KR100832946B1 - Deriving Method of Indicator Gene for Discerning Leukemia Subclasses and Indicator Gene and DNA chip Using The Same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 백혈병(leukemia) 아형 판별용 지표 유전자 도출 방법과 이에 따른 지표 유전자 및 DNA칩에 관한 것으로, 특히 백혈병 환자의 골수로부터 RNA를 추출하고, 상기 추출한 RNA로부터 형광표지된 cDNA를 합성하며, 상기 cDNA를 다양한 인간 유전자가 집적되어 있는 DNA chip 에 적용하여 혼성화시키고, 상기 혼성화 정도에 따라 상기 인간 유전자의 발현 양상을 수치화하여, 상기 수치화된 정도에 따라 상기 인간 유전자의 발현 양상이 동일한 범위 내에 있는 환자들을 상기한 백혈병 아형 별로 구분하여 그룹화함으로써, 발현수준이 높은 인간 유전자를 도출하는 것을 특징으로 한다. 이러한 본 발명에 의하는 경우, 백혈병 아형 별로 특이하게 발현되는 다수의 지표 유전자군을 도출해 낼 수 있고, 이러한 지표 유전자군을 통하여 백혈병 환자의 정확한 백혈병 아형(AML, ALL, CML, CLL)을 진단할 수 있는 효과가 있다. The present invention relates to a method for deriving an indicator gene for leukemia subtype determination and an indicator gene and a DNA chip according to the present invention. In particular, RNA is extracted from bone marrow of a leukemia patient, and a fluorescently labeled cDNA is synthesized from the extracted RNA. cDNA is applied to a DNA chip in which various human genes are integrated and hybridized, and the expression pattern of the human gene is quantified according to the degree of hybridization, and the expression pattern of the human gene is within the same range according to the quantified degree. By grouping them by the above leukemia subtype, it is characterized by deriving a human gene with high expression level. According to the present invention, it is possible to derive a large number of indicator gene groups that are specifically expressed by leukemia subtypes, and to diagnose accurate leukemia subtypes (AML, ALL, CML, CLL) of leukemia patients through these indicator gene groups. It can be effective.

백혈병, 아형, 지표 유전자 Leukemia, subtypes, indicator genes

Description

백혈병 아형 판별용 지표 유전자 도출 방법과 이에 따른 지표 유전자 및 ＤＮＡ칩{Deriving Method of Indicator Gene for Discerning Leukemia Subclasses and Indicator Gene and DNA chip Using The Same}Deriving Method of Indicator Gene for Discerning Leukemia Subclasses and Indicator Gene and DNA Chip Using The Same}

도 1a 내지 도 1d는 본 발명에 따라 백혈병 환자의 골수에서 추출한 RNA로부터 형광표지된 cDNA를 합성하고, 상기 cDNA를 백혈병 아형 별로 다양한 인간 유전자가 집적되어 있는 DNA chip에 혼성화시킨 결과를 예시적으로 나타내는 사진이고,1A to 1D illustrate a result of synthesizing fluorescently labeled cDNA from RNA extracted from bone marrow of a leukemia patient according to the present invention, and hybridizing the cDNA to a DNA chip in which various human genes are integrated for each leukemia subtype. It is a photograph,

도 2는 본 발명에 따라 DNA chip에 혼성화시킨 결과를 계층적 다발형성(hierarchical clustering) 분석법을 통하여 그룹화한 결과를 예시적으로 나타내는 그래프이고, Figure 2 is a graph showing the results of grouping the results hybridized to the DNA chip in accordance with the present invention through a hierarchical clustering method for example,

도 3a는 본 발명에 따라 4가지 백혈병 아형 별로 그룹화한 결과로부터 심층적 분석을 통하여 발현 수준이 높은 인간 유전자를 도출한 결과를 예시적으로 나타내는 평면 그래프이고, 도 3b는 도 3a의 결과에 따라 도출한 발현 수준이 높은 인간 유전자를 본질구성분석법(Principle Component Analysis, PCA)을 통하여 환자들에게 도입한 결과를 예시적으로 나타내는 3차원 그래프이고, FIG. 3A is a flat graph illustrating a result of deriving a human gene having a high expression level through in-depth analysis from the results grouped by four leukemia subtypes according to the present invention, and FIG. 3B is derived according to the result of FIG. 3A. Three-dimensional graph showing the results of introducing human genes with high expression levels into patients through Principle Component Analysis (PCA),

도 4a는 본 발명에 따라 2가지 백혈병 아형 별로 그룹화한 결과로부터 심층적 분석을 통하여 발현 수준이 높은 인간 유전자를 도출한 결과를 예시적으로 나타 내는 평면 그래프이고, 도 4b는 도 4a의 결과에 따라 도출한 발현 수준이 높은 인간 유전자를 본질구성분석법(PCA)을 통하여 환자들에게 도입한 결과를 예시적으로 나타내는 3차원 그래프이다. Figure 4a is a planar graph showing the result of deriving a human gene with a high expression level through in-depth analysis from the results grouped by two leukemia subtypes according to the present invention, Figure 4b is derived according to the result of Figure 4a A three-dimensional graph that exemplifies the results of introducing a human gene with a high expression level into patients through intrinsic constitutive analysis (PCA).

본 발명은 백혈병에 관한 것으로, 특히 백혈병(leukemia) 아형 판별용 지표 유전자 도출 방법과 이에 따른 지표 유전자 및 DNA칩에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 백혈병 아형 별로 특이하게 발현되는 다수의 지표 유전자군을 도출해 내는 방법과 이렇게 도출된 지표 유전자군을 이용하여 백혈병 환자의 정확한 백혈병 아형을 진단하기 위한 것이다. The present invention relates to leukemia, and more particularly, to a method for deriving an indicator gene for leukemia subtype determination, and an indicator gene and DNA chip accordingly. More specifically, the method is to derive a large number of marker gene groups that are specifically expressed by leukemia subtypes, and to diagnose accurate leukemia subtypes of leukemia patients using the derived gene groups.

백혈병은 고형암을 비롯한 기타 종양과는 달리 골수세포의 이상에 의하여 비롯되는 다양한 혈액종양의 집합체를 가리킨다. 백혈병은 혈액을 구성하는 성숙된 백혈구로 진행하는 다양한 전구세포들에 유전적 문제가 생겨 더 이상 성숙하지 못하고 기능적으로 미성숙한 상태로 급속한 수적인 증가만을 지속한다. 미성숙한 혈액 종양세포는 그 자체의 문제뿐만 아니라 결과적으로 정상적인 백혈구에 의해 유지되는 면역체계에 문제를 노출하여 다양한 면역질환을 동반하기도 한다. Leukemia, unlike solid tumors and other tumors, refers to a collection of various blood tumors caused by abnormal bone marrow cells. Leukemia is a genetic problem in the various progenitor cells that progress to the mature white blood cells that make up the blood, which is no longer mature and functionally immature. Immature blood tumor cells are not only a problem of their own, but also consequently exert a variety of immune diseases by exposing problems to the immune system maintained by normal white blood cells.

이러한 백혈병은 급성과 만성 그리고 골수성과 림프구성에 의해 크게 네 종류－급성 골수성 백혈병 (Acute Myelocytic Leukemia; AML), 급성 림프구성 백혈병 (Acute Lymphocytic Leukemia; ALL), 만성 골수성 백혈병 (Chronic Myelocytic Leukemia; CML), 만성 림프구성 백혈병 (Chronic Lymphocytic Leukemia; CLL)－로 나뉘는데, 백혈병의 종류에 따라 환자의 치료방법이 결정되기 때문에 백혈병 아형의 정확한 진단은 좋은 예후를 위해 무엇보다 중요하다.These leukemias are categorized into acute and chronic, and myeloid and lymphocytic disease are largely classified into four types—Acute Myelocytic Leukemia (AML), Acute Lymphocytic Leukemia (ALL), and Chronic Myelocytic Leukemia (CML). Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) is divided into two groups, and the type of leukemia determines the treatment of the patient. Therefore, accurate diagnosis of the leukemia subtype is important for a good prognosis.

