KR100783199B1 - New cancer stem cell line GBM 2 established from human Glioblastoma multiforme tissue - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인체 유래의 뇌 암 조직을 분리, 일차 배양하여 지속적인 계대배양을 수행하여 안정한 뇌 암세포 주를 확립하고 이의 기본적인 세포학적 성상을 밝히고 하위세포군인 암 줄기세포의 특이적인 약물 내성 특성 및 방사선 요법에 의한 치료법에 대한 저항성을 규명하여 앞으로의 뇌 암 치료의 주 표적이 되는 암 줄기세포의 기능적 특성을 밝혀 과학적 근거를 제시하고자 한다.The present invention is to isolate and primary culture brain cancer tissue derived from the human body to perform a continuous passage culture to establish a stable brain cancer cell line, to reveal its basic cytological characteristics and specific drug resistance characteristics and radiation therapy of cancer stem cells as a sub-cell group The purpose of this study is to examine the resistance of the treatment method and to present the scientific basis by identifying the functional characteristics of cancer stem cells, which are the main targets for future brain cancer treatment.
본 발명에 따르면, 본 발명의 암 줄기세포주는 기존 항암제의 내성을 극복할 수 있는 새로운 항암제의 탐색이나 암 치료효율을 극대화하는 치료법 개발을 위해 유용하게 이용될 수 있다.According to the present invention, the cancer stem cell line of the present invention can be usefully used for the development of a new anticancer drug that can overcome the resistance of the existing anticancer agent or the development of a treatment for maximizing cancer treatment efficiency.
Description
도 1 A, B, D 는 배양된 뇌 암세포의 신경모세포 발현마커 및 신경세포에서 발현되는 단백질의 발현을 면역형광 분석법 및 웨스턴 블럿 방법으로 분석한 후 형광현미경으로 확인한 결과이다. C 의 경우 확립한 암세포주의 증식 속도를 나타 낸것이다.Figure 1 A, B, D is a result of confirming the expression of neuroblastoma markers and proteins expressed in neuronal cells of cultured brain cancer cells by immunofluorescence and Western blot analysis by fluorescence microscope. In case of C, the rate of proliferation was established.
도 2는 배양 암세포의 세포 표면인자의 발현 양상을 분석한 그림이다.Figure 2 is a diagram analyzing the expression of cell surface factors of cultured cancer cells.
도 3은 배양 암세포의 세포하위 구조를 전자 현미경으로 분석하고 염색체 이상을 나타내는 핵형을 함께 분석한 결과이다.Figure 3 is a result of analyzing the subcellular structure of cultured cancer cells with an electron microscope and karyotypes showing chromosomal abnormalities.
도 4는 배양된 뇌 암세포가 발현하는 신경줄기세포 관련 마커, Wnt 신호전달 관련 단백질 및 막 수송체 발현 양상을 나타낸 그림이다.4 is a diagram showing the expression of neural stem cell-related markers, Wnt signaling-related proteins and membrane transporters expressed in cultured brain cancer cells.
도 5는 확립한 암 줄기세포는 전 분화능(transdifferentiation potency)을 가지고 줄기세포특징을 갖고 있음을 면역화학적 방법으로 확인한 것이다. Figure 5 confirms that the established cancer stem cells have stem cell characteristics with transdifferentiation potency by immunochemical methods.
도 6은 확립한 암 세포 및 기존의 뇌종양 세포 주 (A172, U87MG)에 대한 약제내성을 나타내는 하위세포의 약제 내성 및 약물처리 후 증식 특성을 나타내는 그림이다.FIG. 6 is a diagram showing drug resistance and proliferative properties of sub-cells showing drug resistance to established cancer cells and existing brain tumor cell lines (A172, U87MG). FIG.
본 발명은 뇌 암 환자로부터 얻어진 악성 뇌 암 조직을 일차 배양하여 확립한 악성 뇌종양 세포 주 (GBM)를 확립하고 이에 악성 특성을 부여하는 하위세포군에 대한 기본적인 세포준위에서의 특성을 규명하고 이와 아울러 하위세포군이 갖는 뇌 암 줄기세포 특성을 기능적 측면에서 규명한 것이다.The present invention establishes the malignant brain tumor cell line (GBM) established by primary culturing malignant brain cancer tissues obtained from brain cancer patients and identifies the characteristics at the basic cell level for subpopulations that impart malignant characteristics thereto. The brain cancer stem cell characteristics of the cell population have been identified in terms of function.
지속적인 노력에도 불구하고 외과요법, 방사선요법, 면역요법, 그리고 유전자요법과 같은 다양한 암 치료요법이 글라이오 블라스토마(glioblastoma)와 같은 뇌종양을 앓고 있는 환자에게 향상된 치료 효율을 보이고 있지 않다. 종양은 골수 안에 있는 정상적인 줄기세포의 변형에 기인한 것으로 간주되고 있지만, 표피 유방, 그리고 뇌와 같은 몇 가지 다른 기관 안에 있는 성체줄기세포의 존재가 고형 종양(solid tumor)을 형성할 수 있는 종양 줄기세포의 기원이 될 수 있음을 암시하고 있다. 유방암과 뇌 암 덩어리에 종양 형성을 촉진하고 종양세포의 비 균일성을 만드는 작은 소수의 세포가 존재한다는 사실은 종양개시세포가 유방세포나 신경줄기세포에서 생성됨을 암시한다. 뇌종양의 세포기원은 아직 명백하지 않고 뇌종양은 일반적으로 다양한 신경계통마크를 표현하는 형태학적으로 다양한 세포들로 구성되어 있다.Despite ongoing efforts, various cancer therapies, such as surgery, radiotherapy, immunotherapy, and gene therapy, have not shown improved treatment efficiency in patients with brain tumors such as glioblastoma. Tumors are considered to be due to the transformation of normal stem cells in the bone marrow, but tumor stems in which the presence of adult stem cells in the epidermal breast and some other organs, such as the brain, can form a solid tumor. Implying the origin of the cell. The presence of a small number of cells in the breast and brain cancer masses that promote tumor formation and make tumor cells non-uniform, suggesting that tumor initiating cells are produced in breast cells or neural stem cells. The cell origin of brain tumors is not yet clear and brain tumors are generally composed of morphologically diverse cells that express various nervous system marks.
