KR100772007B1 - An aloe composition for macrophage activation or anticancer - Google Patents

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Abstract

본 발명은 MAP(Modified Aloe Polysaccharides)의 마크로파지 활성화 또는 항암 효능에 관한 것으로, 최적의 마크로파지 활성화 또는 항암 효능을 갖는 분자량 범위 5 내지 400KDa의 MAP를 함유하는 알로에 조성물을 제공한다.The present invention relates to macrophage activation or anticancer efficacy of Modified Aloe Polysaccharides (MAP), and provides an aloe composition containing a MAP having a molecular weight range of 5 to 400 KDa having an optimal macrophage activation or anticancer efficacy.

알로에, MAPAloe, MAP

Description

마크로파지 활성화 또는 항암용 알로에 조성물{An aloe composition for macrophage activation or anticancer}An aloe composition for macrophage activation or anticancer

도 1은 RAW 264.7 세포 상에서의 MAP의 면역 활성을 나타낸 그림이고,1 is a diagram showing the immune activity of MAP on RAW 264.7 cells,

도 2는 MAP로 배양된 RAW 264.7 세포의 면역표현형 분석을 나타낸 그림이며,2 is a diagram showing an immunophenotype analysis of RAW 264.7 cells cultured with MAP,

도 3은 MAP로 자극된 RAW 264.7 세포의 탐식력을 나타낸 그림이고,3 is a diagram showing the phagocytosis of RAW 264.7 cells stimulated with MAP,

도 4는 MAP의 분자량 크기-마크로파지 활성화와의 관계를 나타낸 그림이며,4 is a diagram showing the relationship between molecular weight size-macrophage activation of MAP,

도 5는 MAP의 항암활성에 대한 유식세포분석을 나타낸 그림이다.5 is a diagram showing a phagocytic assay for the anticancer activity of MAP.

본 발명은 MAP(Modified Aloe Polysaccharides)의 마크로파지 활성화 또는 항암 효능에 관한 것으로, 최적의 마크로파지 활성화 또는 항암 효능을 갖는 분자량 범위 5 내지 400KDa의 MAP를 함유하는 알로에 조성물을 제공한다.The present invention relates to macrophage activation or anticancer efficacy of Modified Aloe Polysaccharides (MAP), and provides an aloe composition containing a MAP having a molecular weight range of 5 to 400 KDa having an optimal macrophage activation or anticancer efficacy.

본 명세서에서 사용된 MAP(Modified Aloe Polysaccharides)는 셀룰라제 처리된 알로에 겔로부터 분리한 가공된 알로에 다당체를 의미하며, 평균 분자량 80KDa의 저분자량을 갖는다. As used herein, Modified Aloe Polysaccharides (MAP) refer to processed aloe polysaccharides isolated from cellulase treated aloe gels and have a low molecular weight of 80 KDa average molecular weight.

알로에 액즙에 함유되어 있는 총 다당체의 양은 건조 중량을 기준으로 약 10% 이고, 이들 다당체의 분자량 크기는 매우 다양하며, 평균 분자량은 2백만 Da 이상인 것으로 알려져 있다. 이 다당체들은 인 비트로 뿐 아니라 인 비보에서도 다양한 면역조절효능을 가지고 있는 것으로 알려져 왔으나([1] Reynolds T, Dweck AC. Aloe vera gel leaf: a review update. J Ethnopharmacol 1999;68:3-37), 가장 좋은 면역증강활성을 나타내는 알로에 다당체의 분자량에 대해서는 아직 논란이 계속되고 있다. The total amount of polysaccharides contained in the aloe juice is about 10% by dry weight, and the molecular weight of these polysaccharides varies widely, and the average molecular weight is known to be 2 million Da or more. These polysaccharides have been known to have various immunomodulatory effects not only in vitro but also in vivo ([1] Reynolds T, Dweck AC.Aloe vera gel leaf: a review update. J Ethnopharmacol 1999; 68: 3-37). Controversy still exists regarding the molecular weight of the aloe polysaccharides, which exhibit the best immunostimulating activity.

알로에 베라의 액즙에서 분리한 천연 다당체 중에서 가장 많이 알려져 있는 에이스만난(Acemannan, CarrisynTM)은 β-(1,4) 결합을 통하여 연결된 아세틸화된 갈락토만난으로, 분리방법에 따라서 그 크기는 다양하며, 상처치유 효능을 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 에이스만난을 종양을 가진 동물에게 복강 투여시 종양을 완전히 치유하거나 유의성 있게 감소시킨다는 사실이 보고된 바 있다. 에이스만난이 림파구 혼합배양시험에서 동종항원에 대한 반응을 증가시키고, IL-6와 TNF-α와 같은 면역사이토카인을 생산하여 마크로파지를 활성화시키며 마크로파지에 의한 NO의 생산 및 탐식 효능을 증가시키는 것으로 볼 때, 에이스만난의 항암효능은 숙주의 방어계를 통하여 나타나는 것으로 보여진다([2] Manna S, McAnalley BH. Determination of the position of the O-acetyl group in a b-(1,4)-mannan (acemannan) from Aloe barbadensis Miller. Carbohydr Res 1993;241:317-319). ([3] Peng SY, Norman J, Curtin G, Corrier D, McDaniel HR, et al. Decreased mortality of Norman Murine Sarcoma in mice treated with the immunomodulator, acemannan. Mol Biother 1991;3:79-87. [4] Harris C, Pierce K, King G, Yates KM, Hall J, Tizard I. Efficacy of acemannan in treatment of canine and feline spontaneous neoplasms. Molec Biother 1991;3:207-213. [5] King GK, Yates KM, Greenlee PG, Pierce KR, Ford CR, et al. The effects of acemannan immunostimulant in combination with surgery and radiation therapy on spontaneous canine and feline fibrosarcomas. J AM Anim Hosp Assoc 1995;31:439-447.) Carrington Lavoratories(Irving, Tex)에서 개발된, CARN은 평균 분자량이 1,000 KDa 인 에이스만난 다당체로 이루어져 있다. Acemannan (Carrisyn TM ), the most well-known natural polysaccharide isolated from aloe vera juice, is an acetylated galactomannan linked through β- (1,4) bonds. It is known to have wound healing effects. It has been reported that acemannan is completely healed or significantly reduced when administered abdominally to animals with tumors. Acemannan is shown to increase response to homologous antigens in the lymphocyte mixed culture test, to produce macrophages by producing immunocytokines such as IL-6 and TNF-α, and to increase the production and phagocytosis of NO by macrophages. Acemannan's anti-cancer efficacy is shown to occur through the host's defense system (2) Manna S, McAnalley BH.Determination of the position of the O-acetyl group in a b- (1,4) -mannan ( acemannan) from Aloe barbadensis Miller.Carbohydr Res 1993; 241: 317-319). (3) Peng SY, Norman J, Curtin G, Corrier D, McDaniel HR, et al.Decreased mortality of Norman Murine Sarcoma in mice treated with the immunomodulator, acemannan.Mol Biother 1991; 3: 79-87. [4] Harris C, Pierce K, King G, Yates KM, Hall J, Tizard I. Efficacy of acemannan in treatment of canine and feline spontaneous neoplasms.Molec Biother 1991; 3: 207-213. [5] King GK, Yates KM, Greenlee PG, Pierce KR, Ford CR, et al. The effects of acemannan immunostimulant in combination with surgery and radiation therapy on spontaneous canine and feline fibrosarcomas.J AM Anim Hosp Assoc 1995; 31: 439-447.) Carrington Lavoratories (Irving, Tex CARN, developed in), consists of an acemannan polysaccharide with an average molecular weight of 1,000 KDa.

