KR100778614B1 - 소나무재선충에 대한 살선충 효과를 갖는3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체 조성물 - Google Patents

소나무재선충에 대한 살선충 효과를 갖는3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 소나무재선충의 방제를 위한 구조식(1)의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체를 함유하는 소나무 재선충 살선충 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 소나무재선충에 대한 강력한 살충작용을 나타내므로 소나무재선충의 예방 및 치료제로 널리 활용할 수 있다.
구조식(1)
Figure 112006096709304-pat00001
상기 식에서, R3은 -CH2-(CH2)n-CH3의 알킬기를 나타내고, R4는 -CH2-(CH=CH)m-R5이고, R5는
Figure 112006096709304-pat00002
,
Figure 112006096709304-pat00003
또는
Figure 112006096709304-pat00004
이고, Z1, Z4 및 Z5는 서로 같거나 다르며, 수소 또는 Cl, F 등의 할로겐이고, Z2는 수소 또는 OH이고, Z3 는 수소, 할로겐, 탄소수 1∼4의 알킬기, 탄소수 1∼4의 알콕시기, NO2 또는 CF3이고, n는 3∼13의 정수이고, m는 0∼1의 정수이다.
3,4-디히드로이소퀴놀리늄, 살선충 물질, 소나무재선충

Description

소나무재선충에 대한 살선충 효과를 갖는 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체 조성물{3,4-DIHYDROISOQUINOLINIUM SALT DERIVATIVE COMPOSITION HAVING NEMATICIDE EFFECT TO B. xylophilus}
도 1은 본 발명의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체의 소나무재선충에 대한 살선충 효과를 나타내는 도표이다.
도 2는 본 발명의 HWY-4213 및 HWY-5038 조성물의 소나무재선충에 대한 살선충 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 소나무재선충에 대한 종래 방제약물의 살선충 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 종래의 방제 약물들과 본 발명의 HWY-4213 및 HWY-5038 조성물의 살선충 효과를 비교한 도표이다.
도 5a 및 도 5b는 종래의 소나무재선충의 약물 스크리닝 방법인 코튼볼 분석방법으로 종래의 방제 약물과 본 발명의 HWY-4213 및 HWY-5038 조성물의 살선충 효과를 비교한 도표와 그래프이다.
도 6은 본 발명의 HWY-4213 조성물 유도체의 고속스크리닝 데이터 도표이다.
도 7은 본 발명의 HWY-4213 조성물 유도체의 소나무재선충에 대한 살선충 효 과를 나타내는 그래프이다.
도 8a, 8b, 8c 및 8d는 본 발명의 HWY-4213 조성물 유도체의 구조를 나타내는 도표이다.
본 발명은 소나무재선충에 대하여 살선충 효과를 갖는 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체 조성물에 관한 것이다.
소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)은 매개충인 솔수염하늘소에 의해 전파가 되는 식물기생선충으로서, 솔수염하늘소가 소나무를 후식할 때 소나무 수관내로 침투하여 번식을 하며 소나무 수관을 막아 소나무를 고사시키는 식물 기생 선충이다. 일본에서는 1971년, 우리나라에서는 1988년 부산 금정산에서 처음 보고가 되었다.
거의 30년간 소나무재선충병의 방제를 위하여 매개충인 솔수염하늘소를 주 타겟으로 많은 연구를 수행하였으나 생물학적 접근을 이용한 소나무재선충에 직접적인 저해제 개발은 매우 미흡한 수준으로 직접적으로 소나무재선충을 타겟으로 하는 방제법은 살아있는 소나무에 예방약을 수관주입하는 방법밖에 없다.
소나무재선충의 수간주입용 약제로는 현재 모란텔 타트레이트(Morantel tartrate), 레바미졸 하이드로클로라이드(Levamisol hydrochloride), 메설펜포 즈(Mesulfenfose), 에마멕틴 벤조에이드(emamectin benzoate), 아바멕틴 (abamectin) 등이 있다.
