KR100782578B1 - 세포 주기조절을 통한 세포 형질전환 효과 증진 방법 - Google Patents

세포 주기조절을 통한 세포 형질전환 효과 증진 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 동물 세포 형질전환을 위한 DNA 도입효과 개선에 대한 새로운 방법 개발에 관한 것으로, 세포 주기조절과 지질을 이용한 형질전환 방법을 혼용하여
각종 동물세포 형질전환 효과를 극대화하는 방법으로 세포학적 수준의 표적 유전자의 기능 및 세포 내 변화양상을 규명하는데 이용될 수 있는 혁신적인 신규 방법이다.
형질 전환, 혈청, 세포 주기

Description

세포 주기조절을 통한 세포 형질전환 효과 증진 방법{Method of improving transient transfection efficiency by synchronization of cell cycle in cells}
도 1a 와 b는 각각 DLD-1 과 Chang 세포성장 시 세포주기를 동시화하기 위하여 각각의 배지에서 성장시킨 세포를 0.2% 혈청 고갈된 배지로 치환하여 12시간 배양함으로써, 세포주기 동시화 및 함께 사용된 LipofectamineTM Reagent 혼용에 따른 형질전환의 효과의 극대화를 보여주는 형광 현미경사진.
도 2는 도 1a 와 1b에서의 형질 전환된 세포를 계수하여 얻어진 데이터를 통계 처리하여 그래프로 나타낸 그림.
도 3은 정상배지와 0.2% 혈청 고갈배지를 이용하여 세포를 배양한 후 LipofectamineTM Reagent에 의한 형질전환 한 세포로부터 세포들을 모아 용출 액을 만들고, 10% SDS-PAGE를 이용하여 단백질을 분리한 후, 유전자 도입에 의한 단백질( X-protein)의 과 발현 정도를 Western blot으로 확인한 결과로써 좌측 레인부터 각각 비 형질전환, 정상배지 성장 후 형질전환, 0.2% 혈청 고갈 배지 성장 후 형질전환을 나타낸다.
도 4는 트랜스펙션 효율 평가를 위하여 실험군과 대조군으로 나누어 실험을 진행한 진행과정을 요약한 것이다.
본 발명은 동물 세포 형질전환을 위한 DNA 도입효과 개선에 대한 새로운 방법 개발에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 세포 주기조절을 이용한 각종 동물세포 형질전환 효과를 극대화하는 방법으로 세포학적 수준의 표적 유전자의 기능 및 세포 내 변화양상을 규명하는데 이용될 수 있는 혁신적인 신규 방법이다.
1970 년대 후반에, 배양에서 외래 또는 외부 DNA를 포유류 세포들로 소개하고 발현하는 것을 가능하게 하는 방법들이 개발되었다. 트랜스펙션 또는 트랜스포메이션으로 알려진 이들 기술은 포유류 및 많은 포유류 바이러스들의 여러 유전자들의 기능 및 발현을 조사하는 강력한 방법이다. 세포에 흥미있는 외래 DNA를 소개하여 그 DNA에 포함된 유전자의 발현을 모니터하여 그 유전자는 자연적으로 발현되는 세포 내에 있는 것에 비하여 더욱 상세하게 분석될 수 있다. 예를 들어 어떤 유전자의 제한된 지역의 돌연변이 및/또는 결손은 그것의 발현의 조절에 중요한 유전자 내 DNA 구성요소를 동정하는데 사용될 수 있다. 그러한 연구들은 여러 RNA 가공 및 번역 신호뿐 아니라 새로운 전사 조절 요소을 발견할 수 있게 한다. 또한 세포주로 외래 유전자의 소개는 트랜스펙션된 유전자의 발현에 대한 약물 및 다른 시료의 효과 또는 그 세포의 성장에 대한 유전자의 효과를 연구하는데 사용될 수 있다.
트랜스펙션 기술은 또한 세포를 지노믹 DNA 풀로 트랜스펙션하여 유전자들을 분리 하고 유전적 상보(complementation) 기술을 사용하여 원하는 세포들을 선택하는데 사용될 수 있다. 치킨 싸이미딘 카이네이즈 유전자, 인간 싸이미디레이트 합성 유전자, 인간 DNA 복구 유전자 및 새 암유전자와 같은 여러 포유류 유전자들은 이들 기술들을 사용하여 분리하였다.