최근에는 알로에 베라로부터 알로에라이드라 명명된 분자량이 4,000 KDa에서 7,000 KDa사이의 고분자 다당체가 분리된 바 있는데 이 또한 면역증강효능이 있는 것으로 밝혀졌다 ([6] Pugh N, Ross SA, ElSohly MA, Pasco DS. Characterization of aloride, a new high-molecular-weight polysaccharide from Aloe vera with potent immunostimulatory activity. J Agric Food Chem 2001;49:1030-1034).Recently, polysaccharides with molecular weights ranging from 4,000 KDa to 7,000 KDa, named aloe ride, have been isolated from Aloe Vera. It has also been found to have immunopotentiating effects ([6] Pugh N, Ross SA, El Sohly MA, Pasco). DS.Characterization of aloride, a new high-molecular-weight polysaccharide from Aloe vera with potent immunostimulatory activity.J Agric Food Chem 2001; 49: 1030-1034).

알로에 액즙을 셀룰라제로 처리하게 되면 점성이 감소되어 쉽게 가공할 수 있는 형태로 변하기는 하나, 알로에 다당체의 분자량 또한 감소될 것이기 때문에 이로 인하여 생리적 활성이 감소될 것이라는 문제가 제기된 바 있다. The treatment of aloe juice with cellulase reduces the viscosity and changes to a form that can be easily processed. However, the problem has been raised because the molecular weight of the aloe polysaccharide will also be reduced, thereby reducing the physiological activity.

그러나, 에이스만난 또는 알로에라이드와는 다르게 '셀룰라제로 처리한' 알로에 액즙으로부터 분리한 '저분자량'의 다당체인, MAP가 가공 전의 평균 분자량이 2,000 KDa인 다당체보다 더욱 강력한 생리 활성효능을 나타낸다고 보고된 바 있다([7] Qui Z, Jones K, Wylie M, Orndorff S. Modified Aloe barbadensis polysaccharide with immunoregulatory activity. Planta Med 2000;66:152-156). 다만, 이 문헌에서는 특히 MAP의 자외선에 대한 보호 효능을 밝히고 있다는 점에서 본원 발명과는 차이가 있다. However, unlike acemannan or aloeride, MAP, a 'low molecular weight' polysaccharide isolated from 'cellulase treated' aloe juice, has been reported to show stronger physiological activity than polysaccharides with an average molecular weight of 2,000 KDa before processing. (7) Qui Z, Jones K, Wylie M, Orndorff S. Modified Aloe barbadensis polysaccharide with immunoregulatory activity.Planta Med 2000; 66: 152-156. However, this document differs from the present invention in that it reveals the protective effect of the MAP particularly against ultraviolet rays.

한편, 평균 분자량 70 KDa 범위 ([8] Madis VH, Omar MM, Madis V. Aloeferon isolation, manufacturing and its applications. U.S. Patent 1989;4,861,761.)와 420 KDa ~ 520 KDa 범위 ([9] Farkas A, Mayer RA. Polysaccharide from the juice of the aloe plant for treatment of wounds. U.S. Patent 1968;3,362,951.)인 알로에 다당체들도 생리활성을 가지고 있는 것으로 보고되었으나, 본원 발명의 마크로파지 활성화 또는 항암 효능과는 다르며, [9]는 특히 상처치유효능을 개시하고 있다는 점에서 본원 발명과 차이가 있다. Meanwhile, the average molecular weight range of 70 KDa ([8] Madis VH, Omar MM, Madis V. Aloeferon isolation, manufacturing and its applications.US Patent 1989; 4,861,761.) And the range of 420 KDa to 520 KDa ([9] Farkas A, Mayer A. Polysaccharides from RA juice polysaccharide from the juice of the aloe plant for treatment of wounds.US Patent 1968; 3,362,951. ] Is different from the present invention in that it discloses a wound healing effect.

상기한 바와 같이 알로에 다당체의 면역조절효능에 대한 연구가 여러 연구자에 의하여 다양하게 수행되어 왔음에도 불구하고, 알로에 다당체의 분자량과 면역조절효능의 상관성은 아직까지 분명히 규명되지 못하고 있다. Although various studies on the immunomodulatory efficacy of aloe polysaccharides have been conducted by various researchers as described above, the correlation between the molecular weight of the aloe polysaccharides and the immunomodulatory efficacy has not been elucidated yet.

따라서, 저분자량을 가지면서도 가장 높은 생리활성을 나타내는 MAP의 최적 분자량 범위를 결정하는 것은 가공의 용이성 및 효과의 우수성을 동시에 제공한다는 점에서 산업적으로 매우 중요하다.Therefore, determining the optimal molecular weight range of MAP having the highest molecular activity while having a low molecular weight is very important industrially in that it simultaneously provides ease of processing and excellence in effect.

이에 본 발명자들은 MAP의 분자량에 따른 효능에 대하여 조사하여, 최적의 마크로파지 활성화 또는 항암 효과를 나타내는 분자량 범위를 밝혔다.
The present inventors investigated the efficacy according to the molecular weight of the MAP, revealed a molecular weight range that shows the optimal macrophage activation or anti-cancer effect.

본 발명은 우수한 마크로파지 활성화 또는 항암 효과를 갖는 알로에 조성물을 제공한다. 특히 본 발명은 5 KDa 내지 400 KDa의 MAP(Modified Aloe Polysaccharides)를 함유하는 마크로파지 활성화 또는 항암용 조성물을 제공한다. 바람직하게는 상기 조성물 중 알로에는 알로에 베라이다. 상기 조성물은 약제학적 조성물 또는 건강기능식품일 수 있다. 또한, 본 발명은 5 KDa 내지 400 KDa의 MAP를 제조하는 방법을 제공한다.The present invention provides an aloe composition having excellent macrophage activation or anticancer effect. In particular, the present invention provides a composition for macrophage activation or anticancer containing MAP (Modified Aloe Polysaccharides) of 5 KDa to 400 KDa. Preferably the aloe in the composition is aloe vera. The composition may be a pharmaceutical composition or a dietary supplement. The present invention also provides a method for preparing MAP of 5 KDa to 400 KDa.

이하에서는 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명에서는 셀룰라아제로 처리된 알로에 다당체인 MAP가 가장 높은 마크로파지 활성화 또는 항암 효능을 나타내는 분자량 범위를 알아보기 위하여 분자량별로 분획하여 실험하였다. In the present invention, the aloe polysaccharide MAP treated with cellulase was tested by fractionation by molecular weight to find the molecular weight range showing the highest macrophage activation or anticancer efficacy.

알로에 젤에 셀룰라아제를 처리한 다음 안트라퀴논(anthraquinones) 및 색소를 제거하기 위해 활성탄을 사용하였다. 그 다음 투석범위가 1KDa인 투석막에 넣은 후 증류수를 이용하여 충분히 투석시키는 방법으로 정제하였다. The aloe gel was treated with cellulase and then activated carbon was used to remove anthraquinones and pigments. Then, the dialysis membrane was placed in a dialysis membrane having a dialysis range of 1 KDa, and purified by distilled water with sufficient dialysis.

