KR100795704B1 - The primer and probe for detecting hbv-dna - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PCR 교잡방법을 통해 B형 간염 바이러스의 유전자 (HBV-DNA)를 정량하는데 사용되는, 프라이머 및 프로브에 관한 것이다. 특히, 상기 B형 간염 바이러스는 adr 또는 adw 아형인 것을 특징으로 한다. The present invention relates to primers and probes, which are used to quantify the gene of hepatitis B virus (HBV-DNA) via PCR hybridization. In particular, the hepatitis B virus is characterized in that the adr or adw subtype.

B형 간염 바이러스 유전자 (HBV-DNA), PCR, 효소면역법, 화학발광법 Hepatitis B virus gene (HBV-DNA), PCR, enzyme immunoassay, chemiluminescence

Description

B형 간염 바이러스 유전자 검출용 프라이머 및 프로브 {THE PRIMER AND PROBE FOR DETECTING HBV-DNA}Primer and probe for detecting hepatitis B virus gene {THE PRIMER AND PROBE FOR DETECTING HBV-DNA}

도 1은 발색법 (효소면역기기 사용)의 개요를 나타낸다. 1 shows an outline of the color development method (using an enzyme immunoassay device).

도 2는 발광법 (화학발광측정기기 사용)의 개요를 나타낸다. 2 shows an outline of a luminescence method (using a chemiluminescence measuring instrument).

도 3은 교잡반응을 위한 증폭산물을 전기영동한 사진으로 증폭산물은 173 bp 크기를 보여준다. Figure 3 is a photograph of the electrophoresis of the amplification product for the hybridization reaction shows an amplification product size of 173 bp.

도 4는 색반응(흡광도측정)용 마이크로플레이트를 나타낸다. 4 shows a microplate for color reaction (absorbance measurement).

도 5는 발광측정기용 마이크로플레이트를 나타낸다.5 shows a microplate for a luminometer.

도 6은 발색흡광도를 이용한 표준시료의 재현성 결과를 바탕으로 작성한 표준검량곡선을 나타낸다. 6 shows a standard calibration curve based on the results of reproducibility of the standard sample using color absorbance.

도 7은 발광도를 이용한 표준시료의 재현성 결과를 바탕으로 작성한 표준검량곡선을 나타낸다. 7 shows a standard calibration curve based on the results of reproducibility of standard samples using luminescence.

도 8은 본 발명에 따른 흡광도방법과 다이진 사 제품과의 결과 비교를 나타낸다. 8 shows a comparison between the absorbance method according to the present invention and the product of Daijin Corporation.

도 9는 본 발명에 따른 발광도방법과 다이진 사 제품과의 결과 비교를 나타낸다. Figure 9 shows a comparison of the results of the luminescence method according to the present invention and products made by Daijin Corporation.

도 10은 흡광도방법과 발명도방법과의 상관관계를 나타낸다. Fig. 10 shows the correlation between the absorbance method and the invention method.

본 발명은 PCR 교잡방법을 통해 B형 간염 바이러스 (Hepatitis B virus; HBV)의 유전자를 정량하는데 사용되는, 프라이머 및 프로브에 관한 것이다. 특히, 상기 B형 간염 바이러스는 adr 또는 adw 아형인 것을 특징으로 한다. The present invention relates to primers and probes, which are used to quantify the gene of Hepatitis B virus (HBV) via PCR hybridization. In particular, the hepatitis B virus is characterized in that the adr or adw subtype.

상기 본 발명의 프라이머 및 프로브를 포함하는 HBV-DNA 검출용 키트는 한국 및 동아시아 지역에서 주로 발견되는 HBV 아형 (subtype)인 adr과 adw의 검출에 특이적으로 정확도와 정밀성이 높고, 면역검사 (효소면역법 또는 화학발광법)에 관련된 기기 중 어느 것이나 사용 가능한 호환 시스템 시약을 제공함으로써 추가 기기구입에 의한 중복 투자를 줄일 수 있으며, 예민도의 향상을 위해 신호 강도 (signal strength)를 높인다. HBV-DNA detection kit comprising the primers and probes of the present invention has high accuracy and precision for the detection of adr and adw, which are HBV subtypes (mainly found in Korea and East Asia), and immunoassay (enzyme) By providing a compatible system reagent that can be used with any of the instruments involved in immunoassay or chemiluminescence, the redundant investment in additional instrument purchases can be reduced and signal strength increased for increased sensitivity.

B형 간염 바이러스 (Hepatitis B virus; HBV)는 인체에 특이적으로 감염되는 헤파드나비리데 (Hepadnaviridae) 계통의 바이러스이다. 세계적으로 약 5 억명의 인구가 HBV에 감염되어 있는 것으로 알려져 있다. HBV의 잠복기는 60-110 일 정도이며, 다양한 정도의 임상기를 거쳐 90-95% 가 완전히 회복하고 감염에서 회복되지 않은 환자의 경우 HBV 게놈 DNA가 사람 간세포의 게놈 DNA에 삽입 및 동화되어 만성활동성 간염, 간경변증, 간암 등으로 발전하게 된다. HBV에 의한 감염은 다른 질환과 마찬가지로 만성 바이러스 감염증, 임파종 질환 및 만성 신장장애를 일으킨다. 따라서, 만성 감염은 더욱 강력한 형태의 질환으로 발전하여 결국 환자의 사망에까지 이르게 하는 치사율이 매우 높은 질환이라 할 수 있다 (Don Ganem et al., Ann. Rec. Biochem., 651(1987): R.P.Beasley et al., Lancet, 1129(1981): D.A.Shafritz et al., New England J. of Medicine, 1067(1981): S.N.Zaman et al., Lancet 1, 1357(1985)).Hepatitis B virus (HBV) is a virus of the Hepadnaviridae strain that specifically infects the human body. It is known that about 500 million people worldwide are infected with HBV. The incubation period of HBV is 60-110 days, and in patients who do not recover from infection after 90-95% complete recovery through various clinical stages, HBV genomic DNA is inserted into and assimilated into the genomic DNA of human hepatocytes and chronically active hepatitis. , Cirrhosis, liver cancer, etc. will develop. Infection with HBV, like other diseases, causes chronic viral infections, lymphoma diseases and chronic kidney disorders. Thus, chronic infection is a disease with a very high mortality rate that develops into a more powerful form of disease and eventually leads to death of patients (Don Ganem et al., Ann. Rec. Biochem., 651 (1987): RPBeasley et al., Lancet, 1129 (1981): DAShafritz et al., New England J. of Medicine, 1067 (1981): SNZaman et al., Lancet 1, 1357 (1985)).

한편, 최근 분자 생물학의 발전은 HBV의 완전한 게놈의 서열을 클로닝할 수 있도록 해 주었다 (Siddiqui, A. et. al, Proc. Natl. Aca. Sci, U.S.A Vol. 76, p4664, 1979; Sninsky, J.J. et al, Nature. Vol. 279, p346, 1979; 및 Charnay, P. et al, Nucl. Acids Res., Vol 7, p335, 1979). 또한 HBV의 다른 바이러스 단백질의 암호영역이 동정되었다 (유럽특허출원공개 No. 13828, 20251 및 38765; Galibert et al. Nature, Vol. 281, p646-650, 1979; Pasek et al., Nature Vol. 282, p575-579, 1979; 및 Valenzuela et al., Nature, Vol. 280, p815-819, 1979). HBV는 DNA 바이러스이지만 레트로바이러스와 유사하게 RNA를 주형으로 DNA 유전자를 합성하는 역전사 활성을 갖는다 (Ganem and Varmus, Annu. Rev. Biochem. 56:651-693, 1987). On the other hand, recent advances in molecular biology have enabled cloning sequences of the complete genome of HBV (Siddiqui, A. et. Al, Proc. Natl. Aca. Sci, USA Vol. 76, p4664, 1979; Sninsky, JJ et al, Nature.Vol. 279, p346, 1979; and Charnay, P. et al, Nucl.Acids Res., Vol 7, p335, 1979). Also coding regions of other viral proteins of HBV have been identified (European Patent Application Publication Nos. 13828, 20251 and 38765; Galibert et al. Nature, Vol. 281, p646-650, 1979; Pasek et al., Nature Vol. 282 , p575-579, 1979; and Valenzuela et al., Nature, Vol. 280, p815-819, 1979). HBV is a DNA virus, but has a reverse transcriptase activity of synthesizing DNA genes with RNA as a template similar to retroviruses (Ganem and Varmus, Annu. Rev. Biochem. 56: 651-693, 1987).

우리나라는 요즈음 B형 간염 바이러스(HBV) 감염이 감소하는 추세이지만 아직도 보균자 수가 약 8%로 추정되는 호발 지역에 속해있다. 특히 만성 B형 간염으로 진행하는 경우가 유아기에서 50%, 소아기에서 20%로 높으며, 성인의 경우에는 대부분 급성으로 나타나지만 3-5%는 만성으로 진행된다. 만성 B형 간염은 치료가 쉽지 않고, 상당수가 간경변 또는 간암으로 진행되는 심각한 질환이다. In Korea, hepatitis B virus (HBV) infection is on the decline these days, but it is still in the outbreak area where the number of carriers is estimated to be about 8%. In particular, chronic hepatitis B progresses to 50% in infancy and 20% in childhood, and is most acute in adults, but 3-5% progresses to chronic. Chronic hepatitis B is not easy to treat and is a serious disease with many developing cirrhosis or liver cancer.