포유류 세포들에 DNA를 트랜스펙션시키는 것의 넓은 유용성으로 인하여 트랜스펙션을 수행하는 많은 프로토콜이 개발되었다. 그들 중 일부는 배양된 포유류 세포들에 의해서 외래 DNA를 흡수하는 캐리어로 칼슘 포스페이트나 DEAE-덱스트란(또는 그것의 유도체들)를 사용하는 것이다. 또 다른 방법은 트랜스펙션을 효과적으로 수행하기 위하여 합성 양이온성 지질을 사용하는 리포펙션 방법이다. 또 세포의 삼투 충격이나 리조좀 저해제로 세포를 처리하여 트랜스펙션 효율을 증가시키는 방법도 있으며 세포에 의하여 DNA 흡수의 효율을 증가시키기 위하여 세포막에 구멍을 생성하기 위하여 고압의 전기 충격을 사용하여 효율을 증가시키는 방법이 있다.
그러나 이러한 방법들은 수용체로 사용하는 세포주에 따라서 약 0.001%에서 1% 범위의 비교적 낮은 트랜스펙션 효율을 가진다(트랜스펙션 효율은 처리된 세포을 염색하여 결정되는 것과 같은 소개된 유전자에 의하여 주어진 특성을 얻은 세포의 % ;또는 트랜스펙션된 DNA내에 코딩된 유전자 산물에 대한 분석에 의하여 결정된 세포에 의하여 흡수된 DNA 응집 양의 측정으로 나타낸다) 이 낮은 트랜스펙션 효율로 인하여 높은 트랜스펙션 효율을 가지는 적은 종류의 세포주에 대해서만 이 기술의 적용을 제한하는 문제가 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 다양한 포유류 세포주에서 높은 트랜스펙션 효율을 야기하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a)포유류 세포를 혈청을 0∼0.5% 포함하는 배지에서 배양하는 단계; b) 상기 배양 후 중간에 양이온성 지질을 사용하는 리포펙션 방법으로 트랜스펙션을 수행하는 단계;c) 상기 트랜스펙션 후 일정 시간 후에 혈청이 포함된 정상 배지로 교체하는 단계;d) 상기 정상배지 교체 후 일정 시간 배양하는 단계;e) 상기 배양 후에 배지를 제거하는 단계; 및 f) 상기 배지 제거 후에 세포를 수집하여 세포 용출액을 제조하는 단계를 포함하는 동물세포 형질전환 효과 증진 방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 포유류 세포는 정상 세포인 것이 바람직하고 바람직한 정상세포로는 정상세포로는 Chang(HeLa, liver tissue, human), 293(Hek293, embryonal kidney, human), L929(connective tissue, mouse), NIH/3T3(embryo, mouse), PC-12(adrenal gland, rat), CHO(ovary,chinese hamster), Cos7(kidney, monky)이가 더욱 바람직하며 Chang 세포가 가장 바람직하다.
또 본 발명에서, 상기 포유류 세포는 암 세포인 것이 바람직하고 바람직한 대장암세포로는 DLD-1, Colo, HCT116, HT-29, HCT-15, SW480(colorectal adenocarcinoma, human); 간암세포로는 HepG2, HepG3(hepatocellular carcinoma, liver, human);유방암세포로는 MCF-7(breast, human); 전립선암세포로는 PC- 3(prostate, human) 등이 더욱 바람직하며 DLD-1 세포가 가장 바람직하다.
또한 본 발명에서, 상기 a) 단계의 세포를 혈청고갈 배지에서 12시간에서 36시간배양까지 배양하는 것이 바람직하며 12시간 배양하는 것이 가장 바람직하다. 또 배양 후 정상배지 교체 12시간 배양 후 다시 12시간 0.2% 혈청 고갈 배지인 것이 바람직하다.
상기 a)단계는 2가지로 구분할 수 있다. 첫 번째, 세포 동시화를 1회만 시행할 시에는 혈청고갈 12시간에서 36시간 범위 내 시간조절이 가능하다. 두 번째, 세포동시화를 2회 시행할 시에는 혈청고갈 12시간 시행 후 회복기를 주기 위하여 12시간 정상배지로 유지하고 다시 혈청 고갈상태로 12시간 동시화를 시행한다. 모두 합산하면 36시간이 된다. b)단계는 a)단계 중 택일하여 시행할 수 있으며, 트랜스펙션 3시간 후 시점이 a)단계의 36시간 시점이 된다.
본 발명에서, 상기 b) 단계의 중간에 a) 단계 시행과 상품회사방법(Invitrogen life technology사의 PlusTM Reagent 및/또는 LipofectamineTM Reagent)이 바람직하며, 상기 두 화합물을 혼용인 것이 가장 바람직하다.
또한 본 발명에서, 상기 c) 단계의 일정 시간은 트랜스펙션 후 3시간부터 12시간까지인 것이 가장 바람직하다.