셀룰라아제를 처리한 알로에 젤의 건조분말을 80% 에탄올을 사용하여 추출한 다음 원심분리하여 침전물을 얻었다. 이 다당체 침전물(G2E1)을 DEAE 세파셀 컬럼을 통하여 단백질이 제거된 다당체 시료(G2E1D)를 얻었고, 이 G2E1D를 세파크릴 S400(Sephacryl S400) 컬럼을 수행하여 분자량 400 KDa 이상과 400 KDa이하로 분획하였다. 이때 400 KDa 이상과 이하의 용출시간 결정을 위하여 시료 분리 전에 동일한 조건으로 브로드덱스트란 여러 분자량들의 표준품 혼합물들을 용출한 후 HPLC 및 RI 검출기를 사용하였다. 400 KDa 이하는 다시 5 KDa 한외여과(ultrafiltration)를 이용하여 원심분리하여 5 KDa 이상과 5 KDa 이하로 분획하였다.The dry powder of aloe gel treated with cellulase was extracted using 80% ethanol and then centrifuged to obtain a precipitate. This polysaccharide precipitate (G2E1) was obtained from a protein-free polysaccharide sample (G2E1D) through a DEAE Sephacel column, and the G2E1D was fractionated to a molecular weight of 400 KDa or more and 400 KDa or less by a Sephacryl S400 column. . At this time, to determine the elution time of more than 400 KDa and less than the separation of the standard mixture of broaddextran molecular weight under the same conditions before sample separation was used HPLC and RI detector. Below 400 KDa was again centrifuged using 5 KDa ultrafiltration to fractionate more than 5 KDa and less than 5 KDa.

얻어진 분자량별 다당체 분획물 400 KDa 이상, 5 KDa 내지 400 KD 및 5 KDa 이하에 대하여 활성시험을 수행한 결과 본 발명자들은 5 KDa 내지 400 KDa의 분자량을 갖는 MAP가 우수한 면역 조절 효능 및 항암 효과를 갖는다는 것을 최초로 밝혀냈다. As a result of the activity test on the obtained polysaccharide fraction of 400 KDa or more, 5 KDa to 400 KD and 5 KDa or less, the present inventors found that MAP having a molecular weight of 5 KDa to 400 KDa has excellent immunomodulation efficacy and anticancer effect. First revealed.

이에, 본 발명에서는 5 KDa 내지 400 KDa의 분자량을 갖는 MAP를 함유하는 마크로파지 활성화 또는 항암용 알로에 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides aloe composition for macrophage activation or anticancer containing MAP having a molecular weight of 5 KDa to 400 KDa.

본 발명의 MAP를 함유하는 마크로파지 활성화 또는 항암용 알로에 조성물은 약제학적 조성물 또는 건강기능식품일 수 있다. The macrophage activation or anti-cancer aloe composition containing the MAP of the present invention may be a pharmaceutical composition or a dietary supplement.

본 발명의 조성물은 약제학적 분야에서 공지된 방법에 의해 제제화 할 수 있으며, 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. The compositions of the present invention can be formulated by methods known in the pharmaceutical art and can be administered orally or parenterally.

그러므로, 본 발명의 조성물은 알로에 추출물 자체 또는 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등과 혼합하여 통상의 약제학적 제제, 예컨대 액제, 캡슐제, 정제 등으로 제제화할 수 있다. Therefore, the compositions of the present invention can be formulated into conventional pharmaceutical preparations such as liquids, capsules, tablets and the like by mixing with the aloe extract itself or with a pharmaceutically acceptable carrier, excipient and the like.

경구 투여를 위한 약제학적 조성물은 결합제, 충진제, 활택제, 붕해제, 또는 습윤제와 같은 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 통상적 수단에 의해 제조되는 캡슐제, 정제 등의 고체 제형 또는 임의로 현탁제, 유화제, 비수성용제 및 보존제 등을 함유하는 용액제, 시럽 또는 현탁제와 같은 액체 제형일 수 있다. Pharmaceutical compositions for oral administration include solid dosage forms, such as capsules, tablets, or the like, optionally prepared as conventional means, together with pharmaceutically acceptable excipients such as binders, fillers, glidants, disintegrants, or wetting agents. , Liquid formulations such as solutions, syrups or suspensions containing non-aqueous solvents and preservatives.                     

비경구 투여를 위한 본 발명의 조성물은 주사, 통상적으로 정맥, 근육내, 복강내 또는 피하 주사로 투여하기 위해 통상적인 방법에 의해 제제화 할 수 있다.Compositions of the invention for parenteral administration can be formulated by conventional methods for administration by injection, typically intravenous, intramuscular, intraperitoneal or subcutaneous injection.

또한 본 발명의 MAP를 식품에 첨가하여, 마크로파지 활성화 또는 항암용 건강기능식품을 제조할 수 있다.In addition, the MAP of the present invention can be added to foods to produce macrophage activation or anti-cancer health functional foods.

이 경우, 건강기능식품이라 함은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 가공한 식품을 말한다. In this case, the health functional food refers to a food manufactured and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills, etc. using raw materials or ingredients having useful functions for the human body.

본 발명 조성물에 있어서 유효성분인 MAP의 투여량은 1일 10 mg/kg 내지 1,000 mg/kg의 범위이다. 다만, 활성 성분으로서 MAP의 상기 투여량은 투여경로, 치료를 받는 환자의 중증도, 연령, 성별, 체중 등 여러 인자를 고려하여 결정되어야하며, 상기 투여량에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것으로 이해되어서는 안된다.The dosage of MAP which is an active ingredient in the composition of the present invention is in the range of 10 mg / kg to 1,000 mg / kg per day. However, the dosage of MAP as the active ingredient should be determined in consideration of various factors such as the route of administration, the severity of the patient being treated, age, sex, and weight, and the scope of the present invention is limited by the dosage. It should not be.

이하에서는 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 목적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, these examples are only presented for the purpose of illustrating the present invention and should not be construed as limiting the scope of the present invention in any way.

실시예Example

실험재료Experimental material

본 연구에 사용된 알로에 다당체의 원재료가 되는 알로에 액즙 분말 시료는 알로에 베라의 껍질 부분을 제거한 액즙을 건조하여 200:1 중량으로 농축된 것이며 Aloecorp(Harlingen, TX, USA)으로부터 공급받아 실험하였다. Aloe juice powder sample, which is a raw material of aloe polysaccharide used in this study, was concentrated to 200: 1 weight by drying the juice removed from the aloe vera shell and was supplied from Aloecorp (Harlingen, TX, USA).                     