HBV의 항원성은 adw, adr, ayw, ayr 등의 아형으로 나타나는데 각각의 유전 자 구조가 다르며 지역에 따라 다른 분포도를 나타낸다. 우리나라 및 동아시아 지역에서는 상기 adw 및 adr 아형이 주로 발견된다. The antigenicity of HBV is represented by subtypes such as adw, adr, ayw, ayr, etc., each of which has a different genetic structure and a different distribution depending on the region. The adw and adr subtypes are mainly found in Korea and East Asia.

HBV의 유전자 정량검사는 HBV에 감염된 환자의 혈청에 존재하는 유전자의 양을 측정하는 검사로서, 최근 HBV의 복제 활성을 판정하는 좋은 지표로 인정받고 있다. HBV 유전자의 정량검사는 B형 간염 환자에게 치료 약제를 투여한 후에 HBV 유전자의 양이 감소되어 치료 효과가 나타나는지, 또는 유전자의 양이 증가하여 치료 효과를 나타내지 않았는지를 검사하므로써 HBV 감염 환자의 경과 관찰과 항바이러스제의 치료 효과의 검증에 반드시 필요한 검사이다. Genetic quantification of HBV is a test for measuring the amount of genes present in the serum of patients infected with HBV, and has recently been recognized as a good indicator for determining the replication activity of HBV. The quantitative test of HBV gene was followed by monitoring the progression of HBV-infected patients by checking whether the amount of HBV gene decreased after treatment with hepatitis B patients and the therapeutic effect was increased by increasing the amount of HBV gene. This test is necessary to verify the therapeutic effect of antiviral drugs.

현재 우리나라에서 HBV 감염자의 진단과 치료 효과의 관찰을 위해 사용하는 진단 시약들은 대부분 외국산을 수입하여 사용하고 있다. 특히 B형 간염 환자에게 치료 약제를 투여한 후에 간염 바이러스가 감소되어 치료되었는지, 또는 증가하여 치료 효과를 나타내지 않았는지를 관찰하는 HBV 유전자(DNA)의 정량 검사용 시약은 100% 외국산을 사용하고 있으며, 1-2 개의 제품이 독점적으로 공급되고 있다.Currently, most of the diagnostic reagents used in Korea for the diagnosis of HBV infection and observation of treatment effect are imported from foreign countries. In particular, the reagent for quantitative testing of the HBV gene (DNA), which observes whether the hepatitis virus has been cured or increased after administration of a therapeutic agent to a hepatitis B patient, has been treated with 100% foreign acid, 1-2 products are available exclusively.

구체적으로, 국내 업체의 경우, HBV 감염 유무만을 확인하는 항원항체반응 스크리닝 시약은 일부 회사 (동아제약, 녹십자, 신진 메딕스 등)에서 생산하고 있으며, HBV-DNA 정량검사용 분자 생물학 방법의 HBV-DNA 정량 검사 시약의 개발 및 생산 업체는 전무한 실정이다. Specifically, in the case of domestic companies, antigen-antibody reaction screening reagents confirming only HBV infection are produced by some companies (Dong-A Pharm, Green Cross, Budding Medics, etc.), and HBV-DNA of molecular biology methods for HBV-DNA quantitative test. There are no developers and producers of quantitative reagents.

반면, 국외 업체의 경우, HBV-DNA 정량검사시약은 카이론 (Chiron) 사 (BAYER에서 공급)에서 생산한 브랜치 DNA (Branched DNA) 제품, 다이젠 (Digen) 사 의 캡처 (capture) HBV-DNA 제품, 로슈 (Roche) 사의 제품 등이 생산 공급되고 있다. On the other hand, for foreign companies, the HBV-DNA quantitative reagent is a branched DNA product produced by Chiron (supplied by BAYER) and a capture HBV-DNA product produced by Digen. And Roche's products are produced and supplied.

상기 카이론 사의 Quantiplex HBV-DNA 분석에 의하면, 표지된 브랜치 DNA 를 PCR 증폭 후 화학발광법으로 브랜치 DNA의 양을 측정하고, 발광된 빛의 강도는 HBV-DNA의 양과 비례한다. 또한, 다이젠 사의 Hybrid Capture II 에 의하면, RNA 프로브를 증폭과정 없이 추출된 HBV-DNA와 교잡반응 (hybridization) 후 RNA-DNA 항체를 결합시켜 화학발광법으로 DNA의 양을 측정하는 RNA-DNA 교잡반응 분석 발광의 강도는 HBV-DNA의 양과 비례한다. 또한, 로슈 사의 Amplicor HBV 모니터링 테스트에 의하면, HBV-DNA를 PCR 증폭 후 프로브와 교잡반응시키고 효소면역법 (발색법)으로 DNA의 양을 측정한다. According to the Quantiplex HBV-DNA analysis of the chiron company, the amount of branched DNA is measured by chemiluminescence after PCR amplification of the labeled branch DNA, and the intensity of emitted light is proportional to the amount of HBV-DNA. In addition, according to Daizen Hybrid Capture II, RNA-DNA hybridization is performed by measuring the amount of DNA by chemiluminescence by combining RNA-DNA antibodies after hybridization with HBV-DNA extracted from RNA probes without amplification. The intensity of the reaction assay luminescence is proportional to the amount of HBV-DNA. In addition, according to Roche's Amplicor HBV monitoring test, HBV-DNA is hybridized with a probe after PCR amplification and the amount of DNA is measured by enzyme-immunoassay (chromophoresis).

그러나, 상기 수입 외국 제품들은 HBV-DNA의 검출범위는 다양하나 우리나라 및 동아시아 지역에서 주로 발견되는 상기 adr 및 adw 아형의 균주에 대해서는 특이도가 떨어지고 위양성 등의 문제가 유발된다는 문제가 있다. 또한, 상기 외국 제품들은 화학발광법 또는 효소면역법 중 어느 하나만을 통해 HBV-DNA의 양을 측정한다는 점에서 HBV-DNA 정량방법 및 이를 위한 기기 선택의 폭이 좁다는 문제가 있다. However, the imported foreign products have a variety of detection range of HBV-DNA, but there is a problem that the specificity of the adr and adw subtype strains mainly found in Korea and East Asia are inferior in specificity and cause problems such as false positives. In addition, since the foreign products measure the amount of HBV-DNA only by chemiluminescence or enzymatic immunoassay, there is a problem in that the method of quantifying HBV-DNA and the device selection for it are narrow.

이에, 본 발명자들은 신규한 B형 간염 바이러스 (HBV)의 유전자 정량방법 및 이를 이용한 검출용 키트를 제공함으로써, 상기와 같은 선행기술의 문제를 해결하고 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present inventors have solved the problems of the prior art and completed the present invention by providing a novel hepatitis B virus (HBV) gene quantification method and detection kit using the same.

본 발명은 PCR 교잡방법을 통해 B형 간염 바이러스의 유전자 (HBV-DNA)를 정량하는데 사용되는, 프라이머 및 프로브를 제공하는 것이다. 상기 본 발명의 프라이머 및 프로브를 포함하는 HBV-DNA 검출용 진단시약키트는, 첫째 한국 및 동아시아 지역에서 주로 발견되는 HBV 아형인 adr과 adw의 검출에 특이적으로 정확도와 정밀성이 높고(기술경쟁력 상품 개발), 둘째 면역검사 (효소면역법 또는 화학발광법)에 관련된 기기 중 어느 것이나 사용 가능한 호환 시스템 시약을 제공함으로써 추가 기기구입에 의한 중복 투자를 줄일 수 있으며 (시약의 호환 사용 가능화), 셋째 두 개의 프로브가 동시에 교잡반응에 관여함으로써 신호 강도를 높여 예민도를 향상시킨다.The present invention provides primers and probes, which are used to quantify the gene of hepatitis B virus (HBV-DNA) through PCR hybridization. The diagnostic reagent kit for detecting the HBV-DNA comprising the primer and the probe of the present invention has a high accuracy and precision specifically for the detection of the HBV subtypes adr and adw, which are mainly found in Korea and East Asia (technical competitiveness products) Development), and by providing a compatible system reagent that can be used with any of the devices involved in the immunoassay (enzyme immunoassay or chemiluminescence), it is possible to reduce redundant investments by purchasing additional equipment (enable reagents for compatibility). Two probes simultaneously participate in the hybridization reaction, increasing signal strength and improving sensitivity.