모란텔 타트레이트(Morantel tartrate)는 원래 가축종물의 구충제로 개발되었으며, 1985년에 예방약으로 시판이 되었다. 모란텔 타트레이트(Morantel tartrate), 레바미졸 하이드로클로라이드(Levamisol hydrochloride), 메설펜포즈 (Mesulfenfose) 모두 일본에서 개발된 약제로 효과적이나 단가가 비싸 현재 우리나라에서는 적용되기 힘든 문제점이 있다. 또한 이는 모두 예방제로서 소나무재선충병이 걸린 소나무는 치료를 할 수가 없어 무조건 잘라 훈증, 파쇄 등의 처리를 해야한다는 문제가 있다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여, 소나무재선충에 효과적이고 특이적인 수간주입용 예방 및 치료 조성물을 개발하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 소나무재선충에 대하여 살선충 효과를 갖는 다음 구조식(1)의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체를 함유하는 조성물(이하, "HWY 조성물"이라 함)을 제공한다.
구조식(1)
Figure 112006096709304-pat00005
상기 식에서, R3은 -CH2-(CH2)n-CH3의 알킬기를 나타내고, R4는 -CH2-(CH=CH)m-R5이고, R5는
Figure 112006096709304-pat00006
,
Figure 112006096709304-pat00007
또는
Figure 112006096709304-pat00008
이고, Z1, Z4 및 Z5는 서로 같거나 다르며, 수소 또는 Cl, F 등의 할로겐이고, Z2는 수소 또는 OH이고, Z3 는 수소, 할로겐, 탄소수 1∼4의 알킬기, 탄소수 1∼4의 알콕시기, NO2 또는 CF3이고, n는 3∼13의 정수이고, m는 0∼1의 정수이다.
특히, 본 발명의 상기 구조식(1)의 HWY 조성물은 다음 구조식(1a) 및 구조식(1b)의 조성물을 포함한다.
구조식(1a) (분자량: 490.00 / C29H41ClFNO2; 이하 "HWY-4213" 이라 함)
Figure 112006096709304-pat00009
구조식(1b) (분자량: 528.22 / C33H50ClNO2; 이하 "HWY-5038" 이라 함)
Figure 112006096709304-pat00010
본 발명의 조성물은 소나무재선충에 대하여 우수한 살선충 효과를 갖는다.
본 발명의 발명자 등은 항진균제에 대한 연구결과, 다음 구조식(1)의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체를 개발하여 한국특허출원 10-2005-0046749호(출원일 2005.06.01)로 출원하였다.
구조식(1)
Figure 112006096709304-pat00011
상기 식에서, R3은 -CH2-(CH2)n-CH3의 알킬기를 나타내고, R4는 -CH2-(CH=CH)m-R5이고, R5는
Figure 112006096709304-pat00012
,
Figure 112006096709304-pat00013
또는
Figure 112006096709304-pat00014
이고, Z1, Z4 및 Z5는 서로 같거나 다르며, 수소 또는 Cl, F 등의 할로겐이고, Z2는 수소 또는 OH이고, Z3 는 수 소, 할로겐, 탄소수 1∼4의 알킬기, 탄소수 1∼4의 알콕시기, NO2 또는 CF3이고, n는 3∼13의 정수이고, m는 0∼1의 정수이다.
본 발명에서는 상기 구조식(1)의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체가 소나무재선충에 대한 살선충 효과가 우수하다는 것을 발견하여 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체를 주성분으로 함유하는 소나무 재선충에 대한 살선충 효과를 갖는 조성물(HWY 조성물)을 제공한다.
상기 구조식(1)의 화합물은, 예를 들어 상기 한국특허출원 10-2005-0046749호에 개시되어 있는 바와 같이 아래와 같이 제조할 수 있다.
다음 구조식(3) 화합물을 다음 구조식(4) 화합물 또는 다음 구조식(5) 화합물과 반응시켜 다음 구조식(6) 화합물을 제조하고; 상기 구조식(6) 화합물을 아실할라이드와 반응시켜 다음 구조식(7) 화합물을 제조하고; 상기 구조식(7) 화합물을 촉매하에 반응시켜 구조식(1)의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체를 제조한다.
Figure 112006096709304-pat00015
Figure 112006096709304-pat00016
Figure 112006096709304-pat00017
구조식(3) 구조식(4) 구조식(5)
Figure 112006096709304-pat00018
Figure 112006096709304-pat00019
구조식(6) 구조식(7)
여기서, R1 및 R2는 -O-CH3이고, X는 무기산이온, 유기산이온 또는 할라이드이다.
또한, 상기 구조식(1)의 화합물은 상기 구조식(3)의 화합물을 아실할라이드와 반응시켜 다음 구조식(8) 화합물을 제조하고; 상기 구조식(8) 화합물을 촉매하에 반응시켜 다음 구조식(9) 화합물을 제조하고; 상기 구조식(9)의 화합물을 상기구조식(V) 화합물과 반응시켜 제조할 수 있다.
