KR100758006B1 - Polypeptide having inhibitory activity for angiogenesis and inflammation and a pharmaceutical composition comprising the polypeptide - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신생혈관 형성 (angiogenesis) 및 염증에 대한 억제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a polypeptide having inhibitory activity against angiogenesis and inflammation and a pharmaceutical composition comprising the polypeptide.
본 발명에 따르면, 신생혈관 형성을 억제하며, 염증 부위로 백혈구 세포가 이동하는 것을 억제함으로써 염증 반응을 경감시킬 수 있고, 인체 투여 및 화학적 합성이 용이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물을 제공할 수 있다.According to the present invention, it is possible to reduce the inflammatory response by inhibiting neovascularization and inhibiting the migration of leukocytes to the site of inflammation, and comprising a polypeptide having an amino acid sequence which is easy for human administration and chemical synthesis, and comprising the polypeptide. Pharmaceutical compositions can be provided.
신생혈관, 염증, 억제 활성, 아미노산 Neovascularization, inflammation, inhibitory activity, amino acids
Description
도 1 은 본 발명에 따른 약학 조성물을 처리하지 않은 경우 (도 1(a) 및 도 1(b))와 처리한 경우 (도 1(c) 및 도 1(d))의 신생혈관 형성 상태를 도립현미경으로 관찰한 결과를 도시한 사진이다.Figure 1 shows the neovascularization state when not treated with the pharmaceutical composition according to the present invention (Fig. 1 (a) and 1 (b)) and when (Fig. 1 (c) and 1 (d)) It is a photograph showing the results observed with an inverted microscope.
도 2는 본 발명에 따른 약학 조성물을 처리하지 않은 경우와, 본 발명에 따른 약학 조성물을 처리한 경우의 혈관 외로 유출된 단핵구 세포의 갯수를 도시한 그래프이다.Figure 2 is a graph showing the number of monocytes leaked out of the blood vessels when not treated with the pharmaceutical composition according to the present invention, and when treated with the pharmaceutical composition according to the present invention.
도 3은 본 발명에 따른 약학 조성물을 처리하지 않은 경우와, 본 발명에 따른 약학 조성물을 처리한 경우의 류마티스성 관절염 지수 (arthritis index)의 변화를 도시한 그래프이다.3 is a graph showing the change in the rheumatoid arthritis index (arthritis index) when not treated with the pharmaceutical composition according to the present invention, and when treated with the pharmaceutical composition according to the present invention.
도 4는 본 발명에 따른 약학 조성물을 처리하지 않은 경우와, 본 발명에 따른 약학 조성물을 처리한 경우의 말초림프절과 관절강 내로 유출된 백혈구세포의 갯수를 실험군 별로 비교한 그래프이다.4 is a graph comparing the number of peripheral lymph nodes and leukocytes leaked into the joint cavity when the pharmaceutical composition according to the present invention is not treated and when the pharmaceutical composition is treated according to the present invention.
도 5는 본 발명에 따른 약학 조성물을 처리하지 않은 경우와, 본 발명에 따른 약학 조성물을 처리한 경우의 관절강 내로 유출된 B세포 (CD19+세포)의 갯수를 도시한 그래프이다.5 is a graph showing the number of B cells (CD19 + cells) leaked into the joint cavity when not treated with the pharmaceutical composition according to the present invention and when treated with the pharmaceutical composition according to the present invention.
도 6은 본 발명에 따른 약학 조성물을 처리하지 않은 경우와, 본 발명에 따른 약학 조성물을 처리한 경우의 말초림프절 내로 유출된 T세포 (CD4+ 또는 CD8+ 세포)와 활성화된 T세포 (CD3+, CD69+세포)의 갯수를 도시한 그래프이다.FIG. 6 shows T cells (CD4 + or CD8 + cells) and activated T cells (CD3 + ) leaked into peripheral lymph nodes when not treated with the pharmaceutical composition according to the present invention and when treated with the pharmaceutical composition according to the present invention. , CD69 + cells).