이와 같이, 본 발명의 HBV 유전자 검출용 진단시약은 상기 기술적 목표를 가지고 국산화한 새로운 진단시약으로서, 상기 외국 제품들의 기술적, 경제적 문제를 해결할 수 있다는 이점을 가지고 있다. As described above, the diagnostic reagent for detecting the HBV gene of the present invention is a new diagnostic reagent localized with the above technical objective, and has the advantage of solving the technical and economic problems of the foreign products.

본 발명은 PCR 교잡방법을 통해 B형 간염 바이러스의 유전자 (HBV-DNA)를 정량하는데 사용되는, 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 갖는 프라이머에 관한 것이다. The present invention relates to a primer having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, which is used to quantify the gene of hepatitis B virus (HBV-DNA) through PCR hybridization.

또한, 본 발명은 PCR 교잡방법을 통해 B형 간염 바이러스의 유전자 (HBV-DNA)를 정량하는데 사용되는, 서열번호 3 또는 4의 염기서열을 갖는 프로브에 관한 것이다. The present invention also relates to a probe having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4, which is used to quantify the gene of hepatitis B virus (HBV-DNA) by PCR hybridization method.

또한, 본 발명은 상기 B형 간염 바이러스가 adr 또는 adw 아형인 것을 특징 으로 하는 프라이머 및 프로브에 관한 것이다. The present invention also relates to primers and probes, characterized in that the hepatitis B virus is adr or adw subtype.

본 발명에 따르면, HBV의 변이가 가장 적은 특정 영역의 염기 서열을 특이하게 고안된 프라이머(서열번호 1 및 2)를 이용하여 증폭한 후에 증폭산물을 마이크로플레이트 웰 (microplate well) 내에서 특이하게 고안된 프로브 (서열번호 3 및 4)와 교잡반응을 수행하고, 반응의 결과물을 효소가 표지된 항체와 결합시켜 부착된 효소 작용에 의해 나타난 발색량(흡광도) 또는 발광량(발광의 세기)으로 HBV-DNA의 양을 측정한다. 전방 프라이머의 5' 에는 비오틴이 부착되어 있어 증폭 산물은 스트렙타비딘과 결합하여 마이크로웰에 부착하는데 5' 에 DIG가 부착된 프로브는 전방 프라이머의 증폭 가닥의 염기서열에 상보적이다. 교잡반응시킨 프로브의 DIG에 POD 효소를 부착시켜 효소면역법으로 측정하든지, AP 효소를 부착시켜 화학발광법으로 측정하든지 검사방법을 선택할 수 있다. 상기 다중 프로브는 2 종류의 프로브가 동시에 같은 DNA 가닥에 교잡반응되어 신호 강도를 높인다. According to the present invention, after amplifying a specific region having the least variation of HBV using a specifically designed primer (SEQ ID NOs: 1 and 2), the amplified product is specifically designed in a microplate well. Hybridization with (SEQ ID NOS: 3 and 4), and the resultant reaction of the HBV-DNA by the amount of luminescence (absorbance) or luminescence (intensity of luminescence) exhibited by the enzymatic action of the enzyme by binding to the enzyme-labeled antibody. Measure the amount. Biotin is attached to the 5 'of the front primer, and the amplification product is attached to the microwell by binding to streptavidin. The test method may be selected whether the POD enzyme is attached to the DIG of the hybridized probe and measured by enzyme immunoassay or the chemiluminescence method by attaching the AP enzyme. In the multiple probe, two types of probes are hybridized simultaneously to the same DNA strand to increase signal intensity.

발색의 강도와 발광의 강도는 HBV-DNA의 양과 비례한다. 따라서, 본 시약키트는 사용자의 의도에 따라 발색법(효소면역검사기기 사용) 또는 발광법(화학발광도측정기기 사용)으로 전환사용이 가능한 우수한 시약키트이다. 상기 HBV-DNA의 정량은 HBV 감염 환자의 경과 관찰과 항바이러스제의 치료 효과의 검증에 반드시 필요한 검사이다.  The intensity of color development and the intensity of luminescence are proportional to the amount of HBV-DNA. Therefore, this reagent kit is an excellent reagent kit that can be converted into coloration method (using enzyme immunoassay device) or luminescence method (using chemiluminescence device) according to the user's intention. Quantification of the HBV-DNA is a test necessary for the observation of HBV-infected patients and the verification of the antiviral therapeutic effect.

발색법 (효소면역기기 사용)의 개요는 도 1에 나타나 있다. 우선, 특정 염기서열의 DNA 산물을 마이크로플레이트 웰에 넣고, 비오틴 (biotin)과 스트렙타비딘 (streptavidin)의 결합에 의해 이중가닥 DNA가 고체상에 부착된다. 비오 틴이 없는 DNA 가닥을 떼어낸 후, 부착단 DNA 가닥에 DIG가 표지된 프로브를 교잡반응시킨다. DIG에 POD (페록시다제)가 결합하고 POD의 작용에 의해 기질을 분해하고 발색제인 TMB (테트라 메틸 벤지딘)를 발색시킨다. 발색의 강도를 흡광도측정기(ELISA reader)로 측정하고, 흡광도의 강도는 HBV-DNA의 양과 비례한다. An overview of the color development method (using an enzyme immunoassay device) is shown in FIG. 1. First, a DNA product of a specific sequence is placed in a microplate well, and double-stranded DNA is attached to a solid phase by binding of biotin and streptavidin. After removing the biotin-free DNA strand, the DIG-labeled probe is hybridized to the attached DNA strand. POD (peroxidase) binds to DIG and decomposes the substrate by the action of POD and develops the coloring agent TMB (tetra methyl benzidine). The intensity of color development is measured with an ELISA reader, and the intensity of absorbance is proportional to the amount of HBV-DNA.

발광법 (화학발광측정기기 사용)의 개요는 도 2에 나타나 있다. 우선, 특정 염기서열의 DNA 산물을 마이크로플레이트 웰에 넣고, 비오틴과 스트렙타비딘의 결합에 의해 이중가닥 DNA가 고체상에 부착된다. 비오틴이 없는 DNA 가닥을 떼어낸 후, 부착단 DNA 가닥에 DIG가 표지된 프로브를 교잡반응시킨다. DIG에 AP (알칼라인 포스파타제)의 작용에 의해 CDP 발광 기질이 빛을 발한다. 빛의 강도를 발광측정기 (luminometer)로 측정하고, 빛의 강도는 HBV-DNA의 양과 비례한다. An overview of the luminescence method (using chemiluminescence measuring instrument) is shown in FIG. First, a DNA product of a specific sequence is placed in a microplate well, and double-stranded DNA is attached to a solid phase by binding of biotin and streptavidin. After removing the biotin-free DNA strand, the DIG-labeled probe is hybridized to the attached DNA strand. The action of AP (alkaline phosphatase) on DIG causes the CDP luminescent substrate to shine. Light intensity is measured with a luminometer, and the light intensity is proportional to the amount of HBV-DNA.

본 발명의 PCR 교잡반응 또는 HBV-DNA의 검출을 위한 상기 프로브 또는 프라이머는 HBV의 adr 및 adw 아형에 특이적으로 공통적인 서열을 기초로 합성하였다. 상기 adr 아형의 전체 게놈 서열은 J. Gen. Virol. 66 (PT1), 195-200 (1985), NCBI accession No. V00867 등에 개시되어 있으며, adw 아형의 전체 게놈 서열은 Dokl. Biochem. 271, 246-249 (1984), CBI accession No. V00866 등에 개시되어 있다. 본 발명의 센스 프라이머 (서열번호 1)는 상기 HBV adr 및 adw 아형의 전체 게놈서열의 제 1432-1453 위를, 안티센스 프라이머 (서열번호 2)는 제 1581-1604 위를, 프로브 1 (서열번호 3)은 제 1435-1460 위를, 프로브 2 (서열번호 4)는 제 1550-1570 위의 염기서열을 기초로 한다. 본 발명의 프로브 또는 프라이머 는 자동 합성 방법 등을 이용하여 합성할 수 있다. The probes or primers for PCR hybridization or detection of HBV-DNA of the present invention were synthesized based on sequences that are specifically common to the adr and adw subtypes of HBV. The entire genome sequence of the adr subtype is J. Gen. Virol. 66 (PT1), 195-200 (1985), NCBI accession No. V00867 and the like, the entire genome sequence of the adw subtype is Dokl. Biochem. 271, 246-249 (1984), CBI accession No. V00866 and the like. The sense primer of the present invention (SEQ ID NO: 1) is located on the 1432-1453 position of the entire genome sequence of the HBV adr and adw subtype, the antisense primer (SEQ ID NO: 2) is located on the 1581-1604 position, probe 1 (SEQ ID NO: 3) ) Is based on the 1435-1460 position and probe 2 (SEQ ID NO: 4) is based on the nucleotide sequence on the 1550-1570. The probe or primer of the present invention can be synthesized using an automatic synthesis method or the like.

