KR100825119B1 - 간질환의 예방 또는 치료용 약학조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명에 따르면, 잎새버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학조성물이 제공된다.

이와 같은 간질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 의하면, 높은 간 보호 활성을 갖으며, 특히, 사염화탄소로 유발된 간 장해에 있어서, 우수한 간 기능 보호작용을 나타내고, 인체에 무해하여, 간 세포 보호 및 간 손상 예방 또는 치료용 의약품에 유용하게 사용할 수 있는 장점을 갖는다.

잎새버섯, 추출물, 간

Description

간질환의 예방 또는 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for preventing and treating liver disease}

도 1은 본 발명에 따른 잎새버섯 추출물의 DPPH assay 결과를 나타낸 그래프,

도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 QR 및 GST 활성을 나타낸 그래프,

도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 마우스 모델에서 각 실험군과 대조군의 GSH 생성량 비를 나타낸 그래프,

도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 마우스 모델에서 각 실험군과 대조군에서의 GSH-Px 활성도를 측정한 실험 결과,

도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 마우스 모델에서 각 실험군과 대조군에서의 SOD 활성도를 측정한 실험 결과,

도 6은 본 발명의 실험예 7에 따라 PCR을 수행한 다음, 자외선 조사장치를 이용하여 아가로즈 젤 상의 DNA를 관찰한 사진,

도 7은 본 발명의 실험예 7에 따라 PCR 수행 후, 각 실험군의 유전자 발현 정도를 나타낸 그래프,

도 8은 본 발명의 실험예 8에 따라 AP color reagent로 발색시킨 젤 사진,

도 9는 본 발명의 실험예 8에 따른 western blot 결과를 나타내는 그래프,

도 10a는 본 발명 참고예 3의 NOR 실험군 간세포 조직을 투과전자현미경으로 관찰한 사진,

도 10b는 본 발명 참고예 3의 CON 실험군 간세포 조직을 투과전자현미경으로 관찰한 사진,

도 10c는 본 발명 참고예 3의 VTC 실험군 간세포 조직을 투과전자현미경으로 관찰한 사진,

도 10d는 본 발명 참고예 3의 GF Ι 실험군 간세포 조직을 투과전자현미경으로 관찰한 사진,

도 10e는 본 발명 참고예 3의 GF Ⅱ 실험군 간세포 조직을 투과전자현미경으로 관찰한 사진,

도 10f는 본 발명 참고예 3의 GF Ⅲ 실험군 간세포 조직을 투과전자현미경으로 관찰한 사진이다.

본 발명은 간질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 높은 간 보호 활성을 갖으며, 인체에 무해하여, 간 세포 보호 및 간 손상 예방 또는 치료용 의약품에 유용하게 사용될 수 있도록 한 간질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

인체의 중요한 장기인 간은 인체의 약 5%정도를 차지하는 비교적 큰 기관으 로서, 물질대사의 해독 및 생명유지에 필수적인 물질을 생성, 저장하는 중요한 장기이다. 생체 이물질들은 간의 대사를 통해 비활성화되어 배설되거나 혹은 활성이 강한 물질로 대사되어 독성을 유발하는데, 이는 간의 대사 능력에 따라 좌우하는 것으로 알려져 있다. 이 외에 혈당조절, 단백질 합성 및 분해, 콜레스테롤 합성, 비타민 대사 및 저장, 호르몬 등의 대사를 조절할 뿐만 아니라 완충작용이 있어 간 질환이 있더라도 초기에는 잘 느끼지 못하나 상당히 진전된 후에야 진단이 되는 특징이 있다.

한편, 간독성 유발 물질로는 사염화탄소, 클로로포름, 에탄올 및 브로모벤젠 등이 있으며, 대표적 간 독소인 사염화탄소(carbon tetrachloride, CCl₄)는 화학반응에 의해 세포파괴를 유발시키는 물질로써 소포체의 기능을 저하시키고 지방의 축적을 일으키며, 심하면 세포괴사를 초래한다고 알려져 있다. 사염화탄소는 유지, 고무, 수지의 용제 등에 이용되며 산업현장에서 쉽게 노출되는 환경물질의 하나로써, 세포의 손상을 일으키는 대표적인 간 독소이다. 사염화탄소의 독성은 과산화물의 생성과 관련이 있는 것으로 보고되었으나 아직 그 기전이 명확하게 밝혀져 있지 않다. 사염화탄소(CCl₄)는 세포 파괴를 일으키는 물질로서, 소포체에서 유리기(free radical)인 CCl₃·(trichloromethyl radical)로 대사되거나, 혹은 CCl₃·(트리클로로메틸 라디칼)이 O₂ ^{2 -}와 반응하여 생성된 Cl₃COO·(trichloromethyl peroxy radical)로 산화되어, 세포막의 고도 불포화지방산(polyenoic acid)을 과산화시킨 다. 이에 따라, 소포체의 기능이 저하되고 지방이 축적되며, 간 지방의 알킬기 또는 간 세포의 핵에 존재하는 DNA와 공유결합 하기도 하고, 심하면 세포괴사를 초래한다고 연구, 보고되었다. 또한, 사염화탄소의 중간대사산물인 유리기들을 추적한 결과 CO₂, Cl₃COO·, COCl₂ 및 O₂ 등이 사염화탄소의 독성을 매개하는 것으로 알려져 있다. 이에 따라, 상기와 같은 독성물질로 인한 간 손상을 보호할 수 있는 천연 식물에 대한 연구가 이루어져 오고 있다.

한편, 버섯은 담자균과 자낭균 중 자실체를 형성하는 고등 균류로서 풍부한 영양소를 골고루 함유하고 있고 독특한 향기와 맛을 가지는 동시에 식용 및 약용으로 널리 이용되어 최근 각광받고 있는 기능성 식품 중의 하나이다. 이러한 버섯은 당질, 단백질, 비타민 및 무기질 등의 영양소가 풍부할 뿐만 아니라, 자실체 및 균사체의 추출물이 체질개선이나 각종 병의 예방과 치료에 효과가 있는 것으로 밝혀져 건강식품이나 의약품으로서의 용도가 크게 증가하고 있다. 그 중에서도 버섯의 항암활성에 관한 연구가 다수 보고되어 있으며, 많은 연구가 진행 중에 있다.

이러한 항암 작용 이외에도 버섯의 항산화효과, 항종양활성, 항알레르기 효과, 혈압강하 효과, 항세균성 효과, 항바이러스 효과, 혈소판 응집저해 효과, 면역증강 효과 등 여러 방면에서 약리작용 및 효능이 있는 것으로 보고되었으며, 한방에서는 버섯을 약재로 사용함과 동시에 의약품의 소재로도 이용되고 있다.

이 중 잎새버섯(Grifola frondosa(Dicks. ex Fr.) S.F.Gray)은 민주름목 구멍장이버섯과(Polyporaceae)에 속하는 버섯으로서 가을에 졸참나무, 물푸레나무의 뿌리 근처에 사물 기생하여 다발로 발생하는 백색 목재부후균으로, 한국, 동아시아, 유럽, 북미 등에 분포되어 있다. 이러한 잎새버섯은 뭉툭한 대에서 무수한 가지꼴로 갈라지며 그 위에 다소 두껍고 구두칼형의 작은 갓을 형성한다. 갓의 크기는 2-5cm이고 두께는 2-4mm이며, 전체의 크기는 15-30cm이다. 표면은 초기에 흑색이나 후에 옅은 흑갈색으로 되고 그 위에 불완전한 둥근 무늬가 있으며, 조직은 부드럽고 백색을 띤다. 대의 기부(基部)는 굵고 바로 윗부분에서 여러 개의 분지로 갈라져 산호모양을 이루며 조직은 단단하며 충실하나 잘 부서진다. 이러한 잎새버섯은 식용 담자균류의 일종으로 향과 맛이 좋아서 일본에서는 송이버섯과 더불어 고급버섯으로 취급되고 있다. 이러한 잎새버섯에 대한 연구는 현재 균사체를 위주로 한 연구가 일부 진행되고 있을 뿐이다. 더구나 잎새버섯의 간독성에 대한 보호 효과에 대한 연구는 아직까지 보고된 바 없다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위하여 창출된 것으로서, 높은 간 보호 활성을 갖으며, 인체에 무해하여, 간 세포 보호 및 간 손상 예방 또는 치료용 의약품에 유용하게 사용될 수 있도록 한 간질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명은 잎새버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

여기서, 상기 잎새버섯 추출물은 잎새버섯 자실체 추출물인 것이 바람직하 다.

또한, 상기 잎새버섯 추출물은 C1 내지 C4의 알코올 및 물로 이루어진 군에서 선택된 하나의 용매 또는 하나 이상의 혼합용매를 이용하여 추출하는 것이 바람직하다.

아울러, 상기 잎새버섯 추출물은 지방간, 간섬유증, 간경화 및 바이러스 또는 약물에 의한 간염으로 이루어진 군에서 선택된 간질환을 예방하거나 치료할 수 있다.

뿐만 아니라, 상기 잎새버섯 추출물은 사염화탄소에 의한 간손상을 예방 또는 치료할 수 있다.

이하, 본 발명의 잎새버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 설명하도록 한다.

본 발명에 따른 잎새버섯 추출물은 C1 내지 C4의 알코올 및 물로 이루어진 군에서 선택된 하나의 용매 또는 하나 이상의 혼합용매를 이용하여 얻을 수 있다.

더욱 자세히 설명하면, 먼저, 건조된 잎새버섯 자실체를 분쇄한 시료에, 20중량배량의 C1 내지 C4의 알코올인 용매를 가한 후 40℃로 조절된 항온수조에서 12시간 동안 3회 반복 추출하였다. 이 추출액을 여과한 후 용매를 제거한 다음 증류수로 용해하여 동결건조하여 추출 시료로 이용하였다.

또한, 물을 이용한 잎새버섯 추출물은 상기 C1 내지 C4의 알코올을 이용한 잎새버섯 추출물을 얻는 과정과 동일하며, 단, C1 내지 C4의 알코올 대신 증류수를 용매로 사용하였다는 것만 상이하다.

본 발명은 잎새버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

특히, 본 발명의 일실시예에서는 잎새버섯 자실체 추출물을 이용하여 잎새버섯 추출물이 간질환에 미치는 영향을 조사하였다. 여기서, 잎새버섯 추출물은 C1 내지 C4의 알코올이나 물을 이용하여 추출할 수 있다.

상기 간질환은 지방간, 간섬유증, 간경화 및 바이러스 또는 약물에 의한 간염일 수 있으며, 특히, 본 발명에 따른 잎새버섯 추출물은 사염화탄소에 의한 간손상을 예방할 수 있다.

이에 따라, 본 발명에 따른 잎새버섯 추출물은 높은 간 보호 활성을 갖으며, 특히, 사염화탄소로 유발된 간 장해에 있어서, 우수한 간 기능 보호작용을 나타내고, 인체에 무해하여, 간 세포 보호 및 간 손상 예방 또는 치료용 의약품에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 상기 잎새버섯 추출물을 포함하고 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 간질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타약학적 활성 화합물과 결합 뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

상기 추출물은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러가지 제형으로 투여될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 혼합 생약재 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose), 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘(Magnesium stearate), 탈크(talc) 등과 같은 활택제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀(liquid paraffin) 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 등이 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 올리브 오일(olive oil)과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트(ethyl oleate)와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

상기 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에서, 본 발명의 잎새버섯 추출물의 유효용량은 10㎎/㎏-2000㎎/㎏이고, 바람직하게는 20㎎/㎏-1000㎎/㎏이며, 하루 1-6회 투여될 수 있다. 단, 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 잎새버섯 추출물을 인체에 투여하는 경우 천연 추출물인 관계로 다른 합성 의약품에 비하여 부작용의 우려가 없으며, 본 발명의 잎새버섯 추출물을 랫트에 경구투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 독성시험에 의한 50% 치사량(LD50)이 적어도 잎새버섯 추출물 10g/㎏ 이상인 안전한 물질로 판명되어 그 안정성이 확보되어 있다.