Figure 112006096709304-pat00020
Figure 112006096709304-pat00021
구조식(8) 구조식(9)
여기서, R1 및 R2는 -O-CH3이고, R3는 상기 구조식 1의 정의와 동일하다.
본 발명의 HWY 조성물들의 소나무재선충에 대한 살충 효과를 알아보기 위하여, 본 발명에서는 1. 고속 스크리닝 방법을 이용하여 스크리닝을 실시하였고. 2. 그 중 효과가 있는 HWY 조성물들의 50% 치사율(IC 50)을 가지고 기존에 알려져 있는 소나무재선충 약물들과 비교를 하였으며, 3. 좀 더 객관적인 비교를 위해서 소나무재선충의 스크리닝 방법으로 기존에 알려져 있는 코튼볼 분석방법을 통하여 정확한 50% 치사율(IC50) 값을 구한 뒤에 비교를 하여 HWY 조성물의 살선충 효과를 검증하였다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 보다 상세히 설명하지만, 본 발명은 이러한 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1
2-(2-플르오르페닐)메틸-3,4-디히드로-6,7-디메톡시-이소퀴놀리늄 클로라이드 합성
3,4-디메톡시펜에틸아민 14.50g의 250ml 메탄올 용액에 2-플르오르벤즈알데히드 10.43 g을 가한후 가열하여 2 내지 3시간동안 환류 반응시킨 다음 얼음 중탕에서 소디움 보로하이드라이드 3.03 g을 서서히 가하고 상온에서 1시간동안 교반한 후 감압하에 메탄올을 제거한다.
농축액을 디클로로메탄 200 ml에 현탁시키고 증류수 200 ml를 가하여 캔칭한 후 층분리하여 유기층을 취하고 물층을 200ml의 디클로로메탄으로 2회 추출하고 유기층을 건조(MgSO4)하고, 여과한 뒤 감압하에 농축시켜 N-(2'-플르오르페닐)메틸-3,4-디메톡시펜에틸아민을 정량적으로 얻었다.
이 아민 1.16g을 1,2-디클로로에탄 25 ml에 녹이고 에틸 포름에이트 0.44 g을 서서히 가하여 상온에서 약 1시간동안 반응시킨 후, 감압하에 농축시켜 아미드 중간체를 합성하고 정제하지 않은 이 중간체를 아세토니트릴 25 ml에 녹이고 포스포릴 클로라이드 0.56 ml를 가하고 가열하여 8시간동안 환류반응 시킨 다음 감압하에 농축시켜 디클로로메탄:메탄올(10:1) 혼합용매를 용출제로 하는 실리카겔 관 크로마토그래피로 분리하여 고체상의 화합물 2-(2-플르오르페닐)메틸-3,4-디히드로- 6,7-디메톡시이소퀴놀리늄 클로라이드 0.98 g을 얻었다.
제조예 2
1-메틸-2-(2-플르오르페닐)메틸-3,4-디히드로-6,7-디메톡시-이소퀴놀리늄 클로라이드 합성
N-(2-플르오르페닐)메틸-3,4-디메톡시펜에틸아민 1.01g을 1,2-디클로로에탄 25 ml에 녹이고 트리에틸아민 0.50 ml를 가한후 0℃에서 아세틸 클로라이드 0.26 ml를 서서히 적가하여 상온에서 약 1시간동안 반응시킨 후 증류수 25 ml로 세척, 층분리 후 물층을 디클로로메탄 25 ml로 2회 추출하고, 유기층을 MgSO4로 건조, 여과한 후 감압하에 농축시켜 아마이드 중간체를 합성한다.
정제하지 않은 이 중간체를 아세토니트릴 25 ml에 녹이고 포스포릴 클로라이드 0.46 ml를 가하고 8시간동안 환류반응 시킨 후 상온 냉각하여 감압하에 용매를 제거하고 디클로로메탄:메탄올(10:1)의 혼합용매를 용출제로 하는 실리카겔 관 크로마토그래피로 분리하여 고체상의 화합물 1-메틸-2-(2-플르오르페닐)메틸-3,4-디히드로-6,7-디메톡시이소퀴놀리늄 클로라이드 1.02 g을 얻었다.