시약 및 기기Reagents and Instruments

본 실험에 사용한 실험기기는 다음과 같다. HPLC는 HITACHI (pump ; L-7100, detector ; L-7490, interface ; D-7000, column oven ; L-7300, Autosampler ; L-7200) 것을 사용하였다. FPLC는 AKTA series(Amersham phamacia biotech)를 사용하였고, 20ℓ(Ilshin Lab co., Ltd) 용량의 동결건조기를 사용하였다. 원심분리기는 Beckman CoulterTM(AllegraTM 60R)을 사용하였고 Rotary vacuum evaporator는 EYELA (N-N series)를 사용하였다. 컬럼 크로마토그래피용 흡착제로는 세파크릴 S400 수지와 DEAE 세파셀 수지(Amersham Bioscience)를 사용하였다. 한외여과는 5K Amicon ultra(Millipore)를 사용하였고 분석시 사용된 HPLC용 컬럼은 BioSep-SEC-S400(Phenomenex)이었다. The experimental equipment used in this experiment is as follows. HPLC was used HITACHI (pump; L-7100, detector; L-7490, interface; D-7000, column oven; L-7300, Autosampler; L-7200). FPLC was used AKTA series (Amersham phamacia biotech), and a freeze dryer of 20 L (Ilshin Lab co., Ltd) capacity. The centrifuge used Beckman Coulter TM (Allegra TM 60R) and the rotary vacuum evaporator EYELA (NN series). Sephacryl S400 resin and DEAE Sephacel resin (Amersham Bioscience) were used as adsorbents for column chromatography. Ultrafiltration was performed using 5K Amicon ultra (Millipore) and the HPLC column used for analysis was BioSep-SEC-S400 (Phenomenex).

추출용 유기용매는 덕산(Seoul, Korea) 제품을 사용하였고, 분리용 유기용매는 1급 시약을 사용하였다. 표준품으로는 브로드 덱스트란(Phenomenex, ALO-2772)을 사용하였다.

The organic solvent for extraction was made by Deoksan (Seoul, Korea), and the first organic reagent was used for separation. Broad dextran (Phenomenex, ALO-2772) was used as a standard.

실험방법Experiment method

MAP의 분리Separation of MAP

알로에 젤에 셀룰라아제를 12 mg/L로 가하여 실온에서 2시간 처리한 다음 90℃에서 30분간 처리하여 반응을 종료시켰다. 함유되어 있는 안트라퀴논 (anthraquinones) 및 색소는 활성탄을 1mg/mL로 가하고 1시간 교반한 후 원심분리 하는 방법으로 흡착제거 하였다. 이렇게 얻은 MAP은 투석범위가 1KDa인 투석막에 넣은 후 증류수를 이용하여 충분히 투석시키는 방법으로 정제하였다. Cellulase was added to 12 mg / L of aloe gel and treated for 2 hours at room temperature, followed by 30 minutes at 90 ° C to terminate the reaction. Anthraquinones and pigments contained were adsorbed and removed by adding activated carbon at 1 mg / mL, stirring for 1 hour, and centrifuging. The MAP thus obtained was purified by a method of sufficiently dialysis using distilled water after putting it in a dialysis membrane having a dialysis range of 1 KDa.

셀룰라아제로 처리한 알로에 젤의 건조 분말 g당 50㎖의 비율로 80% 에탄올을 첨가한 뒤 1시간 동안 교반한 후 3000rpm, 15분, 25℃ 조건에서 원심분리를 하였다. 원심분리 후 침전물에 소량의 물을 첨가하여 -70℃에서 하루 방치한 다음 동결건조 하였다. 이 동결건조물을 G2E1이라 명명하였다. After the addition of 80% ethanol at a rate of 50 ml per g dry powder of aloe gel treated with cellulase and stirred for 1 hour, centrifugation was performed at 3000 rpm, 15 minutes, 25 ℃. After centrifugation, a small amount of water was added to the precipitate, and the mixture was left at -70 ° C for one day and then lyophilized. This lyophilisate was named G2E1.

G2E1 20g을 소량의 20mM Tris-HCl(pH 7.4) 완충액에 잘 용해시킨 다음 0.45㎛로 여과하였다. DEAE 세파셀 컬럼(6 cm X 30 cm)이 부착되어 있는 FPLC를 이용하여 4㎖/min의 유속으로 시료를 결합시켰다. 20mM Tris-HCl(pH 7.4) 완충액을 흘려주어 컬럼 수지와 결합하지 않은 단백질이 제거된 다당체 용액을 소량의 용액만 남을 때까지 감압 농축시켰다. -70℃에서 하루 방치한 다음 동결건조 하였다. 이 동결건조물을 G2E1D라 명명하였다. 20 g of G2E1 was dissolved in a small amount of 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) buffer and then filtered to 0.45 mu m. Samples were bound at a flow rate of 4 ml / min using FPLC with a DEAE Sephacel column (6 cm × 30 cm) attached. 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) buffer was flowed, and the polysaccharide solution from which protein was not bound to the column resin was removed under reduced pressure until only a small amount of solution remained. It was left at -70 ℃ for one day and then lyophilized. This lyophilisate was named G2E1D.

브로드 덱스트란 7.2KDa, 16.2KDa, 230KDa, 520KDa을 각각 10㎎씩 혼합하여 세파크릴 S400 컬럼(4 cm X 100 cm)을 수행하였다. 용출용매로는 100% 증류수를 사용하였고 시험관당 5ml씩 분취하였다. 각각의 표준혼합용액 용출 분획 및 이들 각각의 표준품을 HPLC로 분석하여 400KDa 이상과 400KDa 이하에 해당하는 용출부피를 결정하였다. 이때 HPLC 조건으로는 Biosep-SEC 컬럼 및 RI 검출기를 사용하였으며 증류수를 이동상으로 사용하였다. Broaddextran 7.2KDa, 16.2KDa, 230KDa, 520KDa was mixed with 10mg each to perform a Sephacryl S400 column (4 cm X 100 cm). 100% distilled water was used as the eluting solvent and 5 ml per test tube was aliquoted. Each standard mixed solution elution fraction and each standard were analyzed by HPLC to determine the elution volume corresponding to more than 400KDa and less than 400KDa. At this time, Biosep-SEC column and RI detector were used as HPLC conditions, and distilled water was used as a mobile phase.

G2E1D 4g을 100% 증류수에 용해한 다음 세파크릴 S400 컬럼을 이용하여 분자 량별 다당체를 분획하였다. 조건은 표준품에서와 동일하게 수행하였다. 표준품의 HPLC 데이터 및 용출 부피를 참고하여 분자량 400 KDa 이상과 400 KDa 이하로 나눈 다음 400 KDa이상은 소량의 용액만 남을 때까지 감압건조 하였다. 400 KDa 이하는 5 KDa 한외여과를 이용하여 3000rpm, 30분, 20℃ 조건에서 원심분리하여 5 KDa 이상과 이하로 분획하였다. 5 KDa 이하의 용액에 포함되어 있는 완충액을 제거하기 위해 아세톤을 첨가한 다음 1000rpm, 10분, 20℃ 조건에서 원심분리하여 침전된 다당체만을 사용하였다. 소량의 용액만 남을 때까지 감압건조 한 다음 -70℃에서 하루 방치 시킨 다음 동결건조하였다. After dissolving 4 g of G2E1D in 100% distilled water, the polysaccharide was fractionated by molecular weight using Sephacryl S400 column. The conditions were performed in the same manner as in the standard product. Referring to the HPLC data and the elution volume of the standard product divided into more than 400 KDa and less than 400 KDa, and more than 400 KDa was dried under reduced pressure until only a small amount of solution remains. Below 400 KDa was centrifuged at 3000 rpm, 30 minutes, 20 ℃ using 5 KDa ultrafiltration and fractionated to more than 5 KDa. Acetone was added to remove the buffer contained in the solution of 5 KDa or less, and then only polysaccharide precipitated by centrifugation at 1000 rpm, 10 minutes, and 20 ° C was used. After drying under reduced pressure until only a small amount of solution remained, the resultant was left at -70 ° C for one day and then lyophilized.