성인의 가장 빈번한 악성 뇌종양인 글라이오 블라스토마는 분자수준에서 치료법을 개발하기 위한 이상적인 모델종양으로 간주되고 있다. 지금까지 뇌종양의 기본적인 형태학과 표현형에 대한 연구는 종양의 임상학적 특징에 기인된 제한된 양의 정보만을 얻었다. 왜냐하면 유사한 형태와 표현형을 가지고 있는 뇌종양은 매우 다른 진단과 치료에 대한 반응을 나타낼 수 있기 때문이다. 다른 관점에서 일반 조직과 비교했을 때, 암은 태아의 조직처럼 덜 분화된 세포 구조를 나타내기 위한 탈분화된 것으로 간주되고 있다. 오늘날, 병리학자들은 여전히 종양의 등급에서 “탈분화(dedifferentiation)의 정도”에 대해서 언급한다. 불충분하게 분화된 것은 잘 분화된 것에 비해 좋지 않은 진단을 암시한다. 화학물질 또는 바이러스와 같은 외적인 요인은 성숙한 성인 세포의 탈분화(dedifferentiation)를 유도하여 분화된 조직을 줄기세포 형태로 분화시킬 뿐만 아니라 동시에 암을 유발하는 요인이 될 수도 있다.Glioblastoma, the most frequent malignant brain tumor in adults, is considered an ideal model tumor for developing therapies at the molecular level. To date, studies of the basic morphology and phenotype of brain tumors have obtained only a limited amount of information due to the clinical characteristics of the tumor. Because brain tumors with similar forms and phenotypes can respond to very different diagnoses and treatments. In other respects, compared to normal tissues, cancer is considered to be dedifferentiated to exhibit less differentiated cellular structures, such as fetal tissue. Today, pathologists still refer to the "dedifferentiation" in tumor grade. Insufficient differentiation suggests a poor diagnosis compared to well differentiated. External factors, such as chemicals or viruses, can induce dedifferentiation of mature adult cells to differentiate differentiated tissues into stem cell forms, as well as to cause cancer.
유전적 변형에 의한 성장 조절 기능에 있어서의 변화는 암에서 나타나는 변화된 성장을 야기하는 것으로 널리 받아들여지고 있다. 자가 갱신에서의 유전자의 제한은 정상조직에서 줄기세포의 증식을 제한한다. 자가 재생 조절의 붕괴는 발암과정에 관여하는 몇 가지 경로가 정상의 줄기세포의 자가 재생 결정에 중요한 역할을 한다는 사실에서부터 암의 발달에 중요한 요인인 것으로 간주되고 있다. Changes in growth regulation by genetic modifications are widely accepted to cause altered growth in cancer. Restriction of genes in self-renewal limits the proliferation of stem cells in normal tissues. The disruption of self-renewal regulation is considered to be an important factor in the development of cancer from the fact that several pathways involved in carcinogenesis play an important role in determining the self-renewal of normal stem cells.
암 조직에는 그들만의 줄기세포를 함유하고 있을 수 있다는 증거가 증가하고 있다. 정상조직과 같이 많은 암들은 느리게 분열하는 줄기세포들, 빠르게 분열하는 일시적 증식세포, 그리고 분화된 세포들을 포함하는 계층제의 조직화된 세포군에 의해 유지되어지는 것으로 간주된다. There is increasing evidence that cancer tissue may contain their own stem cells. Many cancers, like normal tissue, are considered to be maintained by hierarchical organized cell populations, including slowly dividing stem cells, rapidly dividing transient proliferating cells, and differentiated cells.
암 줄기세포에서 기원 세포는 그것들의 정상적인 줄기세포로부터 유래되었을 수도 있고 아닐 수도 있다. 악성 신경교종(malignant gliomas)은 종종 분화되지 않은 줄기 세포군과 분화된 세포군 모두를 포함하고, 때때로 글라이알 마크와 네스틴(nestin)이 발현되는 세포들을 포함하는데 이는 다양한 잠재력을 지닌 신경 전구세포들을 포함할 수도 있다는 것을 의미한다. 천천히 분화되는 암줄기세포의 작은 특정 생물형군인 하위세포군(subpopulation)의 존재는 심지어 대부분의 암세포들이 요법에 의해 모두 죽을 때에도 방사선 조사 또는 세포독성 약물을 처리한 후에 생존하여 재발에 중요한 요인이 될 수 있다. 늘 몇몇의 암 세포들은 치료에도 불구하고 살아남으며, 이 생존한 세포들은 암줄기세포일지도 모르며, 종양 줄기세포는 치료요법에 대해 저항성을 나타낼 뿐만 아니라 암의 악성을 위해 필수적이다. 단지 몇몇의 희귀한 부류의 종양줄기세포가 암 조직에서 악성을 만들며, 그래서 치료법의 목표가 이 개체를 식별하여서 그것을 표적으로 한 치료법을 개발하는 것이다.In cancer stem cells, the cells of origin may or may not be derived from their normal stem cells. Malignant gliomas often include both undifferentiated and differentiated cell populations, sometimes with cells expressing Glymal Marks and Nestin, which can produce neural progenitor cells of varying potential. It can also include. The presence of subpopulations, which are small, specific biotypes of slowly dividing cancer stem cells, can survive after treatment with radiation or cytotoxic drugs, even when most cancer cells are all killed by therapy, which can be an important factor in recurrence. . Some cancer cells always survive despite treatment, and these surviving cells may be cancer stem cells, and tumor stem cells are essential for cancer malignancy as well as resistance to therapy. Only a few rare classes of tumor stem cells produce malignancy in cancerous tissues, so the goal of therapy is to identify the individual and develop therapies that target it.
암 요법에 대한 새로운 접근은 종양이나 암세포에서 구조적으로 활성화된 신호전달경로와 필수불가결한 유전자 저해 요소를 이용한 치료 연구에 집중되고 있다. 이들 신호전달계를 표적으로 하는 약물은 상당히 좋은 전망을 나타내고 있다. New approaches to cancer therapy are focused on therapeutic studies using structurally activated signaling pathways and indispensable gene inhibitors in tumors or cancer cells. Drugs targeting these signaling systems have a very good prospect.
본 발명자의 연구 결과를 통해서 약제의 탐색이나 최근의 초고속 탐색기술에 효율적으로 적용할 수 있는, 암의 하위 세포군에 대한 기본 특성 및 이에 대한 인식이 아직까지 잘 알려져 있지 않는 현실의 암세포에 대한 이해를 보다 정확하게 할 수 있는 계기가 될 것이다. 뿐만 아니라, 암줄기세포의 세포학적 기본특성의 이해 및 이들 하위세포군이 가지는 뇌 암의 악성을 결정하는 기능 및 그 작용양식은 약제 내성의 기작을 이해하는데 영향을 줄 것이고 아마도 미래의 치료표적을 발굴 하는 데 아주 유용한 지표가 될 것이다. Based on the research results of the present inventors, the basic characteristics of cancer cell subpopulations, which can be efficiently applied to drug search and recent ultra-high speed search technology, can be understood. It will be a chance to do it more accurately. In addition, the understanding of the cellular basic characteristics of cancer stem cells, their ability to determine the malignancies of brain cancer, and their mode of action will influence the understanding of the mechanisms of drug resistance, perhaps to identify future therapeutic targets. It will be a very useful indicator.
