KR100745763B1 - Method for designing probe set probe set designed by the method microarray comprising the probe set and method for identifying target sequence using the probe set - Google Patents

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Abstract

본 발명은 혼성화에 의한 표적 서열의 동정에 사용되는 프로브 세트를 설계하는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method of designing a probe set for use in the identification of target sequences by hybridization. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 설계된 프라이머 및 프로브 세트, 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 키트, 상기 방법을 컴퓨터가 수행할 수 있도록 하는 프로그램을 기록한 컴퓨터 판독가능한 매체 및 상기 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 표적 서열의 동정 방법에 관한 것이다. In addition, the present invention using primers and a probe set, the primer and probe set kit, a computer-readable medium storing a program that enables the method to a computer to perform, and the primer and probe set comprising a designed according to the method It relates to a method of identifying target sequences. 본 발명에 따르면, 많은 수의 표적 서열들을 신속하게 동정할 수 있고 2종 이상의 표적 서열이 동시에 출현하더라도 정확하게 동정할 수 있는 프로브 세트를 용이하게 설계할 수 있다. According to the invention, it is possible to quickly identify a large number of target sequences can be readily designed a probe set that has two or more target sequences can be accurately identified even appearance at the same time.
프로브, 설계, 표적 서열 동정, 마이크로어레이 Probes, the design, the target sequence identification, microarray

Description

프로브 세트를 설계하는 방법, 그에 의하여 설계된 프로브 세트, 상기 프로브 세트를 포함하는 마이크로어레이, 및 상기 프로브 세트를 이용한 표적 서열의 동정 방법{Method for designing probe set, probe set designed by the method, microarray comprising the probe set, and method for identifying target sequence using the probe set} Method of designing a probe set, microarray comprising a probe set, the probe set designed by him, and how the identification of the target sequence with the probe set {Method for designing probe set, probe set designed by the method, microarray comprising the probe set, and method for identifying target sequence using the probe set}

도 1은 본 발명에 따른 프로브 세트의 설계 방법을 나타내는 흐름도이다. 1 is a flow diagram illustrating a method of designing a probe set according to the invention.

도 2는 2개의 보존서열을 이용한 본 발명의 프로브 세트 설계 방법의 한 예를 도시한 개략도이다. Figure 2 is a schematic diagram showing an example of how designing a probe set of the present invention using two conserved sequence.

도 3은 2개의 보존서열을 이용한 본 발명의 프로브 세트 설계 방법의 다른 예를 도시한 개략도이다. Figure 3 is a schematic diagram showing another example of how to design a probe set of the present invention using two conserved sequence.

도 4는 3개의 보존서열을 이용한 본 발명의 프로브 세트 설계 방법의 한 예를 도시한 개략도이다. Figure 4 is a schematic diagram showing an example of how designing a probe set of the present invention using the three conserved sequence.

5도 5는 3개의 보존서열을 이용한 본 발명의 프로브 세트 설계 방법의 다른 예를 도시한 개략도이다. 5 Figure 5 is a schematic view showing another example of a method designed probe set of the present invention using the three conserved sequence.

도 6은 도 2에 의해 설계된 프로브 세트를 포함하는 마이크로어레이의 스팟팅 배열 및 그를 이용한 표적 서열 동정 방법의 일 예를 도시한 것이다. 6 illustrates an example of a spotted array, and identifying target sequences using the same method of a microarray comprising the probe set designed by FIG.

도 7은 도 3에 의해 설계된 프로브 세트를 포함하는 마이크로어레이의 스팟팅 배열 및 그를 이용한 표적 서열 동정 방법의 일 예를 도시한 것이다. 7 shows an example of how the target sequence identified by spotting an array of micro-arrays, and including him a probe set designed by FIG.

도 8은 도 4에 의해 설계된 프로브 세트를 포함하는 마이크로어레이의 스팟팅 배열 및 그를 이용한 표적 서열 동정 방법의 일 예를 도시한 것이다. 8 shows an example of how the target sequence identified by 4 spotted array of micro-array comprising the probe set designed by him and.

도 9는 도 5에 의해 설계된 프로브 세트를 포함하는 마이크로어레이의 스팟팅 배열 및 그를 이용한 표적 서열 동정 방법의 일 예를 도시한 것이다. 9 illustrates an example of an identified target sequence method of Figure microarray including the probe set designed by the five spotted arrays and him.

본 발명은 표적 서열의 동정에 사용될 수 있는 프로브 세트를 설계하는 방법, 그에 의하여 설계된 프로브 세트, 상기 프로브 세트를 포함하는 마이크로어레이, 상기 방법을 컴퓨터가 수행할 수 있도록 하는 프로그램을 기록한 컴퓨터 판독가능한 매체 및 상기 프로브 세트를 이용한 표적 서열의 동정 방법에 관한 것이다. The present invention is a computer readable medium storing a program that enables the method, designed probe set, microarray including the probe set, and the method by him to design a probe set that can be used in the identification of the target sequence, the computer may perform and to a method of identifying target sequences using the above probe set.

마이크로어레이란 기판 상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. Microarray is as immobilized at a high density of the group of polynucleotides on a substrate, the polynucleotide group refers to a microarray that is immobilized on each of a given area. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. Such microarray is well known in the art. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국 특허 제 5,445,934호 및 제 5,744,305호에 개시되어 있다. , For example with respect to the microarray it is disclosed in U.S. Patent No. 5,445,934 and No. 5,744,305 arc. 또한, 상기 마이크로어레이의 제조방법에는 일반적으로 포토리소그래피를 이용하는 방법이 알려져 있다. Further, the production process of the microarray has a general method using a known photolithography. 포토리소그래피를 이용하는 경우, 제거가능한 기로 보호된 단량체가 도포된 기판 표면 상의 일정한 영역을 에너지 원에 노출시켜 보호기를 제거하고, 제거가능한 기로 보호된 단량체를 커플링 시키는 단계를 반복함으로써, 폴리뉴클레오티드의 마이크로어레이를 제조할 수 있다. When using photolithography, a removable group to expose a predetermined area on a protected monomer-coated surface of the substrate to an energy source to remove the protecting group and removed by repeating the step of coupling the protected monomer groups available, a micro polynucleotide It can be produced array. 이 경우, 마이크로어레이 상에 고정화되는 폴리뉴클레오티드는 단량체를 하나씩 연장시키는 방식으로 합성된다. In this case, polynucleotides to be immobilized on a microarray are synthesized in such a manner as to extend the monomers one by one. 또한, 스팟팅(spotting) 법에 의하는 경우, 마이크로어레이는 이미 합성된 폴리뉴클레오티드를 일정한 위치에 고정화시킴으로써 고정화된다. In the case depend on spotting (spotting) method, a microarray is already immobilized by fixing the synthesized polynucleotide in a constant position. 이러한 마이크로어레이의 제조방법은 예를 들면, 미국특허 제5,744,305호, 제5,143,854호 및 제5,424,186호에 개시되어 있다. Method for producing such microarrays, for example, are disclosed in U.S. Patent No. 5,744,305, 1 - 5,143,854 and No. 5,424,186 arc. 마이크로어레이 및 그의 제조방법에 관한 상기 문헌은 원용에 의하여 본 명세서에 그 전체로서 포함되어진다. The literature on the microarray and a method of produced is included in its entirety herein by reference.

마이크로어레이에 고정화되는 폴리뉴클레오티드("프로브" 또는 "프로브 핵산" 또는 "프로브 폴리뉴클레오티드"라고도 한다)는 표적 핵산과 특이적으로 혼성화할 수 있어 표적 핵산을 검출 또는 확인하는데 사용되어진다. (Also referred to as a "probe" or "probe nucleic acid" or "polynucleotide probe") a polynucleotide immobilized on a microarray are used to a target nucleic acid can be hybridized to a target nucleic acid and the specific detection or confirmation. 종래 프로브 DNA는 각 표적 서열에 대한 프로브 DNA를 선택하기 위한 기준을 설정하고, 상기 기준에 맞는 DNA 서열을 선택한다. Conventional DNA probes are set criteria for selecting a probe DNA for each target sequence, and selects a DNA sequence meeting the standard. 선택된 DNA 서열에 대하여 상기 기준 및 다른 요건을 검정한 다음 가장 바람직한 프로브 서열을 선택하게 된다. For the selected DNA sequence black, the dimensions and other requirements will then select the most preferable probe sequence. 상기 기준에는 프로브의 길이, 프로브의 Tm 값(이중가닥 DNA 분자들 가운데 50%가 2개의 단일가닥으로 해리되는 온도), 및 다른 DNA와 서열 상동성의 한계값 등이 포함되어질 수 있다. The reference may be included The length of a probe, Tm value of the probe (in the middle of the double-stranded DNA molecule that is a temperature of 50% dissociation of two single-stranded), and the other DNA sequence homology with the limit values. 상기 기준에 맞는 후보 프로브 DNA가 선택되면, 상기 후보 프로브 DNA가 표적 서열에만 유니크한 것인지, 교차혼성화를 유도하기 쉬운 서열은 아닌지 등에 대하여 Tm 및 서열 상동성 등을 통하여 조사한다. When a candidate DNA probe is selected for the reference, whether one of the candidate DNA probe is unique only to a target sequence, and easy to induce cross hybridization sequence is investigated by such as Tm and sequence homology for the like or not. 이들 표준들을 만족시키는 후보 프로브 DNA 중에서 가장 바람직한 것을 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합하는 서열로서 선택하 게 된다. Selected as a sequence specifically binding to the most preferred in the target DNA sequence from the candidate DNA probes that satisfy these standards, it is. 그러나, 이러한 프로브 세트 설계 방법은 각 표적 서열에 대하여 혼성화하면서 다른 서열에는 교차 혼성화하지 않는 특이적 서열만을 프로브로서 선택하였기 때문에, 표적 서열간의 서열 상동성이 높거나, 동정하고자 하는 표적 서열의 수가 많아지는 경우 특이적 프로브를 설계하기 어려운 문제점이 있었다. However, this probe set construction method because it selects only specific sequences and hybridization for each target sequence that does not include cross-hybridization another sequence as a probe, to increase the sequence homology between the target sequence, or the number of the target sequence to be identified more If that was the difficult problem to design a specific probe.