실시예 1. 잎새버섯 추출물 추출

잎새버섯 추출물을 얻기 위하여, 일본 동경의 지바현 시장에서 구입한 건조된 잎새버섯 자실체를 잘게 분쇄한 다음, 각각 물과 메탄올을 용매로 이용하여 추출하였다.

먼저, 메탄올을 용매로 하여 잎새버섯 추출물을 얻는 과정을 설명하면, 분쇄된 잎새버섯 시료에 20중량배량의 메탄올을 가한 다음, 40℃로 조절된 항온 수조에서 12시간 동안 3회에 걸쳐 반복하여 추출하였다. 이 추출액을 여과한 다음, 회전식 농축기(rotary evaporator, EYELA Co., Japan)를 이용하여 용매를 제거하였다. 다음으로, 용매가 제거된 시료를 증류수로 용해하고 동결건조하여 잎새버섯 추출물을 얻었다.

물을 용매로 하여 잎새버섯 추출물을 얻는 과정은 상기 메탄올을 용매로 하여 잎새버섯 추출물을 얻는 과정과, 사용되는 용매만 제외하고 동일하므로, 반복적인 설명은 생략하도록 한다.

실험예 1. 잎새버섯 및 잎새버섯 추출물의 성분 분석

잎새버섯의 일반 성분 분석은 공인분석화학회(AOAC)에 등재된 시험법에 준하여 실시하였다. 수분은 105℃ 건조법, 조단백질은 micro-Kjeldahl 법, 조지방은 Soxhlet법, 조회분은 550℃ 직접 회분법을 사용하여 측정하였으며, 조섬유는 0.13M H₂SO₄, 0.23M KOH로 분해한 후 건조 및 회화시켜 정량하였다.

또한, 메탄올 및 물을 이용하여 추출된 잎새버섯 추출물의 수율 값은 추출액 일정량을 취하여 동결건조한 다음 건물 중량을 구하고, 추출액 조제에 사용한 원료 건물량에 대한 백분율로 계산하였다.

상기의 잎새버섯 및 잎새버섯 추출물의 성분 분석 결과는 다음 표 1에 나타내었다.

	잎새버섯	잎새버섯 추출물(메탄올)	잎새버섯 추출물(물)
수분	8.59±0.69	6.91±0.43	9.14±0.40
조단백질	32.55±3.24	10.13±0.53	44.66±0.26
조지방	1.10±0.64	1.63±0.20	0.74±0.33
조회분	7.04±0.12	11.98±0.85	12.49±0.79
조섬유	13.80±0.18	0.22±0.05	0.20±0.04
탄수화물	36.90±0.21	69.13±0.12	32.77±0.12
수율	-	28.7%	49.2%

표 1을 참조하면, 잎새버섯 자실체의 일반성분은 수분 8.59%, 단백질 32.55%, 지방 1.10%, 회분은 7.04%, 섬유 13.80%로 나타났다.

또한, 잎새버섯 자실체를 메탄올 및 물을 용매로 이용하여 추출한 후, 추출물에 대한 일반 성분을 분석한 결과, 전반적으로 비슷한 함량이 나타났으나, 단백질 함량이 메탄올을 이용한 추출물보다 물을 이용한 추출물이 4배 이상 많았다.

잎새버섯을 각각 메탄올 및 물을 이용하여 추출 및 동결건조한 후 각 추출용매별로 측정한 수율은, 물을 이용한 잎새버섯 추출물이 49.2%로 메탄올을 이용한 잎새버섯 추출물 28.7%보다 훨씬 많았다.

실험예 2. DPPH assay

DPPH assay는 활성 라디칼에 전자를 공여하여 식품 중의 지방질 산화를 억제시키는 척도로 사용되고 있을 뿐만 아니라, 인체 내에서 활성 라디칼에 의한 노화를 억제하는 작용의 척도로 이용되고 있다.

본 발명의 실시예에서는 Blois의 방법에 따라 실험하였다. 상기 실시예 1에서 물 및 메탄올을 용매로 이용하여 추출된 각각의 버섯 추출물이 0.1㎎/㎖, 0.5㎎/㎖, 1㎎/㎖, 5㎎/㎖의 농도가 되도록 메탄올에 녹인 시료 4㎖을 준비하였다. 이렇게 준비된 각 시료에 1.5×10⁴M DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)용액을 넣고, 15초 동안 격렬하게 혼합한 후 실온에서 30분간 방치한 다음, 520㎚에서 흡광도를 측정하였다.

여기서, 메탄올의 흡광도를 측정하고, 측정된 메탄올의 흡광도를 후술할 수학식 1의 시료무첨가구의 흡광도에 대입하여, DPPH라디칼 소거능을 도출하였다.

상기에서 측정한 흡광도는 아래의 수학식 1에 대입하여, DPPH 라디칼 소거능(DPPH radical scavenging activity)을 도출하는 데 이용하였다.

DPPH 라디칼 소거능(%) = {1-(시료첨가구의 흡광도)/(시료무첨가구의 흡광도)}×100

상기와 같은 수학식 1에 의해 도출된 DPPH 라디칼 소거능 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1은 본 발명에 따른 잎새버섯 추출물의 DPPH assay 결과를 나타낸 그래프이다. 도 1에 나타낸 그래프에서 가로축은 농도(concentration, ㎎/㎖)를 나타내며, 세로축은 DPPH 라디칼 소거능(DPPH radical scavenging activity, %)을 나타낸다.

도 1을 참조하면, 잎새버섯의 DPPH 라디칼 소거능은 0.5㎎/㎖농도의 메탄올 추출물은 37.1%, 물 추출물은 45.2%이었고, 1㎎/㎖농도의 경우, 메탄올 추출물 65.0%, 물 추출물 72.4%로 나타났으며, 5㎎/㎖의 경우 메탄올 추출물 91.5%, 물 추출물 91.7%으로 나타났다. 이에 따라, 물을 용매로 이용한 경우, 메탄올을 용매로 이용한 경우보다 다소 높은 DPPH 소거 효과를 갖는 것을 알 수 있으며, 잎새버섯 추출물의 높은 DPPH 소거 효과를 확인할 수 있었다.

참고예 1. 효소활성 측정을 위한 실험동물 모델

본 실험에 사용한 동물은 4주령의 수컷 ICR mouse(체중 20-25g)를 오리엔트 바이오 사업부에서 구입하여 5일간 안정화시킨 후 실험에 사용하였으며 실험 기간 중 사료와 물은 자유로이 먹게 하였다. 실험군은 마우스 10마리를 한 군으로 하여 시료를 투여하지 않은 대조군(control)과 물을 용매로 이용하여 추출된 잎새버섯 추출물을 마우스 무게 ㎏당 각각 100, 500, 1000㎎으로 투여한 실험군으로 나누었 으며, 시료투여는 마우스당 0.2㎖씩 하루 1회로 하여 14일간 관류법으로 투여하였다.

참고예 2. 사이토졸 부유액 조제

상기 효소활성 측정을 위한 마우스 모델에서 관류법을 통한 시료 처리가 완료되고, 24시간이 지난 후 마우스를 질식시켰다. 이렇게 질식시킨 마우스의 복피를 절개하여 간을 취하였으며, 효소 활성을 측정하기 위한 사이토졸 부유액을 다음과 같이 제조하였다.

먼저, 간은 무균상태에서 0.15M KCl 완충용액으로 관류(perfusion)시킨 후 적출하고, 다시 2-3회 세척한 다음 여과지로 수분을 제거하였다. 이러한 조직을 0.25M 수크로오스(sucrose) 용액(각 조직 g당 4.0㎖)으로 빙냉 상태에서 조직 균질기(Bio homogenizer, M133/1281-0, ESGE, Switzerland)를 사용하여 마쇄하였다. 이 마쇄액을 9000×g에서 20분간 원심분리하여 침전시킨 후 침전물을 제거하고 상징액 1㎖당 0.1M 염화칼슘(CaCl₂) 용액을 0.2㎖의 부피로 첨가하여 빙냉 상태에서 30분간 방치하였다. 여기서, 상기 0.1M 염화칼슘 용액은 0.2M 수크로오스 용액을 용매로 하여 제조하였다. 그 다음, 다시 27,000×g에서 20분 동안 원심분리시켜 상징액을 얻었으며, 이것을 사이토졸 부유액으로 하여 각각의 효소 활성 측정에 시료로 사용하였다.

실험예 3. 효소활성 측정

본 실험에서는 in vitro 상에서 물 추출물이 메탄올 추출물보다 암예방 효과가 높은 것으로 나타난 것을 기초로, 물을 용매로 한 잎새버섯 추출물을 실험동물에 농도별로 투여하여 암예방 관련 효소계의 활성 변화를 측정하였다.

3-1. QR ( Quinone reductase ) 활성

QR은 포유동물의 세포 중 사이토졸 속에 다량 포함된 플라보 단백질로서 생체내에 유입되는 다양한 퀴논(quinone)과 퀴논이민(quinoneimine)을 환원시키는 역할을 한다. 상기와 같이 QR은 퀴논과 퀴논이민을 환원시킴으로서, 돌연변이를 유발하고, 발암물질에 의한 종양유발을 억제하는 것으로 알려져 있다.

이러한 QR 활성 측정은 Prochaska의 방법에 따라, 참고예 2에서 제조된 대조군과 실험군 각각의 사이토졸 부유액 50㎕에 반응액 200㎕를 첨가하여 측정하였다. 여기서, 반응액은 0.5M Tris-HCl(pH7.4) 7.5ml, Bovine serum albumin 100mg, 1.5% Tween-20 1.0㎕, 7.0mM FAD 0.1ml, 150mM glucose-6-phosphate 1.0ml, 50mM NADP 90㎕, yeast-glucose-6-phosphate dehydrogenase 300unit, MTT 45mg, 50mM menadione 150㎕를 첨가한 다음, 150㎖가 되도록 증류수를 첨가하였다. 상기와 같은 반응액을 첨가하고, 5분간 반응을 시킨 다음, 0.3mM dicumarol과 5mM potassium phosphate가 함유된 용액 50㎕를 첨가하여 반응을 중지시켰으며, microplate reader(SUNRISE, TECAN, Austeralia)를 이용하여 610㎚에서 흡광도를 측정하였다.

다음으로, QR 활성을 측정하기 위하여, 세포수에 대한 QR 생성량을 측정하 였다. 상기 QR 생성량 측정은 실험군 각각의 사이토졸 부유액 50㎕를, 2부피% 에탄올에 녹인 0.2%(w/v) crystal violet에 10분간 담근 다음 2분간 흐르는 물에 씻었다. 그 다음으로, 50부피% 에탄올에 녹인 0.5%(w/v) SDS를 상기 시료에 첨가하고, 37℃, CO₂ 배양기에서 1시간 반응시킨 후 610㎚에서 흡광도를 측정하였다.(Crystal violet staining)

여기서, QR 활성은 환원된 MTT와 crystal violet에 의한 흡광도로 산정하였고, QR 활성 유도는 잎새버섯 추출물을 처리하지 않은 대조군의 QR 활성에 대하여, 시료를 처리한 QR 활성의 비로 나타내었다. QR 활성 유도 계산식은 다음 수학식 2와 같다.

단위시간당 MTT 흡광도의 변화/crystal violet 흡광도×3345nmol/㎎

상기의 QR 활성 측정의 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 QR 및 GST 활성을 나타낸 그래프이다. 여기서, GST 활성에 대한 설명은 후술하도록 한다. 도 2에서 세로축은 대조군에 대한 각 실험군의 활성비(ratio of specific activities)를 나타낸다.

도 2를 참조하면, QR의 활성은 대조군과 비교하여 각 실험군에서 1.1-1.4배의 유의성 있는 증가가 일어난 것을 확인할 수 있다.