또한 본 발명에서, 상기 d) 단계의 일정 시간은 정상 배지로 교체 후 12시간부터 48시간 배양하는 것이 가장 바람직하다.
이하 본 발명을 설명한다
본 발명의 특징은 기존의 세포형질전환 실험 방법을 이용하면서 세포주기조절을 함께 실시함으로써 세포형질전환 효과가 극대화되어 각종 세포학적 수준의 표적 유전자의 기능 및 세포 내 변화양상을 규명하는데 효과적으로 응용될 수 있는 혁신적인 신규 방법이다.
본 발명은 세포형질전환을 유도하기 위하여 표적 유전자를 준비 및 세포형질전환을 유도시킬 세포를 배양하는 단계; 상기 유전자를 세포에 도입시키는 단계; 상기 유전자가 도입된 세포를 형광 현미경과 전기영동을 통하여 확인하는 단계로 구성되었으며, 특히 효과 판정을 효과적으로 수행하기 위하여 표적 유전자와 녹색형광 단백질을 발현하는 유전자를 혼합하여 표적유전자의 발현과 함께 녹색형광 단백질발현을 동시에 볼 수 있도록 하였다.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
실시예;
1) 준비물
실험에 사용된 표적유전자는 녹색형광 단백질 발현이 함께 일어나는 혼합 유전자를 준비하였고, 세포형질전환에 사용할 세포 주는 인체 대장암 세포 DLD-1 주를 RPMI1640배지에 5% CO2, 37 ℃로 배양하였으며, 유전자 도입 시점의 세포 수는 배양 접시의 약 60%로 하였다 (도 1).
2) 발명에 사용된 세포주
인체 정상 간세포 분리주인 Chang세포를 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)배지에서, 인체 대장암세포 분리주인 DLD-1세포를 RPMI 1640배지에서 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS), streptomycin (100 mg/ml), 및 penicillin G sodium (100 mg/ml)를 첨가하여 5% CO2 농도가 유지되는 37℃ 배양기로 배양하였다.
3) 트랜스펙션에 사용된 벡터 DNA
트랜스펙션 효율을 평가하기 위하여 형질 전환시 녹색형광 단백질이 발현될 수 있도록 벡터 DNA는 BD Science사에서 구입된 pd2EGFP를 사용하여 X-protein 유전자를 클로닝 하였다. 트랜스펙션에 사용된 시약은 Invitrogen life technology사의 PlusTM Reagent와 LipofectamineTM Reagent를 사용하였다.
트랜스펙션 효율 평가를 위하여 실험군과 대조군으로 나누어 각 세포 주당 100mm 배양접시 6개를 준비하였고, 3개는 실험군으로 3개는 대조군으로 하였다. 세포형질전환을 유도하기 위하여 배양접시에 각 세포 주 5× 105개를 계수하여 24시간 동안 위에 제시된 배지로 배양하여 세포를 안정화시켰다. 안정화된 각 세포 배양접시에 pd2-X-protein-EGFP 플라스미드 4㎍을 Invitrogen life technology가 제시하는 방법대로 트랜스펙션을 실시하였다.
본 발명의 세포주기동시화에 의한 트랜스펙션 효율을 증대를 위한 구체적인 실험법은 실험군과 대조군에 5× 105개를 계수하여 24시간 동안 위에 제시된 배지로 배양하여 세포를 안정화를 유도한 다음 세포주기동시화를 위한 실험군은 9시간동안 10% FBS 혈청을 넣지 않은 배지로 교체하여 배양하였고, 대조군은 그 시간 동안 정상배지에서 배양되었다. 9시간 후 실험군과 대조군 모두 10% FBS가 없는 배지에서 트랜스펙션을 하였으며, 트랜스펙션 3시간 후 각 배지를 10% FBS가 포함된 정상 배지로 교체하고, 이어서 12시간 배양한 후 배지를 제거하고 생리식염수로 세척한 다음 스크레이퍼로 접시바닥을 긁어 세포를 모은 다음 세포용출시약 500㎕를 사용하여 세포 용출 액을 만들었다(도 4 참조).
세포용출시약 조성은 Tirs-HCl: 50 mM, pH 7.4; NP-40: 1%;Na-deoxycholate: 0.25 %; NaCl: 150 mM; EDTA: 1 mM; PMSF: 1 mM; Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 각 1 mg/ ml; Na3VO4: 1mM; NaF: 1mM. 상기 각 시약은 최종농도이다.