예컨대, 특정 박테리아 군을 구성하는 복수의 박테리아들 중 시료 내에 존재하는 박테리아가 어떤 종인지를 동정하기 위해서 종래에는 상기 복수의 박테리아의 보존 서열(consensus sequence), 특히 16S rRNA 부위를 이용하였다. For example, it is conventional to use a conserved sequence of a plurality of bacteria (consensus sequence), particularly 16S rRNA region in order to identify whether the bacteria present in the one of the plurality of bacteria that make up a particular group of bacteria which sample species. 즉, 상기 16S rRNA 부위 중 상기 종들에 공통적인 서열은 프라이머로서 사용하고, 각 종들에 유니크한 서열은 프로브로서 사용하였다. That is, the common sequence in the species of the 16S rRNA region is used as a primer, and the sequence unique to each species was used as a probe. 상기 방법은 몇 종의 박테리아를 동정하는데 사용될 수 있지만, 16S rRNA 부위는 고도로 보존되어 있어 10종 이상의 박테리아의 동정에 사용되기에는 어려움이 있다. The method may be used to identify several species of bacteria, 16S rRNA region is it is difficult doegie used in the identification of more than 10 species of bacteria it is highly conserved. 예컨대, 패혈증(sepsis)에 관련된 박테리아 37종 및 혈액 배양시 오염 또는 균혈증(bacteremia)에 관련된 박테리아 34종의 총 71종의 경우 16S rRNA 서열 1,002 bp에 있어서, 14종의 서열 상동성이 100%이고, 상기 종들의 97%의 서열 상동성이 70% 이상이고, 상기 71종의 서열 상동성의 평균은 83%로 고도로 보존되어 있다. For example, in the case of bacteria involved in sepsis (sepsis) 37 species and blood total bacterial 34 kinds related to contamination or bacteremia (bacteremia) during culture 71 kinds in the 16S rRNA sequence 1,002 bp, a 100% sequence homology of 14 and and having a phase of 97% of the species sequence at least 70% Bi, and the average sequence homology of the 71 species are highly conserved in 83%. 따라서, 종래의 방법을 이용하여 상기 71종을 동정하기 위한 프로브를 설계하는 경우, 각 프로브간 80% 이하의 상동성을 갖도록 설계하는 경우 12종을 동정할 수 있는데 불과하다. Therefore, when designing a probe for identifying the 71 kinds by using a conventional method and may only be identified if the 12 kinds are designed to have each probe between the homology of 80% or less.

또 다른 종 동정을 위한 유전자인 23S rRNA의 경우 서열이 많이 상이하여 16S rRNA를 사용하는 경우 보다 많은 수의 종들을 동정할 수 있다. In the case of other genes in 23S rRNA for the species identified by sequence it is different from lot can identify a large number of species than when using the 16S rRNA. 하지만, 23S rRNA 서열은 공개되어 있지 않은 경우가 많아, 이의 서열을 확인하는데는 추가의 비용이 발생한다는 문제점이 있다. But, 23S rRNA sequences are in many cases not been disclosed, there is a problem that additional costs are generated to identify its sequence. 예컨대, 상기 71종의 박테리아의 경우 약 2,600 bp의 23S rRNA 서열 중 대략 반 정도 이상의 서열이 공개되어 있는 종의 수는 43종에 불과하다. For example, in the case of the 71 species of bacteria, the number of species that have approximately half or more sequences of 23S rRNA sequence of approximately 2,600 bp is open is only 43 species. 상기 23S rRNA 서열을 이용하여 30종의 박테리아를 동정하였다는 보고가 있었지만("Rapid diagnosis of bacteremia by universal amplification of 23S ribosomal DNA followed by hybridization to an oligonucleotide array, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Feb. 2000, pp.781-788), 상기 논문에는 23S rRNA 서열이 공개되어 있지 않을 뿐만 아니라, 여전히 30종 이상을 동정할 수 없다는 문제점이 있다. The 23S rRNA sequences were identified by using the 30 species of the bacteria, but the ( "Rapid diagnosis of bacteremia by universal amplification of 23S ribosomal DNA followed by hybridization to an oligonucleotide array, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Feb. 2000, pp report. 781-788), the paper has not only does not have a 23S rRNA sequence is published, there is a problem still can not be identified more than 30 species.

요컨대, 기존의 프로브 세트 설계 방법을 이용하여 다수의 종을 식별 가능한 프로브를 설계하는 것은 다음과 같은 한계를 갖는다. In short, to design probes for identifying the plurality of species using the conventional probe set design method has the following limitations: 첫째, 다수의 종에 대해 위치가 일치하는 공개된 서열을 확보하는 것이 16S rRNA를 제외하고는 어렵고, 둘째, 16S rRNA의 경우 서열의 보존이 잘 되어 있어 같은 속(genus) 내의 다른 종과 구분을 하기 위한 서열을 발굴하기가 어렵고, 셋째, 종간의 서열이 비교적 상이한 유전자나 게놈상의 특정 위치의 서열의 경우 모든 종에 대해 서열을 확보하기 위해서는 서열을 얻기 위한 별도의 실험을 실시해야 하여 추가 비용이나 개발 기간의 지연 등이 발생하게 된다. First, a different species distinguished from within to secure the published sequence where the match for the plurality of kinds of difficult and with the exception of the 16S rRNA, the second, in (genus) as it is well-preserved in the case of the 16S rRNA sequence it is difficult to sequence excavation to third, of the species sequence for relatively different genes or sequences for a specific location on the genome in order to secure a sequence of all kinds to be subjected to a separate experiment for obtaining the sequence additional cost or such as the delay of the development period is generated.

본 발명자들은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 연구를 계속 하던 중, 복수의 표적 서열들의 하나의 보존 서열을 비교하여 상기 복수의 표적 서열들을 그룹화 하고, 상기 그룹들 중 하나의 표적 서열로 구성되는 경우 표적 서열 특이적 프로브를 선택하고, 상기 그룹들 중 둘 이상의 표적 서열로 구성되는 경우 그룹 프로브를 선택하고, 상기 둘 이상의 표적 서열로 구성되는 그룹의 표적 서열들의 다른 보존 서열에 대하여 상기 과정을 반복하면 30개 이상의 표적 서열을 동정할 수 있는 프로브 세트를 설계할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. The present inventors made up of one of the target sequences of the while trying to continue the research in order to solve the conventional problems, as compared to a conserved sequence of a plurality of target sequences and grouping the plurality of the target sequence, the same group as the If a select target sequence specific probe, and select the group probe when consisting of more than one target sequence among the group, and the above process with respect to the other conserved sequence of the target sequence consisting of the two or more target sequence group repeated by ensuring that it is possible to design a probe set capable of identifying the more than 30 target sequences, thereby completing the present invention.

본 발명의 목적은 표적 서열의 동정에 사용되는 프로브 세트를 설계하는 방법을 제공하는 것이다. An object of the present invention to provide a method of designing a probe set for use in the identification of the target sequence.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 설계된 프로브 세트를 제공하는 것이다. Another object of the invention is to provide a probe set designed in accordance with the above method.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로브 세트를 포함하는 마이크로어레이를 제공하는 것이다. A further object of the present invention is to provide a micro-array comprising the probe set.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법을 컴퓨터가 수행할 수 있도록 하는 프로그램을 기록한 컴퓨터 판독가능한 매체를 제공하는 것이다. Another object of the invention to provide a computer readable medium storing a program that enables the method, the computer may perform.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로브 세트를 이용하여 표적 서열을 동정하는 방법을 제공하는 것이다. It is another object of the invention to provide a method for identifying a target sequence using the probe set.

본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 a) 복수의 표적 서열들의 하나의 보존 서열을 비교하여, 상기 하나의 보존 서열에 포함되어 있는 일정 기준을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 표적 서열들끼리 각각 그룹화하는 단계; In order to achieve the object of the present invention, each of the present invention a) among themselves as compared with one of the conserved sequence of a plurality of target sequence, target sequence comprising a polynucleotide having a predetermined reference corresponding to the at least one conserved sequence grouping; b) 상기 a) 단계의 그룹들 중 하나의 표적 서열로 구성된 그룹의 경우, 상기 일정 기준을 갖는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 표적 서열 특이적 프로브(target sequence specific probe)로 선택하는 단계; b) selecting in step a), if the group of one of the target sequences of the groups of steps, oligonucleotide specific probe (target sequence specific probe the nucleotide target sequence specifically binding to a polynucleotide having the predetermined standard) step; c) 상기 a) 단계의 그룹들 중 2 이상의 표적 서열로 구성된 그룹의 경우, 상기 일정 기준을 갖는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 각 그룹의 그룹 프로브(group probe)로 선택하는 단계; c) wherein a) in the case of the group consisting of a group of two or more target sequences of the phase oligonucleotide that specifically binds to a polynucleotide having the predetermined reference select the nucleotides in Group Probe (group probe) in each group; 및 d) 상기 a) 단계의 그룹들 중 2 이상의 표적 서열로 구성된 그룹의 경우, 상기 2 이상의 표적 서열로 구성된 각 그룹의 복수의 표적 서열들의 다른 보존 서열에 대하여 2 이상의 표적 서열로 구성된 그룹이 존재하지 않을 때까지 상기 a) 단계 내지 c) 단계를 반복하는 단계를 포함하는 표적 서열의 동정에 사용되는 프로브 세트를 설계하는 방법을 제공한다. And d) wherein a) in the case of the group consisting of a group of two or more target sequences of the step, a group of two or more of the target sequence relative to the other conserved sequence of a plurality of target sequences in each group of the target sequence the two or more existing until no provides a method of designing a probe set for use in the identification of target sequences, comprising the step of repeating the step a) to step c).

본 발명에 따른 프로브 세트 설계 방법에 있어서, 상기 일정 기준은 서열 상동성, 염기 길이, 혼성화 융점(Tm), 혼성화 융점 차이(ΔTm), GC 함량, 자기 정렬(self-alignment), 변이 위치, 반복서열 정도 및 3' 말단의 염기 구성으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. In the probe set designed method according to the invention, the predetermined criterion is sequence homology, base length, the hybridization melting temperature (Tm), the hybridization melting temperature differences (ΔTm), GC content, and self-assembly (self-alignment), mutation location, repeat SEQ degree and 3 'may be at least one selected from the group consisting of a base structure of a terminal.