제조예 3
1-n-운데실-2-(2-플르오르페닐)메틸-3,4-디히드로-6,7-디메톡시-이소퀴놀리늄 클로라이드 합성 (구조식(1a): HWY-4213)
제조예 2에서 아세틸 클로라이드 대신 라우로일 클로라이드를 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 오일상의 화합물 1-n-운데실-2-(2-플르오르페닐)메틸-3,4-디히드로-6,7-디메톡시-이소퀴놀리늄 클로라이드 1.16g을 얻었다.
제조예 4
1-운데실-2-(4-t-부틸페닐)메틸-3,4-디히드로-6,7-디메톡시 이소퀴놀리늄 클로라이드 합성 (구조식(1b): HWY-5038)
제조예 1에서 부티릴 클로라이드 대신에 라우로일 클로라이드를 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 제조된 1-운데실-3,4-디히드로-6,7-디메톡시이소퀴놀린(1 mmol)과 4-t-부틸 벤질클로라이드(1.2 mmol)을 반응시켜 1-운데실-2-(4-t-부틸페닐)메틸-3,4-디히드로-6,7-디메톡시 이소퀴놀리늄 클로라이드를 420mg을 얻었다.
제조예 5
1-n-펜틸-2-(4-트리플르오르메틸페닐)메틸-3,4-디히드로-6,7-디메톡시이소퀴놀리늄 클로라이드 합성 (HWY-4213c)
N-(4-트리플르오르메틸페닐)메틸-3,4-디메톡시펜에틸아민 1.36g을 1,2-디클로로에탄 25 ml에 녹이고 트리에틸아민 0.50 ml를 가한후 0℃에서 카프로일 클로라이드 0.65g를 서서히 가하고 상온에서 약 1시간동안 반응시킨 후 증류수 25 ml를 가하여 세척하고 층분리후 물층을 디클로로메탄 25 ml로 2회 추출하고 유기층을 MgSO4로 건조, 여과하고 감압하에 농축시켜 아마이드 중간체를 합성하였다.
정제하지 않은 이 중간체를 아세토니트릴 25 ml에 녹이고 포스포릴 클로라이드 0.56 ml를 가하고 가열하여 8시간동안 환류반응 시킨 후 상온 냉각하여 감압하에 농축시킨 후 디클로로메탄:메탄올 10:1의 혼합용매를 용출제로 하는 실리카겔 액체 크로마토그래피로 분리하여 오일상의 화합물 1-n-펜틸-2-(4-트리플르오르메틸페닐)메틸-3,4-디히드로-6,7-디메톡시이소퀴놀리늄 클로라이드 1.10 g을 얻었다.
제조예 6
1-n-운데실-2-(4-트리플르오르메틸페닐)메틸-3,4-디히드로-6,7-디메톡시이소퀴놀리늄 클로라이드 합성(HWY-4213a)
제조예 5에서 카프로일 클로라이드 대신 라우로일 클로라이드를 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 오일상의 화합물 1-n-운데실-2-(4-트리플르오르메틸페닐)메틸-3,4-디히드로-6,7-디메톡시이소퀴놀리늄 클로라이드 1.16 g을 얻었다.
제조예 7
1-n-펜타데실-2-(4-트리플르오르메틸페닐)메틸-3,4-디히드로-6,7-디메톡시이소퀴놀리늄 클로라이드 합성(HWY-4213d)
제조예 5에서 카프로일 클로라이드 대신 파미토일 클로라이드를 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 오일상의 화합물 1-n-펜타데실-2-(4-트리플르오르메틸 페닐)메틸-3,4-디히드로-6,7-디메톡시이소퀴놀리늄 클로라이드 1.07 g을 얻었다.
제조예 8
1-n-펜틸-2-(2-클로로페닐)메틸-3,4-디히드로-6,7-디메톡시이소퀴놀리늄 클로라이드 합성(HWY-4213g)
N-(2'-클로로페닐)메틸-3,4-디메톡시펜에틸아민 1.22g을 1,2-디크로로에탄 25 ml에 녹이고 트리에틸아민 0.50 ml를 가한후 0℃에서 카프로일 클로라이드 0.96 ml를 서서히 가하여 상온에서 약 1시간동안 반응시킨 후 증류수 25 ml를 가하여 세척, 층분리후 물층을 디클로로메탄 25 ml로 2회 추출하고 유기층을 MgSO4로 건조, 여과하고 감압하에 농축시켜 아마이드 중간체를 합성하였다.