본 발명은 신생혈관 형성 (angiogenesis) 및 염증에 대한 억제 활성을 갖는 아미노산 서열 및 상기 아미노산 서열을 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는, 신생혈관 형성을 억제하며, 염증 부위로 백혈구 세포가 이동하는 것을 억제함으로써 염증 반응을 경감시킬 수 있고, 인체 투여 및 화학적 합성이 용이한 아미노산 서열 및 상기 아미노산 서열을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to an amino acid sequence having inhibitory activity against angiogenesis and inflammation and a pharmaceutical composition comprising the amino acid sequence, and more particularly, to inhibit neovascular formation, The present invention relates to an amino acid sequence which can alleviate an inflammatory response by inhibiting migration, and which is easy to human administration and chemical synthesis, and a pharmaceutical composition comprising the amino acid sequence.
신생혈관 형성 (angiogenesis)라는 용어는 1998년 5월 초, 미국 하버드 의과대학의 Judah Folkman 박사팀이 개발한 신생혈관 형성 억제제 안지오스태틴 (angiostatin) 및 엔도스태틴 (endostatin)이 쥐에 투입되는 경우 항암 활성을 갖 는다는 보고가 있은 후, 널리 알려지게 되었으며, 현재는 암 치료를 위한 효과적인 수단의 하나로서 신생혈관 형성을 억제하는 방법이 집중적으로 연구되고 있는 실정이다.The term "angiogenesis" refers to angiogenesis inhibitors developed by Dr. Judah Folkman of Harvard Medical School in early May 1998 when angiostatin and endostatin are introduced into rats. After reports of anti-cancer activity, it became widely known, and now, as one of the effective means for the treatment of cancer, the method of inhibiting neovascular formation has been intensively studied.
일반적으로 신생혈관 형성은 신생혈관 형성 유도인자 (angiogenic factor)가 관여하는 일련의 과정에 의해서 발생되며, 배 성장, 생식 (reproduction), 발달 (development) 및 상처 회복 (wound repair)과 같은 정상적인 과정에서는 그 조절이 원활하게 수행되며 발생되지만, 그 조절 메카니즘에 이상이 발생되는 경우에는 당뇨병성 망막증, 신생혈관성 녹내장 (neovascular glaucoma), 류마티스성 관절염, 카포시 육종 (kaposi’s sarcoma), 건선 (psoriasis) 및 혈관종 (hemangiomas) 등의 심각한 질병들을 야기하게 된다. In general, neovascularization is caused by a series of processes involving angiogenic factors, and in normal processes such as embryonic growth, reproduction, development, and wound repair. Its regulation is carried out and occurs smoothly, but if abnormalities occur in its regulatory mechanism, diabetic retinopathy, neovascular glaucoma, rheumatoid arthritis, kaposi's sarcoma, psoriasis and angioma ( serious diseases such as hemangiomas).
한편, 인체 내에서 백혈구들은 효과적으로 항원을 인식하고 제거하기 위해서 인체 내를 순환하게 되며, 항원 침입이나 조직 손상과 같은 응급 상황이 발생되면 그러한 장소로 이동하여 항원을 제거하게 되는데, 이때 백혈구들은 조직 사이를 직접 이동할 수도 있고, 혈관벽을 통과하여 목표장소까지 이동할 수도 있고, 이러한 일련의 과정을 염증 반응이라고 부른다. 염증 반응이 발생하면 항원이 효과적으로 제거되겠지만, 그 반응이 과도하게 나타나거나 지속적으로 나타나게 되면 주변 조직이 손상을 받게 되어 질병의 원인이 되기도 한다.On the other hand, white blood cells in the human body circulate in the human body to effectively recognize and remove antigens, and when an emergency situation such as antigen invasion or tissue damage occurs, it moves to such a place to remove antigens. You can move directly through the walls of blood vessels to the target site, this series of processes are called inflammatory reactions. Inflammatory reactions can effectively remove antigens, but excessive or persistent reactions can damage surrounding tissues and cause disease.