본 발명에 따른 프로브 세트 설계 방법에 있어서, 상기 일정 기준은 동일 그룹의 폴리뉴클레오티드에 대해서 100%의 상동성 및 다른 그룹의 폴리뉴클레오티드에 대해서 90% 이하의 상동성인 것이 바람직하다. In the probe set designed method according to the invention, the predetermined criteria is preferably homology of 90% or less with respect to the homology, and polynucleotides of the other groups of 100% with respect to the polynucleotide in the same group.

본 발명에 따른 프로브 세트 설계 방법에 있어서, 상기 보존 서열은 16S rRNA, 23S rRNA, sodA, gyrA, groEL 및 rpoB로 구성된 군에서 선택될 수 있다. In the probe set designed method according to the invention, the conserved sequence may be selected from the group consisting of 16S rRNA, 23S rRNA, sodA, gyrA, groEL and rpoB.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 상기 프로브 세트 설계 방법에 따라 설계된 프로브 세트를 제공한다. In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a probe set is designed according to design the probe set method.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 상기 프로브 세트가 기판 상에 고정화 되어 있는 것을 특징으로 하는 표적 서열 동정용 마이크로어레이를 제공한다. In order to attain the further object of the present invention, the present invention provides a microarray for the target sequence is identified, characterized in that it is immobilized on the probe set of the substrate.

상기 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅될 수 있다. The substrate amino-active group is selected from the group consisting of silane (amino-silane), poly -L- lysine (poly-L-lysine) and aldehyde (aldehyde) can be coated.

또한, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. Further, the substrate may be selected from the group consisting of a silicon wafer, glass, quartz, metals and plastics.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 상기 프로브 세트 설계 방법을 컴퓨터가 수행할 수 있도록 하는 프로그램을 기록한 컴퓨터 판독가능한 매체를 제공한다. In order to attain the further object of the present invention, there is provided a computer readable medium storing a program that enables a computer to perform a set of the probe design methods.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 상기 프로브 세트를 이용하여 표적 서열을 동정하는 방법을 제공한다. In order to attain the further object of the present invention, the present invention provides a method for identifying a target sequence using the probe set.

본 발명에 따른 표적 서열 동정 방법은 a) 본 발명에 따른 마이크로어레이에 표적 서열을 포함하는 반응 시료를 적용하는 단계; Target sequence identification process according to the invention comprising the steps of: a) applying the reaction samples containing the target sequences to a microarray according to the present invention; b) 프로브와 표적 서열을 혼성화시키는 단계; b) step of hybridization of the probe and the target sequence; c) 비특이적 반응을 제거하기 위해 세척하는 단계; c) the step of washing to remove non-specific reaction; 및 d) 하이브리드 형성에 의한 형광 시그널을 검출하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. And d) preferably includes the step of detecting the fluorescent signal by the hybrid formation.

이하 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. Reference to the drawings will be described in more detail the present invention.

본 발명의 일면은 표적 서열 동정용 프로브 세트 설계 방법에 관한 것이다. One aspect of the invention relates to a probe set design method for identifying a target sequence.

도 1은 본 발명에 따른 프로브 세트 설계 방법을 나타내는 흐름도이다. 1 is a flow diagram illustrating a probe set design method according to the invention.

본 발명에 따른 프로브 세트 설계 방법은 a) 복수의 표적 서열들의 하나의 보 존 서열을 비교하여, 상기 하나의 보존 서열에 포함되어 있는 일정 기준을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 표적 서열들끼리 각각 그룹화하는 단계를 포함한다. A probe set design method according to the present invention includes a) a plurality of targets by comparing a retention sequences of the sequence, each group of the target sequence comprising a polynucleotide having a predetermined reference that is included in the conserved sequence of the one between and a step.

본 명세서에 있어서 "표적 서열(target sequence)"이란 프로브와의 결합에 의하여 동정하기 위해 선택되는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. In the present specification refers to a polynucleotide selected to identify by bonding to the "target sequence (target sequence)" is a probe. 상기 표적 서열은 게놈 DNA, 제한 효소에 의하여 절단된 DNA 단편, 및 PCR 산물 등을 포함한다. The target sequence includes genomic DNA, the DNA fragment by restriction enzyme digestion, and PCR products and the like. 일반적으로는 게놈 DNA의 특정 영역을 PCR에 의하여 증폭함으로써 얻어지는 게놈 DNA 단편이 많이 사용된다. Generally it is used a lot of genomic DNA fragment obtained by amplifying a specific region of the genomic DNA by PCR. 본 발명의 방법은 표적 서열이 복수 개인 경우에 적용할 수 있는 프로브 세트를 설계하는 방법이다. The method of the present invention is a method of designing a probe set that can be applied when the target sequence multiple individuals.

본 명세서에 있어서 "보존 서열(consensus sequence)"이란 해당 표적 서열들 내의 동일한 부위에 위치하는 동일 또는 유사한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. In the present specification, "conserved sequence (consensus sequence)" refers to a polynucleotide having the same or similar base sequence located on the same site in the corresponding target sequence. 상기 보존 서열은 해당 표적 서열들의 어떤 유전자라도 상관 없다. The conserved sequence is irrelevant in any gene of the target sequence. 예컨대, 상기 a) 단계에서 비교되는 보존 서열은 16S rRNA 부위, 23S rRNA 부위, sodA 부위, gyrA 부위, groEL 부위 및 rpoB로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. For example, the conserved sequence is compared in the step a) may be any one selected from the group consisting of 16S rRNA site, 23S rRNA site, sodA region, gyrA region, groEL region and rpoB.

본 발명에 따른 프로브 세트 설계 방법에 있어서, "기준"은 프로브를 선택하는 종래의 통상적인 기준일 수 있다. In the probe set designed method according to the present invention, the "standard" may be date in a conventional common practice to select the probe. 즉, 상기 기준은 서열 상동성, 염기 길이, 혼성화 융점(Tm), 혼성화 융점 차이(ΔTm), GC 함량, 자기 정렬(self-alignment), 변이 위치, 반복서열 정도 및 3' 말단의 염기 구성으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. That is, in the standard sequence homology, base length, the hybridization melting temperature (Tm), the hybridization melting temperature differences (ΔTm), GC content, and self-assembly (self-alignment), mutation location, repeat sequences and the degree of the 3 'base structure of the terminal It may be at least one selected from the group consisting of. 또한, 상기 "일정 기준"은 동일 그룹의 폴리뉴클레오티드에 대해서 100% 및 다른 그룹의 폴리뉴클레오티드에 대해서 90% 이하의 상동성, 18~25 bp의 염기 길이, 72~76℃의 혼성화 융점, 30~70%의 GC 함량, 및 G 또는 C의 3' 말단 염기 구성인 것이 바람직하다. Further, the "predetermined criterion" is 100% and with respect to polynucleotides of the other group of homology, a 18 ~ 25 bp nucleotide length of no more than 90%, and 72 to the hybridization melting temperature of 76 ℃ for the polynucleotides of the same group, from 30 to it is a 70% GC content, and G or C in the 3 'terminal base configuration is preferred.

또한, 본 발명에 따른 프로브 세트 설계 방법은 b) 상기 a) 단계의 그룹들 중 하나의 표적 서열로 구성된 그룹의 경우, 상기 일정 기준을 갖는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 표적 서열 특이적 프로브(target sequence specific probe)로 선택하는 단계를 포함한다. In addition, the probe set designed method according to the invention b) wherein a) in the case of the group of one of the target sequences of the groups of steps, oligonucleotide that specifically binds to a polynucleotide having the predetermined criteria specific nucleotide target sequences and a step of selecting a probe (target sequence specific probe).

본 발명에 있어서, 프로브의 선택은 상기의 기준에 따라 종래 알려진 방법을 이용하여 결정될 수 있다. In the present invention, the selection of the probe may be determined by using a conventionally known method based on the criteria described above. 즉, 프로브 DNA를 선택하기 위한 기준을 설정하고, 상기 기준에 맞는 DNA 서열을 선택하고, 선택된 DNA 서열에 대하여 상기 기준 및 다른 요건을 검정한 다음 가장 바람직한 서열을 프로브 DNA로서 선택하게 된다. That is, set the criteria for selecting a probe DNA, and selecting a DNA sequence meeting the criteria, are the following: The most preferred sequence black, the dimensions and other requirements for the selected DNA sequence to select as the probe DNA. 상기 기준에 맞는 후보 프로브 DNA가 선택되면, 상기 기준을 만족시키는 후보 프로브 DNA 중에서 가장 바람직한 것을 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합하는 프로브 서열로서 선택하게 된다. When a candidate DNA probe is selected for the reference, to combine the reference specifically to the target DNA sequence that most preferred among the candidate DNA probes satisfying ever it is selected as the probe sequence. 상기 프로브 DNA는 표적 DNA에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 것이면 하나의 표적 DNA에 대하여 2 이상의 프로브 DNA가 선택될 수도 있다. The DNA probe may be specific number as long as it selects one of the two or more with respect to the target DNA with probe DNA combined with respect to the target DNA.

또한, 본 발명에 따른 프로브 세트 설계 방법은 c) 상기 a) 단계의 그룹들 중 2 이상의 표적 서열로 구성된 그룹의 경우, 상기 일정 기준을 갖는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 각 그룹의 그룹 프로브(group probe)로 선택하는 단계를 포함한다. In addition, the probe set designed method according to the invention c) wherein a) in the case of the group consisting of a group of two or more target sequences of the phase oligonucleotide that specifically binds to a polynucleotide having the predetermined reference nucleotide in each group and a step of selecting a group of probes (probe group).

또한, 본 발명에 따른 프로브 세트 설계 방법은 d) 상기 a) 단계의 그룹들 중 2 이상의 표적 서열로 구성된 그룹의 경우, 상기 2 이상의 표적 서열로 구성된 각 그룹의 복수의 표적 서열들의 다른 보존 서열에 대하여 2 이상의 표적 서열로 구성된 그룹이 존재하지 않을 때까지 상기 a) 단계 내지 c) 단계를 반복하는 단계를 포함한다. In addition, the probe set designed method according to the invention d) wherein a) in the case of the group consisting of a group of two or more target sequences of the steps, on the other conserved sequence of a plurality of target sequences in each group of the target sequence the two or more for until the group consisting of two or more of the target sequence is not present and a step of repeating the step a) to step c).