근대 의학의 발전과 함께 진단기술의 향상은 백혈병 진단의 정확성을 높이는데 기여하고 있다. 최근에는 각 아형별 백혈병의 특징을 이용한 다양한 방법들－세포형태학적, 세포화학적, 면역특징학적, 핵형－을 종합하여 진단하고 있다. 그러나 이 같은 방법은 각 백혈병 아형이 가지고 있는 한 개나 극소수의 특징만을 고려하기 때문에 잘못된 진단 가능성을 내포하고 있다. 또한, 환자로부터 시료 채취 후 진단 결과의 도출까지는 일주일이나 그 이상의 시간이 걸린다는 단점을 함께 가지고 있다.Improvements in diagnostic technology, along with the development of modern medicine, contribute to improving the accuracy of leukemia diagnosis. Recently, various methods using the characteristics of leukemia in each subtype—cytomorphological, cytochemical, immunospecific, and karyotype—are being diagnosed. However, such a method involves only one or a few features of each leukemia subtype, and thus poses a false diagnosis. In addition, there is a drawback that it takes a week or more to extract the diagnosis result after sampling from the patient.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 특히 백혈병 환자의 골수로부터 RNA를 추출하고, 상기 추출한 RNA로부터 형광표지된 cDNA를 합성하며, 상기 cDNA를 다양한 인간 유전자가 집적되어 있는 DNA chip 에 적용하여 혼성화시키고, 상기 혼성화 정도에 따라 상기 인간 유전자의 발현 양상을 수치화하여, 상기 수치화된 정도에 따라 상기 인간 유전자의 발현 양상이 동일한 범위 내에 있는 환자들을 상기한 백혈병 아형 별로 구분하여 그룹화함으로써, 발현수준이 높은 인간 유전자를 도출하는 것을 특징으로 하는 백혈병 아형 판별용 지표 유전자 도출 방법을 제공하고자 한다. The present invention is to solve the problems of the prior art as described above, in particular, RNA extracted from the bone marrow of leukemia patients, synthesized fluorescently labeled cDNA from the extracted RNA, the cDNA is a DNA in which various human genes are integrated By applying to the chip hybridization, by quantifying the expression pattern of the human gene according to the degree of hybridization, by grouping the patients with the expression pattern of the human gene within the same range according to the quantified degree by dividing the group by the leukemia subtype To provide a method for deriving indicator genes for leukemia subtype discrimination, which is characterized by deriving human genes with high expression levels.

이러한 본 발명을 통하여, 백혈병 아형 별로 특이하게 발현되는 다수의 지표 유전자군을 도출해 내고, 이렇게 도출한 지표 유전자군을 통하여 백혈병 환자의 정확한 백혈병 아형(AML, ALL, CML, CLL)을 진단하고자 하는 것이 본 발명의 목적이다. Through the present invention, it is possible to derive a large number of marker gene groups that are specifically expressed by leukemia subtypes, and to diagnose accurate leukemia subtypes (AML, ALL, CML, CLL) of leukemia patients through the derived gene groups. It is an object of the present invention.

그리고, 본 발명은 AML, ALL, CML, CLL과 같은 백혈병 환자 전반에 걸쳐 그 아형을 진단할 수 있는 유전자군과 그것의 발현 비교 방법을 제시함으로써, 기존의 단일지표 검사에서 올 수 있는 잘못된 진단 가능성을 낮추고자 함이다. 또한, 본 발명을 기존 검사방법에 추가적으로 적용함으로써 진단의 정확성을 더욱 향상시키고자 하는 것이다. 아울러 본 발명에서는 급성 백혈병(AML, ALL)과 만성 백혈병(CML, CLL) 집단으로 구분해 줄 수 있는 유전자군을 따로 선별하여 제공하고자 한다. 이러한 본 발명에 따라 선별된 유전자군의 집적화를 통해 백혈병 아형 판별용 DNA 칩의 제작과 분석에 대한 새로운 방법을 제시하기 위한 것이다.In addition, the present invention provides a group of genes capable of diagnosing subtypes and their expression comparison methods across leukemia patients such as AML, ALL, CML, and CLL, and thus, the possibility of false diagnosis that can come from the existing single-marker test. To lower. In addition, the present invention is to further improve the accuracy of the diagnosis by further applying to the existing test method. In addition, the present invention is to provide a separate gene group that can be divided into acute leukemia (AML, ALL) and chronic leukemia (CML, CLL) group. Through the integration of the gene group selected according to the present invention to propose a new method for the production and analysis of DNA chip for leukemia subtype discrimination.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 백혈병 아형 판별 용 지표 유전자 도출 방법은 먼저, 백혈병 아형이 이미 알려진 다수의 환자 골수로부터 RNA를 추출하고, 상기 추출한 RNA로부터 cDNA를 수득하는 단계; 상기 수득한 cDNA에 시아닌 3-dCTP(cyanine 3 dCTP)과 시아닌 5-dCTP(cyanine 5-dCTP)로 형광 표지 시킨 것을 정상인의 골수 RNA로부터 얻은 cDNA와 함께 인간 유전자가 집적화 되어 있는 DNA 마이크로어레이에 상기한 백혈병 아형 별로 구분하여 혼성화시키는 단계; 상기 혼성화시킨 DNA 마이크로어레이 상에서 상기 시아닌 3-dCTP와 시아닌 5-dCTP가 발현하는 형광 강도에 따라 상기 인간 유전자의 발현 양상을 수치화하는 단계; 상기 수치화된 정도에 따라 상기 인간 유전자의 발현 양상이 소정의 오차 범위 내에서 동일한 환자들을 상기한 백혈병 아형 별로 구분하여 그룹화하는 단계; 및 상기 백혈병 아형 별로 그룹화한 환자들 집단에서 소정의 기준 이상으로 발현수준이 높은 인간 유전자를 도출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. In accordance with an embodiment of the present invention, a method for deriving an indicator gene for leukemia subtype determination according to an embodiment of the present invention comprises: extracting RNA from a plurality of patient bone marrow of which leukemia subtype is known, and obtaining cDNA from the extracted RNA. ; The cDNA obtained above was fluorescently labeled with cyanine 3-dCTP and cyanine 5-dCTP to cDNA obtained from a bone marrow RNA of a normal human and a DNA microarray in which a human gene was integrated. Hybridizing according to one leukemia subtype; Quantifying the expression pattern of the human gene according to the fluorescence intensity expressed by the cyanine 3-dCTP and the cyanine 5-dCTP on the hybridized DNA microarray; Dividing and grouping the patients with the same leukemia subtype according to the quantified degree of the expression patterns of the human genes within a predetermined error range; And deriving a human gene having a high expression level above a predetermined standard from a group of patients grouped by the leukemia subtype.

본 발명의 바람직한 다른 실시형태는 상술한 백혈병 아형 판별용 지표 유전자 도출 방법에 의해 도출된 것을 특징으로 하는 백혈병 아형 판별용 지표 유전자일 수 있고, 이러한 지표 유전자를 포함하는 백혈병 아형 판별용 DNA칩도 가능하다. Another preferred embodiment of the present invention may be an indicator gene for leukemia subtype determination, which is derived by the above-described method for deriving leukemia subtype discrimination, and a DNA chip for leukemia subtype determination including such an indicator gene is also possible. Do.

이하에서는, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시형태를 구체적으로 설명한다. Hereinafter, with reference to the accompanying drawings will be described in detail a preferred embodiment of the present invention.

백혈병은 유전적 변이에 의해 성숙하지 못한 채 지속적인 증식만을 거듭하는 혈액세포들의 전구세포의 암세포화에 의해 발생한다. 백혈병은 전 연령층에 걸쳐 발병하는데 기타 종양과는 달리 소아에서도 빈번히 발생하는 혈액종양이다. 또한 혈액을 구성하는 다양한 세포들에 따라 특이적인 유전적인 변이가 일어나기 때문에 아형의 진단에 따라 다양한 항백혈병 치료가 요구된다. 본 발명은 백혈병의 이러한 특징에 의거하여 각 아형별로 특이적인 공통적 유전적 발현 변화를 보여주는 표지 유전자군을 발굴하는 것에 주안점을 두었다. Leukemia is caused by cancer cell progenitors of blood cells that are only matured due to genetic variation and continue to proliferate. Leukemia is a blood tumor that occurs frequently in children, unlike other tumors. In addition, since specific genetic variation occurs in various cells constituting the blood, various anti-leukemia treatments are required according to the diagnosis of subtypes. The present invention focuses on the discovery of marker gene groups that show common genetic expression changes specific to each subtype based on this feature of leukemia.