현재, 상기 서술한 바와 같은 신생혈관 생성의 억제를 위한 다양한 억제제가 개발되어 있으며, 여기에는 TGF-β 및 TNF-α 등과 같은 폴리펩티드류; DS 4152 등과 같은 다당류; 푸마길린 (fumagillin) 및 미노사이클린 (minocycline) 등과 같은 항생제류; 앤지오스테틱 스테로이드 및 2-메톡시에스트라디올 등과 같은 스테로이드류; 수마린 (sumarine) 및 프로타민 (protamine) 등과 같은 폴리 양이온 또는 폴리 음이온류; 및 TP53 또는 RB와 같은 암억제 유전자류 등이 포함되며, 더불어, 다양한 신생혈관 형성 억제제들이 현재 임상 단계 중에 있다.Currently, various inhibitors for the inhibition of neovascularization as described above have been developed, including polypeptides such as TGF-β and TNF-α; Polysaccharides such as DS 4152 and the like; Antibiotics such as fumagillin and minocycline; Steroids such as angiosteroids and 2-methoxyestradiol; Poly cations or poly anions such as sumarine and protamine; And cancer suppressor genes such as TP53 or RB. In addition, various neovascularization inhibitors are currently in clinical stage.
그러나, 현재 사용 또는 개발 중인 대부분의 신생혈관 형성 억제제 및 염증 억제제들은 대부분 특이성, 면역반응 유발 가능성, 침투성, 및 생산성 등에 있어서 중대한 문제점들을 안고 있다.However, most of the neovascularization inhibitors and inflammatory inhibitors currently in use or in development have major problems in specificity, likelihood of inducing immune response, permeability, and productivity.
따라서, 본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하여, 신생혈관 형성 억제 및 염증 반응 억제 효과가 탁월하면서도, 크기가 작고, 생산이 용이한 아미노산 서열 및 상기 아미노산 서열을 포함하는 약학 조성물을 제공하고자 하는 데에 그 목적이 있다.Accordingly, the present invention is to solve the problems of the prior art, to provide a pharmaceutical composition comprising the amino acid sequence and the amino acid sequence is small, easy to produce, while excellent in the inhibition of neovascularization and inflammatory response Its purpose is to.
본 발명은 상기 기술적 과제를 달성하기 위한 일 구현예에서,The present invention in one embodiment for achieving the above technical problem,
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로서, 신생혈관 형성 (angiogenesis) 및 염증에 대한 억제 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 provides a polypeptide having inhibitory activity against angiogenesis and inflammation.
본 발명은 상기 기술적 과제를 달성하기 위한 다른 구현예에서,The present invention in another embodiment for achieving the above technical problem,
상기 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하여 신생혈관 형성 및 염증에 대한 억제 활성을 갖는 약학 조성물을 제공한다.It provides a pharmaceutical composition having inhibitory activity against neovascularization and inflammation, including the polypeptide having the amino acid sequence.
이하, 본 발명에 대해서 더욱 상세하게 설명하기로 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명자들은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 (이하, 본 명세서에서 이를 'Inad1'으로 명명)가 혈관 내피 세포나 백혈구 세포의 표면에 높은 친화성으로 결합하여 이들의 이동을 억제하는 기능을 갖는다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. 특히, Inad1은 신생혈관 생성 또는 백혈구 세포의 작용에 대한 탁월한 억제 효과를 보임으로써 새로운 염증 억제제로서 유용하게 사용될 수 있다.The present inventors have a function of binding a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (hereinafter referred to herein as 'Inad1') with high affinity to the surface of vascular endothelial cells or leukocyte cells to inhibit their migration. The discovery of the fact that the present invention has been completed. Inad1, in particular, can be usefully used as a novel inflammation inhibitor by showing an excellent inhibitory effect on neovascularization or the action of white blood cells.
본 발명은 다른 구현예에서, 상기 Inad1을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.In another embodiment, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising Inad1.