상기 다른 보존 서열은 상기 2 이상의 표적 서열들로 구성된 각 그룹의 복수의 표적 서열들의 어떤 유전자라도 상관 없다. The other conserved sequence does not matter any gene of a plurality of target sequences in each group of the two or more target sequences. 상기 d) 단계에서 비교되는 다른 보존 서열은 상기 a) 단계에서 비교된 하나의 보존 서열을 제외한 보존 서열들로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. Wherein d) the other conserved sequence to be compared in the step may be any one selected from the conserved sequence except for a conserved sequence compared in step a). 예컨대, 상기 a) 단계에서 16S rRNA 부위가 비교된 경우, d) 단계의 다른 보존 서열은 23S rRNA 부위, sodA 부위, gyrA 부위, groEL 부위 및 rpoB로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. For example, the a) If it is determined in step a 16S rRNA region compared, d) another step of conserved sequence may be any one selected from the group consisting of 23S rRNA site, sodA region, gyrA region, groEL region and rpoB. 또한, 각 그룹에서 비교되는 보존 서열은 반드시 동일할 필요가 없다. Further, the conserved sequence is compared in each group does not necessarily have to be the same. 예컨대, 상기 a) 단계에서 16S rRNA 부위가 비교된 경우, d) 단계에서 하나의 그룹은 23S rRNA 부위가 비교되고 다른 그룹은 sodA 부위가 비교될 수 있다. For example, the a) when the 16S rRNA region from the comparison step, d) a group of steps, the 23S rRNA region comparison and the other groups can be compared to the sodA region.

본 단계는 2 이상의 표적 서열로 구성된 그룹이 존재하지 않을 때까지, 즉 모든 그룹이 하나의 표적 서열로 구성되고 각 그룹의 각 하나의 표적 서열에 대해 표적 서열 특이적 프로브를 선택할 때까지 반복된다. This step is repeated until there is no group of two or more target sequences, i.e., until all the groups is composed of a target sequence and select a target sequence-specific probes for each one of the target sequence in each group.

상기한 과정에 의하여 얻어지는 복수의 그룹 프로브 및 표적 서열 특이적 프로브는 상기 복수의 표적 서열들을 동정에 사용하기 위한 프로브 세트로서 선택된다. A plurality of group-specific probes and target sequences obtained by the above process probe is selected as a probe set for use in the identification of a target sequence of said plurality.

도 2는 2개의 보존서열을 이용한 본 발명의 프로브 세트 설계 방법의 한 예를 도시한 개략도이다. Figure 2 is a schematic diagram showing an example of how designing a probe set of the present invention using two conserved sequence.

이해를 돕기 위하여 본 예에서는 6개의 표적 서열을 사용하였지만, 그의 수에 제한되는 것은 아니며, 오히려 그의 수가 증가할 수록 본 발명은 보다 강력함을 당업자는 용이하게 이해할 수 있을 것이다. In the present example for better understanding but using the six target sequences, not limited to its number, but rather the present invention will be more to increase their number will be understood to those skilled in the art that facilitate more powerful.

도 2를 참조하면, 6개의 표적 서열들의 보존 서열 A를 비교하여, 폴리뉴클레오티드 a를 포함하는 표적 서열들인 표적 서열 1, 표적 서열 2 및 표적 서열 3을 그룹 I로 그룹화하고, 폴리뉴클레오티드 b를 포함하는 표적 서열들인 표적 서열 4, 표적 서열 5 및 표적 서열 6을 그룹 II로 그룹화한다. Referring to Figure 2, as compared to the conserved sequence A of six target sequences, and groups the polynucleotide target containing a sequence which are the target sequence 1, the target sequence 2 and target sequence 3 in the group I, including a polynucleotide b and grouping the target sequence, which are the target sequence 4, the target sequence and the target sequence 5 to 6 in the group II. 상기 그룹 I 및 그룹 II가 모두 2개 이상의 표적 서열로 구성되어 있기 때문에, 상기 폴리뉴클레오티드 a 및 폴리뉴클레오티드 b를 각각 그룹 I 및 그룹 II의 그룹 프로브로 선택한다. Because the Group I and Group II is composed both of two or more target sequences, and selects a group of the probe polynucleotide and a poly-nucleotide b each group I and group II.

이후 상기 그룹 I 및 그룹 II 각각의 복수의 표적 서열들의 다른 보존 서열을 비교한다. Since compares the other conserved sequence of the group I and group II, respectively a plurality of target sequence. 이 단계는 각 그룹에 대해서 독립적으로 수행되는 것이므로, 각 그룹에 대해 상이한 보존 서열을 사용할 수도 있다. This step is performed since it will be applied independently with respect to each group, it is also possible to use a different conserved sequence for each group. 예컨대, 그룹 I에 대해서는 보존 서열 B를 비교하고, 그룹 II에 대해서는 보존 서열 C를 비교할 수 있다. For example, compare the conserved sequence B for the group I, and may compare the conserved sequence C for the group II. 다시 도 2를 참조하면, 그룹 I의 표적 서열 1, 표적 서열 2 및 표적 서열 3의 보존 서열 B를 비교하여, 폴리뉴클레오티드 a'를 포함하는 표적 서열 1을 그룹 I-1, 폴리뉴클레오티드 b'를 포함하는 표적 서열 2를 그룹 I-2 및 폴리뉴클레오티드 c'를 포함하는 표적 서열 3을 그룹 I-3으로 그룹화한다. Referring back to Figure 2, group I of the target sequence 1, the target sequence 2 and target as compared to the conserved sequence B of SEQ ID NO: 3, the polynucleotide a 'to the target sequence first group I-1, a polynucleotide b containing' a second target sequence group includes the target sequence to 3 including a group of I-2 and polynucleotides c 'as a group I-3. 또한, 그룹 II의 표적 서열 4, 표적 서열 5 및 표적 서열 6의 보존 서열 B를 비교하여, 폴리뉴클레오티드 d'를 포함하는 표적 서열 4를 그룹 II-1, 폴리뉴클레오티드 e'를 포함하는 표적 서열 5를 그룹 II-2 및 폴리뉴클레오티드 c'를 포함하는 표적 서열 6을 그룹 II-3으로 그룹화한 다. In addition, the target sequence of the group II 4, the target sequence 5 and the target as compared to the conserved sequence B of SEQ ID NO: 6, poly-target sequence containing nucleotides d 'to the target sequence Group II-1, a polynucleotide e containing' 5 a is a grouping of six target sequences containing the group II-2 and polynucleotides c 'as a group II-3. 상기 각 그룹들은 모두 하나의 표적 서열로 구성되어 있으므로, 상기 폴리뉴클레오티드 a', 폴리뉴클레오티드 b', 폴리뉴클레오티드 c', 폴리뉴클레오티드 d' 및 폴리뉴클레오티드 e'를 표적 서열 특이적 프로브로 선택한다. Wherein each group because they are all made up of a single target sequence, is selected as the polynucleotide a ', a polynucleotide b', polynucleotide c ', polynucleotide d' and polynucleotides e 'to the target sequence specific probe.

상기 예의 표적서열 3 및 표적서열 6과 같이 2개의 표적 서열의 그룹 프로브가 상이한 경우, 그들의 표적 서열 특이적 프로브는 동일할 수도 있다. If the second group of probes of the target sequence as shown in the above example the target sequence three and six different target sequences, their target sequence specific probe may be the same.

도 3은 2개의 보존서열을 이용한 본 발명의 프로브 세트 설계 방법의 다른 예를 도시한 개략도이다. Figure 3 is a schematic diagram showing another example of how to design a probe set of the present invention using two conserved sequence.

도 3을 참조하면, 6개의 표적 서열들의 보존 서열 A를 비교하여, 폴리뉴클레오티드 a를 포함하는 표적 서열 1 및 표적 서열 2를 그룹 I로 그룹화하고, 폴리뉴클레오티드 b를 포함하는 표적 서열 3, 표적 서열 4 및 표적 서열 5를 그룹 II로 그룹화하고, 폴리뉴클레오티드 c를 포함하는 표적 서열 6을 그룹 III으로 그룹화한다. 3, the target to compare the conserved sequence A of six target sequences by, grouping the target sequence 1 and the target sequence 2, comprising a polynucleotide a in group I, and includes a polynucleotide b SEQ ID NO: 3, the target sequence group 4 and the target sequence 5 to the group II, and group the target sequence 6 comprising a polynucleotide c as a group III. 상기 그룹 III은 하나의 표적 서열로 구성되어 있기 때문에 상기 폴리뉴클레오티드 c를 표적 서열 6의 표적 서열 특이적 프로브로 선택한다. The group III are selected for the specific target sequence in a polynucleotide c probes of the target sequence 6. Because the consist of a single target sequence. 한편, 상기 그룹 I 및 그룹 II는 2개 이상의 표적 서열로 구성되어 있기 때문에, 상기 폴리뉴클레오티드 a 및 폴리뉴클레오티드 b를 각각 그룹 I 및 그룹 II의 그룹 프로브로 선택한다. On the other hand, the group I and group II is selected as because it is composed of more than two target sequences, the group of the probe polynucleotide and a poly-nucleotide b each group I and group II. 다음으로, 그룹 I의 표적 서열 1 및 표적 서열 2의 보존 서열 B를 비교하여, 폴리뉴클레오티드 a'를 포함하는 표적 서열 1을 그룹 I-1, 폴리뉴클레오티드 b'를 포함하는 표적 서열 2를 그룹 I-2로 그룹화한다. Next, the group as compared to the target sequence 1 and the target sequence two conserved sequence B of the I, polynucleotide a a 'a target sequence 1 a group I-1, a polynucleotide b including "target sequence 2, comprising a group I The grouped into 2. 상기 각 그룹은 하나의 표적 서열로 구성되어 있으므로, 상기 폴리뉴클레오티드 a' 및 b'를 표적 서열 1 및 2의 표적 서열 특이적 프로브로 선택한다. Wherein each group because it is made up of a single target sequence, selects the polynucleotide a 'and b' to the target sequence and the target sequence specific probe 1 of Fig. 마찬가지로, 그룹 II의 표적 서열 3, 표적 서열 4 및 표적 서열 5의 보존 서열 B를 비교하여, 폴리뉴클레오티드 c'를 포함하는 표적 서열 3을 그룹 II-1, 폴리뉴클레오티드 d'를 포함하는 표적 서열 4를 그룹 II-2 및 e'를 포함하는 표적 서열 5를 그룹 II-3으로 그룹화한다. Similarly, the target sequence for group II 3, the target sequence 4 and the target as compared to the conserved sequence B of SEQ ID NO: 5, a polynucleotide c target sequence comprising, the target sequence 3 group containing II-1, a polynucleotide d '4 It is a grouping of the target sequence 5 comprising a group II-2 and e 'as a group II-3. 상기 각 그룹은 하나의 표적 서열로 구성되어 있으므로, 상기 폴리뉴클레오티드 c', d' 및 e'를 표적 서열 3, 4 및 5의 표적 서열 특이적 프로브로 선택한다. Wherein each group because it is made up of a single target sequence, is selected as the polynucleotide c ', d' and e 'to the target sequence 3, 4 and 5 of the target sequence specific probe.