이에, 본 발명자들은 약제의 탐색이나 최근의 초고속 탐색기술에 효율적으로 적용할 수 있는 암 줄기세포에 대한 정보를 획득하기 위하여 연구한 결과, 암세포나 종양에서 10 - 15 % 미만으로 존재하면서 약제 및 방사선요법에 의한 내성을 가지는 하위 세포군의 정체 분석 및 이들의 약제 내성 기능을 정확하게 규명하는데 본 발명을 완성하게 되었다. Thus, the present inventors have studied to obtain information about cancer stem cells that can be efficiently applied to the search for drugs or the latest ultra-fast search technology, and the present invention is less than 10-15% in cancer cells or tumors, and the drugs and radiation The present invention has been completed to accurately identify the identity of subpopulations with resistance by therapy and to accurately identify their drug resistance functions.
따라서, 본 발명은 인간의 뇌암 조직에서 유래된 확립된 뇌암 세포주로부터 암 치료를 위한 표적이 되는 암 줄기세포를 규명하여 효율적 암 치료에 기본적 정보를 제공하는데 그 목적이 있다. Accordingly, an object of the present invention is to identify basic cancer stem cells for cancer treatment from established brain cancer cell lines derived from human brain cancer tissues and to provide basic information for efficient cancer treatment.
본 발명의 암 줄기세포는 항암제의 탐색이나 암 치료 효율을 극대화하는 치료법 개발을 위한 기본 정보를 제공하는데 중요한 역할을 가질 것을 기대한다.Cancer stem cells of the present invention is expected to play an important role in providing basic information for the development of therapeutics to maximize the search for anticancer drugs or cancer treatment efficiency.
본 발명은 인체 뇌 암 조직 유래 확립한 뇌 암세포에 존재하는 유래 확립한 뇌 암세포에 존재하는 암 세포의 악성 및 각 종 치료요법에 내성을 제공하는 하위 세포군의 존재 및 특성을 규명하는데 그 특성 및 의의가 있다고 할 수 있다.The present invention is to identify the presence and characteristics of subpopulations that provide resistance to malignant and various therapies of cancer cells present in established brain cancer cells derived from human brain cancer tissue. It can be said.
본 발명의 한 양태에 따르면, 악성 뇌종양 환자의 글라이오블라스토마(glioblastoma) 조직에서 유래하고 항암제에 대한 약제 내성을 갖는 암 줄기세포주 GBM 2(KCLRF-BP00134)를 제공한다.According to one aspect of the present invention, there is provided a cancer stem cell line GBM 2 (KCLRF-BP00134) derived from glioblastoma tissue of a malignant brain tumor patient and having drug resistance to anticancer agents.
본 발명의 암 줄기세포주 GBM 2는 서울대학교 의과대학의 한국세포주연구재 단에 2006년 4월 27일에 기탁번호 (KCLRF-BP00134)로 기탁되었다.Cancer stem
바람직하게는, 본 발명은 미분화 신경줄기세포에서 발현되는 네스틴(Nestin)과 Oct 4를 다량 발현하고 탈분화된 후 신경세포로의 전 분화능(transdifferentiation)을 갖는 것을 특징으로 하는 암 줄기세포주 GBM 2를 제공한다. 본 발명의 실시예에서는 상기 줄기세포주로서의 특성 및 약제 내성 등을 실험하여 본 발명의 암세포주가 악성 뇌종양의 원인인 암 줄기세포주임을 입증하였다. Preferably, the present invention provides a cancer stem
본 발명의 다른 양태에 따르면, 뇌 암 환자로부터 악성 뇌종양 조직을 채취하는 단계; 상기 조직을 잘게 자른 다음 트립신을 처리하여 분리하는 단계; 상기 분리된 세포를 bFGF 및 EGF를 첨가하여 배양하는 단계; 상기 세포를 적어도 35세대 이상 계대배양하여 암세포주를 확립하는 단계; 상기 암세포주로 부터 FACS를 통해 CD133 양성인 하위 세포군(subpopulation)을 확인하는 단계; 상기 암세포주를 RT-PCR을 통해 네스틴(Nestin)과 Oct 4의 발현여부를 확인하는 단계; 상기 암세포주를 탈분화한 후 신경세포로의 전 분화능을 확인하는 단계; 및 상기 암세포주를 항암제에 대한 약제 내성을 확인하는 단계를 포함하는 악성 뇌종양 환자에서 유래한 암 줄기세포주의 제조방법을 제공한다.According to another aspect of the invention, the step of collecting malignant brain tumor tissue from a brain cancer patient; Slicing the tissue and then subjecting to trypsin for isolation; Culturing the isolated cells by adding bFGF and EGF; Subcultured at least 35 generations of cells to establish a cancer cell line; Identifying a subpopulation of CD133 that is positive through FACS from the cancer cell line; Confirming the expression of nestin and Oct 4 in the cancer cell line through RT-PCR; Confirming the full differentiation ability to neurons after dedifferentiating the cancer cell line; And it provides a method for producing a cancer stem cell line derived from a malignant brain tumor patient comprising the step of confirming the drug resistance to the cancer cell line anticancer agent.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 암 줄기세포주 GBM 2에 후보 항암제를 처리하는 단계 및 상기 암 줄기세포주의 세포사멸율을 측정하는 단계를 포함하는 악성 뇌암에 대한 신규 항암제의 탐색방법을 제공한다. 따라서, 본 발명의 암 줄기세포주는 종래 항암제의 약제내성을 극복할 수 있는 악성 뇌암에 효과적인 신 규 항암제를 개발하기 위한 표적으로 이용할 수 있다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for searching for a novel anticancer agent for malignant brain cancer comprising the step of treating the cancer stem
이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.The present invention will be described in more detail as follows.
본 발명은 먼저 뇌종양 환자의 종양조직을 추출하여 일차 배양 및 계대 배양하여 안정적인 세포 주를 확립하였다. 확립한 배양 뇌 암세포의 특성을 연구하기 위해 줄기세포의 특징을 가지면서 암의 악성도를 결정하는 10 % 이하의 분포도를 가지는 하위세포군인 암줄기세포의 기본적 특성 및 기능적 특성을 규명하고 나아가 항암제의 탐색이나 암 치료효율을 극대화하는 치료법 개발을 위해 표적세포로 간주하고 이를 특이적으로 사멸시킬 수 있는 방법을 모색하여 기존의 뇌 암 치료 방법에서 진보된 치료방법을 간접적으로 제시하는데 궁극적인 목적이 있다. The present invention first to extract the tumor tissue of brain tumor patients to establish a stable cell line by primary culture and passage culture. To study the characteristics of cultured brain cancer cells, the basic characteristics and functional characteristics of cancer stem cells, which are sub-populations with the characteristics of stem cells and the distribution of less than 10% to determine the malignancy of cancer, are further explored. In order to develop a treatment that maximizes cancer treatment efficiency, the goal is to indirectly present an advanced treatment method in the existing brain cancer treatment method by searching for a method that can be considered as a target cell and specifically killing it.
