접종하는 단계;및

상기 접종된 골수와 매질을 -20 ∼ -90℃의 온도 범위 내에서 냉동시키는 단계; 를 포함하여 이루어지는 골수의 동결 보관방법
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 동결 절편 제작용 매질은 O.C.T. compound 혹은 RNAlater 인 것을 특징으로 하는 골수의 동결 보관방법
제1항에 있어서, 상기 골수냉동 용기 내에 충진되는 골수의 함량은 0.1∼3ml 범위 내인 것을 특징으로 하는 골수의 동결 보관방법
제1항에 있어서, 상기 제3 단계중 골수냉동 용기에서 꺼낸 1차 냉동된 골수 블록을 -20℃이하로 냉동된 냉동 플레이트를 사용하여 그 상부에서 냉동골수 보관용기에 안착시키는 공정을 수행하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 골수의 동결 보관방법
청구항 1항에 사용되는 골수냉동 용기로서, 입구부, 골수 충진부 및 바닥부를 구비하며, 상기 골수 충진부는 상방이 개방되고 내부가 비어있는 형상을 갖으며,

상기 바닥부는 그 저면이 상기 냉동골수보관용기 내에 안착가능한 형상을 갖는 것을 특징으로 하는 골수냉동 용기
제6항에 있어서, 상기 용기 본체는 실린더, 튜브, 상자 혹은 시험관 형상을 갖는 것을 특징으로 하는 골수냉동 용기
제6항에 있어서, 상기 골수냉동 용기의 가로와 세로는 각각 0.5cm∼3cm 범위내이고, 높이는 0.5cm 이상인 것을 특징으로 하는 골수냉동 용기
제6항에 있어서, 상기 용기 본체의 재질은 합성수지, 실리콘 고무, 라텍스 혹은 폴리계열 인 것을 특징으로 하는 골수냉동 용기
제6항에 있어서, 상기 입구부에는 상기 용기 본체와 일체형으로 혹은 분리형으로 밀폐용 캡이 형성되는 것을 특징으로 하는 골수냉동 용기
제6항에 있어서, 상기 바닥부의 저면은 편평하거나 혹은 실린더 형상을 갖는 것을 특징으로 하는 골수냉동 용기
청구항 2항에 사용되는 냉동골수보관용기로서,

청구항 6항 내지 11항중 어느 한항에 의한 골수냉동 용기의 바닥부 저면과 대응되 는 형상을 이루어 골수냉동 용기가 안착되는 골수처리용기 안착부를 구비하는 것을 특징으로 하는 냉동골수보관용기
제12항에 있어서, 상기 냉동골수보관용기 상에 필름을 씌운 다음 실링 처리하는 것을 특징으로 하는 냉동골수보관용기
제12항에 있어서, 상기 용기 본체의 재질은 합성수지, 실리콘 고무, 라텍스 혹은 폴리계열 인 것을 특징으로 하는 냉동골수보관용기
제1항 또는 제2항에 의해 얻어진 동결된 골수를 그 박절면을 따라 박절하여 동결 절편을 제작하는 단계; 및

상기 동결 절편을 슬라이드 글라스 상에서 자연건조시킨 후 염색하는 단계; 를 포함하여 이루어지는 동결절편 슬라이드의 제작방법
제15항에 있어서, 상기 동결된 절편의 박절 두께는 2∼10μm 범위 내인 것을 특징으로 하는 골수 동결절편 슬라이드의 제작방법
제5항에서 사용되는 냉동 플레이트로서,

그 상부 철판과 하부 고무판을 두께가 0.5∼2cm 이내인 일체형이 되도록 접착시켜 제작하고, 상기 상부 철판의 양측에는 손잡이 끼움돌기를 이용하여 손잡이를 배설하는 것을 특징으로 하는 냉동 플레이트