도 4는 3개의 보존서열을 이용한 본 발명의 프로브 세트 설계 방법의 한 예를 도시한 개략도이고, 도 5는 3개의 보존서열을 이용한 본 발명의 프로브 세트 설계 방법의 다른 예를 도시한 개략도이다. 4 is a schematic diagram showing an example of how designing a probe set of the present invention using the three conserved sequence, Figure 5 is a schematic view showing another example of how the probe set of the present invention design using three conserved sequence.

도 4 및 도 5를 참조하면, 상기 예에서와 같이 2개의 보존 서열을 비교한 후에도 하나 이상의 그룹이 2개 이상의 표적 서열로 구성되어 있는 경우, 상기 2개 이상의 표적 서열로 구성된 그룹에 대해 다시 다른 보존 서열을 비교할 수 있다. Figures 4 and 5, if it is more than one group after a comparison of the two conserved sequence consisting of two or more target sequences, as in the example above, again different for the groups of the two or more target sequences It can be compared to the conserved sequence. 구체적인 방법은 상기에서 설명한 바와 동일하다. Specific methods are the same as described above. 도 4 및 도 5에서는 3개의 보존 서열을 이용하였지만, 동정하고자 하는 표적 서열의 범위가 매우 많은 경우, 4개 이상의 보존 서열을 이용할 수도 있다. In Figure 4 and 5 but using the three conserved sequence, if the range of the target sequence to be identified is very large, it is also possible to use four or more conserved sequence.

본 발명의 다른 일면은 본 발명의 프로브 세트 설계 방법에 따라 설계된 프로브 세트에 관한 것이다. Another aspect of the invention relates to a probe set is designed according to the designing method of the present invention, the probe set.

본 발명의 또 다른 일면은 상기 프로브 세트가 기판 상에 고정화 되어 있는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이에 관한 것이다. Another aspect of the invention relates to a microarray, characterized in that it is immobilized on the probe set of the substrate.

본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 프로브 세트를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. Microarrays according to the present invention may be prepared by conventional methods known to those skilled in using the probe set according to the art.

즉, 상기 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅될 수 있다. That is, the substrate amino-active group is selected from the group consisting of silane (amino-silane), poly -L- lysine (poly-L-lysine) and aldehyde (aldehyde) can be coated. 또한, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. Further, the substrate may be selected from the group consisting of a silicon wafer, glass, quartz, metals and plastics. 본 발명에 따른 프로브 세트를 기판에 고정화시키는 방법으로는 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 법, 핀(pin) 형태의 스팟터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다. As a method for immobilizing a probe set according to the invention to a substrate may be used a method using a pie crude Electric (piezoelectric) scheme micro pipetting (micropipetting) method using the pin (pin) shape of the spot emitter (spotter), etc. .

본 발명의 또 다른 일면은 상기 프로브 세트를 이용하여 표적 서열을 동정하는 방법에 관한 것이다. Another aspect of the invention relates to a method for identifying a target sequence using the probe set. 상기 동정 방법은 상기 마이크로어레이를 이용하여 수행되는 것이 바람직하다. The identification method is preferably carried out by using the microarray. 즉, 본 발명에 따른 표적 서열 동정 방법은 a) 본 발명에 따른 마이크로어레이에 표적 서열을 포함하는 반응 시료를 적용하는 단계; That is, the target sequence identification process according to the invention comprising the steps of: a) applying the reaction samples containing the target sequences to a microarray according to the present invention; b) 프로브와 표적 서열을 혼성화시키는 단계; b) step of hybridization of the probe and the target sequence; c) 비특이적 반응을 제거하기 위해 세척하는 단계; c) the step of washing to remove non-specific reaction; 및 d) 하이브리드 형성에 의한 형광 시그널을 검출하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. And d) preferably includes the step of detecting the fluorescent signal by the hybrid formation.

도 6 내지 도 9는 각각 도 2 내지 도 5에 의해 설계된 프로브 세트를 포함하는 마이크로어레이의 스팟팅 배열 및 그를 이용한 표적 서열 동정 방법의 일 예를 도시한 것이다. 6 to 9 illustrates an example of a method 2 to spotted arrays and target sequence identified using the same micro-array comprising the probe set designed by FIG. 5, respectively.

본 발명에 따른 마이크로어레이에 있어서 프로브 세트는 도 6 내지 도 9에서와 같이, 그가 유래된 보존 서열별로 스팟팅될 수 있지만, 특정 스팟팅 배열에 특별히 한정되는 것은 아니다. In the microarray according to the present invention as a probe set in Figs. 6-9, but he may be spot plated by the conserved sequence derived from, but is not particularly limited to a specific spotted array.

도 6A를 참조하면, 보존 서열 A에서 유래된 그룹 프로브인 폴리뉴클레오티드 a 및 폴리뉴클레오티드 b를 하나의 칼럼에 배열하고, 보존 서열 B에서 유래된 각 표적 서열 특이적 프로브인 폴리뉴클레오티드 a', b', c', d' 및 e'를 다른 칼럼에 배열하여 마이크로어레이를 제작하였다. Referring to Figure 6A, a group of the probe is a polynucleotide and a and polynucleotides b to the one arranged in the column and, specific probe for each target sequence derived from the conserved sequence B polynucleotide a derived from a conserved sequence A ', b' , c ', d' and the e 'to prepare a microarray arranged in different columns. 도 6B를 참조하면, 상기에서 제조된 마이크로어레이를 이용하여 본 발명의 표적 서열 동정 방법을 수행한 결과, 프로브 a 및 프로브 c'에 혼성화 반응이 검출되었다. Referring to Figure 6B, the results of the target sequence identification method of the present invention using the microarray prepared in the above, a probe and a probe c 'The hybridization reaction was detected on. 다시 도 2를 참조하면, 프로브 a는 그룹 I을 의미하고, 프로브 c'는 그 중 표적 서열 3을 의미하는 것이다. Referring back to Figure 2, a probe is intended to mean a group I and probe c 'indicates the target sequence three of them. 따라서, 상기 결과로부터 시료에 포함되어 있는 것은 표적 서열 3이라고 동정할 수 있다. Thus, included in the sample from the above results can be identified as the target sequence 3.

마찬가지로, 도 7A를 참조하면, 보존 서열 A에서 유래된 그룹 프로브인 폴리뉴클레오티드 a 및 폴리뉴클레오티드 b, 및 표적 서열 특이적 프로브인 폴리뉴클레오티드 c를 하나의 칼럼에 배열하고, 보존 서열 B에서 유래된 각 표적 서열 특이적 프로브인 폴리뉴클레오티드 a', b', c', d' 및 e'를 다른 칼럼에 배열하여 마이크로어레이를 제작하였다. Similarly, each reference to Figure 7A when, retention arrangement for the in SEQ ID NO: A-derived group probe is a polynucleotide and a and polynucleotides b, and the target sequence specific probe is a polynucleotide c in a column, and derived from the conserved sequence B by arranging the target sequence specific probe is a polynucleotide a ', b', c ', d' and e 'on the other column to prepare a microarray. 도 7B를 참조하면, 상기에서 제조된 마이크로어레이를 이용하여 본 발명의 표적 서열 동정 방법을 수행한 결과, 프로브 b 및 프로브 d'에 혼성화 반응이 검출되었다. Referring to Figure 7B, results of the microarray using the target sequence identification method of the present invention prepared in the above, hybridization was detected in the probe and the probe b d '. 다시 도 3을 참조하면, 상기 결과로부터 시료에 포함되어 있는 것은 표적 서열 4라고 동정할 수 있다. Referring again to Figure 3, it is contained in the sample from the result can be identified that target SEQ ID NO: 4.

또한, 도 8A를 참조하면, 보존 서열 A에서 유래된 그룹 프로브인 폴리뉴클레오티드 a 및 b를 하나의 칼럼에 배열하고, 보존 서열 B에서 유래된 그룹 프로브 또는 표적 서열 특이적 프로브인 폴리뉴클레오티드 a', b' 및 c'를 다른 칼럼에 배열하고, 보존 서열 C에서 유래된 표적 서열 특이적 프로브인 폴리뉴클레오티드 a", b" 및 c"를 다른 칼럼에 배열하여 마이크로어레이를 제작하였다. 도 8B를 참조하 면, 상기에서 제조된 마이크로어레이를 이용하여 본 발명의 표적 서열 동정 방법을 수행한 결과, 프로브 b, 프로브 c' 및 프로브 a"에 혼성화 반응이 검출되었다. Also, Referring to Figure 8A, conservation of sequence A groups probe is a polynucleotide array, a and b in a single column, the group of probes derived from the conserved sequence B, or a target sequence specific probe derived from a polynucleotide a ', b 'and c' of the arrangement in an array to another column, specifically a target sequence derived from the conserved sequence C probe is a polynucleotide a ", b" and c "the other column to produce a microarray Referring to Figure 8B surface and, as a result of performing the target sequence identification method of the present invention using the microarray prepared in the above, the hybridization reaction was detected in the probe b, a probe c ', and the probe a ". 다시 도 4를 참조하면, 상기 결과로부터 시료에 포함되어 있는 것은 표적 서열 6이라고 동정할 수 있다. Referring again to Figure 4, is contained in the sample from the above results can be identified as the target sequence. 6.