본 발명의 프로브 또는 프라이머는 진단 및 프로브용의 검출가능한 표지(label)를 포함하도록 추가로 변형될 수 있다. 이러한 다양한 표지는 당업계에 잘 알려져 있으며, 적합한 표지는 이에 한정되는 것은 아니지만, 비오틴, DIG 등을 포함한다. 당업자라면 손쉽게 이러한 표지를 이용하여 본 발명의 프로브 또는 프라이머의 표지된 변이체를 얻을 수 있다. Probes or primers of the invention can be further modified to include detectable labels for diagnostics and probes. Such various labels are well known in the art, and suitable labels include, but are not limited to, biotin, DIG, and the like. Those skilled in the art can readily use these labels to obtain labeled variants of the probes or primers of the invention.

본 발명에 사용되는 프라이머는 서열번호 1 및 2의 센스 및 안티센스 프라이머의 혼합액을, 프로브는 서열번호 3 및 4의 프로브 1 및 프로브 2의 혼합액을 사용하며, 이들의 염기서열은 하기 표 1과 같다.The primer used in the present invention is a mixture of the sense and antisense primers of SEQ ID NO: 1 and 2, the probe is a mixture of probe 1 and probe 2 of SEQ ID NO: 3 and 4, the base sequence thereof is shown in Table 1 below .

항목Item 염기서열Sequence 센스 프라이머Sense primer 5'-ccg tcg gcg ctg aat ccc gcg g-3' (서열번호 1)5'-ccg tcg gcg ctg aat ccc gcg g-3 '(SEQ ID NO: 1) 안티센스 프라이머Antisense primer 비오틴-5'-acg tgc aga ggt gaa gcg aag tgc-3' (서열번호 2)Biotin-5'-acg tgc aga ggt gaa gcg aag tgc-3 '(SEQ ID NO: 2) 프로브 1Probe 1 DIG-5'-tcg gcg ctg aat ccc gcg gac gac cc-3'(서열번호 3)DIG-5'-tcg gcg ctg aat ccc gcg gac gac cc-3 '(SEQ ID NO: 3) 프로브 2Probe 2 DIG-5'-cgt ctg tgc ctt ctc atc tgc-3'(서열번호 4)DIG-5'-cgt ctg tgc ctt ctc atc tgc-3 '(SEQ ID NO: 4)

발색법과 발광법의 차이는 하기 표 2와 같으며, 이 외에는 검사방법이 동일하다. The difference between the color development method and the light emission method is shown in Table 2 below, except that the inspection method is the same.

발색법Color development 발광법Luminescence 사용효소Enzyme used 페록시다제 (POD)Peroxidase (POD) 알칼라인 포스파타제 (AP)Alkaline phosphatase (AP) 사용기질Substrate 과산화수소Hydrogen peroxide CDP-starTM CDP-star TM 사용기기Device used 흡광도 측정기Absorbance meter 발광 광도계Luminous photometer 표준시료 농도 (pg/ml)Standard sample concentration (pg / ml) 0.5, 100, 1000, 20000.5, 100, 1000, 2000 0.5, 100, 2000, 50000.5, 100, 2000, 5000

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 주어진 것이며 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다. EMBODIMENT OF THE INVENTION Hereinafter, this invention is demonstrated in detail based on an Example. The following examples are given for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the invention.

실시예 1. 효소면역 측정기 사용시Example 1 Using Enzyme Immunoassay

시약의 구성Composition of Reagents

1. HBV-DNA의 추출과정 1. Extraction process of HBV-DNA

1) 용해시액 (0.2N NaOH)1) Dissolution solution (0.2N NaOH)

2) 중화시액 (0.2N HCl) 2) Neutralization solution (0.2N HCl)

2. 증폭 및 교잡반응2. Amplification and Hybridization

* HBV-DNA의 증폭 * Amplification of HBV-DNA

1) 동결건조 PCR 반응시약 시험관 (중합효소 2.5U, 4 종류의 핵산 250 uM, Tris-HCl 10 mM, KCl 40 mM, MgCl2, 안정화색소가 함유되어 건조상태로 보관함)1) Lyophilized PCR reaction reagent test tube (polymerase 2.5U, 4 kinds of nucleic acid 250 uM, Tris-HCl 10 mM, KCl 40 mM, MgCl 2 , stabilized pigments are stored in a dry state)

2) PCR 완충액 (1 pM 의 프라이머와 100 uM 의 d-UTP 함유된 정제수)2) PCR buffer (purified water containing 1 pM primer and 100 uM d-UTP)

3) 저농도 양성대조3) Low concentration positive control

4) 중농도 양성대조4) Medium concentration positive control

5) 표준곡선 작성용 표준시료5) Standard sample for preparing standard curve

표준액의 농도 : 1. 0.5 pg/mlConcentration of Standard Solution: 1.0.5 pg / ml

2. 100 pg/ml                2. 100 pg / ml

3. 1000 pg/ml                3. 1000 pg / ml

4. 2000 pg/ml                4. 2000 pg / ml

# 표준시료는 ATCC 39630 HBV 균주를 구입하여, 미국특허 제4,942,125호, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2606-2610, 1981 등에 기재되어 있는 방법으로 제작하였다. # Standard sample was purchased from ATCC 39630 HBV strain, US Pat. No. 4,942,125, Proc. Natl. Acad. Sci. It was produced by the method described in USA 78: 2606-2610, 1981 and the like.

* 교잡반응시액 * Hybridization reaction solution

1) 부착반용 완충액 (PBS, 0.05% Tween20)1) Attachment Buffer (PBS, 0.05% Tween20)

2) DNA 변성시액 (0.2 N NaOH)2) DNA denaturation solution (0.2 N NaOH)

3) 스트렙타비딘 (streptavidin)이 코팅된 마이크로웰 플레이트3) microwell plate coated with streptavidin

4) 교잡반응 완충액 (4X SSC, 20 mM HEPES, 2 mM EDTA, 0.15% tween20, 0.5% BSA, pH 7.2)4) Hybridization Buffer (4X SSC, 20 mM HEPES, 2 mM EDTA, 0.15% tween 20, 0.5% BSA, pH 7.2)

5) DIG 단백이 연결된 프로브 (DIG-labeled probe)5) DIG-labeled probe

6) 항체가 부착된 효소 (Ab conjugated POD: 페록시다제)와 희석액 (PBS)6) Antibody-attached enzyme (Ab conjugated POD: peroxidase) and diluent (PBS)

7) 기질액 (Substrate): 과산화수소Substrate: Hydrogen Peroxide

8) 발색제 (테트라 메틸 벤지딘 (Tetra Methyl Benzidine); TMB)8) Coloring Agent (Tetra Methyl Benzidine; TMB)

9) 반응정지액 (Stopping solution): 황산9) Stopping solution: sulfuric acid

10) 세척액 (1X PBS, 0.05% tween20)10) Wash solution (1X PBS, 0.05% tween20)

검사과정Inspection process

1. HBV-DNA 추출1. HBV-DNA Extraction

검사혈청 50 ul과 용해시액 50 ul를 혼합한 후, 40 rpm으로 교반하면서 37℃에서 30 분간 반응시켰다. 이 때, 표준시료 1 내지 4 를 각 2개씩 검체와 동일하게 추출하였다. 중화완충액 50 ul를 첨가 후 혼합하고, 12000G로 10 분 간 원심 침전시켰다. 상층액 5 ul를 증폭에 사용하였다. 50 ul of the test serum and 50 ul of the dissolved solution were mixed and reacted at 37 ° C. for 30 minutes while stirring at 40 rpm. At this time, 2 to 4 standard samples were extracted in the same manner as the sample. 50 ul of neutralization buffer was added, mixed, and centrifuged for 10 minutes at 12000 G. 5 ul of supernatant was used for amplification.

2. PCR2. PCR

건조상태의 예비 혼합물에 추출 DNA 5 ul와 PCR 완충액 45 ul를 넣어 총량 50 ul로 마스터 혼합액 (증폭 반응액)을 만들었다. 증폭반응조건을, 1) 95℃ 3 분, 2) [94℃ 40 초, 60℃ 40 초, 72℃ 40 초] * 25 사이클, 3) 72℃ 7 분으로 하였다. 증폭은 약 1 시간 소요되었다. 5 ul of extracted DNA and 45 ul of PCR buffer were added to the dried preliminary mixture to prepare a master mixture (amplification reaction solution) with a total amount of 50 ul. Amplification reaction conditions were 1) 95 degreeC 3 minutes, 2) [94 degreeC 40 second, 60 degreeC 40 second, 72 degreeC 40 second] * 25 cycles, and 3) 72 degreeC 7 minutes. Amplification took about 1 hour.

이와 관련하여, 도 3은 교잡반응을 위한 증폭산물을 전기영동한 사진으로 증폭산물은 173 bp 크기를 보여준다. 1 번 레인은 100 bp 래더(ladder)의 사이즈 마커 DNA, 2 번과 3 번 레인은 0.5 pg/ml, 4 번 레인은 100 pg/ml, 5 번 레인은 1000 pg/ml, 6번 레인은 2000 pg/ml 농도의 표준시료이다. 도 3은 100 pg/ml 이하에서는 음성으로 나타나고 1000 pg/ml에서 뚜렷한 띠가 나타나 DNA의 양에 따른 차이를 보여주고 있다. In this regard, Figure 3 is a photograph of the electrophoresis of the amplification product for the hybridization reaction shows an amplification product size of 173 bp. Lane 1 is 100 bp ladder size marker DNA, lanes 2 and 3 are 0.5 pg / ml, lane 4 is 100 pg / ml, lane 5 is 1000 pg / ml, lane 6 is 2000 Standard sample at pg / ml concentration. Figure 3 shows a negative at less than 100 pg / ml and a distinct band at 1000 pg / ml showing the difference according to the amount of DNA.