이에, 본 발명에 따른 백혈병 아형 판별용 지표 유전자 도출 방법에서는 먼저, 백혈병 아형이 이미 알려진 다수의 환자 골수로부터 RNA를 추출하고, 상기 추출한 RNA로부터 cDNA를 수득하였다. 즉, 백혈병 아형이 이미 알려진 65명의 환자들(AML: 35명, ALL: 8명, CML: 13명, CLL: 9명)을 대상으로 하여, 이들로부터 얻은 골수시료의 RNA로부터 백혈병 아형 별로 각각의 cDNA를 얻었다. 본 발명은 이와 같이 백혈병 아형을 이미 알고 있는 환자들의 cDNA를 이용하여, 이것으로부터 각 아형 별로 특이하게 발현하는 유전자를 찾고자 함이다. Thus, in the method for deriving leukemia subtypes according to the present invention, RNA was first extracted from a large number of patient bone marrow of which leukemia subtypes were known, and cDNA was obtained from the extracted RNA. That is, in 65 patients with known leukemia subtypes (AML: 35, ALL: 8, CML: 13, and CLL: 9), each of the leukemia subtypes from the bone marrow samples obtained from them cDNA was obtained. The present invention seeks to find genes that are specifically expressed for each subtype from the cDNA of patients who already know leukemia subtypes.

이러한 본 발명에 있어서, 상기 백혈병 아형은 급성 골수성 백혈병(Acute Myelocytic Leukemia; AML), 급성 림프구성 백혈병(Acute Lymphocytic Leukemia; ALL), 만성 골수성 백혈병(Chronic Myelocytic Leukemia; CML) 및 만성 림프구성 백혈병(Chronic Lymphocytic Leukemia; CLL)의 4종류로 구분될 수 있거나 또는 급성 백혈병과 만성 백혈병의 2종류로 구분될 수도 있다. 즉, 본 발명은 상기한 4가 지 종류의 백혈병 아형 별로 특이하게 발현되는 지표 유전자를 찾아내는 것이 가능하고, 상기한 2가지 종류의 백혈병 아형 별로 특이하게 발현되는 지표 유전자를 찾아내는 것도 가능하다. In the present invention, the leukemia subtypes include Acute Myelocytic Leukemia (AML), Acute Lymphocytic Leukemia (ALL), Chronic Myelocytic Leukemia (CML) and Chronic Lymphocytic Leukemia (Chronic Leukemia). Lymphocytic Leukemia (CLL) can be divided into four types, or two types of acute and chronic leukemia. That is, the present invention can find indicator genes that are specifically expressed for each of the four types of leukemia subtypes, and can also find indicator genes that are specifically expressed for each of the two types of leukemia subtypes.

그리고는, 상기와 같이 수득한 cDNA에 시아닌 3-dCTP(cyanine 3 dCTP)과 시아닌 5-dCTP(cyanine 5-dCTP)로 형광 표지 시키고, 이것을 정상인의 골수 RNA로부터 얻은 cDNA와 함께 인간 유전자가 집적화 되어 있는 DNA 마이크로어레이에 혼성화 시킨다. 혼성화는 상기한 백혈병 아형 별로 구분하여 혼성화시키는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서, 상기와 같이 수득한 cDNA에 시아닌 3-dCTP과 시아닌 5-dCTP로 형광 표지 시키는 것은 혼성화에 의해 상기한 유전자가 발현되는 정도를 수치화하기 위한 것이다. Then, the cDNA obtained as described above was fluorescently labeled with cyanine 3-dCTP (cyanine 3 dCTP) and cyanine 5-dCTP (cyanine 5-dCTP), and human genes were integrated with cDNA obtained from normal bone marrow RNA. Hybridize to a DNA microarray. Hybridization is preferably to hybridize to the above-described leukemia subtypes. In the present invention, the fluorescent labeling of cDNA obtained as described above with cyanine 3-dCTP and cyanine 5-dCTP is for quantifying the degree of expression of the genes described above by hybridization.

또한, 이렇게 형광 표지된 cDNA를 인간 유전자가 집적화 되어 있는 DNA 마이크로어레이에 혼성화시키는 것은 백혈병 아형을 알고 있는 환자의 cDNA가 인간의 어떠한 유전자와 특이적으로 결합하는지 여부를 확인하기 위한 것이다. 이를 위하여, 상기 인간 유전자는 백혈병과 관련이 있거나 또는 관련이 없는 것으로 알려진 수천종류의 인간 유전자를 포함할 수 있고, 백혈병과 관련이 있는 것으로 알려진 다수의 서로 다른 인간 유전자인 것이 바람직하며, 본 발명자에 의해 개발된 8352개의 인간 유전자를 포함하는 DNA 칩을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명에서는 상기와 같이 형광 표지된 cDNA를 정상인의 골수 RNA로부터 얻어진 cDNA와 함께 인 간 유전자 8352개가 집적화되어 있는 DNA 마이크로어레이에 각각 혼성화하였고, 이렇게 혼성화 결과는 특수 스캐너(GenePix 4000B)를 이용하여 얻었으며, 각 아형별로 대표적인 혼성화 결과는 도 1a 내지 도 1d에 도시된 바와 같다. In addition, the hybridization of the fluorescently labeled cDNA to the DNA microarray in which the human genes are integrated is to confirm whether the cDNA of the patient who knows the leukemia subtype specifically binds to any human gene. To this end, the human gene may comprise thousands of human genes known to be associated with or not related to leukemia, and it is preferable that the human gene is a plurality of different human genes known to be associated with leukemia. It is more preferable to use a DNA chip containing 8352 human genes developed by. In the present invention, the fluorescently labeled cDNA was hybridized to a DNA microarray in which 8352 human genes were integrated together with the cDNA obtained from bone marrow RNA of a normal human. The hybridization results were obtained using a special scanner (GenePix 4000B). Representative hybridization results for each subtype are as shown in FIGS. 1A to 1D.

이어서, 본 발명은 상기와 같이 혼성화시킨 DNA 마이크로어레이 상에서 상기 시아닌 3-dCTP와 시아닌 5-dCTP가 발현하는 형광 강도에 따라 상기 인간 유전자의 발현 양상을 수치화하고, 상기 수치화된 정도에 따라 상기 인간 유전자의 발현 양상이 소정의 오차 범위 내에서 동일한 환자들을 상기한 백혈병 아형 별로 구분하여 그룹화하는 단계를 거친다. 백혈병 아형을 이미 알고 있는 환자의 cDNA와 결합하는 인간 유전자의 발현 양상을 수치화 하는 것은 상기 인간 유전자의 발현 양상이 동일하거나 비슷한 대상을 백혈병 아형 별로 구분하여 그룹화하기 위한 것이다. 또한, 이렇게 백혈병 아형 별로 그룹화하는 것은 동일한 백혈병 아형을 가진 대상이 어떠한 특정 인간 유전자와 관련이 있는가를 알아보기 위한 것이다. Next, the present invention quantifies the expression of the human gene according to the fluorescence intensity expressed by the cyanine 3-dCTP and the cyanine 5-dCTP on the hybridized DNA microarray as described above, and the human gene according to the quantified degree. Patients who have the same expression pattern within a predetermined error range are divided into groups according to the leukemia subtypes described above. To quantify the expression pattern of the human gene that binds to cDNA of a patient who already knows the leukemia subtype is to group the subjects with the same or similar expression pattern of the human gene by the leukemia subtype. In addition, grouping by leukemia subtypes is to determine which specific human genes are related to subjects with the same leukemia subtype.

이를 위하여, 본 발명은 상기한 도 1a 내지 도 1d에 나타난 바와 같은 혼성화 결과로부터 각 유전자들의 발현 수준을 수치화한 후 계층적 다발형성(hierarchical clustering) 분석법을 통하여 유전자 발현양상이 유사한 환자들 간에 그룹화를 시도하였으며, 그 결과는 도 2에 나타난 바와 같다. 여기서, 상기 인간 유전자의 발현 양상이 동일하거나 비슷한 정도는 특별히 제한되는 일이 없이 본 발명을 사용하는 관리자의 선택에 따라 달라질 수 있지만, 이를 위해 본 발명에서는 인간 유전자 의 발현 양상에 대한 객관적인 판단을 위하여 인간 유전자의 발현 양상을 수치화하였고, 이에 따라 상기 소정의 오차 범위는 0.0001% 내지 10% 범위내 인 것이 바람직하다. 가능하다면 상기한 범위보다 작은 오차 범위는 바람직하지만, 상기한 오차 범위를 벗어나는 경우, 유전자 발현 양상에 대한 비교가 부정확해 지기 때문이다. To this end, the present invention quantifies the expression level of each gene from the hybridization results as shown in Figures 1a to 1d above and then grouping among patients with similar gene expression patterns through hierarchical clustering analysis. An attempt was made and the results are shown in FIG. 2. Here, the same or similar degree of expression of the human gene may vary depending on the choice of a manager using the present invention without particular limitation, and for this purpose, in the present invention, for the purpose of objectively determining the expression of the human gene. The expression pattern of the human gene was quantified, and therefore, the predetermined error range is preferably in the range of 0.0001% to 10%. If possible, an error range smaller than the above range is preferable, but if it is outside the above error range, the comparison of gene expression patterns becomes inaccurate.