또한, 도 9A를 참조하면, 보존 서열 A에서 유래된 그룹 프로브 또는 표적 서열 특이적 프로브인 폴리뉴클레오티드 a, b 및 c를 하나의 칼럼에 배열하고, 보존 서열 B에서 유래된 그룹 프로브 또는 표적 서열 특이적 프로브인 폴리뉴클레오티드 a', b' 및 c'를 다른 칼럼에 배열하고, 보존 서열 C에서 유래된 표적 서열 특이적 프로브인 폴리뉴클레오티드 a" 및 b"를 다른 칼럼에 배열하여 마이크로어레이를 제작하였다. Also, Referring to Figure 9A, specific conserved sequence A groups probe or a target sequence specific probe is a polynucleotide a, b and a group of probe or target sequence derived from the c from one array to the column, and the conserved sequence B derived from to prepare a probe of the polynucleotide a ', b' and c 'of an array to another column, specifically a target sequence derived from the conserved sequence C probe is a polynucleotide a "and b" microarray arranged in another column . 도 9B를 참조하면, 상기에서 제조된 마이크로어레이를 이용하여 본 발명의 표적 서열 동정 방법을 수행한 결과, 프로브 a, 프로브 a' 및 프로브 b"에 혼성화 반응이 검출되었다. 다시 도 5를 참조하면, 상기 결과로부터 시료에 포함되어 있는 것은 표적 서열 2라고 동정할 수 있다. When Referring to Figure 9B, a result of performing a microarray using the target sequence identification method of the present invention was prepared in the probe a probe a 'and probe b "The hybridization was detected in. Referring back to Figure 5 , is contained in the sample from the result can be identified that target SEQ ID NO: 2.

본 발명의 또 다른 일면은 본 발명에 따른 프로브 세트 설계 방법을 컴퓨터가 수행할 수 있도록 하는 프로그램을 기록한 컴퓨터 판독가능한 매체에 관한 것이다. Another aspect of the invention is a computer readable medium storing a program that enables a computer to perform a set of probe design method according to the invention.

본 발명은 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록 매체에 컴퓨터(정보 처리 기능을 갖는 장치를 모두 포함한다)가 읽을 수 있는 코드로서 구현하는 것이 가능하다. The invention can be realized as code that can be read by a computer (including all devices having an information processing function) on a computer-readable recording medium. 컴퓨터가 읽을 수 있는 기록 매체는 컴퓨터 시스템에 의하여 읽혀질 수 있는 데이터가 저장되는 모든 종류의 기록 장치를 포함한다. The computer-readable recording medium includes all kinds of recording devices in which data that can be read by a computer system. 컴퓨터가 읽을 수 있는 기록 장치의 예로는 ROM, RAM, CD-ROM, 자기 테이프, 플로피 디스크, 광데이터 저장장치 등이 있다. An example of a recording apparatus in a computer-readable has a ROM, RAM, CD-ROM, magnetic tapes, floppy disks, optical data storage devices.

본 발명의 실시예에서는 패혈증 유발과 관련된 박테리아 37종과 혈액 배양시 오염 또는 균혈증(bacteremia) 유발과 관련된 박테리아 34종을 포함하는 총 71종의 박테리아를 대상으로 상기 박테리아들을 동정할 수 있는 프로브 세트를 설계하고자 하였다. A probe set that can be in the embodiment of the present invention to identify the above bacterial targets of a total of 71 species of bacteria, including bacteria, 34 kinds of related bacteria 37 species and blood cultures when contamination or bacteremia (bacteremia) causes associated with sepsis-induced It was to design. 그 결과, 총 64종을 동정할 수 있는, 24개의 그룹 프로브 및 56개의 표적 서열 특이적 프로브의 총 80개로 이루어진 프로브 세트를 설계하였다. As a result, it has been designed for, the probe 24 group and the 56 probe set comprising a total of 80 pieces of the target sequence specific probe to identify a total of 64 species.

16S rRNA 부위만을 이용하는 기존의 프로브 설계 방법은 각 프로브간 90% 이하의 상동성을 갖도록 설계하는 경우 71종 중 35종을 동정할 수 있었고 80% 이하의 상동성을 갖도록 설계하는 경우 71종 중 12종을 동정할 수 있었다. 16S rRNA region only conventional probe design methods used were able to identify 35 of the 71 kinds of species if designed to have a homology of 90% or less between each probe if designed to have a homology of 80% or less of the 71 species of 12 They were able to identify the species. 하지만, 본 발명은 각 프로브간 80% 이하의 상동성을 갖도록 설계하는 경우에도 64종을 동정할 수 있었다. However, the present invention was able to identify 64 kinds, even if designed to have a homology of 80% or less between each probe.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. And in more details below the present invention through the embodiments. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. However, these examples are not intended to be in the range of the present invention are for the purpose of illustrating the invention by way of example only to the examples.

실시예 1 Example 1

71종의 박테리아를 동정할 수 있는 프로브 세트의 설계 The design of the probe sets that can be identified 71 species of bacteria

본 실시예에서는 표 1과 같은 패혈증 유발과 관련된 박테리아 37종(1~37번)과 혈액 배양시 오염 또는 균혈증(bacteremia) 유발과 관련된 박테리아 34종(38~71번)을 포함하는 총 71종의 박테리아를 대상으로 상기 박테리아들을 동정할 수 있는 프로브 세트를 설계하고자 하였다. In this embodiment, a total of 71 species, including bacteria 37 kinds of (1 to 37) and blood cultures when bacteria 34 species (38-71 times) related contamination or bacteremia (bacteremia) causes associated with sepsis-induced, such as Table 1 It was to design a probe set capable of identifying said bacterial target bacteria.

먼저, 상기 71개의 표적 종들의 한 보존 서열인 16S rRNA 부위 서열을 비교하여, 동일 그룹의 폴리뉴클레오티드에 대해서 100%의 상동성 및 다른 그룹의 폴리뉴클레오티드에 대해서 80% 이하의 상동성을 갖고 18~25 bp의 폴리뉴클레오티를 포함하는 그룹들끼리 그룹화하고, 상기 각 폴리뉴클레오티드를 각 그룹의 프로브로 선택하였다. First, as compared to a conserved sequence in 16S rRNA region sequences of the 71 target species, have a homology of 80% or less with respect to the homology, and polynucleotides of the other groups of 100% with respect to the polynucleotides of the same group of 18 to group among the group comprising the poly-nucleotide T of 25 bp, which was selected for each of the polynucleotides with a probe of each group. 각 종의 16S rRNA 서열은 균주에 따라 다양할 수 있으며, 공지의 서열 데이터베이스 예컨대, GenBank로부터 용이하게 입수할 수 있다. 16S rRNA sequence of each species can vary depending on the strain, there can easily be obtained from sequence databases, for example, GenBank known. 그 서열의 예를 표 1에 GenBank 등록번호로 나타내었다. An example of the sequence in Table 1 are shown in GenBank Accession Number.

다음으로, 상기 각 그룹의 복수의 종들에 대해 다른 보존 서열인 23S rRNA, sodA, gyrA, groEL 또는 rpoB 부위 서열을 독립적으로 비교하여, 동일 종의 폴리뉴클레오티드에 대해서 100%의 상동성 및 다른 종의 폴리뉴클레오티드에 대해서 80% 이하의 상동성을 갖고 18~25 bp의 폴리뉴클레오티를 포함하는 그룹들끼리 그룹화하였다. Next, the for a plurality of species in each group compared to the other conserved sequence of 23S rRNA, sodA, gyrA, groEL or rpoB region sequences independently, of the same species of the same sex and species of a 100% with respect to the polynucleotide It has a homology of 80% or less with respect to polynucleotides were grouped among a group comprising of a 18 ~ 25 bp poly-T nucleotide. 상기 그룹화는 모든 그룹이 하나의 종으로 구성될 때까지 반복 수행하였고, 상기 각 폴리뉴클레오티드를 각 종의 종 특이적 프로브로 선택하였다. The grouping was carried out repeatedly until all groups are composed of one species, were selected for each of the polynucleotides with species-specific probes for each species. 각 종의 상기 보존 서열은 균주에 따라 다양할 수 있으며, 공지의 서열 데이터베이스 예컨대, GenBank로부터 용이하게 입수할 수 있다. Can vary depending on the conserved sequence is a strain of each species, known sequence databases for example, can easily be obtained from GenBank.

상기 과정에 의해 설계된 그룹 프로브 및 종 특이적 프로브의 일부 내용을 표 2에 나타내었다. Portions of the group of probes and species-specific probes designed by the above procedure are shown in Table 2 below. 본 실시예에 의해 그룹 프로브 24개 및 표적 서열 특이적 프로브 56개의 총 80개의 프로브 세트를 설계하였고, 상기 프로브 세트를 사용하면 총 71종의 박테리아 중 패혈증 유발과 관련된 출현 빈도가 낮은 2종( Bacteroides fragilis , Proteus penneri ) 및 균혈증(bacteremia) 유발과 관련된 출현 빈도가 낮 은 5종( Enterococcus gallinarum, Lactobacillus fermentum, Propionibacterium acnes, Corynebacterium jeikeium, Aeromonas hydrophila )을 제외한 64종에 대해 동정할 수 있었다. 24 group probe according to the present embodiment and one target sequence specific probe 56 was designed for a total of 80 probe sets, wherein using the probe set a low frequency of appearance associated with sepsis caused during a total of 71 species of bacteria two kinds (Bacteroides frequency of appearance is less related to fragilis, Proteus penneri) and bacteremia (bacteremia) cause could be identified on the 64 kinds other than the five kinds (Enterococcus gallinarum, Lactobacillus fermentum, Propionibacterium acnes, Corynebacterium jeikeium, Aeromonas hydrophila).