결과적으로 400 KDa 이상 (G2E1DS3), 400 KDa 내지 5 KDa 이상(G2E1DS2), 5KDa 이하 (G2E1DS1)의 다당체로 분획하였으며 각 분획별 수율은 다음과 같다. ; G2E1, 50.3%; G2E1D, 39.7%; G2E1DS1, 5.6%; G2E1DS2, 2.6%; G2E1DS3, 12.5%.
As a result, the polysaccharide was fractionated to 400 KDa or more (G2E1DS3), 400 KDa to 5 KDa or more (G2E1DS2), and 5 KDa or less (G2E1DS1), and yields of each fraction were as follows. ; G2E1, 50.3%; G2E1D, 39.7%; G2E1DS1, 5.6%; G2E1DS2, 2.6%; G2E1DS3, 12.5%.

세포 배양Cell culture

RAW 264.7 세포의 배양은 10%의 우혈청 (Hyclone), 50μM의 2-머캅토에탄올(SIGMA), 100 ㎍/ml의 페니실린 G (Bio-whittaker) 및 100 units/ml의 스트렙토마이신(Bio-whittaker)을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지를 사용하였으며, 37℃의 인큐베이터 (5% CO2/ 95% 대기)에서 배양하였다. Cultures of RAW 264.7 cells consisted of 10% bovine serum (Hyclone), 50 μM 2-mercaptoethanol (SIGMA), 100 μg / ml penicillin G (Bio-whittaker) and 100 units / ml streptomycin (Bio-whittaker). DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) was added and cultured in an incubator at 37 ° C. (5% CO 2 /95% atmosphere).

증식 분석Proliferation assay

RAW 264.7 세포를 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 2×104 세포/웰로 가한 다 음, 각 웰에 시료를 농도별로 첨가하여 42시간 동안 혼합 배양하였다. RAW 264.7의 증식정도는 [3H]-티미딘 (0.5 μCi/웰)을 각 웰에 가한 다음, 6시간 더 배양한 후[3H]-티미딘 인코포레이션([3H]-thymidine incoporation)법으로 측정하였다.
RAW 264.7 cells were added to the 96-well microtiter plate at 2 × 10 4 cells / well, and then samples were added to each well by concentration and incubated for 42 hours. Proliferation of RAW 264.7 is [3 H] - thymidine (0.5 μCi / well) was added to each well of 6 hours and then further incubated [3 H] - thymidine in Corporation ([3 H] -thymidine incoporation) Measured by the method.

면역표현형 분석Immunophenotyping

알로에 다당체와 함께 배양한 마크로파지 대하여 클래스 II MHC 분자, B7-1, B7-2, CD40, ICAM-1등의 공자극 분자(co-stimulatory molecules)를 중심으로 세포표면항원의 발현 정도를 유식세포측정기(flow cytometry)로 분석하였다. 실험에 사용된 단일클론항체들인 항-CD40 (클론 3/23), 항-ICAM-1 (클론 3E2), 항-I-Ab (클론 AF6-120.1), 항-B7-1 (클론 16-10A1), 항-B7-2 (클론 GL1)와 아이소타입-매치된 대조군 항체는 Pharmingen (San Diego, CA)으로부터 구입하여 실험에 사용하였다. 염색이 끝난 세포는 1% ρ-포름알데하이드로 고정한 다음, FACS 칼리버(Becton-Dickinson)를 이용하여 보통 10,000개의 살아 있는 세포를 대상으로 분석하였다.
Macrophage cultured with aloe polysaccharides were used to determine the expression level of cell surface antigens based on co-stimulatory molecules such as class II MHC molecules, B7-1, B7-2, CD40, and ICAM-1. It was analyzed by (flow cytometry). Monoclonal antibodies used in the experiments: anti-CD40 (clone 3/23), anti-ICAM-1 (clone 3E2), anti-I-Ab (clone AF6-120.1), anti-B7-1 (clone 16-10A1 ), Anti-B7-2 (clone GL1) and isotype-matched control antibodies were purchased from Pharmingen (San Diego, Calif.) And used for experiments. After staining, the cells were fixed with 1% ρ-formaldehyde, and then analyzed on 10,000 live cells using FACS caliber (Becton-Dickinson).

탐식력Grasping power

알로에 다당체에 의한 RAW 264.7세포의 탐식력은 FITC(fluorescein isothiocyante)와 알부민이 들어 있는 입자 형태의 마이크로스피어를 이용하여 측정하였다. RAW 264.7 세포를 6-웰 컬쳐 플레이트에 1×106 세포/웰/3 ml로 가한 다음 100 ㎍/ml 의 시료를 첨가하여 배양하였다. 48시간 배양한 후, 형광물질인 FITC 를 함유하고 있는 폴리-(L)-락트산으로 만든 마이크로스피어(평균 직경, 300 nm)를 첨가하여 다시 2시간 배양하였으며, PBS로 3회 세척하여 탐식되지 못한 마이크로스피어를 제거하였다. RAW 264.7세포에 의해 탐식된 마이크로스피어의 양은 유식세포측정기 (Becton-Dickinson)로 분석하였다. The phagocytosis of RAW 264.7 cells by aloe polysaccharides was measured using microspheres in the form of particles containing fluorescein isothiocyante (FITC) and albumin. RAW 264.7 cells were added to 6-well culture plates at 1 × 10 6 cells / well / 3 ml and then cultured by adding 100 μg / ml of sample. After 48 hours of incubation, microspheres (average diameter, 300 nm) made of poly- (L) -lactic acid containing the fluorescent substance FITC were added and cultured again for 2 hours, and washed three times with PBS. Microspheres were removed. The amount of microspheres phenotyped by RAW 264.7 cells was analyzed by a flow cytometer (Becton-Dickinson).

오브알부민(Ovalbumin)과 FITC가 들어 있는 마이크로스피어는 용매증발법[19]에 의하여 만들었다. OVA를 3% 폴리비닐 알콜(최종, 4 mg/ml) 중에 용해시키고, 폴리(L-락트산) (PLG, 최종, 5%) 및 FITC (최종, 5 mg/ml)을 아세톤 및 에탄올의 혼합물(9:1) 중에 용해시켰다. 150 ml의 OVA 용액 및 30 ml의 PLG 용액을 천천히 혼합시키고, 밤새 실온에서 계속적인 교반에 의해 유화시켰다. 단단해진 마이크로스피어를 300 g에서 원심분리에 의해 모으고, PBS로 2회 세척했다.
Microspheres containing Ovalbumin and FITC were prepared by solvent evaporation [19]. OVA is dissolved in 3% polyvinyl alcohol (final, 4 mg / ml), poly (L-lactic acid) (PLG, final, 5%) and FITC (final, 5 mg / ml) are a mixture of acetone and ethanol ( 9: 1). 150 ml OVA solution and 30 ml PLG solution were slowly mixed and emulsified by continuous stirring overnight at room temperature. Hardened microspheres were collected by centrifugation at 300 g and washed twice with PBS.