본 발명의 약학 조성물에는 약제학적으로 허용가능한 첨가제가 포함될 수 있다. 상기 첨가제는 통상적인 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 현탁화제 등 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택적으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물을 정제 또는 경질캅셀제 등의 고형제형으로 제조할 경우, 부형제로서 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈 등이 사용될 수 있고, 붕해제로서 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘 등이 사용될 수 있다. 결합제로는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈 등이 사용될 수 있고, 활택제로서는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크 등으로부터 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 현탁화제로는 약제학 분야에서 통상적으로 사용되는 계면활성제 (예를 들어, 소르비탄 에스테르류, 또는 폴리소르베이트류 등)를 사용할 수 있다.Pharmaceutical compositions of the invention may include pharmaceutically acceptable additives. The additives may optionally be used one or two or more of conventional excipients, disintegrants, binders, lubricants, suspending agents and the like. For example, when the composition of the present invention is prepared in a solid form such as tablets or hard capsules, microcrystalline cellulose, lactose, low-substituted hydroxycellulose and the like can be used as excipients, sodium starch glycolate, anhydrous as a disintegrant. Calcium monohydrogen phosphate may be used. As the binder, polyvinylpyrrolidone, low-substituted hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl cellulose and the like can be used. The lubricant can be selected from magnesium stearate, silicon dioxide, talc and the like. In addition, as the suspending agent, surfactants (eg, sorbitan esters, polysorbates, etc.) commonly used in the pharmaceutical field may be used.
본 발명의 조성물은 액상 형태를 포함한 다양한 형태의 제형으로 제제화할 수 있으며, 이들 제형은 액제 (solution), 현탁제, 유제 등으로 제조할 수도 있다. 바람직하게는 본 발명의 조성물은 주사제로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 예를 들어 1일 0.01 내지 10 mg/kg의 범위로 투여될 수 있다.The compositions of the present invention can be formulated into a variety of formulations, including liquid forms, which can also be prepared in solutions, suspensions, emulsions and the like. Preferably the composition of the present invention may be administered by injection. The composition of the present invention can be administered, for example, in the range of 0.01 to 10 mg / kg per day.
그러나, 상기 투여량은 나이, 연령 및 성별과 같은 상태 및 질병의 경중 등에 따라 적당한 양으로 조정하여 투여될 수 있으며, 이러한 투여량은 임상적으로 환자의 치료 또는 예방에 종사하는 당업자라면 용이하게 조정할 수 있다.However, the dosage may be adjusted to an appropriate amount depending on the condition such as age, age and gender and the severity of the disease, such dosage can be easily adjusted by those skilled in the art clinically engaged in the treatment or prevention of patients. Can be.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the following examples are intended to illustrate the present invention by way of example, the scope of the present invention is not limited only to the following examples.
실시예 1. Inad1 합성Example 1 Inad1 Synthesis
Inad1은 자동화합성기(PeptrEx-R48, 펩트론사, 대전, 대한민국)을 이용하여 FMOC solid-phase method로 합성하였다. 합성된 Inad1은 C18 analytical RP column (Shiseido capcell pak)을 사용한 reverse-phase HPLC (Prominence LC-20AB, Shimadzu사, 일본)로 정제, 분석하였으며, 질량분석기 (HP 1100 Series LC/MSD, Hewlett-Packard사, Roseville, 미국)를 이용하여 동정, 확인하였다.Inad1 was synthesized by the FMOC solid-phase method using an automated synthesizer (PeptrEx-R48, Peptron, Daejeon, Korea). The synthesized Inad1 was purified and analyzed by reverse-phase HPLC (Prominence LC-20AB, Shimadzu, Japan) using a C18 analytical RP column (Shiseido capcell pak), and mass spectrometer (HP 1100 Series LC / MSD, Hewlett-Packard) , Roseville, USA).
실시예 2. Inad1을 포함하는 약학 조성물의 제조Example 2 Preparation of a Pharmaceutical Composition Comprising Inad1
Inad1을 디메틸술폭시드 (Dimethylsulfoxide; DMSO)에 3㎎/㎖ 농도로 녹인 후, 부피 100㎕에 2 ㎍ 또는 20 ㎍의 최종 아미노산 서열 농도가 되도록 생리식염수를 첨가하여 보정하였다.Inad1 was dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO) at a concentration of 3 mg / ml, and calibrated by adding physiological saline to a final amino acid sequence concentration of 2 μg or 20 μg in a volume of 100 μl.
실시예 3. 신생혈관 형성 억제능 실험Example 3. Angiogenesis Inhibitory Activity
본 발명에 따른 약학 조성물의 신생혈관 형성 억제능을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.In order to determine the neovascularization inhibitory ability of the pharmaceutical composition according to the present invention was carried out the following experiment.