<표 1> <Table 1>

번호 number 종(species) Species (species) 16S rRNA 부위 서열의 GenBank Accession No. 16S rRNA region sequences of GenBank Accession No. 1 One 박테로이데스 프라질리스( Bacteroides fragilis ) Prado Park Des teroyi jilriseu (Bacteroides fragilis) NC_006347 NC_006347 2 2 클로스트리디움 퍼프린젠스( Clostridium perfringens ) Clostridium perfringens (Clostridium perfringens) AB075767 AB075767 3 3 클라미도필라 뉴모니애( Chlamydophila pneumoniae ) Cloud Pillar shown pneumoniae (Chlamydophila pneumoniae) NC_005043 NC_005043 4 4 엔터로박터 에어로제네스( Enterobacter aerogenes ) Enter a bakteo Aero jeneseu (Enterobacter aerogenes) AY186054 AY186054 5 5 엔터로코쿠스 아비움( Enterococcus avium ) Enter Rocco Coos Oh Away (Enterococcus avium) AY442814 AY442814 6 6 엔터로코쿠스 카셀리플라부스( Enterococcus casseliflavus ) Enter Rocco Syracuse Kassel ripple La Booth (Enterococcus casseliflavus) AJ420804 AJ420804 7 7 엔터로박터 클로아캐( Enterobacter cloacae ) Enter a bakteo claw ahkae (Enterobacter cloacae) AY736548 AY736548 8 8 에스케리키아 콜리( Escherichia coli ) Escherichia coli (Escherichia coli) NC_004431 NC_004431 9 9 엔터로코쿠스 두란스( Enterococcus durans ) Enter Rocco Coos two Lance (Enterococcus durans) AY683836 AY683836 10 10 엔터로코쿠스 패시움( Enterococcus faecium ) Enter Lokomotiv kusu passive help (Enterococcus faecium) AY723748 AY723748 11 11 엔터로코쿠스 패칼리스( Enterococcus faecalis ) Enter Lokomotiv kusu faecalis (Enterococcus faecalis) NC_004668 NC_004668 12 12 엔터로코쿠스 라피노수스( Enterococcus raffinosus ) Enter Lokomotiv kusu raffinose Versus (Enterococcus raffinosus) AJ301838 AJ301838 13 13 엔터로박터 사카자키( Enterobacter sakazakii ) Enter a bakteo sakajaki (Enterobacter sakazakii) AY702097 AY702097 14 14 해모필루스 인플루엔재( Haemophilus influenzae ) To a brush loose influenza material (Haemophilus influenzae) NC_000907 NC_000907 15 15 클레브시엘라 옥시토카( Klebsiella oxytoca ) Klebsiella oxy cytokines (Klebsiella oxytoca) AJ630270 AJ630270 16 16 클레브시엘라 뉴모니애( Klebsiella pneumoniae ) Klebsiella pneumoniae (Klebsiella pneumoniae) AY736552 AY736552 17 17 리스테리아 모노시토제네스( Listeria monocytogenes ) L. monocytogenes cytokines jeneseu (Listeria monocytogenes) NC_002973 NC_002973 18 18 미코박테리움 아비움( Mycobacterium avium ) Mycobacterium Oh Away (Mycobacterium avium) X74495 X74495 19 19 미코박테리움 투베르쿨로시스( Mycobacterium tuberculosis ) Mycobacterium tuberculosis cool-to-Bercy (Mycobacterium tuberculosis) AJ536031 AJ536031

<표 1(계속)> <Table 1 (continued)>

번호 number 종(species) Species (species) 16S rRNA 부위 서열의 GenBank Accession No. 16S rRNA region sequences of GenBank Accession No. 20 20 네이세리아 고노르호애( Neisseria gonorrhoeae ) Nathan ceria and Nord hoae (Neisseria gonorrhoeae) AF398329 AF398329 21 21 네이세리아 메닌기티디스( Neisseria meningitidis ) Nathan Serie menin giti display (Neisseria meningitidis) AY573194 AY573194 22 22 슈도모나스 에어루지노사( Pseudomonas aeruginosa ) Pseudomonas air Rouge labor (Pseudomonas aeruginosa) AY631058 AY631058 23 23 프로테우스 미라빌리스( Proteus mirabilis ) Proteus Billy's Mum (Proteus mirabilis) AJ605736 AJ605736 24 24 프로테우스 페네리( Proteus penneri ) Tenerife Tenerife Proteus (Proteus penneri) AJ634474 AJ634474 25 25 프로테우스 불가리스( Proteus vulgaris ) Proteus vulgaris (Proteus vulgaris) AY186048 AY186048 26 26 리케트시아 리케트시( Rickettsia rickettsii ) Li Li blankets cyano blankets during (Rickettsia rickettsii) AY573599 AY573599 27 27 스트렙토코쿠스 아갈락티애( Streptococcus agalactiae ) Streptococcus Agar Rock tiae (Streptococcus agalactiae) NC_004116 NC_004116 28 28 스타필로코쿠스 아우레우스( Staphylococcus aureus ) Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) NC_002952 NC_002952 29 29 스트렙토코쿠스 보비스( Streptococcus bovis ) Vorbis streptococcus (Streptococcus bovis) AY327523 AY327523 30 30 살모넬라 엔터리티디스( Salmonella enteritidis ) Salmonella Enterprise Disk utility (Salmonella enteritidis) AY186056 AY186056 31 31 스타필로코쿠스 에피더미디스( Staphylococcus epidermidis ) Staphylococcus epidermidis (Staphylococcus epidermidis) AY728198 AY728198 32 32 세라티아 마세센스( Serratia Serratia Wu Senses (Serratia marcescens ) marcescens) AY730005 AY730005 33 33 스트렙토코쿠스 미티스( Streptococcus mitis ) Streptococcus US Tees (Streptococcus mitis) AY005045 AY005045 34 34 스트렙토코쿠스 뉴모니애( Streptococcus pneumoniae ) Streptococcus pneumoniae (Streptococcus pneumoniae) NC_003098 NC_003098 35 35 스트렙토코쿠스 피오제네스( Streptococcus pyogenes ) Streptococcus Pio jeneseu (Streptococcus pyogenes) NC_004070 NC_004070 36 36 살모넬라 티피( Salmonella typhi ) Salmonella typhimurium (Salmonella typhi) Z47544 Z47544 37 37 예르시니아 엔터로콜리티카( Yersinia enterocolitica ) For reusi coli urticae in California Enter (Yersinia enterocolitica) AJ639645 AJ639645

<표 1(계속)> <Table 1 (continued)>

번호 number 종(species) Species (species) 16S rRNA 부위 서열의 GenBank Accession No. 16S rRNA region sequences of GenBank Accession No. 38 38 아시네토박터 바우마니( Acinetobacter baumannii ) Acinetobacter baumannii (Acinetobacter baumannii) Z93435 Z93435 39 39 아시네토박터 칼코아세티쿠스( Acinetobacter calcoaceticus ) Acinetobacter knife core Shetty kusu (Acinetobacter calcoaceticus) AY800383 AY800383 40 40 에어로모나스 히드로필라( Aeromonas hydrophila ) Pseudomonas aero dihydro pillar (Aeromonas hydrophila) AB182089 AB182089 41 41 아시네토박터 로피( Acinetobacter lwoffii ) Acinetobacter ropi (Acinetobacter lwoffii) Z93441 Z93441 42 42 코리네박테리움 디프테리애( Corynebacterium diphtheriae ) Ke Corynebacterium deep Terry (Corynebacterium diphtheriae) BX248357 BX248357 43 43 시트로박터 프레운디( Citrobacter freundii ) A seat frame bakteo undi (Citrobacter freundii) AB182200 AB182200 44 44 카디오박테리움 호미니스( Cardiobacterium hominis ) Cardio fitness hoe tumefaciens (Cardiobacterium hominis) AY360343 AY360343 45 45 코리네박테리움 제이케윰( Corynebacterium jeikeium ) Corynebacterium claim ike ium (Corynebacterium jeikeium) X84250 X84250 46 46 캄필로박터 제주니( Campylobacter jejuni ) Campylobacter your Jeju (Campylobacter jejuni) AY830883 AY830883 47 47 엔터로코쿠스 갈리나룸( Enterococcus gallinarum ) Enter Rocco Syracuse Galina Room (Enterococcus gallinarum) AY346316 AY346316 48 48 푸소박테리움 누클레아툼( Fusobacterium nucleatum ) Fu Te earthy Solarium press Cle Atum (Fusobacterium nucleatum) AJ810282 AJ810282 49 49 해모필러스 아프로필러스( Haemophilus aphrophilus ) To a brush Russ Russ O profile (Haemophilus aphrophilus) AY362906 AY362906 50 50 해모필러스 파라인플루엔재( Haemophilus parainfluenzae ) To a brush Russ para influenza material (Haemophilus parainfluenzae) AY362908 AY362908 51 51 락토바실러스 퍼멘텀( Lactobacillus fermentum ) Lactobacillus momentum spread (Lactobacillus fermentum) AJ617543 AJ617543 52 52 마이크로코쿠스 루테우스( Micorococcus luteus ) Microcode Syracuse Lou Proteus (Micorococcus luteus) AB182215 AB182215 53 53 모가넬라 모가니( Morganella morganii ) Nella Mo Mo going (Morganella morganii) AB182240 AB182240 54 54 프로피오니박테리움 아크네스( Propionibacterium PROFIBUS sludge tumefaciens arc Ness (Propionibacterium acnes ) acnes) AF076032 AF076032 55 55 슈도모나스 플루오레센스( Pseudomonas fluorescens ) Pseudomonas fluorescein sense (Pseudomonas fluorescens) NC_005043 NC_005043 56 56 슈도모나스 푸티다( Pseudomanas putida ) The footage Pseudomonas (Pseudomanas putida) AY789573 AY789573 57 57 스타필로코쿠스 카피티스( Staphylococcus capitis ) Staphylococcus copy Tees (Staphylococcus capitis) AY688039 AY688039 58 58 스타필로코쿠스 코흐니( Staphylococcus cohnii ) Staphylococcus your Koch (Staphylococcus cohnii) AJ717378 AJ717378

<표 1(계속)> <Table 1 (continued)>

번호 number 종(species) Species (species) 16S rRNA 부위 서열의 GenBank Accession No. 16S rRNA region sequences of GenBank Accession No. 59 59 스타필로코쿠스 해모리티쿠스( Staphylococcus haemolyticus ) Staphylococcus Mori's Tea Syracuse (Staphylococcus haemolyticus) AY688062 AY688062 60 60 스타필로코쿠스 호미니스( Staphylococcus hominis ) Staphylococcus hoe Nice (Staphylococcus hominis) AJ717375 AJ717375 61 61 스트렙토코쿠스 인터메디우스( Streptococcus intermedius ) Streptococcus inter Medi-house (Streptococcus intermedius) Z69040 Z69040 62 62 스테토트로포모나스 말토필리아( Stenotrophomonas maltophilia ) Stephen sat troponin Monastir malto pilriah (Stenotrophomonas maltophilia) AY826621 AY826621 63 63 스트렙토코쿠스 오랄리스( Streptococcus oralis ) Streptococcus oral less (Streptococcus oralis) AY281080 AY281080 64 64 스트렙토코쿠스 살리바리우스( Streptococcus salivarius ) Streptococcus salivarius (Streptococcus salivarius) AY669233 AY669233 65 65 스트렙토코쿠스 산귀니스( Streptococcus sanguinis ) Streptococcus sangwi varnish (Streptococcus sanguinis) AY691542 AY691542 66 66 스타필로코쿠스 사프로피티쿠스( Staphylococcus saprophyticus ) Staphylococcus four Pro repetition kusu (Staphylococcus saprophyticus) AY688090 AY688090 67 67 스타필로코쿠스 시물란스( Staphylococcus simulans ) Staphylococcus simul Lance (Staphylococcus simulans) AY688101 AY688101 68 68 살모넬라 티피무리움( Salmonella typhimurium ) Salmonella typhimurium (Salmonella typhimurium) NC_003197 NC_003197 69 69 스트렙토코쿠스 베스티불라리스( Streptococcus vestibularis ) Streptococcus Betsy ing less (Streptococcus vestibularis) AY581143 AY581143 70 70 스타필로코쿠스 와네리( Staphylococcus warneri ) Staphylococcus and Tenerife (Staphylococcus warneri) AY688106 AY688106 71 71 스타필로코쿠스 자일로서스( Staphylococcus xylosus ) Staphylococcus Giles in Saskatchewan (Staphylococcus xylosus) AY688109 AY688109