3-2. GST ( Glutathione S- transferase ) 활성

GST는 외부 이물질의 대사 과정 중 생성된 친전자성 대사산물을 GSH와 결합시켜 용해되기 쉬운 수용성 물질로 만들어 배설시키는 해독효소로서, 사이토졸 내에 다량으로 존재하는 것으로 밝혀져 있다. 또한, 이 효소는 생체내의 GSH를 기질로 이용하여 생체 항산화 과정에서 생산되는 활성 중간 대사산물을 제거함은 물론 항암 기전에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이 효소는 항산화 및 암예방 물질을 검색하는 데 있어 생물학적 지표로 이용되고 있다.

상기의 GST 활성은 참고예 2에서 제조된 대조군과 실험군 각각의 사이토졸 부유액 20㎕를 대상으로, Habig 방법(J. Biol . Chem . 249(22): 7130-7139)에 준하여 실시하였다. GST 활성 유도는 대조군에 대한 각 실험군의 효소 활성의 비로 나타내었다.

도 2를 참조하면, 실험군의 GST 활성은 대조군과 비교하여 2.0-3.8배로 나타났으며, 마우스에 투여한 잎새버섯 추출물의 농도가 증가할수록 그 수치가 크게 높아지는 것으로 나타났다.

3-3. GSH ( Glutathione ) 생성량

GSH는 GST의 기질로 사용되며, 독성이 있는 친전자성 대사물과 직접 반응을 함으로서 세포 내에서 중요한 암억제 기능을 한다. 또한, 동물의 조직에 존재하는 친전자적인 특성을 보이는 화합물과 쉽게 접합함으로써 친전자성 화합물이 갖는 세포파괴, 유전자 이상 초래와 같은 독소 작용을 차단시켜 줄 수 있으므로 암예방 효과를 측정하는데 중요한 지표가 된다.

상기의 GSH 생성량 측정은 참고예 2에서 제조된 대조군과 실험군 각각의 사이토졸 부유액 40㎕를 대상으로, Griffith 방법(Anal. Biochem. 106(1):207-212)에 준하여 실시하였다. GSH 함량은 표준 곡선에 의하여 산출하였고, GSH 생성량은 대조군에 대한 각 실험군의 효소 생성량 비로 나타내었다.

상기에서 측정된 GSH 생성량 비의 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 마우스 모델에서 각 실험군과 대조군의 GSH 생성량 비를 나타낸 그래프이다. 도 3에서 가로축은 참고예 1에서 마우스 무게 ㎏당 각각 100, 500, 1000㎎으로 투여한 각 실험군(Concentration, ㎎/㎏ body wt.)을 나타내며, 세로축은 대조군에 대한 각 실험군의 GSH 생성량 비(ratio of GSH levels, treated/control)를 나타낸다.

도 3을 참조하면, 실험군의 GSH 생성량의 비는 마우스에 투여한 잎새버섯 추출물의 양이 증가할수록 큰 수치가 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 각 실험군은 대조군과 비교하여 그 수치가 1.2-1.5배로 나타났다.

상기에서 측정된 QR 및 GST의 효소 활성비 및 GSH의 생성량을 보면, 잎새버섯 추출물의 투여가 마우스의 간조직에서 암예방 효소의 활성을 증가시키는 것을 확인할 수 있으며, 외부물질의 유입이나 생체내 대사산물에 의해 일어날 수 있는 암에 대한 예방 효과를 가지고 있는 것으로 판단된다.

3-4. Glutathione peroxidase ( GSH - Px ) 활성

GSH-Px는 체내 존재하는 항산화제인 GSH을 기질로 하여 과산화수소(H₂O₂)를 처리하는 효소로서, 유리기를 물로 변환시켜 생성된 활성 산소를 체외로 배설시키는 역할을 한다

마우스 조직내의 GSH-Px 활성도는 Paglia과 Lawrence의 방법에 의하여 측정하였다. 여기서, 50mM 인산칼륨(potassium phosphate) 완충 용액(pH 7.0) 50㎖에 1mM 아지드화 나트륨(NaN₃), 0.2mM NADPH(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), 1mM GSH(reduced glutathione), 그리고 1E.U./ml의 GSSH-reductase(oxidized glutathione-reductase)를 혼합하여 제조된 반응액을 이용하였다. 상기 반응액 0.8㎖에 참고예 2 각각의 사이토졸 부유액 0.1㎖를 넣고, 2.2mM 과산화수소(H₂O₂) 용액 0.1㎖를 첨가하여, 340㎚에서의 NADPH 흡광도 감소로 측정하였다. 효소 활성도는 단백질 ㎎당 1분 동안 산화되는 NADPH nmole로 표기하였다.

상기와 같이 측정한 GSH-Px 활성도의 실험 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 마우스 모델의 각 실험군과 대조군에서의 GSH-Px 활성도를 측정한 실험 결과이다. 도 4에서 가로축은 참고예 1의 대조군(control) 및 마우스 무게 ㎏당 각각 100, 500, 1000㎎으로 투여한 각 실험군(Concentration, ㎎/㎏ body wt.)을 나타내며, 세로축은 단백질 ㎎당 1분 동안 산화되는 NADPH nmole(GSH-Px, unit/㎎ protein)을 나타낸다.

도 4를 참조하면, 대조군(control)에 비하여 각 실험군의 GSH-Px 활성도가 유의성있게 증가하는 것으로 나타났다. 즉, 잎새버섯 추출물 투여량의 증가에 따라 GSH-Px의 활성은 각각 1.8, 2.2, 2.5배 증가하는 것으로 나타났다.

3-5. Superoxide dismutase ( SOD ) 활성

SOD는 생체 이물질로 인하여 생성된 수퍼옥사이드 이온(superoxide anion)을 과산화수소(H₂O₂)로 전환시키는 효소로서 생체 내의 해독 체계 중 하나이며, SOD는 산화적 손상을 저해하고 그 효소활성은 산소 스트레스하에 유도되어 나타난다고 한다.

SOD 활성은 크산틴(xanthine), 크산틴 산화효소(xanthine oxidase) 및 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)의 첨가에 의한 페리사이토크롬 c(fericytochrome c) 환원의 억제 정도에 의하여 결정하였다. 즉, 50mM 인산칼륨(potassium phosphate) 완충용액(pH 7.8)에 0.01M EDTA, 1units/㎖의 카탈라아제(catalase), 5×10^-5M의 NBT(Nitroblue tetrazolium), 10^-4M의 크산틴 및 5mM의 신안화나트륨(sodium cyanide, NaCN)이 첨가되도록 용해시킨 후 잘 혼합하여 반응액을 제조하였다. 이 반응액 0.8㎖에 참고예 2 각각의 사이토졸 부유액 0.1㎖를 넣고 크산틴 산화효소 0.1㎖를 첨가하여 혼합한 후, 560㎚에서 흡광도를 측정하였다.

이 때, 사이토졸 부유액을 넣지 않는 블랭크(blank)도 동일한 처리를 하여 환원된 cytochrome c의 최대 농도를 결정하였다. 효소의 활성도는 cytochrome c의 최대 환원을 50% 저지한 SOD의 양을 1 unit로 정의하였으며, 단백질 농도를 기준으로 하여 unit/㎎ protein으로 나타냈다.

상기와 같이 측정한 SOD 활성도의 실험 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 마우스 모델에서 각 실험군과 대조군에서의 SOD 활성도를 측정한 실험 결과이다. 도 5에서 가로축은 참고예 1의 대조군(control) 및 마우스 무게 ㎏당 각각 100, 500, 1000㎎으로 투여한 각 실험군(Concentration, ㎎/㎏ body wt.)을 나타내며, 세로축은 단백질 ㎎당 cytochrome c의 최대 환원을 50% 저지한 SOD의 양(SOD, unit/㎎ protein)을 나타낸다.

도 5를 참조하면, 대조군(control)에 비하여 각 실험군의 SOD 활성도가 유의성있게 증가하는 것으로 나타났다. 더욱 자세하게는, 잎새버섯 추출물 투여량의 증가에 따라 SOD 활성은 각각 1.9, 2.2, 2.6배로 증가하는 것으로 나타났다.

참고예 3. 간독성 실험을 위한 실험동물 모델

실험동물은 외견상 건강한 5주령의 Sprague-Dawley종 웅성 랫트 80마리(Orient Co., Korea)를 구입하여 일주일간 일반 고형 사료로 안정화시킨 후 실험에 사용하였다. 실험기간 중 사료와 물은 자유로이 공급하였고, 사육실의 온도는 25±1℃, 상대습도는 50±10%로 유지시켰다. 점등관리는 자동조명조절기에 의해 12시간 명암주기(light-dark cycle)로 조절하였다. 실험군은 평균체중이 165±10g인 것을 난괴법에 의하여 각 군당 7마리씩 6군으로 나누어 케이지에 1마리씩 분리하여 2주간 사육하였다.

상기 6군의 모든 실험동물군은 14일간 기본적으로 정상 식이를 하였으며, 그에 추가하여 각 실험군마다 다음과 같은 처리를 실시하였다.

정상군( NOR )

실험기간 동안 흰쥐에 증류수를 1g/㎏/day의 용량으로 14일 동안 경구투여 후 올리브 오일(olive oil)을 1㎖/㎏의 용량으로 3일간 투여하였다.

사염화탄소 투여군( CON )

흰쥐에 증류수를 1g/㎏/day의 용량으로 14일 동안 경구투여 후 사염화탄소(CCl₄)를 동량의 올리브 오일에 용해하여 1㎖/㎏의 용량으로 3일간 간독성을 유발하였다.

제1 시료 투여군( GF Ι)

흰쥐에 잎새버섯 추출물을 0.5g/㎏/day의 용량으로 14일 동안 경구투여 후 사염화탄소를 동량의 올리브 오일에 용해하여 1㎖/㎏의 용량으로 3일간 간독성을 유발하였다.

제2 시료 투여군( GF Ⅱ)

흰쥐에 잎새버섯 추출물을 1g/㎏/day의 용량으로 14일 동안 경구투여 후 사염화탄소를 동량의 올리브 오일에 용해하여 1㎖/㎏의 용량으로 3일간 간독성을 유발하였다.

제3 시료 투여군( GF Ⅲ)

흰쥐에 잎새버섯 추출물을 2g/㎏/day의 용량으로 14일 동안 경구투여 후 사염화탄소를 동량의 올리브 오일에 용해하여 1㎖/㎏의 용량으로 3일간 간독성을 유발하였다.

양성 대조군( VTC )

흰쥐에 비타민 B, C 복합제(vitamin BC complex)를 1g/㎏/day의 용량으로 14일 동안 경구투여 후 사염화탄소를 동량의 올리브 오일에 용해하여 1㎖/㎏의 용량으로 3일간 간독성을 유발하였다.

참고예 4. 간독성 실험을 위한 실험동물 모델로부터 간균질액 조제

상기의 참고예 3의 각 6개의 실험군을 대상으로, 간 조직을 적출하고 적출한 간 조직 1g당 4배 가량의 0.1M 인산칼륨 완충액(potassium phosphate buffer, pH 7.4)를 가하여 호모지나이저(Ultra-Turrax homogenizer)로 4℃ 빙냉하에서 마쇄한 후 간균질액을 만들었다. 이 간균질액을 600×g에서 10분간 원심 분리하여 핵 및 미마쇄부분을 제거한 상징액을 일정량씩 나누어 -70℃에서 냉동 보관하면서 분석실험에 이용하였다.

참고예 5. 간독성 실험을 위한 실험동물 모델로부터 혈청분리

상기 참고예 3의 6개 실험군에서, 2주간 사육한 실험동물은 도살 전 12시간 동안 물을 제외한 식이는 중단하였으며 에테르(ether)로 마취시킨 다음 복부 중앙선을 따라 개복한 후 쥐의 심장 박동이 유지되고 있는 상태에서 복부대동맥으로부터 채혈하였다. 채취한 혈액은 해파린 튜브에 바로 주입하여 3000rpm, 4℃에서 20분간 원심분리 한 뒤 혈청을 분리하였으며, 혈청은 -70℃에서 냉동 보관하면서 각각의 분석실험에 사용하였다.