일반적으로, 혈관의 바닥막 성분과 혈관내피 세포의 상호작용은 신생혈관의 형성과 유지에 중요한 요소이며, 이러한 바닥막 성분의 복합체인 매트리겔 (Matrigel)을 24-웰 플레이트에 넣으면 중합반응을 일으켜 플러그 (plug)를 형성하게 된다. 따라서, 본 실시예에서는 사람의 혈관내피세포 (HUVEC; Human Umbilical Vein Endothelial Cell)를 8 x 104 cells/well의 밀도로 매트리겔이 도포된 24 well 세포배양판에 접종한 후, 기초 피브로블라스트 성장 인자 (basic Fibroblast Growth Factor; bFGF, 150 ng/㎖)와 실시예 2로부터 제조된 약학 조성물 (3 ㎍/㎖)을 각각 (도 1(b)와 도 1(c)) 또는 혼합하여 (도 1(d)) 첨가하고, 24시간 배양하였다. 그 후 도립현미경하에서 x50 배율로 확대하여 신생혈관 형성여부를 관찰한 후 사진을 촬영하였다. In general, the interaction of the vascular endothelial components with the vascular endothelial cells is an important factor in the formation and maintenance of neovascularization. When the matrigel, a complex of these membrane components, is placed in a 24-well plate, a polymerization reaction occurs and a plug ( to form a plug. Therefore, in the present embodiment, human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) were inoculated into a 24 well cell culture plate coated with Matrigel at a density of 8 x 10 4 cells / well, followed by basal fibroblasts. Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF, 150 ng / ml) and the pharmaceutical composition (3 μg / ml) prepared from Example 2, respectively (FIG. 1 (b) and 1 (c)) or mixed (FIG. 1 (d)) was added and incubated for 24 hours. Thereafter, the image was taken after observing whether neovascularization was formed by expanding at x50 magnification under an inverted microscope.
도 1 은 실시예 3과 같은 처리 후의 각 샘플들의 신생혈관 형성 상태를 도립현미경으로 관찰한 결과를 도시한 사진이다. 도 1(a) 내지 도 1(d)를 참조하면, 본 발명에 따른 약학 조성물로 처리한 샘플들 (도 1(c) 및 도 1(d))의 경우, 신생혈관의 형성이 현저하게 억제되어 있는 것을 알 수 있다.1 is a photograph showing the results of observing the neovascularization state of each sample after the same treatment as in Example 3 with an inverted microscope. 1 (a) to 1 (d), in the case of samples treated with the pharmaceutical composition according to the present invention (Figs. 1 (c) and 1 (d)), the formation of neovascularization is significantly inhibited. It can be seen that.
실시예 4. 단핵세포 (monocyte)의 혈관외 유출 억제능 실험Example 4 Experimental Inhibition of Extravasation of Monocytes
사람혈관내피세포를 보이덴 챔버 (Boyden chamber)의 위칸에서 전체적으로 고르게 자라도록 배양하였다. 세포가 고르게 자라고 나면 배양상층액을 제거하고 본 발명에 따른 약학 조성물로 1시간 전처리하거나 전처리하지 않은 사람단핵구세포 (U937; Human monocyte)를 각 처리구에 5 x 105 개씩 넣어주었다. 이때 아래칸에는 화학유인물질이 포함된 배양액을 넣어서 단핵구 세포의 침윤을 유도하였다. 2, 3일간 배양하면서 아래칸으로 침윤하여 이동한 세포수를 측정하였다. 상기 실험을 3-5회 반복 실험하여 얻은 수치들을 통계 처리하였다.Human vascular endothelial cells were cultured to grow evenly throughout the Wikan of the Boyden chamber. After the cells were grown evenly, the culture supernatant was removed and 5 × 10 5 human monocytes (U937; Human monocytes), which were not pretreated or pretreated with the pharmaceutical composition according to the present invention, were placed in each treatment. At this time, a culture solution containing a chemical attractant was placed in the lower compartment to induce monocyte infiltration. The number of cells infiltrated into the lower cell while culturing for 2 or 3 days was measured. The values obtained by repeating the experiment 3-5 times were statistically processed.