지금까지 암조직의 암세포는 무한 증식하는 세포로 알려져 있고 항암제에 의하여 사멸하지만 조직 내의 특정 하위세포군(subpopulation)이 항암제제에 의하여 죽지 않고 암의 재발의 모태가 되어 이를 암줄기세포로 인식하고 있었고, 이 암 줄기세포에 대한 존재의 인식 및 이의 세포학적 특성 규명 및 이의 약물 및 방사선 치료요법에 대한 저항성특성에 대한 기본정보의 산출이 거의 전무한 실정이다. 따라서 본 발명자의 기본 연구를 통해서 암 치료의 표적이 될 수 있는 하위세포군에 대한 연구를 집중적 수행하여 규명하였다.Until now, cancer cells of cancer tissues are known to be infinitely proliferating cells and are killed by anticancer drugs, but certain subpopulations within the tissues are not killed by anticancer drugs. There is almost no basic information on the recognition of the presence of cancer stem cells, their cytological characteristics, and their resistance to drug and radiation therapy. Therefore, through the basic research of the present inventors have been investigated by intensively researching the sub-cell population that can be the target of cancer treatment.
본 발명자들은 악성 뇌종양 (신경 교종) 환자의 뇌로부터 적출한 암 조직의 일차 배양 및 지속적인 계대배양을 통해 확립한 뇌 암 세포 주를 이용하여 배양 세포 중 낮은 분포도를 가지는 하위세포군에 대한 일반적인 특성을 세포 준위에서 조사하였다. 이는 악성 뇌종양 환자로부터 얻어진 글라이오 블라스토마 암 조직을 적 출하여 일차 배양한 후 적어도 35 세대 이상 계대 배양하여 안정한 세포 주를 확립한다. 본 발명에서는 새롭게 확립한 세포주의 일반적인 특성을 규명하여 악성 뇌종양에 대한 세포학적, 기능적 측면에서의 새로운 정보를 제공하는데 큰 의의가 있다. 세포학적 측면에서의 특성 분석은 암세포의 세포표면 인자의 분석과 전자 현미경 (TEM, transmission electronic microscope) 을 이용한 세포 하위구조의 분석, 핵형 분석에 따른 염색체 이상형 판단, 전사 체 발현 분석을 통한 일반적인 뇌 암 세포에서의 각 종 마커에 대한 유전자 발현 분석, 그리고 뇌 암 세포의 전 분화 능의 분석 등으로 수행하여 기존의 세포 주와 상호 비교하여 암 세포 준위에서 이해할 수 있는 정보의 산출에 중요한 연구 결과가 될 것이다 [도 1, 2, 3, 4, 5 ]. The present inventors have described the general characteristics of low-distribution subpopulations of cultured cells using brain cancer cell lines established through primary and continuous passage of cancer tissues extracted from the brains of patients with malignant brain tumors (neuroglioma). The level was investigated. It extracts primary glioma bladder cancer tissue from malignant brain tumors and passages at least 35 generations to establish stable cell lines. In the present invention, it is of great significance to provide new information in terms of cytology and function of malignant brain tumors by identifying general characteristics of newly established cell lines. In terms of cytology, analysis of cell surface factors of cancer cells, analysis of cell substructures using transmission electronic microscope (TEM), chromosomal abnormality determination by karyotype analysis, and general brain cancer through transcriptome expression analysis Gene expression analysis of various markers in the cell, and analysis of the pluripotency of brain cancer cells, etc., will be important for the generation of comprehensible information on cancer cell levels compared with existing cell lines. 1, 2, 3, 4, and 5.
또한, 본 발명자들은 암세포주를 확립하여 기본적 특성을 규명한데 이어 확립한 배양 암세포에서 약제 내성을 나타내는 낮은 분포도로 존재하는 하위 세포군인 암 줄기세포에 대해 기능적 측면에서의 약제 내성 특성을 밝히고 이 하위세포군의 정체를 밝혀 앞으로의 약제 내성을 극복하여 보다 효율적인 암 치료에 중요한 지표가 될 수 있는 정보를 산출하였다 [도 6]. In addition, the present inventors have established the cancer cell line to identify the basic characteristics, and then revealed the drug resistance characteristics in terms of functional resistance to cancer stem cells, which are subgroups of cells present in a low distribution of drug resistance in the cultured cancer cells. By finding out the identity of the drug to overcome the future drug resistance yielded information that can be an important indicator for more effective cancer treatment [Fig. 6].
본 발명의 실시예는 구체적으로,Specifically, the embodiment of the present invention,
1) 환자의 뇌 암 조직의 수집 및 이의 일차배양법에 의한 세포주의 확립 단계;1) the collection of brain cancer tissue of the patient and the establishment of a cell line by its primary culture method;
2) 확립한 암 세포주의 배양 세포에 대하여 표면 에피토프(surface epitope)의 발현을 분석하는 단계;2) analyzing the expression of surface epitope on cultured cells of the established cancer cell line;
3) 확립한 암 세포주 배양 세포의 전자 현미경을 이용한 세포하위 구조에 대 한 탐색 및 분석 단계;3) exploration and analysis of subcellular structures using established electron microscopy of cancer cell line cultured cells;
4) 확립한 암 세포주 배양 세포의 핵형을 분석하는 단계;4) analyzing the karyotype of the established cancer cell line cultured cells;
5) 확립한 암 세포주의 RNA을 추출한 후 RT-PCR를 수행하여 기본적인 뇌암 세포의 전사체 발현 특성을 밝히는 단계 ;5) extracting RNA of the established cancer cell line and performing RT-PCR to reveal the transcriptome expression characteristics of basic brain cancer cells;
6) 확립한 암 세포주의 배양 세포 및 암조직의 성상을 줄기세포 마커의 일차항체를 이용하여 발현정도를 확인하고 배양 세포의 분화능을 분화 유도 후 면역조직화학적 방법으로 확인하고 정량하는 단계; 및6) confirming the expression level of the cultured cells and cancer tissues of the established cancer cell line using the primary antibody of the stem cell marker and confirming and quantifying the differentiation capacity of the cultured cells by immunohistochemical method after induction of differentiation; And
7) 확립한 암 세포주의 배양 세포의 암 치료 약물 치료법에 대한 내성 및 감수성을 조사하는 단계; 7) investigating resistance and susceptibility to culture therapy drug therapy of established cancer cell lines;
를 포함한다.It includes.
본 발명의 수행을 위한 암 줄기세포의 동정 및 뇌 암에서의 기능 규명과정을 상세히 설명하면 다음과 같다.Referring to the identification of cancer stem cells for the performance of the present invention and the process of identifying the function in brain cancer in detail as follows.