실험예 4. 간독성 실험을 위한 실험동물 모델의 체중 및 장기중량 측정

먼저, 상기 참고예 3의 각각의 실험군에서 체중 측정을 위하여 측정 10시간 전에 사료 급여를 중단하고 매주 2회 일정시각에 측정하였다. 체중 증가량은 실험 종료 시 측정한 체중에서 실험을 시작할 때 측정한 체중을 감하여 실험기간 중의 체중 증가량으로 환산하였다.

상기의 체중 측정 실험 결과는 다음 표 2에 나타내었다.

	실험 전 체중(g)	실험 후 체중(g)	일일증가량(g)
NOR	173.58±8.83	264.31±8.78	6.52±0.24
CON	173.03±6.83	249.91±5.28	5.49±0.65
VTC	172.50±7.64	261.11±7.12	6.33±0.25
GF Ι	173.33±6.26	259.04±5.21	6.11±0.42
GF Ⅱ	172.69±5.53	258.57±4.60	6.13±0.47
GF Ⅲ	172.49±7.54	259.34±5.20	6.20±0.26

표 2를 참조하면, 증류수만을 2주간 경구투여한 정상군(NOR)의 경우 173.58±8.83g에서 261.31±8.78g으로 33.8% 증가하였고, 사염화탄소만을 처리한 대조군(CON)은 173.03±6.83g에서 249.91±5.28g로, 30.8%, 양성대조군(VTC)의 경우 172.50±7.64g에서 261.11±7.12g으로, 33.9% 증가하였다. 잎새버섯 추출물을 0.5g/kg 투여한 GF Ⅰ군은 173.33±6.26g에서 257.33±6.60g로, 32.6%, 1g/kg 투여한 GF Ⅱ군은 172.69±5.53g에서 258.57±4.60g으로, 33.2% 및 2g/kg 투여한 GF Ⅲ군은 172.49±7.54g에서 259.34±5.20g으로, 33.5% 증가하였다.

실험동물 체중의 일일증가량은 정상군(NOR)이 6.45±0.72g으로 가장 높았으며 양성대조군(VTC) 6.33±0.25g, GF Ⅲ군 6.20±0.26g, GF Ⅱ군 6.13±0.47g의 순으로 나타났으나 정상군과의 유의적 차이는 없었다. 반면에 대조군(CON)은 5.49±0.65g으로 다른 군에 비해 매우 낮은 체중 증가를 보였다.

사염화탄소 투여에 의한 체중의 유의적 감소는 간손상이 일어남으로써 일어나는 현상이라는 보고가 있으며, 버섯시료 추출물 투여군에서 체중이 증가한 것은 사염화탄소로 유발된 간에서의 생체대사물질의 합성 및 대사의 손상을 개선시킨 것으로 유추하는 보고가 있는 것으로 보아, 잎새버섯 추출물이 사염화탄소 처리로 인해 초래되는 체중 감소를 최소화하는 효과가 있음을 알 수 있었다.

다음으로, 장기의 독성여부를 볼 수 있는 기초적 지표가 되는 실험동물의 장기 중량을 측정하였다.

장기의 무게를 측정하기 위하여, 2주간 사육한 실험동물은 도살 전 12시간 동안 물을 제외한 식이는 중단하였으며 에테르(ether)로 마취시킨 다음 복부 중앙선을 따라 개복한 후 쥐의 심장 박동이 유지되고 있는 상태에서 복부대동맥으로부터 채혈하였다. 간은 채혈 직후 빙냉의 0.15 M 염화칼륨(KCl) 완충액으로 관류하여 간 조직 내에 남아있는 혈액을 제거한 뒤 적출하였고, 적출한 간은 생리식염수로 여러 번 세척한 후 여과지(Whatman No. 2)로 수분을 완전히 제거한 다음, 간 조직의 무게를 측정하였다. 기타 장기(신장, 비장, 심장 및 허파)도 적출하여 생리식염수로 깨끗이 씻어내고 여과지로 수분을 제거한 후 측정하여 체중 100g당 장기 중량으로 환산하였다. 상기의 모든 조작은 0-4℃에서 실시하였다.

상기에서 측정된 결과는 다음 표 3에 나타내었다.

	간	신장	비장	허파	심장
NOR	3.42±0.46	0.83±0.09	0.21±0.08	0.47±0.03	0.37±0.03
CON	4.32±0.79	0.93±0.03	0.25±0.05	0.48±0.04	0.38±0.02
VTC	4.08±0.77	0.87±0.07	0.25±0.04	0.46±0.05	0.36±0.03
GF Ι	3.78±0.13	0.84±0.04	0.23±0.03	0.45±0.05	0.36±0.05
GF Ⅱ	3.73±0.26	0.88±0.13	0.23±0.02	0.48±0.05	0.37±0.03
GF Ⅲ	3.67±0.27	0.88±0.08	0.22±0.03	0.47±0.06	0.37±0.02

표 3을 참조하면, 간 중량의 경우 대조군(4.32±0.79g)의 간 중량이 정상군(3.42±0.46g)과 비교하여 20.8% 증가한 것을 확인할 수 있다.

간기능 장애가 발생하였을 경우, 간에 다량의 지질성분 축적으로 간의 중량비가 증가한다고 한 보고가 있는 바, 이는 상기의 결과와 일치하는 것이다. 또한, 사염화탄소에 의하여 간독성이 유발된 흰쥐군의 체중당 간의 중량비가 정상군에 비해 유의하게 증가되었다고 보고한 연구결과와도 일치하였다. 특히, 간은 사염화탄소에 의해 가장 영향을 받는 목표 기관으로서 사염화탄소와의 접촉은 농도 의존적으로 간 무게를 상승시키는 작용을 한다는 보고와, 사염화탄소를 투여하면 간 세포막의 손상으로 투과성이 증가하여 부종이 일어나고 지방변성이 생기며 간의 지질 성분이 대량 축적됨으로써 간장의 비대화가 일어나는 보고가 상기와 같은 결과를 뒷받침해준다.

시료투여군 중 GF Ⅰ군(3.78±0.13g), GF Ⅱ군(3.73±0.26g) 및 GF Ⅲ군(3.67±0.27g)은 각각 9.5, 8.3, 및 6.8% 증가를 보였으나 정상군(NOR)과는 유의적 차이가 없는 것으로 나타났으며 양성대조군(VTC)은 4.08±0.77g으로 정상군(NOR)보다 16.2%의 증가를 보였다.

그 외에도 신장과 비장에서 대조군(CON)이 정상군(NOR)에 비해 중량이 증가하였으며, 시료투여군(GF group)에서는 대조군(CON)보다 감소하는 경향이 나타났으나 유의적 차이는 없었다. 폐와 심장은 역시 수치의 차이는 있었으나 실험군간의 유의성은 없었다.

실험예 5. 간독성 실험을 위한 실험동물 모델의 혈청분석

실험 동물에서 간독성을 측정하는 방법을 혈액의 생화학적 분석, 간의 분비능 측정, 간 조직의 구성 성분의 변화 및 조직병리 검사로 크게 4가지로 분류된다. 이 중 가장 일반적으로 사용하는 방법은 혈액의 생화학적 분석과 조직병리 검사이며, 혈액의 생화학적 분석 중 혈청 효소 활성측정법은 지난 25년간 표준 간독성 평가법으로 이용되어 왔다. 본 실험예에서는 간독성의 지표로써, 담즙정체(Cholestasis)가 유발되었는지를 보기 위하여 alkaline phosphatase(ALP)와 γ-glutamyl transpeptidase(γ-GTP)를 측정하였으며, 간세포의 손상 여부를 알아보기 위하여 aspartate aminotransferase (AST)와 alanine aminotransferase(ALT) 및 lactate dehydrogenase(LDH)를 각각 측정하였다.

5-1. Aspartate aminotransferase ( AST )와 Alanine aminotransferase( ALT )

아미노기 전이 효소 (Aminotransferase)는 aspartate aminotransferase(AST)와 alanine aminotransferase(ALT)로 존재하며, 아미노산(amino acid)과 α-케토산(α-keto acid) 사이에서 아미노기 전이반응을 촉매하는 효소이다. AST와 ALT는 알코올, 유기용매 및 기타 독성물질에 의해 간의 실질 세포가 손상을 받았을 때 항진되어 나타나므로 간 장해의 지표가 되는 것으로 알려져 있다.

AST와 ALT는 모든 장기에 존재하지만 AST는 심장, 간, 골격근에 많고, ALT는 간에 많아 간독성의 지표로 널리 이용되고 있다. AST, ALT등의 효소 활성도의 상승은 간 손상으로 인한 간 세포의 괴사와 간 조직의 파괴가 진행됨에 따라 아미노기 전이 효소(transaminase)가 혈중으로 유리되어 그 활성이 증가하므로 간세포의 변성 및 괴사의 지표가 된다.

이러한 혈청 중의 AST 및 ALT의 효소 활성도는 Rentiman-Frankel의 방법에 따라 조제된 아산제약의 키트를 사용하여 측정하였다. 먼저, AST 및 ALT 각각 키트 중 기질액 1.0㎖를 37℃에서 5분간 반응시켰다, 그 다음으로, 상기 참고예 5에서 분리된 각 실험군의 혈청 0.2㎖를 첨가한 뒤 잘 혼합하여 37℃에서 AST는 60분, ALT는 30분간 반응시켰다. 그 다음, 키트 중 정색시액 1.0㎖를 첨가해 잘 혼합하여 실온에서 20분간 발색시켰다. 여기에 0.4N 수산화나트륨 수용액(NaOH) 10.0㎖를 가하여 혼합한 뒤 실온에서 10분간 방치한 후 505㎚에서 흡광도를 측정하였고, 그 활성도를 표준 검량선에 준하여 산정하였다. 이 때, 활성도는 혈청 ㎖당 Karmen unit로 나타내었다.

상기의 각 실험군에서 측정된 혈청 AST 및 ALT의 활성 변화는 다음 표 4에 나타내었다.

	AST(Karmen unit/㎖)	ALT(Karmen unit/㎖)
NOR	134.71±27.21	59.80±14.05
CON	230.10±11.77	142.17±14.45
VTC	157.06±3.66	75.53±12.49
GF Ι	188.53±8.88	100.41±5.19
GF Ⅱ	184.45±5.73	102.86±10.59
GF Ⅲ	166.26±4.10	83.42±12.04

표 4를 참조하면, 간손상 진단을 위한 일반적 지표로 사용되고 있는 AST의 활성은 사염화탄소만을 투여한 대조군인 CON(230.10±11.77KA unit)에서 정상군인 NOR(134.71±27.11KA unit)에 비해 70.8%의 AST 활성 증가를 나타내었다. 반면, 잎새버섯 추출물을 투여한 실험군(GF)에서는 대조군(CON)에 비하여 현저히 억제되었는데, GF Ⅰ군(188.53±8.88KA unit), GF Ⅱ군(184.45±5.73KA unit) 및 GF Ⅲ군(166.26±4.10KA unit)으로 대조군(CON)보다 AST 활성이 각각 30.3, 33.8 및 47.4%로 낮았다.

또한, ALT 활성에서도 AST와 유사한 경향을 나타내었다. 즉, 대조군(CON)과 비교하여 GF Ι, Ⅱ 및 Ⅲ군에서 ALT 활성이 29.3%, 27.6%, 41.3%로 낮았으며, 특히 GF Ⅲ군은 양성대조군(VTC)과 유사한 활성을 나타내었다.