다음으로, 본 발명은 상기 백혈병 아형 별로 그룹화한 환자들 집단에서 소정의 기준 이상으로 발현수준이 높은 인간 유전자를 도출하는 것이다. 본 발명에서는 상기 그룹화한 환자들이 가지고 있는 백혈병 아형을 이미 알고 있고, 이로부터 발현수준이 높은 인간 유전자를 도출해냄으로써, 백혈병 아형 별로 특이적인 지표 유전자를 도출해 낼 수 있는 것이다. 상기 발현수준에 관한 소정의 기준이라함은 특별히 제한되는 일이 없이 본 발명을 사용하는 관리자의 선택에 따라 달라질 수 있지만, 이를 위해 본 발명에서는 인간 유전자의 높은 발현 수준에 대한 객관적인 판단을 위하여 인간 유전자의 발현 양상을 수치화하였고, 이에 따라 상기 소정의 기준이상이라 함은 상기 그룹화한 환자들 집단 중에서 발현수준이 높은 순으로 상위 1% 내지 50% 범위 내인 것이 바람직하다. 상기한 범위보다 작은 수준으로는 다양한 지표 유전자를 도출해 낼 수가 없고 이 경우 비정상적인 요인에 의한 발현 상의 오차를 걸러내지 못하는 단점이 있으며, 상기한 범위보다 큰 수준이면 백혈병 아형별로 특이하다고 볼 수 없기 때문이다. 본 발명에서는 예시적으로, 진스프링 (GeneSpring 6.1) 프로그램과 마이크로어레이의 심층적 분석(Significance Analysis of Microarray, SAM) 프로그램을 이용하여, 네 가지 각 아형별 환자집단에서 특이적으로 발현 수준이 높은 49개의 지표 유전자를 도출하였다(도 3a). Next, the present invention is to derive a human gene with a high expression level above a predetermined criterion in the patient group grouped by the leukemia subtype. In the present invention, the leukemia subtypes of the grouped patients are already known, and by deriving a human gene having a high expression level from the leukemia subtypes, specific marker genes for each leukemia subtype can be derived. The predetermined criterion for the expression level may vary depending on the manager's choice of using the present invention without particular limitation, but for this purpose, in the present invention, the human gene may be used for objective judgment on the high expression level of the human gene. The expression pattern of was quantified, and accordingly, above the predetermined criteria is preferably in the upper 1% to 50% range in the order of the highest expression level among the grouped patients. It is not possible to derive various indicator genes at a level smaller than the above range, and in this case, there is a disadvantage in that it is not possible to filter out an error in expression caused by abnormal factors. . In the present invention, by using the GeneSpring 6.1 program and the Significance Analysis of Microarray (SAM) program, for example, 49 high expression levels in four subgroups of patients can be used. Indicator genes were derived (FIG. 3A).

이와 더불어, 도 3b는 상기와 같은 본 발명에 의해 도출된 49개의 지표 유전자가 각 백혈병 유형별로 특이하게 발현하는 지표 유전자인지를 확인하기 위한 것으로써, 도 3a로부터 얻어진 유전자군에 대해서 역으로 본질구성분석법(Principle Component Analysis, PCA)을 이용하여 각 환자들에게 도입한 것이다. 그 결과는 도 3b에 나타난 바와 같이, 본질구성의 차이에 의하여 상기한 4종류의 백혈병 아형 별로 나뉘어짐을 확인할 수 있다. In addition, FIG. 3B is for confirming whether the 49 index genes derived by the present invention as described above are marker genes specifically expressed for each leukemia type, and are inversely related to the gene group obtained from FIG. 3A. Each patient was introduced using a Principle Component Analysis (PCA). As shown in Figure 3b, it can be confirmed that the four types of leukemia subtypes are divided by the difference in the constituent nature.

한편, 상술한 바와 같이 본 발명은 백혈병 환자의 아형을 구분하여 진단의 정확성을 보다 향상시킬 수 있는 유전자군에 관한 것으로써, 이를 위한 유전자군에는 하기의 표 1에 나타난 바와 같이 백혈병의 네 가지 아형 판별을 위한 49개의 유전자군이 가능하고, 하기의 표 2에 나타난 바와 같이 급성/만성을 판별해 주는 30개의 유전자군으로 구분될 수도 있다. AML, ALL, CML 및 CLL로 구분되는 백혈병 아형별로 본 발명을 수행하는 것과 마찬가지로, 급성과 만성으로 구분되는 백혈병 아형 집단 별로 본 발명을 수행하면 급성과 만성에 각각 특이적인 30개 유전자군을 얻을 수 있었고, 이들 역시 두 집단 간 확연한 구분 능력이 있음을 도 4a와 4b에서 확인할 수 있다. On the other hand, the present invention relates to a group of genes that can further improve the accuracy of diagnosis by distinguishing subtypes of leukemia patients, the gene group for this as shown in Table 1 below four subtypes of leukemia 49 gene groups for discrimination are possible, and as shown in Table 2 below, may be divided into 30 gene groups for discriminating acute / chronic. Similar to carrying out the present invention for each leukemia subtype divided into AML, ALL, CML and CLL, the present invention can be obtained for each of the acute and chronic subtypes of leukemia subtypes. 4A and 4B, these groups also have a clear distinction between the two groups.

[표 1: 백혈병의 4가지 아형별 특이 49개 유전자군]Table 1: 49 Genotypes Specific to Four Subtypes of Leukemia

AML 환자에서 특이적으로 과발현 하는 유전자군Genetic Overexpression Specific to AML Patients Family with sequence similarity 20, member BFamily with sequence similarity 20, member B CalumeninCalumenin c-kit protooncogenec-kit protooncogene Mesoderm specific transcript homolog (mouse)Mesoderm specific transcript homolog (mouse) NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1, subcomplex unknown, 2, 14.5kDaNADH dehydrogenase (ubiquinone) 1, subcomplex unknown, 2, 14.5kDa Dendritic cell proteinDendritic cell protein Lactate dehydrogenase BLactate dehydrogenase B Myristoylated alanine-rich protein kinase C substrateMyristoylated alanine-rich protein kinase C substrate Non-metastatic cells 1, protein (NM23A) expressed inNon-metastatic cells 1, protein (NM23A) expressed in Mitochondrial ribosomal protein L12Mitochondrial ribosomal protein L12 Arginyl-tRNA synthetaseArginyl-tRNA synthetase TAF9 RNA polymerase II, TATA box binding protein (TBP)-associated factor, 32kDaTAF9 RNA polymerase II, TATA box binding protein (TBP) -associated factor, 32kDa Kelch repeat and BTB (POZ) domain containing 10Kelch repeat and BTB (POZ) domain containing 10 Interleukin 1 receptor accessory proteinInterleukin 1 receptor accessory protein

ALL 환자에서 특이적으로 과발현 하는 유전자군Genetic group specifically overexpressed in ALL patients Stromal cell-derived factor 2-like 1Stromal cell-derived factor 2-like 1 Membrane metallo-endopeptidase (neutral endopeptidase, enkephalinase, CALLA, CD10)Membrane metallo-endopeptidase (neutral endopeptidase, enkephalinase, CALLA, CD10) EST (GenBank No.: AA489633)EST (GenBank No .: AA489633) EPH receptor B4EPH receptor B4 EST (GenBank No.: R06446))EST (GenBank No .: R06446)) Interleukin 7 receptorInterleukin 7 receptor CASP2 and RIPK1 domain containing adaptor with death domainCASP2 and RIPK1 domain containing adapter with death domain Nuclear receptor interacting protein 1Nuclear receptor interacting protein 1