도 2에는 대조군으로서 본 발명에 따른 약학 조성물을 처리하지 않은 경우와, 본 발명에 따른 약학 조성물을 처리한 경우의 혈관 외로 유출된 단핵세포의 갯수를 도시한 그래프를 나타내었으며, 도 2를 참조하면, 본 발명에 따른 약학 조성물을 처리하는 경우에 혈관 외로 유출된 단핵세포의 갯수가 대조군에 비해서 3 분의 2 수준으로 감소되는 사실을 알 수 있다.Figure 2 shows a graph showing the number of mononuclear cells leaked out of the blood vessels when not treated with the pharmaceutical composition according to the present invention as a control, and when treated with the pharmaceutical composition according to the present invention, referring to Figure 2 In the case of treating the pharmaceutical composition according to the present invention, it can be seen that the number of mononuclear cells leaked out of the blood vessel is reduced to two thirds of the level compared to the control group.
실시예 5. 콜라겐 주입에 의해 유도된 관절염 억제능 실험Example 5 Arthritis Inhibitory Activity Induced by Collagen Injection
본 발명에 따른 약학 조성물의 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis; RA)에 대한 치료효과를 조사하기 위하여, 생후 8 -12주 생쥐에 골라겐 II형을 주입하여 RA를 유도하였다. 실시예 2로부터 제조된 약학 조성물을 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis; RA)이 유도된 생쥐 1마리 당 2 ㎍/100㎕ 또는 20 ㎍/100㎕를 이틀 간격으로 4주간 주입하였다. 대조군으로 생리식염수 100㎕를 주입한 생쥐를 사용하였다. 3 실험군에서의 관절염 유발 및 질환의 정도를 육안으로 판정하여 관절염지수 (arthritis index)를 측정, 비교하였다. In order to investigate the therapeutic effect of rheumatoid arthritis (RA) of the pharmaceutical composition according to the present invention, RA was induced by injecting collagen type II into 8-12 weeks old mice. The pharmaceutical composition prepared from Example 2 was infused for 2 weeks with 2 μg / 100 μl or 20 μg / 100 μl per mouse induced rheumatoid arthritis (RA) for 2 weeks. Mice injected with 100 μl of saline were used as a control. Arthritis index was measured and compared with the naked eye to determine the degree of arthritis and disease in the experimental group.
도 3에는 대조군으로서 본 발명에 따른 약학 조성물을 처리하지 않은 경우와, 본 발명에 따른 약학 조성물을 처리한 경우의 류마티스성 관절염 지수를 도시한 그래프를 나타내었으며, 도 3을 참조하면, 본 발명에 따른 약학 조성물 20 ㎍을 이틀 간격으로 주입한 경우에 류마티스성 관절염 지수가 처리 후 2주부터 감소하기 시작하여 4주 경에는 대조군에 비해서 약 3 분의 1수준으로 감소되는 사실을 알 수 있다.FIG. 3 shows a graph showing the rheumatoid arthritis index when the pharmaceutical composition according to the present invention is not treated as a control and when the pharmaceutical composition according to the present invention is treated. Referring to FIG. When 20 μg of the pharmaceutical composition was injected at two-day intervals, the rheumatoid arthritis index began to decrease from 2 weeks after treatment, and decreased to about one third of the control group at 4 weeks.
실시예 6. 말초림프절과 관절강내에서의 백혈구세포의 혈관외 유출 억제능 실험Example 6 Inhibition of Extravascular Leakage of Leukocytes in Peripheral Lymph Nodes and Joint Joints
실시예 5에서 기술한대로 처리하여 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis; RA)을 유도한 생쥐에 실시예 2의 약학 조성물 20 ㎍/100㎕을 이틀 간격으로 4주간 주입하였다. 대조군으로 정상 생쥐, RA에 걸린 생쥐 중 생리식염수 또는 항염증치료제로 사용되고 있는 메소트렉세이트 (Methotrexate; MTX)를 주입한 생쥐를 사용하였다. 4 실험군에서의 말초림프절과 관절강 내에서의 백혈구세포의 수를 측정하여 혈관외 유출의 정도를 비교하였다. Mice induced with rheumatoid arthritis (RA) by treatment as described in Example 5 were injected with 20 μg / 100 μl of the pharmaceutical composition of Example 2 for 4 weeks at two-day intervals. As a control group, mice injected with Mesotrexate (MTX), which is used as a saline solution or an anti-inflammatory agent, were used in normal mice and mice with RA. We measured the number of leukocytes in peripheral lymph nodes and joint cavity in the experimental group and compared the degree of extravascular leakage.