증폭 반응 후 PCR 증폭액 50 ul에 정제수 150 ul를 넣어 혼합하였다. After the amplification reaction, 150 ul of purified water was mixed into 50 ul of PCR amplification solution.

3. 교잡반응3. Hybridization reaction

부착반응 완충액 150 ul를 웰에 넣고, 희석된 PCR 증폭액 10 ul를 첨가하여 혼합한 다음, 50℃의 수조에서 40 rpm으로 교반하면서 1 시간 동안 반응시켰다. DNA 변성액을 100 ul 첨가한 후 20 분간 실온에서 반응시켰다. 이 때, 반응 시간동안 프로브를 교잡반응 완충액에 1 Ul/ml의 비율로 필요한 만큼 조제한다. 반응이 끝난 후 세척액으로 5 회 세척하였다. 세척액을 깨끗하게 털어낸 후 프로브 조제액을 웰에 100 ul 넣고 50℃의 수조에서 40 rpm으로 교반하면서 1 시간 동안 반응시켰다. 이 때, 반응 시간동안 효소를 희석액에 1:1000의 비율로 필요한 만큼 조제한다. 반응이 끝난 후 세척액으로 5 회 세척하였다. 세척액을 깨끗하게 털어낸 후 희석 효소액 (POD Conjugated anti-DIG ab)를 100 ul씩 각 웰에 가하고 37℃수조에서 40 rpm으로 교반하면서 30 분 동안 반응시켰다. 이 때, 반응시간 동안 기질액과 발색제를 1:1의 비율로 필요한 만큼 조제한다. 반응이 끝난 후 세척액으로 5 회 세척하였다. 세척액을 깨끗하게 털어낸 후 동량 희석하여 준비한 발색시액을 각 웰에 100 ul씩 분주 후 암소에서 15 분간 반응시켰다. 반응정지액 100 ul씩 각 웰에 첨가하여 반응을 정지시키고 효소면역 측정기에서 620 nm를 참조로 하여 450 nm 파장에서 흡광도(발색의 강도)를 측정하였다.150 ul of adhesion reaction buffer was added to the well, 10 ul of diluted PCR amplification solution was added and mixed, followed by reaction for 1 hour while stirring at 40 rpm in a water bath at 50 ° C. After adding 100 ul of the DNA denatured solution, the reaction was performed at room temperature for 20 minutes. At this time, the probe is prepared as needed in the reaction buffer at a ratio of 1 Ul / ml during the reaction time. After the reaction was washed five times with a wash solution. After rinsing off the washing solution cleanly, 100 ul of the probe preparation was added to the well, and reacted for 1 hour while stirring at 40 rpm in a water bath at 50 ° C. At this time, the enzyme is prepared as needed in the diluent at a ratio of 1: 1000 during the reaction time. After the reaction was washed five times with a wash solution. After diluting the washing solution cleanly, diluted enzyme solution (POD Conjugated anti-DIG ab) was added to each well by 100 ul and reacted for 30 minutes while stirring at 40 rpm in a 37 ° C water bath. At this time, the substrate solution and the colorant are prepared as necessary in a ratio of 1: 1 during the reaction time. After the reaction was washed five times with a wash solution. The washing solution was thoroughly shaken off, and the coloring solution prepared by diluting the same amount was dispensed into each well for 100 ul and reacted in the cow for 15 minutes. 100 ul of reaction stopper was added to each well to stop the reaction, and the absorbance (intensity of color development) was measured at 450 nm with reference to 620 nm in an enzyme immunoassay device.

이와 관련하여, 도 4는 색반응(흡광도측정)용 마이크로플레이트를 나타내고 있으며, 빛이 투과할 수 있도록 투명한 물질로 제작되어 있음을 알 수 있다. 육안으로도 반응의 변화를 알 수 있다. 그러나 정확한 측정을 위해 흡광도측정기(ELISA reader)를 사용한다. In this regard, Figure 4 shows a microplate for color reaction (absorbance measurement), it can be seen that the light is made of a transparent material to transmit. The change of reaction can be seen with the naked eye. However, an ELISA reader is used for accurate measurements.

결과 산출Result output

표준시료 1: 0.5 pg/mlSample 1: 0.5 pg / ml

표준시료 2: 100 pg/mlSample 2: 100 pg / ml

표준시료 3: 1000 pg/mlSample 3: 1000 pg / ml

표준시료 4: 2000 pg/ml Sample 4: 2000 pg / ml

상기 표준시료 1 내지 4의 흡광도 측정값을 가지고 표준검량선을 작성한 후, 각각의 검체의 흡광도 측정값을 표준검량선에 대입하여 HBV-DNA의 농도 (pg/ml)를 구하였다.After preparing a standard calibration curve with the absorbance measurements of the standard samples 1 to 4, the absorbance measurements of each specimen were substituted into the standard calibration curve to determine the concentration of HBV-DNA (pg / ml).

결과 해석Interpret the results

0.5 pg/ml 이상을 양성으로 판정하며, 전의 결과 등과 비교하여 증가 또는 감소 경향을 판정한다. 투약 전의 측정 결과에 비하여 측정농도가 현저하게 낮아지거나 음성의 결과를 나타내면, 약제 (인터페론 등의 항 바이러스제)가 바이러스에 대하여 치료효과를 가지는 것으로 판단한다. 반대로, 투약 전의 측정결과에 비하여 전혀 감소를 나타내지 않거나 오히려 증가하면, 치료효과가 전혀 나타나지 않은 것으로 판정한다. 임상 의사들은 실질적으로 200 pg/ml의 농도 이상의 경우에는 치료효과가 전혀 없는 것으로, 1000 pg/ml, 2000 pg/ml 등의 농도 값과 거의 같은 의미로 해석한다. 본 검사는 일회성의 검사치보다 경과 관찰을 위해서 투약 전과 후의 검사치 변화정도를 측정하는 것이 목적이다. 0.5 pg / ml or more is determined as positive, and an increase or decrease tendency is determined in comparison with the previous results and the like. If the measured concentration is significantly lower than the measurement result before administration or shows a negative result, it is determined that the drug (antiviral agent such as interferon) has a therapeutic effect against the virus. Conversely, if there is no reduction or increase in comparison with the result of pre-dose, it is determined that no therapeutic effect is observed. Clinicians have virtually no treatment effect at concentrations above 200 pg / ml, which translates to almost the same meaning as concentration values of 1000 pg / ml and 2000 pg / ml. The purpose of this test is to measure the degree of change in test values before and after dosing for follow-up rather than one-time test.

실시예 2. 화학발광광도계 (Chemiluminometer) 사용시Example 2 Using a Chemiluminometer

시약의 구성Composition of Reagents

1. HBV-DNA의 추출과정 1. Extraction process of HBV-DNA

1) 용해시액 (0.2N NaOH)1) Dissolution solution (0.2N NaOH)

2) 중화시액 (0.2N HCl) 2) Neutralization solution (0.2N HCl)

2. 증폭 및 교잡반응2. Amplification and Hybridization

* HBV-DNA 의 증폭 * Amplification of HBV-DNA

1) 동결건조 PCR 반응시약 시험관 (중합효소 2.5U, 4 종류의 핵산 250 uM, Tris-HCl 10 mM, KCl 40 mM, MgCl2, 안정화색소가 함유되어 건조상태로 보관함)1) Lyophilized PCR reaction reagent test tube (polymerase 2.5U, 4 kinds of nucleic acid 250 uM, Tris-HCl 10 mM, KCl 40 mM, MgCl 2 , stabilized pigments are stored in a dry state)

2) PCR 완충액 (1 pM 의 프라이머와 100 uM 의 d-UTP 함유된 정제수)2) PCR buffer (purified water containing 1 pM primer and 100 uM d-UTP)

3) 저농도 양성대조3) Low concentration positive control

4) 중농도 양성대조4) Medium concentration positive control

5) 표준곡선 작성용 표준시료5) Standard sample for preparing standard curve

표준액의 농도 : 1. 0.5 pg/mlConcentration of Standard Solution: 1.0.5 pg / ml

2. 100 pg/ml                2. 100 pg / ml

3. 2000 pg/ml                3. 2000 pg / ml

4. 5000 pg/ml                 4. 5000 pg / ml

# 표준시료는 ATCC 39630 HBV 균주를 구입하여, 미국특허 제4,942,125호, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2606-2610, 1981 등에 기재되어 있는 방법으로 제작하였다. # Standard sample was purchased from ATCC 39630 HBV strain, US Pat. No. 4,942,125, Proc. Natl. Acad. Sci. It was produced by the method described in USA 78: 2606-2610, 1981 and the like.