먼저, 본 대학병원 신경외과에서 외과적 수술에 의해 얻어지는 악성 뇌종양환자로부터 종양조직을 추출한 후 이를 적어도 35 세대까지 배양하여 안정한 뇌암 세포 주를 확립, 확보한다. 배양 종양세포에 대하여 이의 기본 특성을 밝히는 예비 실험을 규명하고자 표면 에피토프(surface epitope) 발현의 분석을 위한 전사체의 분석 및 암세포에서의 전자현미경 분석을 통한 암세포의 세포 하위의 특성 및 핵형분석을 수행한다. 뿐만 아니라, 배양 암세포의 분화적 특성을 규명하기 위해 배양한 종양 세포주를 먼저 성장인자가 포함된 배양배지에서 부유 배양한다. 이때 배양과정에서 NB(Neurobasal) 배지에 성장인자를 처리하여 2 ~ 6일간 부유 배양한 다. 상기 성장인자로는 EGF(epidermal growth factor) 및 bFGF(basic fibroblastic growth factor)를 사용하는 것이 신경 줄기세포의 성장을 유도하는 이유로 바람직하다. 배양 후 성숙한 신경세포 및 신경아교세포로의 분화능을 분석하기 위해 배양세포를 7일간 2% FBS, 20 ng/ml retinoic acid 를 함유하는 분화배지를 이용하여 laminin 또는 fibronectin 이 입혀진 배양 접시에서 분화를 유도하였다. 분화 유도 후 분화 효율 및 이의 분석은 신경세포가 발현하는 전사체 발현의 분석 및 면역화학적 방법을 통한 단백질의 발현양의 분석을 통하여 확인하였다. 한편, 본 발명에서는 일차 배양 뇌 암세포에 대한 치료제로 활용되고 있는 화학 치료제에 대한 내성 특성을 규명하였다. 이러한 암 치료 요법에 대한 내성 특성은 암 줄기 세포 특성을 가지는 하위세포군의 특성으로 간주 되며 이들 하위세포군인 암 줄기세포의 세포학적 기능적 특성을 분석하는데 본 발명의 의의가 있다. 이와 아울러, 암 줄기세포는 약제 내성이나 방사선 치료에 대한 내성, 모든 뇌 지역으로의 전이, 그리고 뇌두개 내로의 이식 후에 대단한 성장 잠재력과 같은 전형적인 암줄기세포의 특성을 보였다.First, tumor tissues are extracted from patients with malignant brain tumors obtained by surgical surgery in the university hospital neurosurgery and cultured for at least 35 generations to establish and secure stable brain cancer cell lines. To identify preliminary experiments on the cultured tumor cells, we performed the analysis of transcripts for the analysis of surface epitope expression and the subcellular characterization and karyotyping of cancer cells through electron microscopic analysis in cancer cells. do. In addition, in order to determine the differentiation characteristics of cultured cancer cells, the cultured tumor cell lines are first suspended in culture medium containing growth factors. At this time, the growth factor in the NB (Neurobasal) medium in the culture process is suspended in culture for 2 to 6 days. EGF (epidermal growth factor) and bFGF (basic fibroblastic growth factor) is preferably used as a growth factor for inducing growth of neural stem cells. In order to analyze the differentiation ability of mature neurons and glial cells after incubation, the cultured cells were differentiated in laminin or fibronectin-coated culture dishes using differentiation medium containing 2% FBS and 20 ng / ml retinoic acid for 7 days. . Differentiation efficiency and its analysis after induction of differentiation were confirmed through analysis of expression of transcripts expressed by neurons and analysis of protein expression levels through immunochemical methods. On the other hand, the present invention has been characterized for resistance to chemotherapeutic agents that are used as a therapeutic agent for primary cultured brain cancer cells. Such resistance to cancer therapy is regarded as a characteristic of a subcellular group having cancer stem cell characteristics and has significance of the present invention in analyzing the cytological and functional characteristics of these stem cell groups, cancer stem cells. In addition, cancer stem cells exhibited typical cancer stem cell characteristics such as drug resistance, resistance to radiation therapy, metastasis to all brain regions, and great growth potential after implantation into the cranial brain.
배양한 뇌 암 세포에 암 줄기 세포와 같은 특정 하위세포군(subpopulation)은 외관상으로 정상적인 혈청을 함유한 배양액에서 6개월 이상 유지되었다.Certain subpopulations, such as cancer stem cells, in cultured brain cancer cells were apparently maintained for over 6 months in cultures containing normal serum.
이러한 뇌종양으로 부터의 뇌 암 줄기세포의 특성 및 기능은 뇌 암의 악성 형성에 중요한 기여를 할 수 있으며, 발암의 과정과 그 기작뿐만 아니라 악성의 탈분화된 암줄기세포를 포함하는 약제 내성기작에 대한 지식은 궁극적으로 암 치료 요법의 발전을 가져올 것으로 기대된다.The characteristics and function of brain cancer stem cells from these brain tumors can make an important contribution to the malignant formation of brain cancer, and the knowledge of drug resistance mechanisms including malignant dedifferentiated cancer stem cells as well as the process and mechanism of carcinogenesis. It is expected to ultimately lead to the development of cancer treatment therapies.
이하, 본 발명은 다음 실시 예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on the following examples, but the present invention is not limited thereto.
실시예 1: 뇌종양조직의 수집과 일차배양Example 1 Collection and Primary Culture of Brain Tumor Tissue
인간의 뇌종양 조직은 신경외과 수술을 받고 있는 환자로부터 부산대학교 메디컬센터에서 국제 검정 단에 의해 입증된 절차에 따라서 수술 30분 안에 얻었다. 종양은 WHO가 제정한 가이드라인에 따라서 신경 병리학자에 의해 등급을 매기고, 종양조직의 배양은 다음의 방법으로 수행하였다. 조직을 세척하고 잘게 다진 후 트립신으로 처리하여 분리된 세포들은 단위 ml당 100,000의 밀도에서 bFGF 20 ng/ml 및 EGF 20 ng/ml을 첨가하여 배양하였다. 적어도 35 세대 이상 계대배양한 후 안정한 글라이오 블라스토마 말티포르메2 (Glioblastoma multiforme 2) 뇌 암 세포주를 확립하였다.Human brain tumor tissues were obtained from patients undergoing neurosurgery within 30 minutes of surgery following a procedure validated by the International Testing Center at Pusan National University Medical Center. Tumors were graded by neuropathologists according to WHO established guidelines, and culture of tumor tissues was performed in the following manner. Tissues were washed, chopped and treated with trypsin and the cells isolated were incubated with the addition of 20 ng / ml bFGF and 20 ng / ml EGF at a density of 100,000 per ml. After passage at least 35 generations or more, a
실시예 2: 표면 에피토프 분석(Surface epitope analysis)Example 2: Surface epitope analysis
암 세포 주에서 특정 생물형군(subpopulation)의 분석을 위하여, 본 발명에서는 상기 실시 예 1에 기술된 것과 같이 세포를 배양하였고, 그 세포들은 트립신과 EDTA로 배양 디쉬로 부터 떼어내어 PBS로 세척하였다. 세척된 세포는 4 ℃에서 30분 동안 CD90, CD133, CD45, 그리고 CD117로 표지한 후 1× 105 세포를 FACS(Vantage fluorescence-activated cell sorter)로 분석하였다. 이때 아이소타입(isotype) 대조군을 위해서 비 특이적 생쥐 또는 토끼 IgG가 일차항체를 표지하 여 분석하였다. 세포 표면의 에피토프를 분석한 후에 형광현미경으로 양성 세포를 분석하였다. 분석하여 본 결과, 환자에서 적출된 뇌 암 조직에서의 확립 배양한 세포에서 줄기세포의 특정 하위 세포군(subpopulation)을 갖고 있었으며, 도 2 에서와 같이 확립한 뇌 암 세포 주는 5.6%의 CD133에 양성을 나타내었고 9.3%가 CD71, 1.65%의 CD117, 그리고 1.4% 가 CD45 에 있어서 양성반응을 나타내었다. 3~4일 배양 후에 CD133 양성 세포 주들이 CD133 음성 세포 주들에 비해 빠른 속도로 증식하는 양상을 보였다. 이로서, 뇌 암 조직에서는 미숙한 세포군, 즉 줄기세포군이 아주 소량 존재함을 알 수 있었고 이는 이미 확립된 악성 뇌 암 세포주의 종류에 따라 다양하게 나타남을 참고로 한 실험에서 확인 할 수 있었다. For analysis of certain subpopulations in cancer cell lines, the cells were cultured as described in Example 1 above, and the cells were removed from the culture dish with trypsin and EDTA and washed with PBS. The washed cells were labeled with CD90, CD133, CD45, and CD117 for 30 minutes at 4 ° C., and then 1 × 10 5 cells were analyzed by FACS (Vantage fluorescence-activated cell sorter). At this time, non-specific mouse or rabbit IgG was labeled with primary antibodies for isotype control. After analyzing the epitopes on the cell surface, positive cells were analyzed by fluorescence microscopy. As a result of the analysis, the cells cultured in the brain cancer tissues extracted from the patients had specific subpopulations of stem cells, and the brain cancer cell lines established as shown in FIG. 2 were positive for 133% of CD133. 9.3% were positive for CD71, 1.65% for CD117, and 1.4% for CD45. After 3-4 days of culture, CD133 positive cell lines proliferated faster than CD133 negative cell lines. As a result, the immature cell group, i.e., the stem cell group, is present in the brain cancer tissues, and it can be confirmed in an experiment that the various types of malignant brain cancer cell lines are established.