정제하지 않은 이 중간체를 아세토니트릴 25 ml에 녹이고 포스포릴 클로라이드 0.56 ml를 가하고 가열하여 8시간동안 환류반응 시킨후 상온 냉각하여 감압하에 농축시킨 후 디클로로메탄:메탄올=10:1의 혼합용매를 용출제로 하는 실리카겔 액체 크로마토그래피로 분리하여 오일상의 화합물 1-n-펜틸-2-(2-클로로페닐)메틸-3,4-디히드로-6,7-디메톡시이소퀴놀리늄 클로라이드 1.10 g을 얻었다.
제조예 9
1-n-운데실-2-(2-클로로페닐)메틸-3,4-디히드로-6,7-디메톡시이소퀴놀리늄 클로라이드 합성(HWY-4213e)
제조예 8에서 카프로일 클로라이드 대신 라우로일 클로라이드를 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 오일상의 화합물 1-n-운데실-2-(2-클로로페닐)메틸-3,4-디히드로-6,7-디메톡시이소퀴놀리늄 클로라이드 1.16 g을 얻었다.
제조예 10
1-n-펜타데실-2-(2-클로로페닐)메틸-3,4-디히드로-6,7-디메톡시이소퀴놀리늄 클로라이드 합성(HWY-4213h)
제조예 8에서 카프로일 클로라이드 대신 파미토일 클로라이드를 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 오일상의 화합물1-n-펜타데실-2-(2-클로로페닐)메틸-3,4-디히드로-6,7-디메톡시이소퀴놀리늄 클로라이드 1.07 g을 얻었다.
제조예 11
1-n-펜틸-2-(4-메톡시페닐)메틸-3,4-디히드로-6,7-디메톡시이소퀴놀리늄 클로라이드 합성(HWY-4213t)
N-(4-메톡시페닐)메틸-3,4-디메톡시펜에틸아민 1.21g을 1,2-디클로로에탄 25 ml에 녹이고 트리에틸아민 0.50 ml를 가한후 0℃에서 카프로일 클로라이드 0.64 g를 서서히 가하고 상온에서 약 1시간동안 반응시킨 후 증류수 25 ml를 가하여 세척하고 층분리후 물층을 디클로로메탄 25 ml로 2회 추출하고 유기층을 MgSO4로 건조, 여과하고 감압하에 농축시켜 아마이드 중간체를 합성하였다.
정제하지 않은 이 중간체를 아세토니트릴 25 ml에 녹이고 포스포릴 클로라이드 0.56 ml를 가하고 가열하여 8시간동안 환류반응 시킨후 상온냉각하여 감압하에 농축시킨 후 디클로로메탄:메탄올 10:1의 혼합용매를 용출제로 하는 실리카겔 액체 크로마토그래피로 분리하여 오일상의 화합물 1-n-펜틸-2-(4-메톡시페닐)메틸-3,4-디히드로-6,7-디메톡시이소퀴놀리늄 클로라이드 1.10 g을 얻었다.
또한, 상기 제조예 1과 동일한 방법에 의하여 출발물질을 달리하여 각각 본 발명의 HWY-4213 유도 조성물을 얻고, 얻어진 화합물을 도 7에 나타내었다.
실시예 1
(HWY 조성물의 고속 스크리닝을 통한 소나무재선충에 대한 살선충 효과 확인)
총 10종의 HWY 조성물을 가지고 소나무재선충에 대한 살선충 효과를 알아보기 위해서 고속스크리닝을 하였다. HWY 조성물은 디메틸설폭시드(DMSO)에 녹여서 사용하였으며 스크리닝을 할 때 디메틸설폭시드(DMSO)에 대한 영향을 배제하기 위하여 전체 양의 1% 미만으로 사용하였다.
HWY 조성물들을 디메틸설폭시드(DMSO)에 녹여 100~200 mM로 저장액을 만들었고, 200, 100, 10, 1, 0.1 mM로 희석 하였다. 소나무재선충은 베르만 깔때기 분리법을 사용하여 분리하였으며 20.000 마리/㎖ 농도로 희석하였다. 희석시에 5㎕씩 5번 정도 채취를 해 정확한 마리 수를 세어서 나중에 실시되는 고속 정밀 카운팅의50% 치사율 값을 구할 때 전체마리수로 이용을 하였다. 희석한 소나무재선충과 HWY 조성물을 96 웰 플레이트나 에펜도르프-튜브에 분주를 하였다. 전체 양은 200 ㎕로 하였으며 분리한 소나무재선충을 100 ㎕씩 분주하였고 희석한 HWY 조성물은 전체 양의 1%인 2 ㎕씩 분주를 하고 나머지는 멸균된 증류수로 양을 맞췄다.