사이토카인 및 일산화질소 생성Cytokine and Nitric Oxide Production

시료의 자극에 의해 마크로파지 세포주인 RAW 264.7로부터 생성되는 종양괴사인자 (TNF)-α와 인터루킨 (IL)-1β, NO의 양을 세포 배양액으로부터 정량하였다. 24-웰 컬쳐 플레이트에 5×105 세포/웰/ml로 세포를 가한 다음, MAP를 농도별로 희석하여 첨가하였다. 48시간 배양한 후, 배양 상등액에 함유되어 있는 TNF-α와 IL-1β의 함량은 R&D ELISA 키트를 이용하여 ELISA 플레이트 리더 (Dynatech MR500)로 450 nm의 파장에서 O.D. 값을 측정하였다. 배양 상등액에 함유되어 있는 일산화질소의 양은 그리에스 시약 (1% 설파닐아미드/0.1% 나프틸렌디아민 디하이드로클로라 이드/2.5% H3PO4)를 이용하여 ELISA 리더 (Dynatech MR500)로 550 nm에서 측정하였으며 표준 곡선은 소듐 니트리트를 이용하였다.
The amount of tumor necrosis factor (TNF) -α, interleukin (IL) -1β, and NO produced from the macrophage cell line RAW 264.7 by stimulation of the sample was quantified from the cell culture. Cells were added at 5 × 10 5 cells / well / ml to 24-well culture plates, then MAP was added by dilution by concentration. After 48 hours of incubation, the contents of TNF-α and IL-1β contained in the culture supernatant were measured by using an R & D ELISA kit with an ELISA plate reader (Dynatech MR500) at a wavelength of 450 nm. The amount of nitrogen monoxide in the culture supernatant was 550 nm with an ELISA reader (Dynatech MR500) using Gries reagent (1% sulfanylamide / 0.1% naphthylenediamine dihydrochloride / 2.5% H 3 PO 4 ). And standard curve using sodium nitrite.

항암 활성Anticancer activity

ICR 마우스의 복강 내에 6일 동안 매일 MAP (1 mg/마우스)를 복강 주사하였다. MAP를 주사한지 4일째 되는 날 ICR 마우스의 복강 내에서 7일 간격으로 계대 배양 중인 육종 180 세포를 회수하여 MAP를 투여중인 마우스의 복강내에 이식하였다 (4×105 세포/마우스). 육종 180 세포를 이식한지 4일 후 마우스를 치사시킨 후 PBS를 5ml씩 복강에 주사한 다음 복강세척액을 회수하였다. 회수한 복강 세척액의 적혈구는 ACK 용해 완충액로 제거하였으며 FITC 결합된 항-마우스 CD45 mAb (Pharmingen)로 염색하여 FACS 칼리버 (Becton-Dickinson)로 자료를 분석하였다.
MAP (1 mg / mouse) was intraperitoneally injected daily for 6 days intraperitoneally of ICR mice. On day 4 after MAP injection, sarcoma 180 cells in passage culture were harvested in the abdominal cavity of ICR mice at 7 day intervals and transplanted intraperitoneally of mice receiving MAP (4 × 10 5 cells / mouse). Four days after the injection of the sarcoma 180 cells, mice were killed, and 5 ml of PBS was injected into the abdominal cavity, and then the abdominal washing solution was collected. Erythrocytes of recovered peritoneal lavage fluid were removed with ACK lysis buffer and stained with FITC-bound anti-mouse CD45 mAb (Pharmingen) and analyzed by FACS caliber (Becton-Dickinson).

내독소의 제거Removal of endotoxin

MAP의 RAW 264.7 세포에 대한 면역증강활성이 내독소의 오염에 의한 것이 아니라는 것을 확인하기 위하여, 모든 시료들을 폴리믹신 B로 처리하여 실험하였다. 실험에 사용된 모든 시료들을 1ml의 Affi-Prep 폴리믹신 기질 (BIO-RAD)가 충진된 바이오-스핀 컬럼 (BIO-RAD)에 충진하여 30g에서 1분간 원심분리 후 0.5ml의 시료를 첨가하였으며 4℃에서 18시간 방치한 다음 다시 30g에서 1분간 원심분리하여 시료를 회수하여 실험에 사용하였다. 친화성 컬럼의 기능을 확인하기 위하여 같은 방 법으로 LPS (10 mg/ml)를 Affi-Prep 폴리믹신 기질 컬럼에 처리하여 실험하였다. 시료의 내독소 제거후 면역증강활성은 RAW 264.7 세포 배양액의 TNF-α를 측정하여 확인하였다.
In order to confirm that the immunopotentiating activity of RAW 264.7 cells of MAP was not due to endotoxin contamination, all samples were tested with polymyxin B. All samples used in the experiment were filled in a bio-spin column (BIO-RAD) filled with 1 ml of Affi-Prep polymyxin substrate (BIO-RAD), centrifuged at 30 g for 1 minute, and 0.5 ml of sample was added. After standing at 18 ° C. for 18 hours, the sample was recovered by centrifugation at 30 g for 1 minute and used for the experiment. In order to confirm the function of the affinity column, LPS (10 mg / ml) was treated with Affi-Prep polymyxin substrate column in the same manner. Immunostimulatory activity after endotoxin removal of samples was confirmed by measuring TNF-α in RAW 264.7 cell culture.

결과result

MAP에 의한 마크로파지의 활성화Activation of Macrophage by MAP

셀룰라제로 처리한 알로에 베라 액즙을 80% 에탄올로 처리하여 얻은 침전물인 G2E1과 G2E1의 단백질을 제거하기 위하여 음이온 교환수지를 통과시켜 얻은 G2E1D의 면역활성효능을 인 비트로에서 마우스 마크로파지 세포주인 RAW 264.7 세포를 이용하여 실험하였다. To remove G2E1 and G2E1 proteins, which were obtained by treating aloe vera juice treated with cellulase with 80% ethanol, the immune activity of G2E1D obtained by passing an anion exchange resin in vitro was used to prepare RAW 264.7 cells, which are mouse macrophage cell lines. The experiment was carried out using.

도 1a에서 보는 것과 같이 G2E1D은 RAW 264.7의 증식을 농도 의존적으로 억제하였다. RAW 264.7 세포에 대한 G2E1D의 증식억제효능은 세포독성에 의한 것이 아니라 RAW 264.7 세포의 분화에 의한 것으로 보여진다. RAW 264.7 세포는 약한 부착성을 가진 세포이지만 알로에 다당체에 의해 분화가 유도되어 강한 부착성을 가진 세포로 변하였다. 그리고 분화되기 전의 RAW 264.7 세포는 세포표면에 가지 (spread)가 관찰되지 않았지만 시료에 의해 분화되어 세포표면에 가지처럼 뻗어 나온 세포질이 관찰되었다. 마크로파지 세포주인 RAW 264.7 세포는 분화하여 성숙한 마크로파지가 되면 증식이 억제되는 성질을 가지고 있다. 따라서 알로에 다당체에는 RAW 264.7 세포의 분화를 유도하여 증식을 억제시키는 효능을 가지고 있는 것으로 생각된다. As shown in FIG. 1A, G2E1D inhibited the proliferation of RAW 264.7 in a concentration dependent manner. The inhibitory effect of G2E1D on RAW 264.7 cells is not due to cytotoxicity but rather to differentiation of RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells are weakly adherent cells, but differentiation is induced by aloe polysaccharides and turned into cells with strong adhesion. In the raw 264.7 cells before the differentiation, no spread was observed on the cell surface, but the cytoplasm, which was differentiated by the sample and extended like a branch on the cell surface, was observed. RAW 264.7 cells, which are macrophage cell lines, have the property of inhibiting proliferation when they differentiate and become mature macrophages. Therefore, aloe polysaccharides are thought to have the effect of inhibiting proliferation by inducing differentiation of RAW 264.7 cells.                     