실시예 3: 핵형 및 세포하위 구조 분석Example 3: Karyotype and Subcellular Structure Analysis
확립한 암 세포 주를 35 세대 이상 배양 한 후 핵형에 있어서의 염색체 이상및 세포하위 구조물의 분석 각각을 핵형 분석 및 전자 현미경 분석을 통하여 수행하였다. 핵형 분석을 위해서 배양 세포를 한 시간 동안 콜세미드 및 KCl 처리 후 4% Gimsa 용액으로 염색한 후 Cytovision karyotyping program 을 이용하여 분석하였다. 그 결과 두 가지 형태의 핵형이 분석되었고 이들은 각각 염색체 수 69 또는 71 개의 비정상적인 핵형을 나타내었다. 대부분의 염색체는 염색체 조각들이 위치 이동이 된 상태로 분석되었고 약간의 염색체는 염색체 조각으로 분석되었다 [ 도 3 ]. 이와 아울러 배양한 암세포의 세포하위 구조를 전자현미경으로 수행한 결과 핵과 세포질의 비율이 상당히 높았고 핵 자체의 모양이 배아와 같은 모양을 일반적으로 갖고 있었고 뿐만 아니라, 농축된 핵형 및 아 세포형의 형태를 가지는 특성을 갖고 있었다 [ 도 3 ]. After 35 generations of established cancer cell lines were cultured, analysis of chromosomal aberrations and subcellular structures in karyotypes was performed through karyotyping and electron microscopic analysis. For karyotyping, cultured cells were stained with 4% Gimsa solution after treatment with colsemid and KCl for 1 hour and analyzed using Cytovision karyotyping program. As a result, two types of karyotypes were analyzed, each showing an abnormal karyotype of 69 or 71 chromosomes, respectively. Most chromosomes were analyzed with shifted chromosomal fragments and some chromosomes were analyzed with chromosomal fragments [FIG. 3]. In addition, the microstructure of the cultured cancer cells under electron microscopy showed that the ratio of nuclei to cytoplasm was quite high, and the nucleus itself was generally embryo-like. Branch had the characteristics [FIG. 3].
실시예 4: RNA 추출과 반정량적 RT-PCR Example 4 RNA Extraction and Semiquantitative RT-PCR
암세포로부터 tRNA을 트리졸(Trizol)로서 추출한 후에 올리고 디티(oligo dT) 프라이머를 사용하여 첫 번째 사슬 C-DNA로 역전사 시킨 후에 20 pM의 특이적 프라이머를 이용하여 35사이클(94 ℃, 1분, 55 ℃ 1분, 72 ℃ 1분)로 증폭시켰다. PCR 증폭은 다음 표 1의 프리이머 세트를 사용하여 수행되었다. 모든 프라이머 배열은 신경계통이나 조절유전자를 나타내는 유전자를 위해 입증된 휴먼 진뱅크 시퀀스(human GeneBank sequences) 정보를 이용하여 제작하였다.After tRNA was extracted from cancer cells as Trizol, it was reverse transcribed into the first chain C-DNA using oligo dT primers, followed by 35 cycles (94 ° C., 1 min, using 20 pM specific primers). 55 °
이 중 PCR 반응은 PCR 효율을 평가하기 위해 대조군으로서 β-액틴으로 제작된 프라이머를 사용하여 증폭하였고 1.5% 아가로스 젤 전기영동에 의하여 분석하였다.Among them, the PCR reaction was amplified using a primer prepared with β-actin as a control to evaluate PCR efficiency and analyzed by 1.5% agarose gel electrophoresis.
PCR 산물의 라벨링을 위해 Applied Biosystems로부터 구입한 사이버 그린 디텍션 킷트(Syber green detection kit)를 사용하였다. 정량적 실시간(Quantitative real time) RT-PCR은 ABI7700 프리즘 시퀀스 디텍션 시스템을 사용하여 수행하였다. Cyber green detection kit purchased from Applied Biosystems was used for labeling PCR products. Quantitative real time RT-PCR was performed using the ABI7700 Prism Sequence Detection System.
프라이머의 염기서열은 GeneBank 데이터베이스로부터 얻어진 염기서열을 사용하여 프라이머 발현 소프트웨어(Primer Express software)를 사용하여 디자인되어졌다. 전술한 모든 유전자에 대한 프라이머의 배열은 다음 표 1과 같다.The base sequence of the primer was designed using Primer Express software using the base sequence obtained from the GeneBank database. The arrangement of primers for all the genes described above is shown in Table 1 below.