* 교잡반응시액 * Hybridization reaction solution

1) 부착반용 완충액 (PBS, 0.05% Tween20)1) Attachment Buffer (PBS, 0.05% Tween20)

2) DNA 변성시액 (0.2 N NaOH)2) DNA denaturation solution (0.2 N NaOH)

3) 스트렙타비딘이 코팅된 마이크로웰 플레이트3) Streptavidin-Coated Microwell Plates

4) 교잡반응 완충액 (4X SSC, 20 mM HEPES, 2 mM EDTA, 0.15% tween20, 0.5% BSA, pH 7.2)4) Hybridization Buffer (4X SSC, 20 mM HEPES, 2 mM EDTA, 0.15% tween 20, 0.5% BSA, pH 7.2)

5) DIG 단백이 연결된 프로브 (DIG-labeled probe)5) DIG-labeled probe

6) 항체가 부착된 효소 (Ab conjugated AP: 알칼라인 포스파타제)와 희석액 (PBS)6) Antibody-attached enzyme (Ab conjugated AP: alkaline phosphatase) and diluent (PBS)

7) 기질액 (Substrate): 상품명 CDP-star (로슈 사); 디소듐 2-클로로-5-(4[1,2-디옥시탄-3,2'-(5'-클리로)-트리시클로[3,3,1,1]데칸]-4일) 페닐 포스페이트(disodium2-chloro-5-(4[1,2-dioxetan-3,2'-(5'-chliro)-tricyclo[3,3,1,1]decan ]-4yl)phenyl phosphate)7) Substrate: trade name CDP-star (Roche); Disodium 2-chloro-5- (4 [1,2-dioxytan-3,2 '-(5'-chloro) -tricyclo [3,3,1,1] decane] -4yl) phenyl Phosphate (disodium2-chloro-5- (4 [1,2-dioxetan-3,2 '-(5'-chliro) -tricyclo [3,3,1,1] decan] -4yl) phenyl phosphate)

8) 세척액 (1X PBS, 0.05% tween20)8) Wash solution (1X PBS, 0.05% tween20)

검사과정Inspection process

1. HBV-DNA 추출과정과 2. PCR 과정은 상기 실시예 1 (효소면역 측정기 사용시)와 동일하다. 1. HBV-DNA extraction process and 2. PCR process are the same as in Example 1 (when using the enzyme immunoassay).

3. 교잡반응3. Hybridization reaction

부착반응 완충액 150 ul를 웰에 넣고, 희석된 PCR 증폭액 10 ul를 첨가하여 혼합한 다음, 50℃의 수조에서 40 rpm으로 교반하면서 1 시간 동안 반응시켰다. DNA 변성액을 100 ul 첨가한 후 20 분간 실온에서 반응시켰다. 이 때, 반응 시간동안 프로브를 교잡반응 완충액에 1 Ul/ml의 비율로 필요한 만큼 조제한다. 반응이 끝난 후 세척액으로 5 회 세척하였다. 세척액을 깨끗하게 털어낸 후 프로브 조제액을 웰에 100 ul 넣고 50℃의 수조에서 40 rpm으로 교반하면서 1 시간 동안 반응시켰다. 이 때, 반응 시간동안 효소를 희석액에 1:1000의 비율로 필요한 만큼 조제한다. 반응이 끝난 후 세척액으로 5 회 세척하였다. 세척액을 깨끗하게 털어낸 후 희석 효소액 (POD Conjugated anti-DIG ab)를 100 ul씩 각 웰에 가하고 37℃ 수조에서 40 rpm으로 교반하면서 30 분 동안 반응시켰다. 이 때, 반응시간 동안 기질액과 발색제를 1:1의 비율로 필요한 만큼 조제한다. 반응이 끝난 후 세척액으로 5 회 세척하였다. 세척액을 깨끗하게 털어낸 후 동량 희석하여 준비한 발색시액을 각 웰에 100 ul씩 분주 후 암소에서 15 분간 반응시켰다. 15 분 이내에 발광도 측정기의 466 nm 파장에서 발광도를 측정하였다. 150 ul of adhesion reaction buffer was added to the well, 10 ul of diluted PCR amplification solution was added and mixed, followed by reaction for 1 hour while stirring at 40 rpm in a water bath at 50 ° C. After adding 100 ul of the DNA denatured solution, the reaction was performed at room temperature for 20 minutes. At this time, the probe is prepared as needed in the reaction buffer at a ratio of 1 Ul / ml during the reaction time. After the reaction was washed five times with a wash solution. After rinsing off the washing solution cleanly, 100 ul of the probe preparation was added to the well, and reacted for 1 hour while stirring at 40 rpm in a water bath at 50 ° C. At this time, the enzyme is prepared as needed in the diluent at a ratio of 1: 1000 during the reaction time. After the reaction was washed five times with a wash solution. After washing off the wash solution cleanly, diluted enzyme solution (POD Conjugated anti-DIG ab) was added to each well by 100 ul and reacted for 30 minutes while stirring at 40 rpm in a 37 ° C water bath. At this time, the substrate solution and the colorant are prepared as necessary in a ratio of 1: 1 during the reaction time. After the reaction was washed five times with a wash solution. The washing solution was thoroughly shaken off, and the coloring solution prepared by diluting the same amount was dispensed into each well for 100 ul and reacted in the cow for 15 minutes. Luminance was measured at 466 nm wavelength of the luminometer within 15 minutes.

이와 관련하여, 도 5는 발광측정기용 마이크로플레이트를 나타내며, 빛이 퍼져 다른 웰에 영향을 주지 않도록 불투명 물질로 되어있음을 알 수 있다. 육안으로 반응의 변화를 인지할 수 없고, 반드시 발광측정기(luminometer)를 사용하여야 한다.In this regard, Figure 5 shows a microplate for a luminometer, it can be seen that the light is made of an opaque material so that it does not affect other wells. It is not possible to notice the change in the reaction with the naked eye, and a luminometer must be used.

결과 산출Result output

표준시료 1: 0.5 pg/mlSample 1: 0.5 pg / ml

표준시료 2: 100 pg/mlSample 2: 100 pg / ml

표준시료 3: 2000 pg/mlSample 3: 2000 pg / ml

표준시료 4: 5000 pg/ml Sample 4: 5000 pg / ml

상기 표준시료 1 내지 4의 발광도 측정값을 가지고 표준검량선을 작성한 후, 각각의 검체의 발광도 측정값을 표준검량선에 대입하여 HBV-DNA의 농도 (pg/ml)를 구하였다.After preparing a standard calibration curve using the luminescence measurement values of the standard samples 1 to 4, the concentration of HBV-DNA (pg / ml) was obtained by substituting the luminescence measurement values of each sample into the standard calibration curve.

결과 해석Interpret the results

상기 실시예 1 (효소면역 측정기 사용시)와 동일하다. It is the same as Example 1 (when using an enzyme immunoassay device).

실험예 1. 성적의 정도 관리 (quality assurance) Experimental Example 1. Quality Assurance

검출의 범위는 발색법의 경우 0.5-2000 pg/ml, 발광법의 경우 0.5-5000 pg/ml로 나타났는데 (도 6 및 도 7 참조), 발색법의 직선성이 2000 pg/ml 이상에서는 발광법보다 떨어진다. 따라서, 표준시료의 농도 발광법의 경우보다 낮은 것을 사용한다.The detection range was 0.5-2000 pg / ml for colorimetric method and 0.5-5000 pg / ml for luminescence method (see FIGS. 6 and 7). Worse than the law. Therefore, a lower one than the case of the standard luminescence method is used.

예민도Sensitivity

예민도 = (양성결과수 - 위음성결과수)/양성검체수 * 100% 로 정의한다. Sensitivity = (positive results-false negative results) / positive samples * 100%.

양성 시료의 결과가 양성으로 나타나는 정도를 하기 표 5의 25번부터 96번까지 72개의 시료의 검사결과를 근거로 예민도를 추산하면, 예민도 = (72-0)/72 * 100 = 100% 이다. 이와 같이, 본 발명에 따르는 경우 HBV-DNA 검출의 예민도는 매우 우수한 결과를 나타내었다. If the sensitivity of the positive sample is estimated based on the test results of 72 samples from 25 to 96 in Table 5, the sensitivity is (72-0) / 72 * 100 = 100%. As such, the sensitivity of HBV-DNA detection in accordance with the present invention showed very good results.

특이도Specificity

특이도 = (음성결과수 - 위양성결과수)/음성검체수 * 100% 로 정의한다. Specificity = (number of negative results-number of false positive results) / number of negative samples * 100%.