마크로파지에 대한 G1E2D의 면역증강효능은 RAW 267.4세포에 의해 TNF-α 생산 (도 1b), IL-1β 생산 (도 1c), 그리고 일산화질소 분비량 (도 1d)이 농도 의존적으로 증가되는 것으로도 확인할 수 있었다. G2E1은 마크로파지를 활성화 시키는 효능이 단백질을 제거한 G2E1D에 비하여 현저하게 떨어졌는데, 이것은 G2E1에 마크로파지의 활성화를 감소시킬 수 있는 불순물이 함유되어 있기 때문인 것으로 생각되어진다. The immunopotentiation effect of G1E2D against macrophages can be confirmed by the concentration-dependent increase in TNF-α production (FIG. 1B), IL-1β production (FIG. 1C), and nitrogen monoxide secretion (FIG. 1D) by RAW 267.4 cells. there was. G2E1 has a significantly lower efficacy of activating macrophages than G2E1D from which proteins are removed, which is thought to be due to the presence of impurities in G2E1 that can reduce the activation of macrophages.

마크로파지에 대한 G2E1D의 면역증강효능이 LPS의 오염에 의한 것이 아니라는 것을 확인하기 위하여 시료를 폴리믹신 B 처리하여 TNF-α(도 1e)의 생성촉진 효능을 실험하였다. 이때 LPS도 알로에 시료와 동일한 방법으로 폴리믹신 B로 처리한 후 대조군으로 하였다. LPS를 폴리믹신 B로 처리한 후 TNF-α 생성량은 처리 전에 비해 크게 감소하였으나 G2E1D는 폴리믹신 B 처리 후에도 처리 전과 비교하여 거의 감소하지 않았다. 따라서 알로에 다당체의 면역증강효능은 내독소의 오염에 의한 것이 아니라는 것을 확인할 수 있었다. In order to confirm that the immunopotentiation effect of G2E1D against macrophages was not caused by contamination of LPS, the samples were treated with polymyxin B to test the effect of promoting TNF-α (FIG. 1E). At this time, LPS was also treated with polymyxin B in the same manner as the aloe sample and then used as a control. After LPS was treated with polymyxin B, the amount of TNF-α was significantly decreased compared with the pretreatment, but G2E1D was hardly decreased even after the polymyxin B treatment. Therefore, it could be confirmed that the immune enhancing effect of the aloe polysaccharide was not caused by endotoxin contamination.

공자극 분자는 마크로파지의 활성화 정도를 나타내는 기준이 될 수 있기 때문에 알로에 다당체에 의한 RAW 264.7 세포 표면의 공자극 분자의 발현 정도를 유식세포측정기로 분석하였다. 도 2에서와 같이 G2E1D는 100㎍/ml 농도에서 CD40, B7-1의 발현이 유의성 있게 증가시켰으나, G2E1는 거의 증가시키지 않는 것으로 나타났다(실선: 발현 수준, 점선: 동형 대조군).Since the co-stimulatory molecule may be a criterion indicating the degree of activation of macrophages, the expression level of co-stimulatory molecules on the surface of RAW 264.7 cells by aloe polysaccharides was analyzed by flow cytometry. As shown in FIG. 2, G2E1D significantly increased the expression of CD40 and B7-1 at 100 μg / ml but showed little increase in G2E1 (solid line: expression level, dashed line: homozygous control).

마크로파지 활성화를 측정할 수 있는 가장 좋은 지표 중의 하나가 탐식력으로, 마크로파지가 활성화 되면 탐식력도 같이 증가된다. One of the best indicators of macrophage activation is phagocytic activity, which increases with phagocytosis.                     

알로에 다당체에 의한 RAW 264.7세포의 탐식력은 FITC와 OVA가 들어 있는 마이크로스피어를 이용하여 측정하였다. RAW 264.7 세포와 알로에 다당체를 48시간 혼합배양한 후, FITC를 함유하고 있는 마이크로스피어 (평균 직경, 300 nm)를 첨가하여 다시 2시간 배양하였으며, 탐식된 마이크로스피어의 양은 유식세포측정기 (Becton-Dickinson)로 분석하였다. 도 3과 같이 G2E1D는 마크로파지의 탐식력을 크게 증가시키는 것으로 확인되었다(실선 히스토그램: MAP로 자극된 RAW 264.7 세포의 탐식력, 음영 히스토그램: 비처리된 RAW 264.7 세포의 탐식력).
The phagocytosis of RAW 264.7 cells by aloe polysaccharide was measured using microspheres containing FITC and OVA. After 48 hours of incubation of RAW 264.7 cells and aloe polysaccharides, microspheres containing FITC (average diameter, 300 nm) were added and cultured again for 2 hours, and the amount of microspheres detected was measured by a flow cytometer (Becton-Dickinson). ). As shown in FIG. 3, G2E1D was found to significantly increase the phagocytosis of macrophages (solid line histogram: MAP-stimulated RAW 264.7 cells, shaded histogram: untreated RAW 264.7 cells).

분자 크기-마크로파지 활성 효능 관계 Molecular Size-Macrophage Activity Efficacy Relationship

가장 좋은 마크로파지 활성 효능을 나타내는 MAP의 분자량 범위를 조사하기 위하여 세파크릴 컬럼 크로마토그래피와 초미세여과법을 이용하여 분자량에 따라 G2E1DS3 (MW ≥400 KDa), G2E1DS2 (5 KDa ≤ MW ≤ 400 KDa), G2E1DS1 (MW ≤ 5 KDa)으로 분획한 다음 RAW 264.6 세포에 첨가하여 활성을 측정하였다. RAW 264.7 세포 배양액에 MAP을 첨가하여 증식억제(도 4a), TNF-α생성(도 4b), 일산화질소 분비 촉진 효능(도 4c)을 지표로 하여 마크로파지 활성 효능을 측정하였다. 도 4에서와 같이 G2E1DS2 분획이 가장 좋은 마크로파지 활성 효능을 가진 것으로 나타났다. G1E2DS2 분획의 효능은 G2E1D와 비교하여 유사하게 나타났으나 G2E1DS1 과 G2E1DS3 분획은 G2E1DS2 분획에 비하여 매우 낮은 활성을 나타내었다.
In order to investigate the molecular weight range of MAP that shows the best macrophage activity efficacy, G2E1DS3 (MW ≥400 KDa), G2E1DS2 (5 KDa ≤ MW ≤ 400 KDa), G2E1DS1, depending on molecular weight, were determined using Sephacryl column chromatography and ultrafiltration. Activity was measured by fractionation (MW <5 KDa) and then addition to RAW 264.6 cells. Macrophage activity efficacy was measured by adding MAP to RAW 264.7 cell culture as an indicator of growth inhibition (FIG. 4A), TNF-α production (FIG. 4B), and nitric oxide secretion promoting effect (FIG. 4C). As shown in FIG. 4, the G2E1DS2 fraction was found to have the best macrophage activity efficacy. The efficacy of the G1E2DS2 fraction was similar to that of G2E1D, but the G2E1DS1 and G2E1DS3 fractions showed very low activity compared to the G2E1DS2 fraction.