도 4에는 대조군으로서 본 발명에 따른 약학 조성물을 처리하지 않은 경우와, 본 발명에 따른 약학 조성물을 처리한 경우의 혈관 외로 유출된 백혈구세포의 갯수를 도시한 그래프를 나타내었으며, 도 4를 참조하면, 본 발명에 따른 약학 조성물을 처리하는 경우에 혈관 외로 유출된 백혈구세포의 갯수가 MTX를 주입한 경우와 유사하게, 생리식염수로 처리한 RA 생쥐 대조군에 비해서 3 분의 2 수준으로 감소되는 사실을 알 수 있다.4 is a graph showing the number of leukocytes leaked out of blood vessels when the pharmaceutical composition according to the present invention is not treated and when the pharmaceutical composition according to the present invention is treated as a control group. Referring to FIG. In the case of treatment with the pharmaceutical composition according to the present invention, the number of leukocytes leaked out of the blood vessel was reduced to two-thirds compared to the control group treated with saline, similar to the case of injection of MTX. Able to know.
실시예 7. 관절강 내에서의 B세포 (CD19+세포)의 혈관외 유출 억제능 실험Example 7 Experimental Inhibition of Extravasation of B Cells (CD19 + Cells) in the Joint cavity
일반적으로, 관절 부위에 염증이 발생하면 관절강 안으로 여러 분화단계의 B 세포들이 침윤하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 실시예에서는 본 발명에 따른 약학 조성물이 B 세포의 염증부위로의 침윤을 억제하는지를 알아보기 위하여, 실시예 6에서 기술한대로 처리한 4 실험군의 관절강 내에서 일정량의 윤활액을 추출한 후, 이 속에 들어있는 세포들의 총수를 측정하였다. 그 후 항-CD19 단클론항체로 염색하고 유세포분석 (flow cytometry analysis)을 실시하여, 총 세포수중 CD19+세포의 수의 비율을 측정하여, 관절강 내로 유입된 B세포의 수를 실험군별로 비교하였다. In general, when inflammation occurs in the joint area, B cells of various stages of differentiation are known to infiltrate into the joint cavity. Therefore, in this embodiment, in order to determine whether the pharmaceutical composition according to the present invention inhibits infiltration of B cells into the inflammatory site, after extracting a certain amount of lubricant in the joint cavity of the four experimental groups treated as described in Example 6, The total number of cells in the stomach was measured. Thereafter, the cells were stained with anti-CD19 monoclonal antibody and subjected to flow cytometry analysis to measure the ratio of the number of CD19 + cells in the total cell number, and the number of B cells introduced into the joint cavity was compared for each experimental group.
도 5에는 대조군으로서 본 발명에 따른 약학 조성물을 처리하지 않은 경우와, 본 발명에 따른 약학 조성물을 처리한 경우의 혈관 외로 유출된 B세포의 갯수를 도시한 그래프를 나타내었다. 도 5를 참조하면, 본 발명에 따른 약학 조성물을 처리하는 경우에 생리식염수로 처리한 RA 생쥐 대조군에 비해서 B세포의 혈관외 유출이 약 60% 수준으로 억제되었고, MTX를 주입한 대조군에 비해서도 B세포의 혈관외 유출이 억제되는 것을 알 수 있다. 5 is a graph showing the number of B cells leaked out of blood vessels when the pharmaceutical composition according to the present invention is not treated as a control and when the pharmaceutical composition according to the present invention is treated. Referring to Figure 5, when treated with the pharmaceutical composition according to the present invention, the extracellular leakage of B cells was suppressed to about 60% compared to the control group treated with saline, and compared to the control group injected with MTX B It can be seen that extravasation of cells is suppressed.