상기와 같이, 사염화탄소 처리로 인하여 대조군(CON)에서 혈청 AST와 ALT의 활성이 현저하게 증가한 것은 사염화탄소에 의하여 간 실질세포에서 손상이 일어남으로써 이들 효소들의 간외 방출이 증가된다는 보고와 일치하는 결과이다. 또한, 상기와 같이 잎새버섯 추출물을 사염화탄소 투여 전에 먼저 14일간 투여한 실험동물(GF 군)에서 AST와 ALT 활성이 유의성 있게 감소하는 현상을 보아, 사염화탄소 투여로 유발되는 실험동물의 간손상을 예방적으로 감소시키는 것이라고 추정할 수 있었다.

5-2. Alkaline phosphatase( ALP )

ALP는 간담도계에 관여하는 효소로써 골아세포, 간세포의 담즙세관막, 신장의 근위세뇨관 및 백혈구 등에 존재하며, 소아와 임산부에서 정상인보다 높은 활성을 보인다. 혈액중 ALP 활성의 증가는 간장질환, 담도질환, 신장 및 골조직의 질환이 있을 때 주로 나타난다. 담도폐쇄로 인한 담즙정체장애가 있을 경우 ALP의 활성이 상승하는데, 이런 이유로 ALP는 간장질환 및 담도질환의 대표적인 지표로 사용되고 있다.

이러한 ALP의 효소 활성도는 Kind-King의 방법에 준하여 조제된 아산제약의 키트(kit)를 사용하여 측정하였다. 키트 중 ALP 기질 완충액 2.0㎖를 37℃에서 5분간 반응시킨 후, 상기 참고예 5에서 분리된 각 실험군의 혈청 0.05㎖를 첨가하여 37℃에서 15분간 반응시켰다. 그 다음, 키트 중 정색시액 2.0㎖를 첨가한 뒤 실온에서 10분간 방치시킨 것을 570㎚에서 흡광도를 측정하고 검량곡선에 준하여 활성도를 산정하였다.

상기의 ALP 효소 활성도 측정 결과는 다음 표 5에 나타내었다.

	ALP(K-A unit)
NOR	26.31±7.81
CON	57.43±13.16
VTC	36.41±7.13
GF Ι	46.02±9.49
GF Ⅱ	45.32±8.70
GF Ⅲ	45.82±10.94

표 5를 참조하면, ALP 활성은 사염화탄소만을 처리한 대조군인 CON(57.43±13.16K-A unit)에서 정상군인 NOR(26.31±7.81K-A unit)에 비해 약 2배 이상 증가한 것을 확인할 수 있다. 이렇게 대조군에서 ALP 활성의 증가는 사염화탄소에 의해 간이 손상되었음을 보여주는 것이다.

또한, GF Ⅰ군(46.02±9.49K-A unit), GF Ⅱ군(45.32±8.70K-A unit) 및 GF Ⅲ군(45.82±10.94K-A unit) 모두 대조군(CON)과 비교하여 ALP 활성이 각각 19.8, 21.1 및 20.2% 낮아진 것을 확인할 수 있다. GF 군에서 농도의존적인 효과는 나타나지는 않았으나, 랫트 모델에서 잎새버섯 추출물이 사염화탄소 처리시 증가하는 ALP의 활성을 유의성 있게 낮추는 것을 확인할 수 있다. 이에 따라, 잎새버섯 추출물은 간장 질환 및 담도질환의 예방에 큰 효과가 있는 것으로 추정된다.

5-3. Lactate dehydrogenase( LDH )

급성 간염에서 현저하게 증가되는 LDH는 탄수화물의 대사과정에서 얻어진 피루브산(pyruvic acid)을 젖산(lactic acid)으로 전환시키는 반응을 촉매한다. 이 LDH는 주로 세포질에 존재하는 효소로서 생체 내 에탄올이 산화될 때 생성되는 NADH의 도움을 받아 젖산의 혈중 농도를 증가시킨다. 또한, 간 손상이 유발되면 LDH의 간세포막 투과력이 증가되어, LDH가 세포를 빠져나가 혈중으로 방출되고, 심장과 신장 등의 세포 소기관에서도 혈중으로 방출되어 LDH 활성이 높아진다고 보고되어 있다.

이러한 LDH의 효소 활성도는 젖산 기질법에 준하여 조제된 아산제약의 키트(kit)를 사용하여 측정하였다. 키트 중 기질 정색액 1.0㎖를 37℃에서 5분간 반응시킨 후, 상기 참고예 5에서 분리된 각 실험군의 혈청 0.05㎖를 첨가하였다. 상기와 같이 혈청을 첨가한 다음 37℃에서 10분간 반응시키고, 희석반응 정지액 3.0㎖를 넣었다. 그 다음, 570㎚에서 흡광도를 측정하고 검량선에 준하여 활성도를 산정하였다. 이때 혈청 중의 LDH 활성도는 Wroblewski 단위로 나타내었다.

상기와 같은 LDH 활성도의 실험 결과는 다음 표 6에 나타내었다.

	LDH 활성(Wroblewski unit)
NOR	360.21±19.52
CON	505.11±8.32
VTC	411.98±27.62
GF Ι	428.12±31.54
GF Ⅱ	424.24±16.81
GF Ⅲ	387.87±33.61

표 6을 참조하면, LDH 활성은 대조군인 CON(505.11±8.32unit)이 정상군인 NOR(360.21±19.52unit)에 비해 약 1.4배 정도의 유의적인 증가를 나타내었다. 반면, 잎새버섯 추출물을 투여한 실험군(GF 군)에서는 LDH 활성이 대조군에 비하여 현저히 낮은 수치를 나타냈다. 즉, GF Ⅰ군(428.12±31.54unit), GF Ⅱ군(424.24±16.81unit) 및 GF Ⅲ군(387.87±33.61unit) 모두 대조군과 비교하여 각각 15.2, 16.0 및 23.2%로 유의성 있게 LDH 활성이 낮았다.

5-4. γ- glutamyl transpeptidase(γ- GTP )

γ-GTP는 간세포의 변성이나 괴사를 초래하는 효소로서, 간손상에 있어서 민감하게 반응하므로, 잠재성을 지닌 간 장애의 분류 및 급성 간염 발병의 조기 진단에 필수적인 요소이다. 이러한 γ-GTP는 간 조직 손상 시 혈중으로 다량 유출되어 그 활성이 증가되는 것으로 알려져 있다

γ-GTP의 효소 활성도는 5-아미노 살리신산법에 준하여 조제된 아산제약의 키트(kit)를 사용하여 측정하였다. 먼저, 키트 중 기질액 1.0㎖를 37℃에서 5분간 반응시킨 후, 상기 참고예 5에서 각 실험군으로부터 분리된 혈청 0.02㎖를 첨가한 뒤 37℃에서 20분간 반응시켰다. 그 다음으로, 키트 중 정색시액 3.0㎖를 첨가하여 실온에서 10분간 방치시킨 후, 60분 이내에 635㎚에서 흡광도를 측정하고 검량선에 준하여 활성도를 산정하였다. 이때의 활성단위는 혈청 ㎖당 mU로 나타내었다.

상기 각 실험군에 대한 γ-GTP 효소 활성도 실험 결과는 다음 표 7에 나타내었다.

	γ-GTP 활성(mU/㎖)
NOR	5.78±2.42
CON	14.77±2.67
VTC	5.81±2.31
GF Ι	10.28±1.56
GF Ⅱ	7.71±2.28
GF Ⅲ	8.08±3.34

표 7을 참조하면, 대조군인 CON(14.77±2.67mU/ml)이 정상군인 NOR(5.78±2.42mU/ml)에 비해 약 2.5배 정도의 증가를 나타내었다. 반면, 잎새버섯 추출물을 투여한 시료투여군(GF 군)에서는 대조군(CON)에 비하여 활성이 크게 낮아졌는데 즉, GF Ⅰ군(10.28±1.56mU/ml), GF Ⅱ군(7.71±2.28mU/ml) 및 GF Ⅲ군(8.08±3.34mU/ml) 모두 대조군(CON)과 비교하여 각각 30.4, 47.8 및 45.3%로 γ-GTP가 유의적인 감소를 나타내었다. 이것은 잎새버섯 추출물이 사염화탄소에 의하여 발생되는 간 조직의 손상이나 간 세포막을 안정화시켜 나타나는 결과라고 추정된다.

5-5. 알부민( Albumin )

혈청 중의 알부민 함량은 혈청 단백질 중 약 60%를 차지하며, 알부민은 혈액 내에서 빌리루빈(bilirubin), 지방산, 비타민 및 약물 등의 각종 성분을 결합, 운반하거나 혈관의 삼투압을 유지하는 역할을 한다. 알부민은 간에서 생성되는 단백질이며, 간기능이 저하되면 알부민의 감소가 나타난다. 사염화탄소에 의한 간 손상에서도 소포체(endoplasmic reticulum)의 변화로 인하여 단백질 합성이 저하된다고 보고되어 있다. 혈중 알부민의 수치가 유의성 있게 감소되면, 광범위하고 만성적인 간 장애를 의심할 수 있다.

이러한 혈청 중의 알부민 함량은 B.C.G법에 준하여 조제된 아산제약의 키트(kit)를 사용하여 측정하였다. 먼저, 상기 참고예 5에서 분리한 각 실험군의 혈청 0.02㎖에 키트 중 정색시액 5.0㎖를 첨가한 후 실온에서 10분간 방치시켰다. 이러한 반응액을 30분 이내에 630㎚에서 흡광도를 측정하고 검량선에 준하여 알부민 함량을 정량하였다.

상기와 같은 알부민 함량 측정 결과는 다음 표 8에 나타내었다.

	알부민(g/㎗)
NOR	3.10±0.09
CON	2.05±0.97
VTC	3.09±0.31
GF Ι	2.87±0.28
GF Ⅱ	3.13±0.18
GF Ⅲ	3.14±0.32

표 8을 참조하면, 알부민 함량은 사염화탄소만을 처리한 대조군인 CON이 정상군인 NOR(3.10±0.09g/㎗)에 비해 2.05±0.97g/㎗로 33.9%의 감소를 나타내었다. 반면, 잎새버섯 추출물(GF group)과 양성대조군(VTC)을 투여한 실험군에서는 대조군에 비하여 알부민 함량이 유의성 있게 높았으며 정상군(NOR)과는 차이가 없는 것으로 나타났다. 혈중 알부민 함량은 간 손상을 받게 되면 그 함량이 감소되는 것으로 알려져 있다. 상기 본 발명 실험예의 결과에서 시료투여군(GF)을 대조군(CON)과 비교하였을 때, 알부민 함량이 농도 의존적으로 유의성 있게 높아지는 것을 확인할 수 있으며, 이는 사염화탄소로 인해 알부민 함량이 감소되는 것을 잎새버섯 추출물이 크게 완화시키는 것을 보여준다.

5-6. 단백질( Total protein ) 함량

혈청 중의 총 단백질(total protein) 함량은 간 및 세포 내피계에 있어서 단백질의 합성 및 간질환과 영양 장애의 지표로 사용된다. 또한 여러 가지 인자 즉, 간장애의 정도, 특성과 기간, 영양상태, 순환장애 및 아미노산 흡수 등에 의해 크게 달라질 수 있다.

혈청 중의 단백질 함량은 Biruet법에 준하여 조제된 아산제약의 키트(kit)를 사용하여 측정하였다. 상기 참고예 5에서 분리된 각 실험군의 혈청 0.05㎖에 키트 중 정색시액 5.0㎖을 첨가한 후 37℃에서 30분간 반응시킨 뒤 30분 이내에 540㎚에서 흡광도를 측정하여 검량선에 준하여 단백질 함량을 정량하였다.

상기에서 측정된 각 실험군의 단백질 함량 분석의 결과는 다음 표 9에 나타내었다.