HWY 조성물의 최종 농도는 2, 1, 0.1, 0.01, 0.001 mM가 되었으며 분주가 끝난 뒤, 6시간 동안 25℃에서 배양을 하였다. 6시간 후 샘플에서 10 ㎕ (약 100 마리)씩 50 mm 민배지에 올려놓은 뒤 30분 정도 25℃ 배양기에서 배양을 하면 살아있는 소나무재선충을 움직여 처음 위치를 벗어나 있게 되고 죽어있는 소나무재선충은 그대로 처음 자리에 있게 된다. 이때 소나무재선충 죽은 수만을 세어서 이중 50% 이상 죽은 경우 HWY 조성물에 대해서는 50% 치사율(IC50)을 측정하였다.
죽은 재선충은 백금선을 이용하여 물리적인 자극을 주었을 때 반응하지 않은 경우 HWY 조성물에 의해 죽은 것으로 간주하였다.
도 1의 실험결과와 같이, 다음 HWY 조성물 4종을 소나무재선충에 처리함으로써 살선충 효과의 유무를 확인하였다. 또한 도 2, 3의 그래프에서 보는 바와 같이 HWY-4213 조성물의 경우 1시간 만에 50% 치사율(IC50)이 측정이 될 정도로 굉장히 빠른 약효를 나타냄으로써 치료제로서의 가능성도 보임을 알 수 있었다.
HWY-4213 (구조식(1a))
Figure 112006096709304-pat00022
HWY-5038 (구조식(1b))
Figure 112006096709304-pat00023
HWY-5060 (구조식 (1c))(분자량: 680.21 / C39H41ClF3NO4)
Figure 112006096709304-pat00024
HWY-5063 (구조식 (1d))(분자량: 664.65 / C38H400Cl2FNO4)
Figure 112006096709304-pat00025
실시예 2
(HWY 조성물과 대조군의 50% 치사율(IC50) 비교)
실시예 1의 스크리닝 결과로 2가지의 효과가 있는 HWY 조성물을 확인하였고 이것을 기존의 소나무재선충 방재약물인 모란텔 타트레이트(Morantel tartrate), 에마멕틴 벤조에이드(Emamectin benzoate), 아바멕틴(Abamectin)을 대조군으로 하여 실험하였다. 실험방법은 실시예 1과 같은 방법으로 실험하여 50% 치사율(IC50) 값을 구해서 비교를 하였다.
도 4의 실험결과와 같이, 일본에서 개발돼 현재 소나무재선충 방제 약물로 널리 쓰이고 있는 모란텔 타트레이트(Morantel tartrate)보다 본 발명의 HWY 조성물들이 높은 살선충 효과를 보임을 알 수 있었다.
실시예 3
(종래 알려진 소나무재선충의 약물 스크리닝 방법인 코튼볼 분석방법으로 HWY 조성물의 약효 검증)
대량 약물 테스트(high throughput assay)에서 효과가 있었던 조성물들을 대상으로 각 약물의 정확한 50% 치사율(IC50)을 구해 대조군 약물들과 비교를 해서 HWY의 약효를 확인을 한다.
소나무재선충을 20,000 마리/㎖의 농도로 분리해서 희석해 준비하고, 6개 농도(10 mM, 1 mM, 100 uM, 10 uM, 1 uM, 0.1 uM)로 약효가 있었던 약물들은 희석해 준비한다. 준비된 소나무재선충 0.5 ㎖(10,000 마리)과 약물(0.01 ㎖) 그리고 멸균된 증류수(0.49 ㎖)를 24웰 플레이트에 분주를 한 후 25℃에서 20시간 보관한다. 20시간 후 이 혼합액을 곰팡이(B. cinerea)가 자라있는 감자한천배지(Potato Dextrose Agar, PDA)의 코튼볼에 0.3 ㎖ml을 접종한다. 감자한천배지는 곰팡이를 배양하는 가장 기본적인 배지이며, 코튼볼은 감자한천배지에 곰팡이를 접종한 플레 이트의 가장 가운데 부분을 일컫는다. 약물과 소나무재선충이 접종된 배지는 25도에서 5일간 배양을 한뒤 베르만 깔대기 방법(Baermann funnel technique)으로 살아있는 소나무재선충을 분리한 후 숫자를 센다.