음성시료의 결과가 음성으로 나타나는 정도를 하기 표 5의 1번부터 24번까지 24개의 시료의 검사결과를 근거로 특이도를 추산하면, 특이도 = (24-1)/24 * 100 = 95.8% 이다. 이와 같이, 본 발명에 따르는 경우 HBV-DNA 검출의 특이도도 우수한 결과를 나타내었다. The degree of negativeness of a negative sample is estimated based on the test results of 24 samples from 1 to 24 in Table 5 below: specificity = (24-1) / 24 * 100 = 95.8% to be. As such, the specificity of HBV-DNA detection also showed excellent results in accordance with the present invention.

재현성Reproducibility

재현성은 같은 검체를 반복 시험하여 검체의 결과들이 얼마나 일치되는지를 판정하며, 본 시약과 같은 정량검사 시약의 경우에 재현성의 정도는 대단히 중요하다. Reproducibility is repeated testing the same sample to determine how consistent the results of the sample are, and for quantitative reagents such as this reagent, the degree of reproducibility is very important.

재현성을 나타내는 인자는, 1) 결과의 평균치 = 검사결과의 총합을 검사 반복 횟수로 나눈 값, 2) 표준편차 = 평균치와 각각의 결과의 차이를 합산하여 검사 반복횟수로 나눈 값, 3) 변이계수 = 표준편차를 평균값으로 나눈 값의 %치이다. Factors that represent reproducibility include: 1) mean value = total test result divided by the number of test iterations, 2) standard deviation = sum of the mean and the difference between each result divided by test iterations, and 3) variation coefficient. = Standard deviation divided by the mean.

재현성은 변이계수로 나타내며 값이 클수록 재현성이 떨어지고 변이계수의 값이 작을수록 우수한 재현성으로 판정한다.The reproducibility is represented by the coefficient of variation. The larger the value, the lower the reproducibility, and the smaller the value of the coefficient of variation, the better the reproducibility.

발색 흡광도 (효소면역측정기)를 이용한 표준시료의 재현성 Reproducibility of Standard Samples Using Color Absorbance

반복횟수Repeat count 표준시료 1 (0.5 pg/ml)Standard sample 1 (0.5 pg / ml) 표준시료 2 (100 pg/ml)Standard Sample 2 (100 pg / ml) 표준시료 3 (1000 pg/ml)Sample 3 (1000 pg / ml) 표준시료 4 (2000 pg/ml)Standard Sample 4 (2000 pg / ml) 1One 0.2730.273 0.6820.682 1.3591.359 2.1512.151 22 0.2900.290 0.6770.677 1.3891.389 2.2352.235 33 0.2980.298 0.6540.654 1.4541.454 2.2742.274 44 0.2910.291 0.6740.674 1.2781.278 2.1382.138 55 0.2520.252 0.6710.671 1.4111.411 2.2142.214 66 0.3180.318 0.7060.706 1.4191.419 2.1282.128 77 0.3060.306 0.6910.691 1.3381.338 2.1262.126 88 0.2810.281 0.6750.675 1.2851.285 2.1852.185 99 0.2860.286 0.6650.665 1.4331.433 2.1792.179 1010 0.3680.368 0.7110.711 1.2891.289 2.2462.246 1111 0.3080.308 0.7070.707 1.3211.321 2.2442.244 1212 0.3270.327 0.8740.874 1.3641.364 2.1552.155 1313 0.2640.264 0.8830.883 1.4011.401 2.2012.201 1414 0.3440.344 0.6920.692 1.4061.406 2.1732.173 1515 0.2770.277 0.6870.687 1.2871.287 2.1132.113 1616 0.2950.295 0.6630.663 1.2931.293 2.2192.219 1717 0.2730.273 0.6820.682 1.3591.359 2.1512.151 1818 0.2900.290 0.6770.677 1.3891.389 2.2352.235 1919 0.2980.298 0.6540.654 1.4541.454 2.2742.274 2020 0.2910.291 0.6740.674 1.2781.278 2.1382.138 2121 0.2520.252 0.6710.671 1.4111.411 2.2142.214 2222 0.3180.318 0.7060.706 1.4191.419 2.1282.128 2323 0.3060.306 0.6910.691 1.3381.338 2.1262.126 2424 0.2810.281 0.6750.675 1.2851.285 2.1852.185 2525 0.2860.286 0.6650.665 1.4331.433 2.1792.179 2626 0.3680.368 0.7110.711 1.2891.289 2.2462.246 2727 0.3080.308 0.7070.707 1.3211.321 2.2442.244 2828 0.3270.327 0.8740.874 1.3641.364 2.1552.155 2929 0.2640.264 0.8830.883 1.4011.401 2.2012.201 3030 0.3440.344 0.6920.692 1.4061.406 2.1732.173 3131 0.2770.277 0.6870.687 1.2871.287 2.1132.113 3232 0.2950.295 0.6630.663 1.2931.293 2.2192.219 평균Average 0.290.29 0.710.71 1.361.36 2.192.19 표준편차Standard Deviation 0.028840.02884 0.0667110.066711 0.058120.05812 0.0475710.047571 변이계수Coefficient of variation 9.66%9.66% 9.43%9.43% 4.28%4.28% 2.17%2.17%

* 상기 수치는 흡광도이며, 단위는 없음. * The above figures are absorbance, no unit

상기 표 3은 발색흡광도를 이용한 표준시료의 재현성결과를 보면 표준시료 1과 2에서 9.66%와 9.43%로 양호한 변이계수를 나타냈고, 표준시료 3과 4에서 4.28%와 2.17%의 지극히 양호한 변이계수를 나타냈는데, 이러한 결과는 아주 우수한 재현성으로 판정할 수 있다.Table 3 shows good variation coefficients of 9.66% and 9.43% in standard samples 1 and 2, and extremely good coefficients of variation of 4.28% and 2.17% in standard samples 3 and 4, respectively. This result can be judged by very good reproducibility.

표준시료의 결과를 바탕으로 작성한 표준 검량곡선 또한 양호하게 작성되었다 (도 6).The standard calibration curve based on the results of the standard sample was also good (Figure 6).

화학발광도 (발광광도측정기)를 이용한 표준시료의 재현성. Reproducibility of standard samples using chemiluminescence (luminescence photometer).

반복횟수Repeat count 표준시료 1 (0.5 pg/ml)Standard sample 1 (0.5 pg / ml) 표준시료 2 (100 pg/ml)Standard Sample 2 (100 pg / ml) 표준시료 3 (2000 pg/ml)Sample 3 (2000 pg / ml) 표준시료 4 (5000 pg/ml)Standard Sample 4 (5000 pg / ml) 1One 8585 1048210482 119311119311 201971201971 22 9292 81948194 122077122077 199432199432 33 8888 1019410194 120303120303 206453206453 44 102102 1019910199 109997109997 199932199932 55 7777 93999399 121212121212 198063198063 66 9696 1030110301 119880119880 200112200112 77 9292 1018810188 117678117678 219832219832 88 7272 1129811298 117566117566 198875198875 99 7070 1129811298 120399120399 197887197887 1010 9999 78987898 123765123765 204056204056 1111 7777 1019210192 120626120626 206789206789 1212 7878 1277012770 117678117678 199467199467 1313 8787 1083210832 119878119878 198997198997 1414 8989 96699669 109978109978 201005201005 1515 7777 98789878 103020103020 210042210042 1616 6969 1018910189 124011124011 198997198997 1717 7676 96979697 119098119098 199807199807 1818 8787 98989898 108788108788 201426201426 1919 9393 99809980 120303120303 200443200443 2020 8888 1099010990 130119130119 199427199427 2121 8080 1081410814 112989112989 203008203008 2222 8181 92999299 123511123511 199887199887 2323 9898 1027710277 118998118998 202145202145 2424 7979 94779477 130208130208 199942199942 2525 7878 1058510585 119402119402 198889198889 2626 8686 1092910929 120302120302 200543200543 2727 8484 1098710987 123118123118 201024201024 2828 7979 1098210982 121233121233 198989198989 2929 9292 1129811298 118789118789 197889197889 3030 6969 1097910979 111920111920 206654206654 3131 8989 1198811988 120119120119 199876199876 3232 8888 1018910189 123224123224 200987200987 평균Average 84.2812584.28125 10354.687510354.6875 119046.875119046.875 201651.4375201651.4375 표준편차Standard Deviation 8.9706810388.970681038 978.3711799978.3711799 5716.0286265716.028626 4461.6901564461.690156 변이계수 Coefficient of variation 10.64%10.64% 9.45%9.45% 4.80%4.80% 2.21%2.21%

* 상기 수치는 발광의 세기를 나타내며 통상 RLU값이라고 함. * The above values indicate the intensity of luminescence and are commonly referred to as RLU values.

상기 표 4는 발광도를 이용한 표준시료의 재현성 결과를 보면 표준시료 1과 2에서 10.64%와 9.45%로 양호한 변이계수를 나타냈고, 표준시료 3과 4에서는 4.80%와 2.21%의 지극히 양호한 변이계수를 나타내어 아주 우수한 재현성으로 판정할 수 있다.Table 4 shows good variation coefficients of 10.64% and 9.45% in standard samples 1 and 2, and the extremely good coefficients of variation of 4.80% and 2.21% in standard samples 3 and 4, respectively. It can be judged by the excellent reproducibility.