뇌암조직 유래의 배양 암세포주가 신경줄기세포나 다른 조직 유래의 줄기세포에서 많이 발현되는 줄기세포 표지인자와 유전자들이 발현되는지를 RT-PCR에 의하여 조사하여 보았다. 암으로부터 유도된 세포들이 Nestin, Oct 4를 다량 발현하였고 반면, EGFR, TrK C, P75를 소량 발현되었고 FGFR, Trk A, B, Notch1 유전자는 발현되지 않았다 [표 2, 도 4]. 이때 Nestin, EGFR, Oct-4, Tert 뿐만 아니라 CXCR4, CXCR2 등은 보통 분화되지 않은 신경줄기세포나 뉴로스피어(neurosphere)에 많이 발현되는 유전자들로 알려져 있고 뇌 암 세포 주에서 줄기세포 관련 유전자가 발현됨을 나타낸다. 이와 함께 배양한 뇌종양 세포 주에서 Wnt 신호전달 과정에서의 단백질이 과량 발현되었고 이와 함께 약제 내성에 중요한 역할을 할 것으로 추정 되는 물질 수동 담당 막 단백질의 발현이 상당히 증가되어 있음을 확인하였다 [도 4 ]. RT-PCR was used to examine whether cancer cell lines derived from brain cancer tissues express stem cell markers and genes expressed in neural stem cells or stem cells derived from other tissues. Cells derived from cancer expressed a large amount of Nestin, Oct 4, whereas a small amount of EGFR, TrK C, P75 and FGFR, Trk A, B, Notch1 genes were not expressed [Table 2, Figure 4]. Nestin, EGFR, Oct-4, Tert as well as CXCR4 and CXCR2 are known as genes that are commonly expressed in undifferentiated neural stem cells or neurospheres, and stem cell-related genes are expressed in brain cancer cell lines. Indicates. In the brain tumor cell line cultured with this, it was confirmed that overexpression of the protein during Wnt signaling and the expression of the passive protein in charge of the substance, which are expected to play an important role in drug resistance, were significantly increased [FIG. 4]. .
실시예 5: 뇌 암세포의 신경교종 세포에서 신경세포로의 전 분화능Example 5 Pre-differentiation of Glioma Cells into Neurons of Brain Cancer Cells
배양한 뇌 암세포주의 전 분화 능을 분석하기 위해 배양된 GBM 세포를 일반적인 신경줄기세포 배양액의 첨가 액을 (B27, supplement)을 혈청을 대신해서 넣고, 뿐만 아니라, 10 ng/ml bFGF, 10 ng/ml EGF가 보충된 NB 배지(Invitrogen)에서 1× 105 per 디쉬의 밀도로 페트리 디쉬에 깔고 이후에 현탁액은 4일 동안 부유 배양하였다. 본 발명자들은 종양에서 유도된 세포를 세포들의 상호결합과 응집을 통하여 탈분화할 수 있는 조건을 부여하는데 이는 암세포의 분화 및 사멸을 억제하고 증식을 유도하는 세포성장인자인 bFGF(10 ng/ml)와 EGF(10 ng/ml)을 배지에 넣어 부유 배양하는 조건에서 유도되었다. 이러한 조건에서 4일 동안 현탁 배양할 경우 신경줄기세포형태인 뉴로스피어(neurosphere)를 형성할 수 있었다. 뉴로스피어의 형성은 미분화된 줄기세포상태에서 세포를 유지할 수 있기 때문에 bFGF(10 ng/ml)와 EGF(10 ng/ml)를 첨가함으로서 다기능의, 자기신생가능하고 신경줄기세포의 성장을 유도할 뿐만 아니라 성숙한 세포군에서도 줄기세포로의 탈분화를 유도하였다. 탈분화된 세포의 분화유도를 위해 배양 암 세포로부터 유도된 뉴로스피어는 라미닌 또는 파이브로넥틴이 코팅된 세포배양접시위에 세포를 분주하고 분화는 B27, 2% FBS 그리고 20 ng/ml 레티노익산이 들어있는 NB 배지에서 7일 동안 배양하여 유도하였다. 레티노익산(Retinoic Acid)은 매 2일마다 처리하였다. 뉴로스피어를 상기의 조건으로 분화시킨 후 효율적인 신경형성을 나타내었고 대조군에 비하여 높은 신경 마크를 로서 MAP2ab와 TuJ의 발현을 확인하였고 다소 낮은 글라이오 형성마크(MBP와 GFAF)를 확인하였다. 또한, 탈분화 세포의 분화 후에 신경줄기세포마크인 Nestin의 발현이 감소하였고 뉴런 마크인 TuJ의 발현 증가를 확인하였다 [도 5]. 따라서, 신경 교세포 유래의 탈분화된 배양 암세포주가 다른 유형의 세포인 뉴런으로 전 분화(transdifferentiation)될 수 있음을 알 수 있었다. 즉, 전형적인 신경줄기세포의 분화 특성과 유사한 암 줄기세포의 특성을 확인 할 수 있었다.In order to analyze the pluripotency of cultured brain cancer cell lines, cultured GBM cells were supplemented with serum (B27, supplement) in place of normal neural stem cell culture medium, as well as 10 ng / ml bFGF, 10 ng / ml. In NB medium supplemented with EGF (Invitrogen), a Petri dish was placed at a density of 1 × 10 5 per dish and the suspension was then suspended incubated for 4 days. The present inventors impose conditions that can dedifferentiate tumor-derived cells through the mutual binding and aggregation of cells, which is a cell growth factor bFGF (10 ng / ml) that inhibits the differentiation and death of cancer cells and induces proliferation. EGF (10 ng / ml) was induced in the culture of suspension culture in medium. Suspension culture for 4 days under these conditions was able to form neurospheres (neurosphere) in the form of neural stem cells. Neurosphere formation is able to maintain cells in undifferentiated stem cell state, so adding bFGF (10 ng / ml) and EGF (10 ng / ml) not only induces the growth of multifunctional, autologous and neural stem cells. In addition, the mature cell population induced dedifferentiation into stem cells. To induce differentiation of de-differentiated cells, neurospheres derived from cultured cancer cells divide cells into laminin or fibronectin-coated cell culture dishes and differentiate into B27, 2% FBS and 20 ng / ml retinoic acid. Induced by incubating for 7 days in NB medium. Retinoic Acid was treated every 2 days. After differentiation of neurospheres under the above conditions, efficient neuronal formation was observed, and expression of MAP2ab and TuJ was confirmed as a high nerve mark as compared with the control group, and a somewhat low glio formation mark (MBP and GFAF) was confirmed. In addition, after differentiation of dedifferentiated cells, the expression of Nestin, a neural stem cell mark, was decreased, and the expression of TuJ, a neuronal mark, was increased [FIG. 5]. Therefore, it was found that dedifferentiated cultured cancer cell lines derived from glial cells can be transdifferentiated into neurons, which are different types of cells. That is, the characteristics of cancer stem cells similar to those of typical neural stem cells were confirmed.