CML 환자에서 특이적으로 과발현 하는 유전자군Genetic Overexpression Specific to CML Patients RAB31, member RAS oncogene familyRAB31, member RAS oncogene family Myocilin, trabecular meshwork inducible glucocorticoid responseMyocilin, trabecular meshwork inducible glucocorticoid response Annexin A3Annexin A3 TSPY-like 2TSPY-like 2 Grancalcin, EF-hand calcium binding proteinGrancalcin, EF-hand calcium binding protein Mannosidase, alpha, class 2A, member 1Mannosidase, alpha, class 2A, member 1 Transcobalamin I (vitamin B12 binding protein, R binder family)Transcobalamin I (vitamin B12 binding protein, R binder family) Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 (biliary glycoprotein)Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 (biliary glycoprotein) Amino-terminal enhancer of splitAmino-terminal enhancer of split Copine IIICopine iii Cytidine deaminaseCytidine deaminase EST (GenBank No.: R32848)EST (GenBank No .: R32848)

CLL 환자에서 특이적으로 과발현 하는 유전자군Genetic Overexpression Specific to CLL Patients B-cell translocation gene 1, anti-proliferativeB-cell translocation gene 1, anti-proliferative Cathepsin HCathepsin h Transmembrane protein 1Transmembrane protein 1 Hypothetical protein FLJ35036Hypothetical protein FLJ35036 ST6 beta-galactosamide alpha-2,6-sialyltranferase 1ST6 beta-galactosamide alpha-2,6-sialyltranferase 1 Membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 1Membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 1 Actin binding LIM protein 1Actin binding LIM protein 1 Pim-2 oncogenePim-2 oncogene Major histocompatibility complex, class II, DM betaMajor histocompatibility complex, class II, DM beta EST (GenBank No.: T63324)EST (GenBank No .: T63324) Actin, alpha 2, smooth muscle, aortaActin, alpha 2, smooth muscle, aorta Spi-B transcription factor (Spi-1/PU.1 related)Spi-B transcription factor (Spi-1 / PU.1 related) Integrin, beta 7Integrin, beta 7 NACHT, leucine rich repeat and PYD (pyrin domain) containing 1NACHT, leucine rich repeat and PYD (pyrin domain) containing 1 RecQ protein-like (DNA helicase Q1-like)RecQ protein-like (DNA helicase Q1-like)

[표 2: 급성/만성 백혈병 환자에서 특이적으로 발현하는 30개 유전자군]Table 2: 30 gene groups specifically expressed in patients with acute / chronic leukemia

급성 백혈병 환자에서 특이적으로 과발현 하는 유전자군Genetic Overexpression in Patients with Acute Leukemia Prominin 1Prominin 1 Epithelial membrane protein 1Epithelial membrane protein 1 Heat shock 60kDa protein 1 (chaperonin)Heat shock 60kDa protein 1 (chaperonin) Fibroblast growth factor (acidic) intracellular binding proteinFibroblast growth factor (acidic) intracellular binding protein Lactate dehydrogenase BLactate dehydrogenase B Major histocompatibility complex, class II, DO betaMajor histocompatibility complex, class II, DO beta RuvB-like 1 (E. coli)RuvB-like 1 (E. coli) Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein, epsilon polypeptideTyrosine 3-monooxygenase / tryptophan 5-monooxygenase activation protein, epsilon polypeptide SRY (sex determining region Y)-box 4SRY (sex determining region Y) -box 4 NudE nuclear distribution gene E homolog 1 (A. nidulans)NudE nuclear distribution gene E homolog 1 (A. nidulans) Vacuolar protein sorting 13D (yeast)Vacuolar protein sorting 13D (yeast) EST (GenBank No.: R37224)EST (GenBank No .: R37224) Chromosome 5 open reading frame 13Chromosome 5 open reading frame 13 Fms-related tyrosine kinase 3Fms-related tyrosine kinase 3 CD99 antigenCD99 antigen V-myb myeloblastosis viral oncogene homolog (avian)V-myb myeloblastosis viral oncogene homolog (avian) LATS, large tumor suppressor, homolog 2 (Drosophila)LATS, large tumor suppressor, homolog 2 (Drosophila) IGF-II mRNA-binding protein 2IGF-II mRNA-binding protein 2

만성 백혈병 환자에서 특이적으로 과발현 하는 유전자군Genetic Overexpression in Patients with Chronic Leukemia EST (GenBank No.: BG875391)EST (GenBank No .: BG875391) Sema domain, seven thrombospondin repeats (type 1 and type 1-like), transmembrane domain (TM) and short cytoplasmic domain, (semaphorin) 5ASema domain, seven thrombospondin repeats (type 1 and type 1-like), transmembrane domain (TM) and short cytoplasmic domain, (semaphorin) 5A Baculoviral IAP repeat-containing 3Baculoviral IAP repeat-containing 3 SLAM family member 7SLAM family member 7 Cytoplasmic FMR1 interacting protein 2Cytoplasmic FMR1 interacting protein 2 Phosphodiesterase 4D interacting protein (myomegalin)Phosphodiesterase 4D interacting protein (myomegalin) TERF1 (TRF1)-interacting nuclear factor 2TERF1 (TRF1) -interacting nuclear factor 2 Cofactor required for Sp1 transcriptional activation, subunit 3, 130kDaCofactor required for Sp1 transcriptional activation, subunit 3, 130 kDa Calpain 3, (p94)Calpain 3, (p94) Cadherin 16, KSP-cadherinCadherin 16, KSP-cadherin Amylo-1, 6-glucosidase, 4-alpha-glucanotransferase (glycogen debranching enzyme, glycogen storage disease type III)Amylo-1, 6-glucosidase, 4-alpha-glucanotransferase (glycogen debranching enzyme, glycogen storage disease type III) Calcium/calmodulin-dependent protein kinase ICalcium / calmodulin-dependent protein kinase I

본 발명은 상술한 바와 같은 백혈병 아형 판별용 지표 유전자 도출 방법에 의해 도출된 것을 특징으로 하는 백혈병 아형 판별용 지표 유전자일 수 있고, 이러한 백혈병 아형 판별용 지표 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 백혈병 아형 판별용 DNA칩이나 키트로 제작될 수 있다. 상기한 지표 유전자들이 백혈병 아형별로 집적화되어 있는 DNA칩에 대상 환자의 RNA 또는 cDNA를 혼성화시키고, 발현되는 양상을 조사함으로써, 상기 대상 환자가 어떠한 백혈병 아형을 가지고 있는지 여부를 간단하게 진단할 수 있는 것이다. 이러한 DNA칩이나 키트는 상기한 본 발명에 따른 지표 유전자를 포함하는 것이면 이 기술분야에서 널리 알려진 다양한 방법에 의해 제조될 수 있음은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 자에게 명백한 사실이다.The present invention may be an indicator gene for leukemia subtype determination, which is derived by the method for deriving leukemia subtype discrimination index gene as described above, and the leukemia subtype discrimination includes the leukemia subtype discrimination index gene. It can be produced as a DNA chip or kit. By integrating the RNA genes or cDNA of the patient on the DNA chips integrated with the leukemia subtypes and examining the expression patterns, the leukemia subtypes can be easily diagnosed. . It will be apparent to those skilled in the art that such a DNA chip or kit can be prepared by various methods well known in the art as long as it contains the above-described indicator gene according to the present invention.

이하에서는 본 발명의 바람직한 하나의 실시형태를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다. 본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허 청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.Hereinafter, one preferred embodiment of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. The invention can be better understood by the following examples, which are intended for the purpose of illustration of the invention and are not intended to limit the scope of protection defined by the appended claims.

실시예1: 환자 sample에서 골수 채취Example 1 Bone Marrow Collection from Patient Samples

본 발명은 이미 아형을 알고 있는 65명의 환자들 (AML: 35명, ALL: 8명, CML: 13명, CLL: 9명)로부터 얻은 골수시료를 획득하여 -70℃에서 보관하였으며, 본 발명에 사용된 골수는 전남대학교 병원과 협의하에 채취하여 사용하였다.The present invention was obtained and stored at -70 ℃ bone marrow samples obtained from 65 patients (AML: 35, ALL: 8, CML: 13, CLL: 9) already know the subtype The bone marrow used was collected and used in consultation with Chonnam National University Hospital.