4) 세포 용출액 준비 및 전기영동
액체 질소에 보관된 간 조직을 분쇄 사발을 사용하여 분말 상태로 분쇄하고 용출 용액에 혼합한 후 4℃에 30분 정도 방치하여 용액 내로 단백질이 용해되도록 한다. 이어서 원심분리기를 이용하여 4℃에서 12,000 x g의 속도로 1시간 동안 시행하고, 상층 액을 얻어 전기영동을 실시한다.
5) 웨스턴 블럿
전기영동이 끝난 젤을 단백질 전이 막에 전기적으로 이동시킨 후 표적 단백질의 항체를 이용하여 신호 전달에 관여하는 표적 단백질의 증가 여부를 확인한다. 상기 발명을 수행한 결과 세포 주기 동시화는 세포의 형질전환을 위한 유전자 도입 효율이 다양한 세포 주에서 현저히 증가됨을 확인하였다 (도 3).
6) 형질전환세포 판정
형질 전환된 세포의 판정은 3회 반복 실험을 하였고, 형광 현미경하에서 녹색형광을 나타내는 세포로 하였으며, 효과는 세포 수를 계수하여 백분율로 환산하고 표준편차를 구하여 통계학적 의의를 확인하였다 (표 1., 도 2).
Figure 112006015630780-pat00001
상기 표 1에서 DLD-1 과 Chang 세포를 정상배지와 혈청이 고갈된 배지에서 12시간 배양하여 세포주기 동시화했을 때 형질전환의 효과가 어떻게 변화되었는가를 판정한 결과임. 각 조건당 3회씩 실험을 실시하였고, 그 결과 얻어진 형질 전환된 세포를 계수하여 그 백분율로 환산한 수치를 보여주는 자료이다.
상기 구성에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명은 세포 주기를 동시화시킴으로 써 세포 형질 전환 효과를 약 4배 증가시키는 매우 효율적인 실험 결과를 얻었다. 본 발명의 핵심은 세포주기조절 동시화를 통하여 많은 수의 세포를 외부 DNA를 효과적으로 받아드릴 수 있는 상태로 만들어 줌으로써, 세포의 형질전환 효과를 극대화하는 것이다.

Claims (11)

  1. a) 포유류 세포를 혈청을 0∼0.5% 포함하는 배지에서 12 내지 36시간 동안 배양하는 단계;
    b) 상기 배양 중간에 양이온성 지질을 사용하는 리포펙션 방법으로 트랜스펙션을 수행하는 단계;
    c) 상기 트랜스펙션 후 일정 시간 후에 혈청이 포함된 정상배지로 교체하는 단계;
    d) 상기 정상배지 교체 후 일정 시간 배양하는 단계;
    e) 상기 배양 후에 배지를 제거하는 단계; 및
    f) 상기 배지 제거 후에 세포를 수집하여 세포 용출액을 제조하는 단계를 포함하는 동물세포 형질전환 효과 증진 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 포유류 세포는 정상 세포인 것을 특징으로 하는 동물세포 형질전환 효과 증진 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 정상 세포는 Chang(HeLa, liver tissue, human), 293(Hek293, embryonal kidney, human), L929(connective tissue, mouse), NIH/3T3(embryo, mouse), PC-12(adrenal gland, rat), CHO(ovary,chinese hamster) 및 Cos7(kidney, monky) 세포로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 동물세포 형질전환 효과 증진 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 정상 세포는 Chang 세포인 것을 특징으로 하는 동물세포 형질전환 효과 증진 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 포유류 세포는 암 세포인 것을 특징으로 하는 동물세포 형질전환 효과 증진 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 암 세포는 대장암세포로는 DLD-1, Colo, HCT116, HT-29, HCT-15, SW480(colorectal adenocarcinoma, human); 간암세포로는 HepG2, HepG3(hepatocellular carcinoma, liver, human);유방암세포로는 MCF-7(breast, human); 및 전립선암세포로는 PC-3(prostate, human)로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 동물세포 형질전환 효과 증진 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 암 세포는 DLD-1 세포인 것을 특징으로 하는 동물세포 형질전환 효과 증진 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 PlusTM 시약; 2,3-디오레일옥시-N-[2(스페르민카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로파니미니움-트리플루오로아세테이트와 디오레일포스파티딜 에탄올아민의 혼합물; 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 동물세포 형질전환 효과 증진 방법.
  9. 삭제
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 c) 단계의 일정 시간은 트랜스펙션 후 3 시간에서 12 시간인 것을 특징으로 하는 동물세포 형질전환 효과 증진 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 d) 단계의 일정 시간은 정상 배지로 교체 후 12 시간에서 48 시간인 것을 특징으로 하는 동물세포 형질전환 효과 증진 방법.
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