실시예 6: 면역형광조직화학적 분석 및 정량적 분석Example 6: Immunofluorescence Histochemical and Quantitative Analysis
분화된 암세포, 분리된 뇌 암 조직 부분 안에서 단백질 발현의 분석을 위해 면역형광 검출방법이 사용되었다. 분화된 세포와 조직절편은 4% 파라포름알데히드 고정 용액으로 고정되어졌고 면역화학적과정의 분석과정을 수행하였다. 세포들은 항GFAF(DAKO, 1: 1500), 항MAP2ab, 항TuJ, 항MBP, 항A2B5, 항Ki 67과 항Sox2에 대한 일차항체와 반응시켰다. PBS로 씻어준 다음 세포를 FITC나 TRITC가 부착된 2차 항체를 반응시켰다. 일차항체를 뺀 것이나 관계없는 IgG로 대체한 대조군의 경우 발색되지 않는다. 시료는 Leica 형광현미경으로 관찰하였다. 면역화학적 실험은 최소 3회 반복하였다. 각 일차항체와 뉴로날(neuronal), 신경교(glial) 그리고 증식하는 마크를 발현하는 세포에서 발현하는 단백질 (ki 67)을 분석하였다. 핵 마커(nuclear marker, DAPI)와 증식 마커(proliferating marker, Ki 67)와 함께 CFDA의 동시 발현 또는 동시 표지된 세포의 분석은(colocalization)은 3개의 레이저가 설치되어 있는 Leica TCS sp2 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 공 초점 주사현미경(Confocal Microscopy)에 의해 수행되었다. Immunofluorescence detection was used to analyze protein expression in differentiated cancer cells, isolated brain cancer tissue sections. Differentiated cells and tissue sections were fixed with 4% paraformaldehyde fixative solution and subjected to immunochemical analysis. Cells were reacted with primary antibodies against anti-GFAF (DAKO, 1: 1500), anti-MAP2ab, anti-TuJ, anti-MBP, anti-A2B5, anti-Ki 67 and anti-Sox2. After washing with PBS, the cells were reacted with a secondary antibody attached to FITC or TRITC. It is not developed in the control subtracted with the primary antibody subtracted or irrelevant IgG. Samples were observed by Leica fluorescence microscope. Immunochemical experiments were repeated at least three times. Proteins expressed in cells expressing each primary antibody, neuronal, glial and proliferating marks (ki 67) were analyzed. Co-expression or colocalization of CFDA with nuclear markers (DAPI) and proliferating markers (Ki 67) was performed using a Leica TCS sp2 laser scanning microscope equipped with three lasers. Using Confocal Microscopy.
이때, 각 일차 항체가 표지된 특정 항원 발현 세포들을 계산하여 각 신경세포 및 신경교세포로의 분화 능을 판단하였다. 이 실험결과는 도 5에 나타내었다.At this time, specific antigen-expressing cells labeled with each primary antibody were counted to determine their differentiation potential into neurons and glial cells. This experimental result is shown in FIG.
실시예 7: 항암제 BiCNU의 감수성의 결정과 증식률 조사Example 7: Determination of sensitivity and proliferation rate of anticancer agent BiCNU
탈분화된 뇌 암세포의 약제에 대한 감수성을 결정하기 위해 탈분화 세포를 단일세포로 형성시킨 후 세포(10000 cells/well)를 12 웰 플레이트에 깔고 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 첨가하여 하룻밤동안 부착시켜 배양하였다. 다음날 아침 배지를 제거하고 BiCNU를 첨가하지 않은 대조군과 각 농도별 BiCNU 항암제(0,17,33,66,99 mg/ml) 희석 액을 첨가하여 배양하였다. 3일까지 각각 농도 항암제를 처리한 후에, 항암제를 함유한 배지를 제거하고 항암제가 없는 배양배지 1 ml을 첨가한 후 CO2 배양기에서 다시 배양하였다.To determine the sensitivity of the drug to dedifferentiated brain cancer cells, dedifferentiated cells were formed into single cells, and the cells (10000 cells / well) were plated in 12-well plates and attached overnight by adding DMEM medium containing 10% FBS. Incubated. The next morning, the medium was removed and cultured by the addition of a control group without BiCNU and a diluting solution of BiCNU anticancer agent (0,17,33,66,99 mg / ml) at each concentration. After treatment with concentration anticancer agents up to 3 days, the medium containing the anticancer agent was removed, 1 ml of the culture medium without the anticancer agent was added, and then cultured again in a CO 2 incubator.
배양 1일 후에 MTT 분석을 수행하여 세포의 생존률 및 증식정도를 분석하였다. 이와 함께 항암제를 각 농도별 처리한 세포들에 성장 속도를 대조군에 대한 성장속도에 대한 변수의 상대적인 값을 정하여 결정하였다(%). 그 결과 높은 농도의 약물에서 2일간 처리한 결과 40% 이하의 생존률을 보였고, 낮은 농도에서는 80% 이상의 생존률을 보였다 [도 6 ]. 약물처리 3일 후에 생존한 하위세포군이 15 - 20% 이하로 나타났지만 이는 생존 후 다시 증식을 활발하게 해서 클론을 형성하였다. 한편 약물에 의해 사멸하는 세포는 apoptotic 세포 사멸 형태를 보였음을 Hoechest 를 이용한 핵 염색을 통해서 확인 하였다 [도 6 ].After 1 day of culture, MTT analysis was performed to analyze the survival rate and proliferation of the cells. In addition, the growth rate of the cells treated with the anticancer agent was determined by determining the relative value of the variable for the growth rate relative to the control group (%). As a result, two days of treatment with high concentrations of the drug showed a survival rate of 40% or less, and a low concentration showed a survival rate of 80% or more [FIG. 6]. After 3 days of drug treatment, surviving subcellular populations were 15-20% or less, but they proliferated again and survived to form clones. Meanwhile, the cells killed by the drug showed apoptotic cell death by nuclear staining using Hoechest [FIG. 6].
이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명은 암 세포 주나 종양에서 추출된 일차 배양 세포 주를 확립하고, 확립한 배양 뇌 암세포의 특성을 연구하기 위해 줄기세포의 특징을 가지면서 암의 악성도를 결정하는 낮은 비율의 분포도를 가지는 하위세포군인 암줄기세포의 기본적 특성 및 기능적 특성을 규명하고 나아가 항암제의 탐색이나 암 치료효율을 극대화하는 치료법 개발을 위해 표적세포로 간주하고 이를 특이적으로 사멸시킬 수 있는 방법을 모색하여 기존의 뇌 암 치료 방법에서 진보된 치료방법을 간접적으로 제시하는데 궁극적인 목적이 있다. 이는 항암제의 탐색이나 암 치료효율을 극대화하는 치료법 개발을 위해 매우 유용하리라 기대된다.As described above, the present invention is to determine the malignancy of cancer while having the characteristics of stem cells to establish a cancer cell line or primary cultured cell line extracted from the tumor, and to study the characteristics of the cultured brain cancer cells To identify the basic and functional characteristics of cancer stem cells, which are sub-populations with a low rate of distribution, and to identify anti-cancer drugs and develop treatments to maximize the efficiency of cancer treatment, and to identify them as target cells and to specifically kill them. The ultimate goal is to indirectly present advanced treatment methods in the existing brain cancer treatment methods. This is expected to be very useful for the development of anticancer drugs and therapies to maximize cancer treatment efficiency.
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