실시예2: 채취한 골수로부터 RNA 추출Example 2 RNA Extraction from Collected Bone Marrow

이미 아형을 알고 있는 환자에서 추출한 골수로부터 RNA를 추출하고, 추출된 소량의 RNA를 증폭의 방법을 통하여 실험에 충분한 양으로 증폭을 진행한 다음, 증폭된 aRNA(amplified RNA)를 이용하여, 올리고(T7 primer)를 프라이머로 하고, 역전사 키트를 이용하여 시아닌 3-dCTP(cyanine 3 dCTP, Amersham, USA)과 시아닌 5-dCTP(cyanine 5-dCTP, Amersham, USA)로 42℃에서 두시간 동안 역전사 반응 시켜서, 형광표지된 cDNA를 수득하였다. RNA is extracted from bone marrow extracted from a patient who already knows the subtype, and a small amount of the extracted RNA is amplified in an amount sufficient for the experiment through the amplification method, and then amplified using amplified aRNA (amplified RNA). T7 primer) as a primer, and reverse transcription using cyanine 3-dCTP (cyanine 3 dCTP, Amersham, USA) and cyanine 5-dCTP (cyanine 5-dCTP, Amersham, USA) for 2 hours using a reverse transcription kit. Fluorescently labeled cDNA was obtained.

실시예3: 혼성화반응Example 3 Hybridization Reaction

한편, 형광표지된 cDNA와 혼성화 반응을 할 수 있는 유전자의 검출을 위하여 유전자를 DNA 칩(Platinum BiochipTM Human 8.3K microarray, Genocheck, 한국)에 적용하고 혼성화 반응을 수행하였다. 즉, 정상인의 골수 RNA로부터 얻어진 cDNA를 열변성을 시킨 다음, 에탄올 침전을 시키고 혼성화 완충용액에 용해시켜서 DNA 칩 에 적용한 다음, 커버글라스를 덮고 밀봉을 하여, 62℃의 조건으로 12시간 동안 혼성화 시켰다. 혼성화된 마이크로어레이를 65℃ 조건으로 2분동안 0.1%(w/v) SDS를 함유한 2XSSC 로 세척하고, 상온에서 1X SSC로 2분간 세척한 다음 최종적으로 상온에서 0.2X SSC로 2분간 세척하고, 저속으로 원심분리하여 건조하였다.Meanwhile, in order to detect a gene capable of hybridization with the fluorescently labeled cDNA, the gene was applied to a DNA chip (Platinum BiochipTM Human 8.3K microarray, Genocheck, Korea) and hybridization reaction was performed. That is, cDNA obtained from normal bone marrow RNA was thermally denatured, ethanol precipitated, dissolved in hybridization buffer solution, applied to DNA chip, cover glass and sealed, and hybridized for 12 hours under 62 ° C. . The hybridized microarray was washed with 2XSSC containing 0.1% (w / v) SDS for 2 minutes at 65 ° C, 2 minutes with 1X SSC at room temperature, and finally 2 minutes with 0.2X SSC at room temperature. It was dried by centrifugation at low speed.

이렇게 혼성화 결과는 특수 스캐너(GenePix 4000B)를 이용하여 얻었으며, 각 아형별로 대표적인 혼성화 결과는 도 1a 내지 도 1d에 도시된 바와 같다. 도 1a 내지 도 1d는 본 발명에 따라 백혈병 환자의 골수에서 추출한 RNA로부터 형광표지된 cDNA를 합성하고, 상기 cDNA를 백혈병 아형 별로 다양한 인간 유전자가 집적되어 있는 DNA chip에 혼성화시킨 결과를 예시적으로 나타내는 사진이다. 그 중에서, 도 1a는 AML 아형에 대한 것이고, 도 1b는 ALL 아형에 대한 것이며, 도 1c는 CML 아형에 대한 것이고, 도 1d는 CLL 아형에 대한 것이다. The hybridization results were obtained using a special scanner (GenePix 4000B), and representative hybridization results for each subtype are as shown in FIGS. 1A to 1D. 1A to 1D illustrate a result of synthesizing fluorescently labeled cDNA from RNA extracted from bone marrow of a leukemia patient according to the present invention, and hybridizing the cDNA to a DNA chip in which various human genes are integrated for each leukemia subtype. It is a photograph. Among them, FIG. 1A is for the AML subtype, FIG. 1B is for the ALL subtype, FIG. 1C is for the CML subtype, and FIG. 1D is for the CLL subtype.

실시예4: 데이터 분석Example 4 Data Analysis

시아닌 3-dCTP(cyanine 3 dCTP, Amersham, USA)과 시아닌 5-dCTP(cyanine 5-dCTP, Amersham, USA)로 각각 표지된 혼성화 신호는 평판 스캐너 (GenePix Scanner 4000B, Axon Instrument Inc., USA)를 이용하여 각각 532, 635nm의 파장에서 측정하고, 측정된 신호를 이미지 분석시스템(GenePix Pro 4.0, Axon Instrument Inc., USA)으로 분석하였다. 이때, 각 DNA 점의 형광강도(점 내부에 존재하는 개별 픽셀의 강도의 평균)는 국지적 평균 배경 삼각법(local mean background substraction) 을 이용하여 계산하였고, 표본 사이의 유전자 발현의 전체적 차이는 대조군에서 측정된 값을 1.0으로 성절하고, 이에 대한 상대적인 값으로 환산하였다(참조: Yang et al., Nucleic Acids Res., 30(4):e15, 2002).Hybridization signals labeled with cyanine 3-dCTP (cyanine 3-dCTP, Amersham, USA) and cyanine 5-dCTP (cyanine 5-dCTP, Amersham, USA), respectively, used a flatbed scanner (GenePix Scanner 4000B, Axon Instrument Inc., USA). The measured signals were measured at wavelengths of 532 and 635 nm, respectively, and analyzed by an image analysis system (GenePix Pro 4.0, Axon Instrument Inc., USA). In this case, the fluorescence intensity of each DNA point (average of the intensity of individual pixels within the point) was calculated using local mean background substraction, and the overall difference in gene expression between samples was measured in the control group. The calculated value was converted to 1.0 and converted to a relative value thereof (Yang et al., Nucleic Acids Res., 30 (4): e15, 2002).

각 유전자들의 발현 수준을 수치화한 후 계층적 다발형성 (hierarchical clustering) 분석법을 통하여 유전자 발현양상이 유사한 환자들 간에 그룹화를 시도하였다. 그 결과는 도 2에 나타난 바와 같다. 도 2는 본 발명에 따라 DNA chip에 혼성화시킨 결과를 계층적 다발형성(hierarchical clustering) 분석법을 통하여 그룹화한 결과를 예시적으로 나타내는 그래프이다. After quantifying the expression level of each gene, grouping was performed among patients with similar gene expression patterns through hierarchical clustering analysis. The result is as shown in FIG. FIG. 2 is a graph exemplarily showing the results of grouping the results of hybridization to a DNA chip according to the present invention through a hierarchical clustering analysis. FIG.

이어서, 상기와 같은 그룹화 결과 네 가지 각 아형별 환자집단에서 특이적으로 발현 수준이 높은 49개의 지표 유전자를 도출하였다(도 3a, 표 1). 도 3a는 본 발명에 따라 4가지 백혈병 아형 별로 그룹화한 결과로부터 심층적 분석을 통하여 발현 수준이 높은 인간 유전자를 도출한 결과를 예시적으로 나타내는 평면 그래프이고, 도 3b는 도 3a의 결과에 따라 도출한 발현 수준이 높은 인간 유전자를 본질구성분석법(Principle Component Analysis, PCA)을 통하여 환자들에게 도입한 결과를 예시적으로 나타내는 3차원 그래프이다. 여기서, 도 3b는 도 3a로부터 얻어진 유전자군을 역으로 본질구성분석법 (Principle Component Analysis, PCA)을 이용하여 각 환자들에게 도입하였을 경우 그 차이에 의하여 네 집단으로 나뉘어짐을 보여준다.Subsequently, as a result of the grouping, 49 index genes with high expression levels were specifically derived from each of four subtypes (FIG. 3A and Table 1). FIG. 3A is a flat graph illustrating a result of deriving a human gene having a high expression level through in-depth analysis from the results grouped by four leukemia subtypes according to the present invention, and FIG. 3B is derived according to the result of FIG. 3A. Three-dimensional graphs exemplarily show the results of introducing human genes with high expression levels into patients through Principle Component Analysis (PCA). Here, FIG. 3B shows that the gene groups obtained from FIG. 3A are divided into four groups by the difference when introduced into each patient by using the Principle Component Analysis (PCA).

한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진자에게 명백한 것이다. On the other hand, while the present invention has been shown and described with respect to certain preferred embodiments, the invention is variously modified and modified without departing from the technical features or fields of the invention provided by the claims below It will be apparent to those skilled in the art that such changes can be made.