표준시료의 결과를 바탕으로 작성한 표준검량곡선도 또한 양호하게 작성되었다 (도 7).A standard calibration curve based on the results of the standard sample was also well prepared (FIG. 7).

기존 검사시약과의 상관성Correlation with Existing Test Reagents

기존에 사용 중인 미국 다이진사의 제품(발광도법)과 비교한 결과, 본 시약 흡광도방법의 경우에는 두 방법 간의 상관계수는 0.9554로 높은 상관성을 나타내었으며(도 8), 또한 본 시약 발광도방법의 경우에도 두 방법간의 상관계수가 0.9798로 높은 상관성을 나타내었다 (도 9).As a result of comparing with the product of the US Daijin (luminescence method), the correlation coefficient between the two methods was 0.9554 in the case of the reagent absorbance method (Fig. 8). Even in this case, the correlation coefficient between the two methods was high as 0.9798 (FIG. 9).

본 시약의 검사 방법간의 결과비교Comparison of results between test methods of this reagent

No.  No. 본 발명The present invention 다이진  Dijin No.  No. 본 발명The present invention 다이진  Dijin EIA 판독기EIA reader 발광 측정기Luminometer EIA 판독기EIA reader 발광 측정기Luminometer 1One <0.5<0.5 <0.5<0.5 <0.5<0.5 4949 664664 705705 789789 22 <0.5<0.5 <0.5<0.5 <0.5<0.5 5050 712712 676676 554554 33 <0.5<0.5 <0.5<0.5 <0.5<0.5 5151 177177 203203 251251 44 <0.5<0.5 <0.5<0.5 <0.5<0.5 5252 312312 344344 372372 55 <0.5<0.5 <0.5<0.5 <0.5<0.5 5353 947947 10971097 10321032 66 <0.5<0.5 <0.5<0.5 <0.5<0.5 5454 87.387.3 76.576.5 109109 77 <0.5<0.5 <0.5<0.5 <0.5<0.5 5555 13991399 13741374 12761276 88 0.50.5 0.60.6 <0.5<0.5 5656 10931093 12091209 13241324 99 <0.5<0.5 <0.5<0.5 <0.5<0.5 5757 12931293 13771377 15661566 1010 <0.5<0.5 <0.5<0.5 <0.5<0.5 5858 19761976 18891889 17281728 1111 <0.5<0.5 <0.5<0.5 <0.5<0.5 5959 312312 338338 243243 1212 <0.5<0.5 <0.5<0.5 <0.5<0.5 6060 225225 214214 228228 1313 <0.5<0.5 <0.5<0.5 <0.5<0.5 6161 696696 776776 897897 1414 <0.5<0.5 <0.5<0.5 <0.5<0.5 6262 768768 887887 908908 1515 <0.5<0.5 <0.5<0.5 <0.5<0.5 6363 11011101 10681068 998998 1616 <0.5<0.5 <0.5<0.5 <0.5<0.5 6464 878878 991991 10991099 1717 <0.5<0.5 0.50.5 <0.5<0.5 6565 479479 524524 398398 1818 <0.5<0.5 <0.5<0.5 <0.5<0.5 6666 412412 398398 447447 1919 <0.5<0.5 <0.5<0.5 <0.5<0.5 6767 911911 899899 778778 2020 <0.5<0.5 <0.5<0.5 <0.5<0.5 6868 765765 778778 754754 2121 0.70.7 <0.5<0.5 <0.5<0.5 6969 887887 10211021 10021002 2222 <0.5<0.5 <0.5<0.5 <0.5<0.5 7070 434434 446446 428428 2323 <0.5<0.5 <0.5<0.5 <0.5<0.5 7171 552552 643643 724724 2424 <0.5<0.5 <0.5<0.5 <0.5<0.5 7272 756756 677677 576576 2525 22.422.4 18.918.9 12.212.2 7373 2000이상More than 2000 32103210 37893789 2626 11.911.9 36.436.4 27.427.4 7474 2000이상More than 2000 47874787 55445544 2727 23.723.7 28.128.1 16.516.5 7575 2000이상More than 2000 32403240 31553155 2828 33.233.2 27.527.5 36.736.7 7676 2000이상More than 2000 42944294 39883988 2929 37.437.4 38.738.7 42.342.3 7777 2000이상More than 2000 5000이상More than 5000 41924192 3030 66.366.3 52.152.1 44.144.1 7878 2000이상More than 2000 33223322 29982998 3131 8.98.9 10.410.4 77 7979 18991899 20782078 23422342 3232 23.623.6 21.521.5 12.912.9 8080 2000이상More than 2000 36873687 29882988 3333 98.498.4 117.2117.2 78.378.3 8181 2000이상More than 2000 34213421 45764576 3434 90.590.5 97.297.2 87.387.3 8282 2000이상More than 2000 19941994 25642564 3535 26.526.5 27.427.4 23.223.2 8383 2000이상More than 2000 28982898 31293129 3636 45.745.7 42.842.8 35.735.7 8484 16531653 18791879 26572657 3737 19.419.4 22.322.3 14.214.2 8585 2000이상More than 2000 5000이상More than 5000 6000이상More than 6000 3838 13.113.1 11.511.5 99 8686 2000이상More than 2000 29432943 22342234 3939 52.952.9 56.456.4 67.567.5 8787 2000이상More than 2000 32873287 34343434 4040 36.736.7 41.141.1 54.454.4 8888 17891789 22122212 30983098 4141 18.418.4 19.219.2 22.122.1 8989 2000이상More than 2000 48564856 6000이상More than 6000 4242 14.114.1 11.911.9 15.815.8 9090 2000이상More than 2000 43214321 34653465 4343 39.439.4 38.238.2 42.742.7 9191 2000이상More than 2000 34253425 39963996 4444 69.169.1 76.476.4 56.956.9 9292 2000이상More than 2000 27782778 24432443 4545 24.124.1 28.928.9 21.121.1 9393 2000이상More than 2000 21622162 29982998 4646 46.346.3 52.552.5 66.466.4 9494 2000이상More than 2000 23752375 28792879 4747 28.928.9 34.134.1 44.144.1 9595 2000이상More than 2000 34763476 28782878 4848 12.112.1 17.417.4 18.918.9 9696 2000이상More than 2000 19921992 16541654

본 발명은 adr 과 adw 아형의 가능한 많은 균주의 염기서열을 비교 검색하여 변이가 없는 HBV-DNA 서열 내에서 프로브와 프라이머를 고안하였으므로, 가능한 adr 과 adw 아형의 모든 균주를 검출할 수 있도록 예민도와 특이도가 높다. 따라서, 검출범위는 다양하나 우리나라 및 동아시아 지역에서 주로 발견되는 상기 adr 및 adw 아형의 균주에 대해서는 특이도가 떨어지고 위양성 등의 문제가 유발되는 수입 외국 제품에 비해 본 발명의 HBV 검출용 키트의 특이도가 매우 우수하다. The present invention has designed probes and primers within the HBV-DNA sequence without mutations by comparing and searching the sequences of as many strains as possible of the adr and adw subtypes, so that the sensitivity and specificity can be detected to detect all possible strains of the adr and adw subtypes. The degree is high. Therefore, the specificity of the HBV detection kit of the present invention compared to the imported foreign products, which vary in the range of detection, but the specificity of the adr and adw subtypes mainly found in Korea and East Asia is lowered and causes problems such as false positives. Is very excellent.

또한, 교잡반응시킨 프로브의 DIG에 POD 효소를 부착시켜 효소면역법으로 측정하든지, AP 효소를 부착시켜 화학발광법으로 측정하든지 검사방법을 선택할 수 있다. 따라서, 기기의 추가 도입 등으로 인한 경제적 부담을 줄일 수 있다. In addition, the test method may be selected whether the POD enzyme is attached to the DIG of the hybridized reaction probe and measured by enzyme immunoassay or by the chemoluminescence method by attaching the AP enzyme. Therefore, the economic burden due to the additional introduction of the device can be reduced.

또한, 본 발명에 사용되는 다중 프로브는 2 종류의 프로브가 동시에 같은 DNA 가닥에 교잡반응되어 신호 강도를 높이는 효과가 있다. 따라서, 높은 농도에서는 물론 낮은 농도에서도 검출율을 높일 수 있다. In addition, the multiple probe used in the present invention has the effect of increasing the signal strength by hybridizing two types of probes to the same DNA strand at the same time. Therefore, the detection rate can be increased at high concentrations as well as at low concentrations.

서열목록 전자파일 첨부 Attach sequence list electronic file

Claims (4)

삭제delete 삭제delete 서열번호 3의 염기서열을 갖는 프로브 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프로브를 함유하는, PCR 교잡방법을 통해 B형 간염 바이러스 adr 또는 adw 아형의 유전자 (HBV-DNA)의 정량용 시약. A reagent for quantification of hepatitis B virus adr or adw subtype gene (HBV-DNA) through a PCR hybridization method, comprising a probe having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a probe having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4. 삭제delete
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