	총단백질(g/㎗)
NOR	6.24±0.22
CON	5.05±0.26
VTC	6.00±0.44
GF Ι	5.88±0.18
GF Ⅱ	5.95±0.42
GF Ⅲ	6.01±0.13

표 9를 참조하면, 혈청 중 총 단백질 함량은 대조군인 CON(5.05±0.26g/dL)이 정상군인 NOR(6.24±0.22g/㎗)에 비해 19.1%의 유의성 있는 감소가 나타나는 것을 확인할 수 있다. 이는 사염화탄소 처리로 인하여 간 손상이 유발되면 간 기능 중의 하나인 단백질 합성이 저하된다는 보고와 일치하는 결과이다.

반면, 잎새버섯 추출물을 투여한 실험군(GF)에서 총 단백질의 함량이 대조군(CON)에 비하여 유의성 있게 높았으며 GF Ⅱ군(5.95±0.42g/㎗)과 GF Ⅲ군(6.01±0.13g/㎗)은 정상군(NOR)과 비교하여 유의적 차이가 없는 것으로 나타났다.

5-7. HDL -콜레스테롤( high density lipoprotein - cholesterol )

HDL-콜레스테롤은 간 이외의 조직에서 콜레스테롤을 간으로 운반하여 콜레스테롤의 운반과 배설을 촉진하는 작용이 있으며, HDL-콜레스테롤의 함량은 고지혈증 발병과 역상관 관계에 있다. 즉, HDL-콜레스테롤 함량이 상승되면, 관상동맥경화증을 비롯한 각종 동맥경화증을 예방할 수 있는 것으로 해석할 수 있다. 또한, 반대로 HDL-콜레스테롤 함량이 저하되면 이런 질환의 위험신호로 여겨지는데, 이는 흡연, 고혈압 및 비만 등이 그 감소 요인이 된다고 알려져 있다. 간경변증 환자의 혈청 중 HDL-콜레스테롤의 함량은 유의하게 감소되는데, 이는 간장기능의 저하로 인한 간세포에서의 HDL 아포단백질(apoprotein)의 합성저하가 일차적인 원인이다

이러한 혈청 중의 HDL-콜레스테롤 함량은 Richmond의 효소법에 준하여 조제된 아산제약의 키트(kit)를 사용하여 측정하였다. 상기 참고예 5에서 분리된 각 실험군의 혈청 0.2㎖에 키트 중 침전시액 0.2㎖를 첨가한 후 잘 혼합하고 실온에서 10분간 방치하였다. 그 다음 3,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 얻은 상층액 0.1㎖를 취해 키트 중 효소시액 3.0㎖를 첨가한 뒤 37℃에서 5분간 반응시킨 것을 500㎚에서 흡광도를 측정하고 검량선에 준하여 HDL-콜레스테롤 함량을 정량하였다.

상기에서 측정된 각 실험군의 HDL-콜레스테롤 함량 결과는 다음 표 10에 나타내었다.

	HDL-콜레스테롤(㎎/㎗)
NOR	41.40±7.71
CON	21.40±7.63
VTC	32.88±5.96
GF Ι	27.19±6.18
GF Ⅱ	29.77±4.81
GF Ⅲ	28.87±5.84

표 10을 참조하면, HDL-콜레스테롤 함량은 대조군인 CON(21.40±7.63㎎/㎗)이 정상군인 NOR(41.40±7.71㎎/㎗)에 비해 약 48.3%의 감소를 나타내었다. 또한, 잎새버섯 추출물을 농도별로 투여한 GF Ⅰ군(27.19±6.18㎎/㎗), GF Ⅱ군(29.77±4.81㎎/㎗) 및 GF Ⅲ군(28.87±5.84㎎/㎗) 모두 대조군(CON)과 비교하여 각각 21.2, 28.1 및 25.9%로 유의성 있게 HDL-콜레스테롤 함량이 증가한 것을 확인할 수 있었다.

5-8. 중성지방( Triglyceride )

지질대사의 장애로 인한 간 조직에서 지방, 특히 중성지방이 간 중량의 5%를 차지하는 경우를 지방간이라고 한다. 중성지방은 글리세롤(glycerol)과 지방산의 에스테르(ester) 화합물로서 대표적인 에너지원이다. 음식물로부터 섭취된 중성지방은 모노글리세리드(monoglyceride)와 지방산으로 소화되어 소장에서 흡수되고, 임파관에서 새로운 중성지방인 카일로마이크론(chylomicron)으로 재합성된다. 이들은 주로 간장과 피하조직에 저장되며, 지방조직에 저장된 중성지방은 에너지원으로 당이 부족할 때 비에스테르화 지방산(nonesterified fatty acid, NEFA)과 글리세롤(glycerol)로 분해되어 혈중에 방출된다. 이때, 에너지원으로 사용되고 남은 비에스테르화 지방산은 간에서 다시 중성지방으로 변하고, 이것이 다시 혈중에 유입되면 내인성 중성지방이 되어 지방조직에 흡수, 저장된다.

상기 참고예 5에서 분리된 각 실험군의 혈청에 함유된 중성지질의 함량은 효소법에 준하여 조제된 아산제약의 키트(kit)를 사용하여 측정하였다. 각 실험군의 혈청 0.02㎖에 키트 중 효소용액 3.0㎖를 첨가한 후 37℃에서 10분간 반응시켜 60분 이내에 550㎚에서 흡광도를 측정하고 검량선에 준하여 중성지질 함량을 정량하였다.

상기에서 측정한 각 실험군에서 혈청에 함유된 중성지질의 함량은 다음 표 11에 나타내었다.

	중성지방(㎎/㎗)
NOR	30.59±7.03
CON	54.68±9.86
VTC	32.78±8.22
GF Ι	40.77±6.50
GF Ⅱ	38.84±8.87
GF Ⅲ	36.28±3.02

표 11을 참조하면, 혈청 중의 중성지방 함량은 대조군인 CON(54.68±9.86㎎/㎗)이 정상군인 NOR(30.59±7.03㎎/㎗)에 비해 약 2배 가량의 증가를 나타내었다. 반면, 잎새버섯 추출물을 투여한 GF Ⅰ군(40.77±6.50㎎/㎗), GF Ⅱ군(38.84±8.87㎎/㎗) 및 GF Ⅲ군(36.28±3.02㎎/㎗) 모두 대조군(CON)과 비교하여 각각 중성지방의 함량이 25.4, 29.0 및 33.7%정도 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 혈액 중 콜레스테롤과 중성지방의 감소로 간에서 지방대사 및 지단백질의 합성이 회복된다고 보고가 있는 바, 이로써, 잎새버섯 추출물을 투여한 실험군(GF)이 대조군(CON)에 비하여 간 손상 정도가 약해진 것을 추정할 수 있다.

5-9. 총 콜레스테롤( Total cholesterol )

지질대사와 지방간의 중요 지표 중 하나인 콜레스테롤은 인지질과 함께 세포막의 성분으로 담즙산의 전구체로써 중요한 역할을 하며, 간 손상 시 배설장애로 인한 고 콜레스테롤 혈증이 나타나는 등 체내 지질대사 이상의 지표로서 중요하다. 이와 유사한 관상동맥질환, 지방대사의 이상, 췌장 및 간장질환 등의 경우도 총 콜레스테롤의 농도가 증가하는 것으로 보고되었다

상기 참고예 5의 각 실험군 혈청에 함유된 총 콜레스테롤의 함량은 효소법에 준하여 조제된 아산제약의 키트(kit)를 사용하여 측정하였다. 혈청 0.02㎖에 효소시액 3.0㎖를 첨가한 후 37℃에서 5분간 반응시켜 60분 이내에 500㎚에서 흡광도를 측정하고 검량선에 준하여 총 콜레스테롤 함량을 정량하였다.

상기에서 측정된 총 콜레스테롤 함량 수치를 다음 표 12에 나타내었다.

	총 콜레스테롤(㎎/g)
NOR	37.10±5.07
CON	58.19±8.03
VTC	42.67±6.24
GF Ι	50.32±8.20
GF Ⅱ	50.19±4.79
GF Ⅲ	46.62±3.81

표 12를 참조하면, 대조군인 CON(58.19±8.03㎎/g)이 정상군인 NOR(37.10±5.07㎎/g)에 비해 약 1.5배의 증가를 나타냈다. 잎새버섯 추출물을 투여한 경우, GF Ⅰ군(50.32±8.20㎎/g), GF Ⅱ군(50.19±4.79㎎/g) 및 GF Ⅲ군(46.62±3.81㎎/g) 모두 대조군(CON)과 비교하여 총 콜레스테롤 함량이 각각 13.5, 13.7, 19.9%로 낮았으나 유의적인 차이는 없었다. 이와 같이, 잎새버섯 추출물이 랫트 모델에서 총 콜레스테롤 함량의 감소를 나타낸 것은 간혈류량의 증가로 인한 간 보호작용으로 인한 것으로 추측할 수 있다.

실험예 6. 간균질액으로부터 과산화지질 함량 분석

과산화지질은 세포 내 산화적 스트레스의 증가 즉, 유리기 생성의 증가 및 항산화적 방어력의 감소로 인하여 증가되는데, 이 반응은 여러 가지 독성 화합물이나 약물에 의한 간 손상 발생의 가장 중요한 기전의 하나로 인정되고 있다. 간세포막 손상의 주된 작용은 phosphatidylcholine hydroperoxide가 관련되는 것으로 보고되고 있다. 과산화지질은 지질성분인 불포화지방산이 산소에 노출됨으로써 과산화되어 일어나며, 특히 생체 내 과산화 현상은 미토콘드리아(mitochondria), 마이크로솜(microsome), 적혈구(erythrocyte) 및 혈소판(platelet) 등의 불포화지방산과 인지질 함량이 풍부한 세포막에서 쉽게 일어날 수 있다.

생체막 손상 정도를 나타내는 조직 과산화지질은 말론디알데히드(malondialdehyde, MDA)의 경우, 2분자의 TBA(Thiobarbituric acid)와 반응하면 특징적인 색깔을 나타내므로, TBA 반응성 산물량을 과산화지질의 정량에 이용하였다.

사염화탄소 투여에 의해 생성된 과산화지질함량은 Ohkawa 등의 TBA(thiobarbituric acid)법에 준해 측정하였다. 즉, 간 균질액 1.0㎖에 TBA solution 2.0㎖를 첨가한 후 15분간 95℃ 수욕상에서 가열한 뒤 실온에서 방냉시켰다. 이를 2,000rpm에서 20분간 원심분리한 후 532㎚에서 흡광도를 측정하였다. 과산화지질함량은 검량 표준곡선에 따라 간 조직 1g당 생성된 말론디알데히드 nmole로 다음 표 13에 나타내었다.

	MDA(n mole/g of tissue)
NOR	6.21±2.86
CON	15.25±3.77
VTC	8.88±2.01
GF Ι	11.51±3.52
GF Ⅱ	9.72±3.70
GF Ⅲ	10.42±1.93

표 14를 참조하면, 간조직 내의 과산화지질 함량은 대조군(15.25±3.77nm)이 정상군(6.21±2.86nm)에 비해 약 2배의 증가를 나타내었다. 잎새버섯 추출물을 농도별로 투여한 GF Ⅰ군(11.51±3.52 nm), GF Ⅱ군(9.72±3.70nm) 및 GF Ⅲ군(10.42±1.93nm) 모두 사염화탄소만을 처리한 대조군(CON)과 비교하여, 각각 24.5, 36.3 및 31.7%로 과산화지질 함량의 유의적 감소를 나타내었다.

본 실험 결과 실험 모델의 사염화탄소 처리(CON)는 간 조직내의 과산화지질 함량을 증가시켰으며, 이것은 사염화탄소를 투여함으로써 간 조직 과산화지질의 함량이 정상군에 비해 현저하게 상승한다는 기존의 보고와 일치하는 것이다. 또한, 외래물질(xenobiotics)의 대사시 약물대사 효소계로부터 생성된 여러 유리기들이 과산화지질을 증가시킨다는 보고와도 일치하였다.