상술한 바와 같이 본 발명에 따르면, 백혈병(leukemia) 환자의 골수로부터 RNA를 추출하는 단계; 상기 추출한 RNA로부터 형광표지된 cDNA를 합성하는 단계; 상기 cDNA를 키트에 포함되어 있는 백혈병의 아형을 판별할 수 있는 DNA chip 에 적용하여 혼성화시키는 단계; 및 상기 결합 여부를 확인해서 백혈병의 아형을 판별하는 단계;를 포함하여 이루어지는 백혈병 아형 판별을 제공할 수 있다. According to the present invention as described above, the step of extracting RNA from the bone marrow of leukemia patients; Synthesizing fluorescently labeled cDNA from the extracted RNA; Hybridizing the cDNA to a DNA chip capable of determining a subtype of leukemia included in the kit; And determining a subtype of leukemia by checking whether the binding is performed. The leukemia subtype determination may be provided.

이러한 본 발명에 의하는 경우, 백혈병 아형 별로 특이하게 발현되는 다수의 지표 유전자군을 도출해 낼 수 있고, 이러한 지표 유전자군을 이용하여 백혈병 환자의 정확한 백혈병 아형 (AML, ALL, CML, CLL)을 진단할 수 있는 효과가 있다. According to the present invention, it is possible to derive a large number of indicator gene groups that are specifically expressed by leukemia subtypes, and to diagnose accurate leukemia subtypes (AML, ALL, CML, CLL) of leukemia patients by using such indicator gene groups. It can work.

그리고, 본 발명에 의해 AML, ALL, CML, CLL과 같은 백혈병 환자 전반에 걸쳐 그 아형을 진단할 수 있는 유전자군과 발현비교 방법을 제시함으로써, 기존의 단일지표 검사에서 올수 있는 잘못된 진단 가능성을 낮출 수가 있다. 또한, 본 발명은 기존 검사방법에 추가적으로 적용하였을 때 진단의 정확성을 더욱 향상시킬 수 있다. 아울러 본 발명은 급성 백혈병 (AML, ALL)과 만성 백혈병 (CML, CLL) 집단을 구분해 줄 수 있는 유전자군을 따로 선별하여 제공할 수도 있다. 결국, 본 발명에 따라 선별된 유전자군의 집적화를 통해 백혈병 아형 판별용 DNA 칩의 제작과 분석에 대한 새로운 방법을 제시할 수가 있다.In addition, by presenting a gene group and expression comparison method for diagnosing subtypes of leukemia patients such as AML, ALL, CML, and CLL by the present invention, it is possible to lower the possibility of false diagnosis that can come from the existing single indicator test. There is a number. In addition, the present invention can further improve the accuracy of diagnosis when additionally applied to the existing test method. In addition, the present invention may separately provide a group of genes that can distinguish between acute leukemia (AML, ALL) and chronic leukemia (CML, CLL) population. As a result, it is possible to propose a new method for the fabrication and analysis of DNA chips for leukemia subtype determination through the integration of selected gene groups according to the present invention.

Claims (9)

삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 백혈병 아형이 이미 알려진 다수의 환자 골수로부터 RNA를 추출하고, 상기 추출한 RNA로부터 cDNA를 수득하는 단계;Extracting RNA from a plurality of patient bone marrow of which leukemia subtypes are already known, and obtaining cDNA from the extracted RNA; 상기 수득한 cDNA에 시아닌 3-dCTP(cyanine 3 dCTP)과 시아닌 5-dCTP(cyanine 5-dCTP)로 형광 표지 시킨 것을 정상인의 골수 RNA로부터 얻은 cDNA와 함께 인간 유전자가 집적화 되어 있는 DNA 마이크로어레이에 상기한 백혈병 아형 별로 구분하여 혼성화시키는 단계;The cDNA obtained above was fluorescently labeled with cyanine 3-dCTP and cyanine 5-dCTP to cDNA obtained from a bone marrow RNA of a normal human and a DNA microarray in which a human gene was integrated. Hybridizing according to one leukemia subtype; 상기 혼성화시킨 DNA 마이크로어레이 상에서 상기 시아닌 3-dCTP와 시아닌 5-dCTP가 발현하는 형광 강도에 따라 상기 인간 유전자의 발현 양상을 수치화하는 단계;Quantifying the expression pattern of the human gene according to the fluorescence intensity expressed by the cyanine 3-dCTP and the cyanine 5-dCTP on the hybridized DNA microarray; 상기 수치화된 정도에 따라 상기 인간 유전자의 발현 양상이 0.0001% 내지 10% 범위 내에서 동일한 환자들을 상기한 백혈병 아형별로 구분하여 그룹화하는 단계; 및Grouping the same patients by the leukemia subtypes according to the quantified degree within the range of 0.0001% to 10% of the expression patterns of the human genes; And 상기 백혈병 아형 별로 그룹화한 환자들 집단 중에서 발현수준이 높은 순으로 상위 1% 내지 50% 범위 내에 속하는 인간 유전자를 도출하는 단계를 포함하는 백혈병 아형 판별용 지표 유전자 도출 방법에 의해 도출된 백혈병 아형 판별용 지표 유전자로써,Leukemia subtype determination for derivation by the leukemia subtype discrimination indicator gene derivation method comprising the step of deriving a human gene belonging to the upper 1% to 50% range in the order of the highest expression level among the patients grouped by the leukemia subtype As an indicator gene, 급성 골수성 백혈병(AML) 아형 판별용 지표 유전자는 Family with sequence similarity 20, member B 또는 Calumenin 또는 c-kit protooncogene 또는 Mesoderm specific transcript homolog (mouse) 또는 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1, subcomplex unknown, 2, 14.5kDa 또는 Dendritic cell protein 또는 Lactate dehydrogenase B 또는 Myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate 또는 Non-metastatic cells 1, protein (NM23A) expressed in 또는 Mitochondrial ribosomal protein L12 또는 Arginyl-tRNA synthetase 또는 Kelch repeat and BTB (POZ) domain containing 10 또는 Interleukin 1 receptor accessory protein이고, 급성 림프구성 백혈병(ALL) 아형 판별용 지표 유전자는 Stromal cell-derived factor 2-like 1 또는 EST(GenBank No.: AA489633) 또는 EPH receptor B4 또는 EST (GenBank No.: R06446) 또는 Interleukin 7 receptor 또는 CASP2 and RIPK1 domain containing adaptor with death domain 또는 Nuclear receptor interacting protein 1이고, 만성 골수성 백혈병(CML) 아형 판별용 지표 유전자는 RAB31, member RAS oncogene family 또는 Myocilin, trabecular meshwork inducible glucocorticoid response 또는 Annexin A3 또는 TSPY-like 2 또는 Grancalcin, EF-hand calcium binding protein 또는 Mannosidase, alpha, class 2A, member 1 또는 Transcobalamin I (vitamin B12 binding protein, R binder family) 또는 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 (biliary glycoprotein) 또는 Amino-terminal enhancer of split 또는 Copine III 또는 Cytidine deaminase 또는 EST (GenBank No.: R32848)이고, 만성 림프구성 백혈병(CLL) 아형 판별용 지표 유전자는 B-cell translocation gene 1, anti-proliferative 또는 Cathepsin H 또는 Transmembrane protein 1 또는 Hypothetical protein FLJ35036 또는 ST6 beta-galactosamide alpha-2,6-sialyltranferase 1 또는 Membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 1 또는 Actin binding LIM protein 1 또는 Pim-2 oncogene 또는 Major histocompatibility complex, class II, DM beta 또는 EST (GenBank No.: T63324) 또는 Actin, alpha 2, smooth muscle, aorta 또는 Spi-B transcription factor (Spi-1/PU.1 related) 또는 Integrin, beta 7 또는 NACHT, leucine rich repeat and PYD (pyrin domain) containing 1 또는 RecQ protein-like (DNA helicase Q1-like)인 것을 특징으로 하는 백혈병 아형 판별용 지표 유전자.Indicator genes for determining acute myeloid leukemia (AML) subtypes are Family with sequence similarity 20, member B or Calumenin or c-kit protooncogene or Mesoderm specific transcript homolog (mouse) or NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1, subcomplex unknown, 2, 14.5 kDa Or Dendritic cell protein or Lactate dehydrogenase B or Myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate or Non-metastatic cells 1, protein (NM23A) expressed in or Mitochondrial ribosomal protein L12 or Arginyl-tRNA synthetase or Kelch repeat and BTB (POZ) domain containing 10 or Interleukin 1 receptor accessory protein, and the indicator gene for discriminating acute lymphocytic leukemia (ALL) subtype is Stromal cell-derived factor 2-like 1 or EST (GenBank No .: AA489633) or EPH receptor B4 or EST (GenBank No. R06446) or Interleukin 7 receptor or CASP2 and RIPK1 domain containing adapter with death domain or Nuclear receptor interacting protein 1, Indicator genes for discriminating sex myeloid leukemia (CML) subtypes are RAB31, member RAS oncogene family or Myocilin, trabecular meshwork inducible glucocorticoid response or Annexin A3 or TSPY-like 2 or Grancalcin, EF-hand calcium binding protein or Mannosidase, alpha, class 2A , member 1 or Transcobalamin I (vitamin B12 binding protein, R binder family) or Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 (biliary glycoprotein) or Amino-terminal enhancer of split or Copine III or Cytidine deaminase or EST (GenBank No .: R32848 And marker genes for the identification of chronic lymphocytic leukemia (CLL) subtypes are B-cell translocation gene 1, anti-proliferative or Cathepsin H or Transmembrane protein 1 or Hypothetical protein FLJ35036 or ST6 beta-galactosamide alpha-2,6-sialyltranferase 1 Or Membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 1 or Actin binding LIM protein 1 or Pim-2 oncogene or Major histocompatibili ty complex, class II, DM beta or EST (GenBank No .: T63324) or Actin, alpha 2, smooth muscle, aorta or Spi-B transcription factor (Spi-1 / PU.1 related) or Integrin, beta 7 or NACHT , leucine rich repeat and PYD (pyrin domain) containing 1 or RecQ protein-like (DNA helicase Q1-like) indicator gene for leukemia subtype discrimination, characterized in that. 백혈병 아형이 이미 알려진 다수의 환자 골수로부터 RNA를 추출하고, 상기 추출한 RNA로부터 cDNA를 수득하는 단계;Extracting RNA from a plurality of patient bone marrow of which leukemia subtypes are already known, and obtaining cDNA from the extracted RNA; 상기 수득한 cDNA에 시아닌 3-dCTP(cyanine 3 dCTP)과 시아닌 5-dCTP(cyanine 5-dCTP)로 형광 표지 시킨 것을 정상인의 골수 RNA로부터 얻은 cDNA와 함께 인간 유전자가 집적화 되어 있는 DNA 마이크로어레이에 상기한 백혈병 아형 별로 구분하여 혼성화시키는 단계;The cDNA obtained above was fluorescently labeled with cyanine 3-dCTP and cyanine 5-dCTP to cDNA obtained from a bone marrow RNA of a normal human and a DNA microarray in which a human gene was integrated. Hybridizing according to one leukemia subtype; 상기 혼성화시킨 DNA 마이크로어레이 상에서 상기 시아닌 3-dCTP와 시아닌 5-dCTP가 발현하는 형광 강도에 따라 상기 인간 유전자의 발현 양상을 수치화하는 단계;Quantifying the expression pattern of the human gene according to the fluorescence intensity expressed by the cyanine 3-dCTP and the cyanine 5-dCTP on the hybridized DNA microarray; 상기 수치화된 정도에 따라 상기 인간 유전자의 발현 양상이 0.0001% 내지 10% 범위 내에서 동일한 환자들을 상기한 백혈병 아형별로 구분하여 그룹화하는 단계; 및Grouping the same patients by the leukemia subtypes according to the quantified degree within the range of 0.0001% to 10% of the expression patterns of the human genes; And 상기 백혈병 아형 별로 그룹화한 환자들 집단 중에서 발현수준이 높은 순으로 상위 1% 내지 50% 범위 내에 속하는 인간 유전자를 도출하는 단계를 포함하는 백혈병 아형 판별용 지표 유전자 도출 방법에 의해 도출된 백혈병 아형 판별용 지표 유전자로써,Leukemia subtype determination for derivation by the leukemia subtype discrimination indicator gene derivation method comprising the step of deriving a human gene belonging to the upper 1% to 50% range in the order of the highest expression level among the patients grouped by the leukemia subtype As an indicator gene, 급성 백혈병 아형 판별용 지표 유전자는 Prominin 1 또는 Epithelial membrane protein 1 또는 Heat shock 60kDa protein 1 (chaperonin) 또는 Fibroblast growth factor (acidic) intracellular binding protein 또는 Lactate dehydrogenase B 또는 Major histocompatibility complex, class II, DO beta 또는 RuvB-like 1 (E. coli) 또는 Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein, epsilon polypeptide 또는 SRY (sex determining region Y)-box 4 또는 NudE nuclear distribution gene E homolog 1 (A. nidulans) 또는 Vacuolar protein sorting 13D (yeast) 또는 EST (GenBank No.: R37224) 또는 Chromosome 5 open reading frame 13 또는 Fms-related tyrosine kinase 3 또는 CD99 antigen 또는 V-myb myeloblastosis viral oncogene homolog (avian) 또는 LATS, large tumor suppressor, homolog 2 (Drosophila) 또는 IGF-II mRNA-binding protein 2이고, 만성 백혈병 아형 판별용 지표 유전자는 EST (GenBank No.: BG875391) 또는 Sema domain, seven thrombospondin repeats (type 1 and type 1-like), transmembrane domain (TM) and short cytoplasmic domain, (semaphorin) 5A 또는 Baculoviral IAP repeat-containing 3 또는 SLAM family member 7 또는 Cytoplasmic FMR1 interacting protein 2 또는 Phosphodiesterase 4D interacting protein (myomegalin) 또는 TERF1 (TRF1)-interacting nuclear factor 2 또는 Cofactor required for Sp1 transcriptional activation, subunit 3, 130kDa 또는 Calpain 3, (p94) 또는 Cadherin 16, KSP-cadherin 또는 Amylo-1, 6-glucosidase, 4-alpha-glucanotransferase (glycogen debranching enzyme, glycogen storage disease type III) 또는 Calcium/calmodulin-dependent protein kinase I인 것을 특징으로 하는 백혈병 아형 판별용 지표 유전자.Indicator genes for identifying acute leukemia subtypes are Prominin 1 or Epithelial membrane protein 1 or Heat shock 60kDa protein 1 (chaperonin) or Fibroblast growth factor (acidic) intracellular binding protein or Lactate dehydrogenase B or Major histocompatibility complex, class II, DO beta or RuvB -like 1 (E. coli) or Tyrosine 3-monooxygenase / tryptophan 5-monooxygenase activation protein, epsilon polypeptide or SRY (sex determining region Y) -box 4 or NudE nuclear distribution gene E homolog 1 (A. nidulans) or Vacuolar protein sorting 13D (yeast) or EST (GenBank No .: R37224) or Chromosome 5 open reading frame 13 or Fms-related tyrosine kinase 3 or CD99 antigen or V-myb myeloblastosis viral oncogene homolog (avian) or LATS, large tumor suppressor, homolog 2 (Drosophila) or IGF-II mRNA-binding protein 2, and the marker gene for discriminating chronic leukemia subtypes is EST (GenBank No .: BG875391) or Sema domain, seven thrombo spondin repeats (type 1 and type 1-like), transmembrane domain (TM) and short cytoplasmic domain, (semaphorin) 5A or Baculoviral IAP repeat-containing 3 or SLAM family member 7 or Cytoplasmic FMR1 interacting protein 2 or Phosphodiesterase 4D interacting protein ( myomegalin) or TERF1 (TRF1) -interacting nuclear factor 2 or Cofactor required for Sp1 transcriptional activation, subunit 3, 130 kDa or Calpain 3, (p94) or Cadherin 16, KSP-cadherin or Amylo-1, 6-glucosidase, 4-alpha Indicator gene for leukemia subtype determination, characterized in that it is -glucanotransferase (glycogen debranching enzyme, glycogen storage disease type III) or Calcium / calmodulin-dependent protein kinase I. 제6항 또는 제7항에 따른 백혈병 아형 판별용 지표 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 백혈병 아형 판별용 DNA칩.A DNA chip for leukemia subtype determination, comprising the indicator gene for leukemia subtype determination according to claim 6. 제6항 또는 제7항에 따른 백혈병 아형 판별용 지표 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 백혈병 아형 판별용 키트.A leukemia subtype discrimination kit comprising a marker gene for leukemia subtype determination according to claim 6.
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