실시예 8. 말초림프절 내에서 T세포 (CD4+ 또는 CD8+ 세포)의 혈관외 유출과 T세포 (CD3+, CD69+세포)의 활성화 억제 실험Example 8 Inhibition of Extravasation of T Cells (CD4 + or CD8 + Cells) and Activation of T Cells (CD3 + , CD69 + Cells) in Peripheral Lymph Nodes
일반적으로, 염증반응이 일어날 경우 말초림프절 내로 T세포의 침윤이 증가 하며, 또한 활성화되는 T세포수도 증가한다. 따라서, 본 실시예에서는 본 발명에 따른 약학 조성물이 T세포의 침윤과 활성화를 억제하는지를 조사하기 위하여 실시예 7에서와 같이 처리한 4 실험군에서 말초림프절을 추출하여 RPMI 1640 배지로 세척 후, 단일세포 수준으로 잘게 저몄다. 이 단일세포들의 총수를 측정한 후, 항-CD4, CD8, CD3, CD69 단클론항체로 염색하고 실시예 6과 같은 방법으로 유세포분석을 통하여 전체 T세포와 활성화된 T세포의 수를 측정함으로써 본 발명에 따른 약학 조성물의 염증억제 효과를 조사하였다. In general, when an inflammatory reaction occurs, T cell infiltration increases into the peripheral lymph nodes, and the number of activated T cells also increases. Therefore, in the present embodiment, to investigate whether the pharmaceutical composition according to the present invention inhibits T cell infiltration and activation, peripheral lymph nodes were extracted from 4 experimental groups treated as in Example 7, washed with RPMI 1640 medium, and then washed with single cells. Chopped to level. After measuring the total number of these single cells, the present invention by staining with anti-CD4, CD8, CD3, CD69 monoclonal antibody and measuring the total number of T cells and activated T cells through flow cytometry in the same manner as in Example 6 The inhibitory effect of the pharmaceutical composition was investigated.
도 6에는 대조군으로서 생리식염수를 처리하거나 MTX를 처리한 경우와, 본 발명에 따른 약학 조성물을 처리한 경우의 말초림프절로 침윤한 T세포의 갯수를 도시한 그래프를 나타내었으며, 도 6을 참조하면, 본 발명에 따른 약학 조성물을 처리하는 경우에 침윤된 CD4+ T세포의 갯수가 생리식염수로 처리한 RA 생쥐 대조군에 비해서 4 분의 3 수준으로 감소되는 사실을 알 수 있다. 또한 도6은 CD8+ T세포의 침윤도와 T 활성화 정도가 생리식염수나 MTX로 처리된 대조군에 비하여 본 약학 조성물로 처리된 실험군에서 현격히 감소함을 보여 준다. 6 shows a graph showing the number of T cells infiltrated into the peripheral lymph nodes when treated with saline or MTX and treated with the pharmaceutical composition according to the present invention as a control group. Referring to FIG. In the case of treating the pharmaceutical composition according to the present invention, the number of infiltrated CD4 + T cells can be seen to be reduced to three quarters of the level compared to the control group of RA mice treated with saline. In addition, Figure 6 shows that the invasion and T activation degree of CD8 + T cells is significantly reduced in the experimental group treated with the pharmaceutical composition compared to the control group treated with saline or MTX.
본 발명에 따르면, 신생혈관 형성을 억제하며, 염증 부위로 백혈구 세포가 이동하는 것을 억제함으로써 염증 반응을 경감시킬 수 있고, 인체 투여 및 화학적 합성이 용이한 아미노산 서열 및 상기 아미노산 서열을 포함하는 약학 조성물을 제 공할 수 있다.According to the present invention, it is possible to reduce the inflammatory response by inhibiting neovascularization and inhibiting the migration of leukocytes to the site of inflammation, and the pharmaceutical composition comprising the amino acid sequence and the amino acid sequence that is easy to human administration and chemical synthesis Can be provided.
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| WO2000035407A2 (en) | 1998-12-16 | 2000-06-22 | Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Inhibition of angiogenesis by high molecular weight kininogen domain 3 peptide analogs |
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