상기와 같이 잎새버섯 추출물을 투여한 군(GF)이 사염화탄소만을 투여한 대조군(CON)보다 과산화지질이 유의성 있게 감소된 것은, 잎새버섯 추출물이 사염화탄소에 의하여 생성된 대사 산물인 유리기의 생성을 억제하거나 소거하는 역할을 하기 때문이다. 이에 따라, 잎새버섯 추출물은 높아진 간 조직 내의 과산화지질을 감소시킴으로써, 간조직의 손상을 완화시키는 것으로 판단된다.

참고예 6. 간독성 실험을 위한 실험동물 모델로부터 RNA 분리

상기 참고예 3에서 6개 군의 랫트 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 상기 각 군에서 간을 일정량(0.5g) 취하여 50㎖ 튜브(Falcon tube)에 넣고, DEPC(Diethyl Pyrocarbonate) 처리한 물을 용매로 하여 제조된 PBS(Phosphate Buffered Saline) 완충액을 5㎖ 가하고, 잘게 세절하여 2,000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 그 다음, 상층액을 제거하고 10배량의 Trizol reagent(Invitrogen, USA)를 첨가하여 피펫팅(pipetting)을 수회 실시하여 추출하였다. 이것을 eppendorf-tube에 1ml씩 분주하여 실온에서 5분간 방치한 다음 클로로포름(chloroform)과 이소아밀알코올(isoamylalcohol) 혼합액(24:1) 200㎕ 첨가하여 교반하였다. 실온에서 30분 방치한 다음, 15,000rpm에서 15분간 원심분리하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA에 이소프로판올(isopropanol)을 첨가, 몇 차례 전도한 후 실온에서 5분간 방치하고 15,000rpm에서 30분간 원심분리하여 RNA를 침전시켰다. 침전된 RNA에 냉각된 80% ethanol을 가하고 15,000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액의 에탄올(ethanol)을 제거하고 실온에서 건조시켜 DEPC 처리한 물(H₂O)를 가하여 용해시켰다. 용해된 total RNA의 농도는 260㎚에서 흡광도를 측정하여 확인한 후, 50㎍/50㎕의 농도로 희석, 분주하여 -70℃에 보관하였다.

실험예 7. PCR ( Polymerase Chain Reaction ) 분석

상기 참고예 3의 랫트 모델의 간 조직에 대한 사이토카인과 케모카인 등 정보전달물질의 발현변화를 알아보기 위하여, 간 조직으로부터 total RNA를 분리한 다음, PCR을 통하여 상기 각 사이토카인 또는 케모카인 등의 유전자가 발현되는 정도를 알아보았다. 본 발명의 실험예에서는 MCP-1, MMP-2, IL-6, collagen(Ι) 및GAPDH 유전자를 대상으로 실험하였다.

사이토카인은 면역계, 조혈계, 내분비계 등 생체의 여러 가지 고차기능을 유지하는데 중요한 생리활성물질이다. 사이토카인은 한 종류가 다양한 세포에 작용하여 여러 가지 활성을 나타내거나 여러 종류의 사이토카인이 단일 세포에 작용하여 동일한 활성을 나타낸다. 이러한 사이토카인의 기능적 특성은 최근 사이토카인 수용체의 cDNA의 클로닝(cloning) 및 사이토카인의 세포 내 정보전달 연구가 급속히 진행됨으로서 밝혀지고 있다.

염증성 사이토카인의 하나인 IL-6(Interleukin-6)는 다기능성 림포카인(multi-functional lymphokine)으로 면역계 조절에 중요한 역할을 담당하고 있다. 생체 내에서 T세포의 분화 및 증식, B세포의 자극, 신경세포의 분화, 파골세포 형성, 간세포에서 급성기 단백질의 생산, 동맥경화질환의 유도 등 다양한 기능을 가지며 면역기능조절에 의한 생체의 항상성을 유지하는데 역할을 한다.

또한, 케모카인은 염증성 세포의 직접적인 유도를 통하여 혈관과 세포막 관련 질환의 진전에 관여하며, 외래분자에 의해 세포가 손상이 되면 CC 케모카인의 하나인 MCP-1(Monocyte chemoattractant protein)의 mRNA의 발현이 현저히 증가하여 손상된 세포로의 단핵백혈구(monocyte), 대식세포(marcrophage) 등과 같은 면역세포의 침윤을 유도하는 것으로 알려져 있다.

아울러, 암의 전이 과정 중에 종양세포의 유리와 침윤에 관여하는 MMP(matrix metalloproteinase)가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히, MMP-2(72kDa type Ⅳ collagenase, gelatinase A)와 MMP-9(92kDa, type Ⅳ collagenase, gelatinase B)이 기저막의 주요 콜라겐(collagen)인 콜라겐(Ⅳ)(type Ⅳ collagen)을 분해하여 암의 침윤과 전이를 일으킨다고 알려져 있다.

상기의 유전자가 발현하는 정도를 알아보기 위한 본 발명의 실시예에 따른 실험 과정은 다음과 같다.

먼저, 상기 참고예 6에서 각 실험군의 간 조직으로부터 분리한 total RNA로부터 cDNA를 합성하기 위하여, 상기 total RNA에 RNA/primer mixture를 첨가하여 Thermo-cycler(DNA증폭기,PC-320, ASTEC, Japan)에서 65℃, 5분간 반응시켰다. 여기에 reaction mixture(Invitrogen, USA)를 각 튜브(tube)에 4.3㎕ 첨가하여 42℃에서 2분간 반응시켰다. 반응시킨 튜브에 0.15㎕의 Superscript Ⅲ를 첨가하여 42℃, 50분과 70℃, 15분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 여기에 RNaseH를 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시켜 남은 RNA를 제거하였다. 합성된 cDNA는 -20℃에서 보관하면서 PCR실험에 이용하였다.

PCR 반응은 시료당 1.5㎕의 상기 cDNA를 분주하여 사용하였다. 그리고 reaction mixture는 25mM 염화마그네슘(MgCl₂)을 포함하는 10×PCR buffer(TakaRa, Japan) 2.35㎕, sense-primer 0.5㎕, antisense primer 0.5㎕, dNTP Mixture(2.5mM each, Takara, Japan) 2.5㎕ 그리고 0.125㎕의 templated DNA를 첨가하여 제조하였다. 1.5㎕의 cDNA에 reaction mixture 23.5㎕을 첨가하여 혼합한 후 DNA 증폭기(PC-320, ASTEC, Japan)를 이용하여 반응시켰다. PCR 반응 조건으로 첫 cycle에서 95℃에서 9분간 수행하였고 나머지 cycle에서는 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분간 20 cycles을 수행하여 PCR 산물을 얻었다. PCR 산물은 EtBr(ethidium bromide)이 포함된 1.2% 아가로즈 젤(agarose gel)상에서 전기영동(Mupid-2plus, Advance, Japan)하고 자외선 조사장치(Ultraviolte Transilluminator, Prime-tec Co, Korea)와 Biocapt program을 이용하여 DNA 마커(DNA ladder)와 비교, 분석하여 발현된 DNA 밴드를 확인하였다.

여기서, 상기 reaction mixture에 포함된 sense-primer 및 antisense primer에 대한 정보는 다음 표 14에 나타내었다.

		primer(5'→3')	온도(℃)
MCP-1	센스(Sense)	CACTGGCAAGATCCCAATG	58.6
	안티센스(Antisense)	GTGCTTGAGGTGGTTGTGGAAA
MCP-2	센스(Sense)	ATCTGGTGTCTCCCTTAC	58
	안티센스(Antisense)	GTGCAGTGATGTCCGACAAC
IL-6	센스(Sense)	CCACCCACAACAGACCAGTAT	51.5
	안티센스(Antisense)	TCCAGAAGACCAGAGCAGATT
collagen(Ι)	센스(Sense)	CCCACGTAGGTGTCCTAAAGT	55
	안티센스(Antisense)	CCGTGGTGCTAAAATAATAAA
GAPDH	센스(Sense)	CTCTACCCACGGCAAGTTCAA	58
	안티센스(Antisense)	GGATGACCTTGCCCACAGC

상기와 같은 PCR 수행 후, 상기 5개의 유전자가 발현되는 정도를 도 6 및 도 7에 나타내었다.

도 6은 본 발명의 실험예 7에 따라 PCR을 수행한 다음, 자외선 조사장치를 이용하여 아가로즈 젤 상의 DNA를 관찰한 사진이며, 도 7은 본 발명의 실험예 7에 따라 PCR을 수행한 다음 Biocapt program(Vilber Lourmat, Cedex, France)을 이용하여, 도 6에 나타난 밴드(band)의 진하기(density)를 측정한 다음, 이 수치를 Microcal(TM) Origin version 6.0(Microcal Software Inc., Northampton, USA)을 사용하여, NOR 실험군의 유전자 발현 정도를 기준으로 각 실험군의 유전자 발현 정도를 나타낸 그래프이다.

도 6 및 도 7을 참조하여 먼저 IL-6의 발현에 대하여 설명하면, 참고예 3의 정상군(NOR)에서와 같이 사염화탄소투여군(CON)에 대한 사염화탄소 처리는 간세포에 있어 IL-6의 발현에 영향을 주지 않지만, 잎새버섯 추출물의 투여가 IL-6의 발현을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한 이러한 효과는 추출물의 첨가 농도에 의존하여 발현이 증가하였다. 이것은 잎새버섯 추출물이 간 조직에서 IL-6의 분비를 특이적으로 촉진시킨 것으로 판단할 수 있으며, 사염화탄소 유도 간 손상에 대하여 어떤 기능을 할 것이라고 예상된다.

다음으로, 잎새버섯 추출물이 MMP-2 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, 사염화탄소투여군(CON)에서는 MMP-2의 발현이 증가한 반면, 시료투여군(GF 군)에서는 MMP-2의 발현이 억제되는 것으로 나타났다.

또한, 본 실험에서 사염화탄소투여군(CON)에서 MCP-1의 발현량이 증가한 반면, 시료투여군(GF 군)에서는 MCP-1의 발현이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.

제1형 콜라겐의 발현은 시료 간에 차이는 없었으나 GF Ⅲ군에서 제1형 콜라겐의 발현을 낮게 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

본 실험 결과, 랫트 모델에서 사염화탄소처리에 의해 손상된 간조직에서는 IL-6의 발현감소와 MCP-1과 MMP-2의 발현 증가가 mRNA 수준에서 확인되었다. 또한, 랫트 모델에 대한 사염화탄소 처리 전에 잎새버섯 추출물의 처리한 GF 군에서는 상기와 같은 사염화탄소의 효과를 상쇄시켰다. 즉, GF 군에서는 IL-6의 발현 증가, MCP-1과 MMP-2 mRNA의 발현 감소가 유도되었다.

참고예 7. 간독성 실험을 위한 실험동물 모델로부터 단백질 분리

참고예 6의 실험에서 사용한 같은 시료의 간을 일정량 취한 다음, 염화칼륨(KCl)이 포함되지 않은 PBS(Phosphate Buffered Saline) 용액 700㎕를 첨가한 후 잘게 세절하여 15,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 그 다음으로, 상층액을 취하여 동량의 2×sample buffer와 혼합하였다. 여기서, 2×sample buffer는 0.5M 트리스 완충용액(Tris-HCl, pH6.8) 2㎖, 10% SDS(sodium dodecyl sulfate) 4㎖, 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol) 1.2㎖, 글리세롤(glycerol) 2㎖, 브로모페놀 블루(bromophenol blue) 3㎎을 혼합하여 만든다. 상기에서 원심분리 후 상층액과 2×sample buffer의 혼합액은 100℃에서 3분간 처리한 후 얼음에서 냉각시켰다. 이것을 튜브(tube)에 일정량씩 분주하여 -20℃에서 보관하면서 SDS-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)에 이용하였다.