MAP의 항암 활성Anticancer Activity of MAP

MAP의 항암 효능은 육종 180 세포를 이식한 ICR 종 생쥐를 이용하여 실험하였다. 본 실험에서는 MAP을 1mg/마우스 농도로 6일 동안 계속 복강 주사하였으며, MAP을 복강 주사한지 4일째 되는 날 육종 180 세포를 생쥐의 복강에 이식하였다. 육종 180을 이식한지 4일째 되는 날 복강 내 증식 중인 세포들을 회수하여 FITC-결합된 항 마우스 CD45 mAb로 복강 내 세포들을 염색하여 유식세포측정기 (Becton-Dickinson)로 분석하였다. 도 5는 복강 내 세포들의 구성을 보여주고 있다. CD45는 적혈구를 제외한 조혈 유래 세포들(M2)에만 발현하기 때문에, 도 5에서 보여 지는 CD45 음성인 세포들(M1)은 육종 180 세포들이다. MAP을 복강 투여한 생쥐에 대한 항암효능은 대조군의 육종 180 세포에 대한 감소비율로서 표시하였다. 표 1에서 보여 지는 것과 같이 G2E1D 분획은 강한 항암효능 (88.2% 감소)을 가지고 있는 것으로 나타났으며, 이러한 G2E1D 분획의 항암효능은 G2E1DS2 분획의 항암효능 (92.4% 감소)에 기인하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 인 비트로에서 확인한 마크로파지 활성효능과 인 비보에서 확인한 항암효능이 연관성을 가지고 있다는 것을 보여주었다. The anticancer efficacy of MAP was tested using ICR species mice transplanted with sarcoma 180 cells. In this experiment, MAP was continuously intraperitoneally injected at a concentration of 1 mg / mouse for 6 days, and sarcoma 180 cells were implanted into the abdominal cavity of mice on the 4th day after the intraperitoneal injection of MAP. On day 4 of sarcoma 180 transplantation, cells intraperitoneally proliferating were harvested and stained intraperitoneally with FITC-bound anti mouse CD45 mAb and analyzed by a Becton-Dickinson. 5 shows the composition of cells in the abdominal cavity. Since CD45 expresses only hematopoietic derived cells (M2) excluding erythrocytes, the CD45 negative cells (M1) shown in FIG. 5 are sarcoma 180 cells. The anticancer efficacy of mice intraperitoneally administered with MAP was expressed as a reduction ratio for sarcoma 180 cells of the control group. As shown in Table 1, the G2E1D fraction was shown to have a strong anticancer effect (88.2% reduction), and the anticancer effect of this G2E1D fraction was due to the anticancer effect of the G2E1DS2 fraction (92.4% reduction). These results show that the macrophage activity identified in vitro and the anticancer activity identified in vivo are related.

육종 180 세포 상에서의 MAP의 항암활성Anticancer Activity of MAP on Sarcoma 180 Cells 투여량 (㎎/마우스/일)Dose (mg / mouse / day) 육종 180 세포Sarcoma 180 cells PECPEC 수 (1X105)Number (1X10 5 ) % 저해b % Inhibition b 수 (1X105)Number (1X10 5 ) % 증가c % Increase c 대조군Control -- 3.903.90 -- 1.101.10 -- G2E1a G2E1 a 1One 3.593.59 7.947.94 1.411.41 128128 G2E1DG2E1D 1One 0.510.51 86.9286.92 4.494.49 408408 G2E1DS1G2E1DS1 1One 3.323.32 14.8714.87 1.681.68 152152 G2E1DS2G2E1DS2 1One 0.330.33 91.5391.53 4.674.67 424424 G2E1DS3G2E1DS3 1One 3.283.28 15.8915.89 1.721.72 156156

a. 항암 활성은 도 5에서 기술된 바와 같이 시험되었다.a. Anticancer activity was tested as described in FIG. 5.

b. % 저해는 다음과 같이 계산되었다: {CN-TN/CN}×100, 여기서 C N 및 TN은 대조군과 처리군 각각의 육종 180 세포의 수를 나타낸다.b. The% inhibition was calculated as follows: {C N -T N / C N } × 100, where C N and T N represent the number of sarcoma 180 cells in each of the control and treatment groups.

c. % 증가는 다음과 같이 계산되었다: {TN-CN/CN}×100, 여기서 C N 및 TN은 대조군과 처리군 각각의 PEC의 수를 나타낸다.c. The% increase was calculated as follows: {T N -C N / C N } × 100, where C N and T N represent the number of PECs in each of the control and treatment groups.

본 발명을 통해 MAP의 마크로파지 활성화 효능 및 항암 효능을 확인하였으며, 가장 좋은 효능을 갖는 최적의 분자량 범위가 5 KDa 내지 400 KDa 범위라는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 쉽게 가공할 수 있으면서도 높은 생리활성을 나타내어 우수한 마크로파지 활성화 효능 및 항암 효능을 갖는 알로에 조성물을 제공한다.The present invention confirmed the macrophage activation efficacy and anticancer efficacy of MAP, it was confirmed that the optimum molecular weight range having the best efficacy is in the range of 5 KDa to 400 KDa. Accordingly, the present invention provides an aloe composition that can be easily processed while exhibiting high physiological activity and having excellent macrophage activation efficacy and anticancer efficacy.

Claims (5)

5 내지 400KDa 분자량을 갖는 가공된 알로에 다당체(MAP, Modified Aloe Polysaccharides)를 함유하는 항암용 조성물.A composition for anticancer containing processed aloe polysaccharides (MAP, Modified Aloe Polysaccharides) having a molecular weight of 5 to 400KDa. 제 1항에 있어서, 상기 알로에 다당체가 알로에 베라로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 조성물.The composition of claim 1, wherein said aloe polysaccharide is obtained from aloe vera. 5 내지 400KDa 분자량을 갖는 가공된 알로에 다당체(MAP)를 함유하는 건강기능식품 조성물.A dietary supplement comprising a processed aloe polysaccharide (MAP) having a molecular weight of 5 to 400 KDa. 셀룰라아제를 처리한 알로에 젤의 건조분말을 에탄올을 사용하여 추출한 다음 원심분리하여 알로에 다당체 침전물을 얻고, 이를 크로마토그래피에 의해 5 KDa 내지 400 KDa의 분자량을 갖는 가공된 알로에 다당체(MAP)로 분획하는 것을 특징으로 하는 가공된 알로에 다당체(MAP)를 제조하는 방법. The dry powder of aloe gel treated with cellulase was extracted using ethanol and then centrifuged to obtain aloe polysaccharide precipitate, which was then chromatographed into processed aloe polysaccharide (MAP) having a molecular weight of 5 KDa to 400 KDa. A process for producing a processed aloe polysaccharide (MAP) characterized by the above. 5 내지 400KDa 분자량을 갖는 가공된 알로에 다당체(MAP)를 함유하는 면역증강용 조성물.Immunity-enhancing composition containing processed aloe polysaccharide (MAP) having a molecular weight of 5 to 400KDa.
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