증식률(propagative rate)은 대조군과 분리된 소나무재선충의 숫자를 비교해서 구하며, 치사율(Inhibition rate)은 (100 - 증식률)의 공식으로 구한다. 각 농도마다 세 번씩의 실험을 하며, 실험 결과를 이용하여 치사농도(Inhibitory concentration, IC)을 구한다.
도 5의 실험결과와 같이, 본 발명의 HWY-4213의 경우 모란텔 타트레이트(Morantel tartrate)보다 50% 치사율(IC50)이 100배 이상 높음을 알 수 있었고, HWY-5038의 경우 60배 이상 높음을 확인할 수 있었다. 또한 고속 스크리닝 방법으로 구한 데이터가 기존에 알려진 코튼볼 분석방법으로 구한 데이터와 같은 양상으로 나옴을 확인할 수 있었다.
실시예 4
(HWY-4213 조성물 유도체들의 고속 스크리닝을 통한 소나무재선충에 대한 살선충 효과 확인)
실시예 1, 2 및 3의 스크리닝 결과로 2가지의 효과가 있는 HWY 조성물(HWY-4213 및 HWY-5038)을 확인하였고, 그 중에서도 효과가 좋았던 HWY-4213 조성물을 유도체 30종을 가지고 고속스크리닝을 실시해 좀 더 효과가 좋은 조성물을 찾았다. 스크리닝 방법은 실시예 1번과 같은 방법으로 실험을 하여 50% 치사율(IC50)을 구 해서 비교를 하였다.
도 6 및 7의 도표와 그래프에서 알 수 있는 바와 같이, 30종의 유도체 조성물들 가운데 11종이 50% 치사율(IC50)을 구할 수 있었고, 그 중에 HWY-4213v 조성물의 경우는 기존의 HWY-4213 조성물보다도 더 좋은 살선충 효과를 보임을 알 수 있다.
이상과 같이, 본 발명에서는 소나무재선충에 효과적인 HWY 조성물들을 찾아냄으로써 새로운 수관주입용 약제를 개발하는데 도움이 될 것이다.
또한 종래의 방제약들이 예방제로서만 효과가 있는데 반하여, 본 발명의 HWY 조성물들은 빠른 시간 안에 소나무재선충을 죽이는 것이 확인이 되었으므로 예방약제 뿐만 아니라 소나무재선충병의 치료제로도 개발이 될 수 있을 것이다.

Claims (14)

  1. 다음 구조식(1)의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체를 함유하는 소나무재선충에 대한 살선충 효과를 갖는 조성물.
    구조식(1)
    Figure 112006096709304-pat00026
    상기 식에서, R3은 -CH2-(CH2)n-CH3의 알킬기를 나타내고, R4는 -CH2-(CH=CH)m-R5이고, R5는
    Figure 112006096709304-pat00027
    ,
    Figure 112006096709304-pat00028
    또는
    Figure 112006096709304-pat00029
    이고, Z1, Z4 및 Z5는 서로 같거나 다르며, 수소 또는 Cl, F 등의 할로겐이고, Z2는 수소 또는 OH이고, Z3 는 수소, 할로겐, 탄소수 1∼4의 알킬기, 탄소수 1∼4의 알콕시기, NO2 또는 CF3이고, n는 3∼13의 정수이고, m는 0∼1의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, 구조식(1)의 유도체가 다음 구조식(1a)의 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
    구조식(1a)
    Figure 112006096709304-pat00030
  3. 제1항에 있어서, 구조식(1)의 유도체가 다음 구조식(1b)의 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
    구조식(1b)
    Figure 112006096709304-pat00031
  4. 제1항에 있어서, 상기 Z3가 CF3인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 Z1이 Cl인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 Z3 및 Z4가 F인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 Z3가 -OCH3인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 Z1 및 Z5가 F인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 Z1이 F이고 Z5가 Cl인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 Z2가 OH이고 Z3이 NO2인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 m이 1이고 R5는
    Figure 112006096709304-pat00032
    인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 R5는
    Figure 112006096709304-pat00033
    인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 R5는
    Figure 112006096709304-pat00034
    인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제12항에 있어서, Z1, Z2 및 Z5는 수소이고 Z3 는 Cl인 것을 특징으로 하는 조성물.
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