실험예 8. Western blot 분석

상기 참고예 3 각 실험군의 간 조직에 대한 사이토카인과 케모카인등 정보전달물질의 발현변화를 western blot 분석을 이용하여 조사하였다.

상기 참고예 7에서 추출된 단백질들은 10% SDS-PAGE방법을 사용하여 24mA에서 약 40분 정도 전기영동(Mini transblot, Biorad Co., USA)한 후 젤(gel)을 분리하였다. 젤(gel)상의 단백질은 전사장치(Atto, AE6675, Japan)를 이용하여 1시간정도 PVDF(Poly viniridene difluoride) 멤브레인(membrane)으로 전사시켰다.

전사된 멤브레인은 TTBS(Tris-buffered Saline with tween-20)용액에 용해한 5% skim milk PBS로 블로킹(blocking) 시킨 후, TTBS에 5분씩 2회 워싱(washing)을 수행하였다. 미리 희석시켜 준비해둔 3가지의 1차항체(β-actin ; Biolegand, 42KDa, Japan, IL-6 ; Santacruz, 28KDa, USA, MCP-1 ; Abcam, 25KDa, England)를 PVDF 멤브레인과 하룻밤 반응시켰다. 여기서, β-actin은 본 실험예의 control로 사용하였다. 1차 항체 반응 종료 후 TTBS로 각각 5분, 10분, 10분 동안 3회 세척하였다. 그 다음으로, 상기 사용된 1차항체의 종류에 따라 각각 2차 항체인 Goat anti Rabbit IgG(AP132A, Chemicon International, Inc., USA), Rabbit anti Goat IgG(AP106A, Chemicon International, Inc., USA)로 2시간 반응시킨 후에 TTBS로 3회 세척하였다. 이것을 TBS(Tris buffered saline) 완충액으로 헹군 후 AP color reagent(No 170-6432, BIORAD, USA)로 발색시켜 증류수로 세척 후 건조시켜 밴드를 확인하였다.

상기의 western blot 실험 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.

도 8은 본 발명의 실험예 8에 따라 AP color reagent로 발색시킨 젤 사진, 도 9는 도 8에 나타난 밴드(band)의 진하기(density)를 측정한 다음, 이 수치를 Microcal(TM) Origin version 6.0(Microcal Software Inc., Northampton, USA)을 사용하여, NOR 실험군의 유전자 발현 정도를 기준으로 각 실험군의 유전자 발현 정도를 나타낸 그래프이다.

도 8 및 도 9를 참조하면, IL-6는 상기 실험예 7에 따른 RT-PCR 결과와 같은 경향을 보였다. 도면에서 보는 바와 같이, 사염화탄소 처리구로 감소된 밴드(band)가 GF 군에서 잎새버섯 추출물 처리로 회복되었으며, 또한 그 효과도 처리되는 잎새버섯 추출물의 농도가 높아질수록 뚜렷하였다. 반면, mRNA 수준에서 발현의 차이가 확인된 MMP-2의 경우, Western blot 분석에서는 큰 차이가 보이지 않았다. 이는 western blot 재료 샘플링 시기의 문제거나, 세포 내 RNA 수준의 변화가 아직 단백질 수준의 변화로 반영되지 않은 것으로 판단된다.

MCP-1의 경우에는 간 손상이 유발된 사염화탄소 처리구(CON)에서 강한 band가 확인되었고, 시료 처리구(GF)에서는 반대의 경향이 나타났다.

상기와 같은 결과로 IL-6와 MMP-2는 사염화탄소에 의한 간 손상과 밀접한 관계가 있다는 것을 시사하고 있다.

이 연구는 잎새버섯 추출물이 간세포내에 작용하여 특이적으로 IL-6의 발현에 관계된다는 것을 최초로 보고하고 있으며 앞으로 어떠한 메카니즘에 의해 이러한 유도가 일어나는지와 다른 정보 전달 물질을 포함한 간손상 회복과 관련된 인자들의 상호작용도 연구되어야 할 것으로 판단된다.

실험예 9. 간세포 조직 관찰

간의 형태학적 관찰은 동물실험 종결 후 해부 즉시 신선한 간 조직을 적출하고, 간 조직편을 1mm³크기로 절단하여 0.1M PBS(phosphate buffer solution, pH 7.4)로 조제한 2.5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 용액에 2-4시간 정도 전고정시켰다. 전고정된 간 조직을 4℃에서 동일한 PBS로 10분 간격으로 3회 세척하였다. 이것을 PBS로 조제한 1% osmium tetraoxide에 다시 2시간 고정한 후 50-100%까지 순차적인 상승농도의 알콜(alcohol)로 탈수시켰으며, propylene oxide로 완전 탈수시킨 후 Epon 812에 포맷시켰다. Porter-Blum MT-2 ultramicrotome으로 1㎛ 두께의 semi-thin section을 만들어 0.5% toluene blue로 간이 염색되는 과정을 거쳐 관찰 대상 부분을 정한 뒤 초박편 표본을 만들어 포화 uranyl acetate와 lead citrate로 이중 염색하여 투과전자현미경(H 600, HITACHI Ltd., Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.

상기와 같이 잎새버섯 추출물을 투여한 후 사염화탄소를 처리한 흰쥐(GF 군)의 간조직을 투과전자현미경으로 관찰한 결과는 도 10a 내지 도 10f에 나타내었다.

도 10a는 본 발명 참고예 3의 NOR 실험군 간세포 조직을 투과전자현미경으로 관찰한 사진, 도 10b는 본 발명 참고예 3의 CON 실험군 간세포 조직을 투과전자현미경으로 관찰한 사진, 도 10c는 본 발명 참고예 3의 VTC 실험군 간세포 조직을 투과전자현미경으로 관찰한 사진, 도 10d는 본 발명 참고예 3의 GF Ι 실험군 간세포 조직을 투과전자현미경으로 관찰한 사진, 도 10e는 본 발명 참고예 3의 GF Ⅱ 실험군 간세포 조직을 투과전자현미경으로 관찰한 사진, 도 10f는 본 발명 참고예 3의 GF Ⅲ 실험군 간세포 조직을 투과전자현미경으로 관찰한 사진이다.

도면을 참조하면, 정상군(NOR)의 경우 핵의 핵막은 둥글고 규칙적이었으며 간조직의 세포막이 뚜렷하게 보였다. 미토콘드리아(Mitochondria)내의 크리스타(cristae)도 잘 관찰되었고 리보좀(ribosome), 골지체, 글리코겐(glycogen) 및 소포체(ER : endoplasmic reticulum)도 골고루 분포하여 정상소견을 보였다. 반면, 사염화탄소만을 처리한 대조군(CON)에서는 핵의 핵막이 매우 불규칙하며 핵질의 응축현상도 관찰되었다. 세포질의 손상과 미토콘드리아가 일부 유지되고 있었으나 대부분 팽창이 있었으며, 리보좀도 일정하지 않고 ER의 분포도 거의 나타나지 않았다. 또한 큰 지방질이 많이 나타났고, 조직 전반에 걸쳐 세포질 내 공포화(vacuolization)현상이 관찰되었으며, 세포질의 모든 구조물들이 퇴화되는 양상을 보였다. 이러한 현상은 사염화탄소 투여 시 간세포가 손상을 받게 되면 주로 조면소포체에 초기 변화가 나타나며 막에 부착된 리보좀이 탈락되면서 평활막성 소포괴를 형성한다는 보고와, 사립체가 손상되어 결국 간세포의 종창을 야기시킨다는 보고와, 사염화탄소의 간세포에 대한 독성작용이 미립체 효소에 의한 활성대사물 생산에 기인한다는 보고와 유사한 결과이다.

잎새버섯 추출물의 경우(GF 군) 농도별로 투여한 GF Ⅰ군은 핵의 모양이 다소 불규칙적이고 미토콘드리아가 팽대하여 형태가 일정치 않았으나 GF Ⅱ군과 GF Ⅲ군으로 갈수록 핵의 모양이 일정하였으며 미토콘드리아가 다소 팽대하였으나 리보좀과 골지체가 잘 관찰되어 손상된 세포질이 회복하려는 경향이 관찰되었다. 이러한 형태적인 변화는 앞에서 나타난 각종 생화학적인 변화와 더불어 간에 있어서 지방대사가 촉진되며, 콜레스테롤과 LDL 및 중성지질의 저하를 가져다주는 사실을 뒷받침해주는 결과로 해석된다.

혈청 내 효소수치의 개선효과와 더불어 간장 내 과산화지질만을 특이적으로 탐지하는 것으로 이미 잘 알려진 방법으로 사염화탄소로 유도된 간장 내 과산화물은 잎새버섯 추출물을 투여함으로 과산화물의 형성이 현저하게 억제되는 것을 알 수 있었다. 이처럼 사염화탄소 투여는 간장 세포내 호흡효소의 차단으로 지질대사에 이상이 오고 그 결과 간세포의 괴사, 지방침윤, 섬유증식과 염증반응 및 과산화물의 형성이 급격히 증가하나, 잎새버섯 추출물이 산화작용을 강하게 억제함으로써 간 손상을 억제한 것으로 판단된다.

실험예 10. 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 5 마리씩의 동물에 실시예 1에 따라 조제된 잎새버섯 추출물을 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1g/㎏, 5g/㎏ 및 10g/㎏의 용량으로 1회 단회 경구투여하였다. 상기 추출물의 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 잎새버섯 추출물을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과, 본 발명의 잎새버섯 추출물은 랫트에서 10g/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 따라서, 경구 투여 중간치사량(LD50)은 본 발명의 잎새버섯 추출물 10g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

제제예 1. 정제의 제조

상기 실시예 1에 따라 제조된 잎새버섯 추출물 100.0 ㎎, 옥수수전분 90.0 ㎎, 유당 180 ㎎, 엘-하이드록시프로필셀룰로오스 18.0 ㎎, 폴리비닐피롤리돈 5.0 ㎎ 및 에탄올 적량을 균질하게 혼합하여 습식과립법으로 과립화하고 스테아린산 마그네슘 1.8 ㎎을 가하여 혼합한 후 1정이 400 ㎎이 되도록 타정하였다.

제제예 2. 연질캅셀의 제조

상기 실시예 1에 따라 제조된 잎새버섯 추출물 100.0 ㎎, 콩기름 180.0 ㎎, 황납 40.0 ㎎, 야자경화유 128.0 ㎎, 대두인지질 20.5 ㎎, 젤라틴 212.0 ㎎, 글리세린(비중 1.24) 50.0 ㎎, d-소루비톨 76.0 ㎎, 파라옥시안식향산메칠 0.54 ㎎, 파라옥시안식향산프로필 0.90 ㎎, 메칠바닐린 0.56 ㎎ 및 황색 203호 적량을 약전 제제총칙중 연질캅셀의 제법에 따라 1 캅셀 중에 함유되도록 제조하였다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

상기 실시예 1에 따라 제조된 잎새버섯 추출물 100.0 mg, 옥수수전분 83.0 mg, 유당 175.0 mg 및 스테아린산 마그네슘 2.0 mg을 균질하게 혼합하여 1캅셀에 360 mg이 함유되도록 충전하였다.

이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 간질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 의하면,

높은 간 보호 활성을 갖으며, 특히, 사염화탄소로 유발된 간 장해에 있어서, 우수한 간 기능 보호작용을 나타내고, 인체에 무해하여, 간 세포 보호 및 간 손상 예방 또는 치료용 의약품에 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (5)

1. 잎새버섯 자실체를 물로 추출한 잎새버섯 물추출물을 유효성분으로 함유하며, 사염화탄소로 유발된 지방간, 간섬유증 및 간경화로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 간질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서,

   상기 잎새버섯 물추출물은 건조된 잎새버섯 자실체를 분쇄한 시료에, 20중량배량의 증류수를 가한 후 40℃로 조절된 항온수조에서 12시간 동안 3회 반복 추출하는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
4. 삭제
5. 삭제

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