<표 2> <Table 2>

그룹 group 그룹 프로브 서열 Group probe sequence 그룹의 해당 종 That kind of group 종 특이적 프로브 서열 Species-specific probe sequence 서열번호 1 SEQ ID NO: 1 Cardiobacterium hominis Cardiobacterium hominis 서열번호 14 SEQ ID NO: 14 II II 서열번호 2 SEQ ID NO: 2 Enterobacter aerogenes Escherichia coli Enterobacter sakazakii Salmonella typhimurium Salmonella typhi Morganella morganii Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Proteus vulgaris Streptococcus intermedius Salmonella enteritidis Yersinia enterocolitica Enterobacter aerogenes Escherichia coli Enterobacter sakazakii Salmonella typhimurium Salmonella typhi Morganella morganii Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Proteus vulgaris Streptococcus intermedius Salmonella enteritidis Yersinia enterocolitica 서열번호 15 서열번호 16 서열번호 17 서열번호 18 서열번호 19 서열번호 20 서열번호 21 서열번호 22 서열번호 23 서열번호 24 서열번호 25 서열번호 26 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26 III III 서열번호 3 SEQ ID NO: 3 Pseudomonas fluorescens Pseudomonas putida Pseudomonas fluorescens Pseudomonas putida 서열번호 27 서열번호 28 SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 28 IV IV 서열번호 4 SEQ ID NO: 4 Acinetobacter baumannii cinetobacter calcoaceticus Acinetobacter lwoffii Acinetobacter baumannii cinetobacter calcoaceticus Acinetobacter lwoffii 서열번호 29 서열번호 30 서열번호 31 SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 31 V V 서열번호 5 SEQ ID NO: 5 Haemophilus aphrophilus Haemophilus influenzae Haemophilus influenzae Haemophilus aphrophilus 서열번호 32 서열번호 33 SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33 VI VI 서열번호 6 SEQ ID NO: 6 Enterobacter cloacae Klebsiella oxytoca Enterobacter cloacae Klebsiella oxytoca 서열번호 34 서열번호 35 SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 35

<표 2(계속)> <Table 2 (continued)>

그룹 group 그룹 프로브 서열 Group probe sequence 그룹의 해당 종 That kind of group 종 특이적 프로브 서열 Species-specific probe sequence VII VII 서열번호 7 SEQ ID NO: 7 Aeromonas Aeromonas hydrophila hydrophila 서열번호 36 SEQ ID NO: 36 VIII VIII 서열번호 8 SEQ ID NO: 8 Mycobacterium avium ycobacterium tuberculosis Mycobacterium avium ycobacterium tuberculosis 서열번호 37 서열번호 38 SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 38 IX IX 서열번호 9 SEQ ID NO: 9 Neisseria Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitides Stenotrophomonas gonorrhoeae Neisseria meningitides Stenotrophomonas maltophilia maltophilia 서열번호 39 서열번호 40 서열번호 41 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 40 SEQ ID NO: 41 X X 서열번호 10 SEQ ID NO: 10 Streptococcus bovis Streptococcus mitis Streptococcus pyogenes Streptococcus bovis Streptococcus mitis Streptococcus pyogenes 서열번호 42 서열번호 43 서열번호 44 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44 XI XI 서열번호 11 SEQ ID NO: 11 Staphylococcus aureus Staphylococcus capitis Staphylococcus cohnii Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus hominis Staphylococcus simulans Staphylococcus warneri Staphylococcus xylosus Staphylococcus aureus Staphylococcus capitis Staphylococcus cohnii Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus hominis Staphylococcus simulans Staphylococcus warneri Staphylococcus xylosus 서열번호 45 서열번호 46 서열번호 47 서열번호 48 서열번호 49 서열번호 50 서열번호 51 서열번호 52 서열번호 53 서열번호 54 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO: 47 SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 50 SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 53 SEQ ID NO: 54

<표 2(계속)> <Table 2 (continued)>

그룹 group 그룹 프로브 서열 Group probe sequence 그룹의 해당 종 That kind of group 종 특이적 프로브 서열 Species-specific probe sequence XII XII 서열번호 12 SEQ ID NO: 12 Enterococcus avium Enterococcus durans Enterococcus faecalis Enterococcus raffinosus Enterococcus avium Enterococcus durans Enterococcus faecalis Enterococcus raffinosus 서열번호 55 서열번호 56 서열번호 57 서열번호 58 SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 57 SEQ ID NO: 58 XIII XIII 서열번호 13 SEQ ID NO: 13 Streptococcus mitis Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae Streptococcus oralis Streptococcus pneumoniae Streptococcus salivarius Streptococcus sanguinis Septococcus vestibularis Streptococcus mitis Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae Streptococcus oralis Streptococcus pneumoniae Streptococcus salivarius Streptococcus sanguinis Septococcus vestibularis 서열번호 59 서열번호 60 서열번호 61 서열번호 62 서열번호 63 서열번호 64 서열번호 65 서열번호 66 SEQ ID NO: 59 SEQ ID NO: 60 SEQ ID NO: 61 SEQ ID NO: 62 SEQ ID NO: 63 SEQ ID NO: 64 SEQ ID NO: 65 SEQ ID NO: 66

본 발명에 따르면, 많은 수의 표적 서열들을 신속하게 동정할 수 있고 2종 이상의 표적 서열이 동시에 출현하더라도 정확하게 동정할 수 있는 프로브 세트를 용이하게 설계할 수 있다. According to the invention, it is possible to quickly identify a large number of target sequences can be readily designed a probe set that has two or more target sequences can be accurately identified even appearance at the same time.

서열목록 전자파일 첨부 List of electronic file attachment sequence

Claims (11)

  1. a) 복수의 표적 서열들의 하나의 보존 서열(consensus sequnece)을 비교하여, 상기 하나의 보존 서열에 포함되어 있는 일정 기준을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 표적 서열들끼리 각각 그룹화하는 단계; the method comprising: a) as compared to a conserved sequence of a plurality of target sequence (consensus sequnece), each grouping together the target sequence comprising a polynucleotide having a predetermined reference corresponding to the at least one conserved sequence;
    b) 상기 a) 단계의 그룹들 중 하나의 표적 서열로 구성된 그룹의 경우, 상기 일정 기준을 갖는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 표적 서열 특이적 프로브(target sequence specific probe)로 선택하는 단계; b) selecting in step a), if the group of one of the target sequences of the groups of steps, oligonucleotide specific probe (target sequence specific probe the nucleotide target sequence specifically binding to a polynucleotide having the predetermined standard) step;
    c) 상기 a) 단계의 그룹들 중 2 이상의 표적 서열로 구성된 그룹의 경우, 상기 일정 기준을 갖는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 각 그룹의 그룹 프로브(group probe)로 선택하는 단계; c) wherein a) in the case of the group consisting of a group of two or more target sequences of the phase oligonucleotide that specifically binds to a polynucleotide having the predetermined reference select the nucleotides in Group Probe (group probe) in each group; And
    d) 상기 a) 단계의 그룹들 중 2 이상의 표적 서열로 구성된 그룹의 경우, 상기 2 이상의 표적 서열로 구성된 각 그룹의 복수의 표적 서열들의 다른 보존 서열에 대하여 2 이상의 표적 서열로 구성된 그룹이 존재하지 않을 때까지 상기 a) 단계 내지 c) 단계를 반복하는 단계;를 포함하는 표적 서열의 동정에 사용되는 프로브 세트를 설계하는 방법. d) wherein a) in the case of the group consisting of a group of two or more target sequences of the step, a group of two or more of the target sequence relative to the other conserved sequence of a plurality of target sequences in each group of the target sequence the two or more exists, method of designing a probe set for use in the identification of a target sequence comprising; not until the step of repeating the step a) to step c).
  2. 제 1항에 있어서, According to claim 1,
    상기 일정 기준은 서열 상동성, 염기 길이, 혼성화 융점(Tm), 혼성화 융점 차이(ΔTm), GC 함량, 자기 정렬(self-alignment), 변이 위치, 반복서열 정도 및 3' 말단의 염기 구성으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법. The constant reference has been made to sequence homology, base length, the hybridization melting temperature (Tm), the hybridization melting temperature differences (ΔTm), GC content, and self-assembly (self-alignment), mutation location, repeat sequences and the degree of the 3 'base structure of the terminal characterized in that at least one selected from the group.
  3. 제 1항에 있어서, According to claim 1,
    상기 일정 기준은 동일 그룹의 폴리뉴클레오티드에 대해서 100%의 상동성 및 다른 그룹의 폴리뉴클레오티드에 대해서 90% 이하의 상동성인 것을 특징으로 하는 방법. The predetermined criteria wherein the homology of 90% or less with respect to 100% homology and the other group of the polynucleotide with respect to polynucleotides of the same group.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 보존 서열은 16S rRNA, 23S rRNA, sodA (superoxide dismutase subunit A), gyrA (DNA gyrase subunit A), groEL (groEL protein coding region) 및 rpoB (DNA-directed RNA polymerase beta chain protein)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1 wherein the conserved sequence is 16S rRNA, 23S rRNA, sodA (superoxide dismutase subunit A), gyrA (DNA gyrase subunit A), groEL (groEL protein coding region) and rpoB (DNA-directed RNA polymerase beta chain protein ) as wherein is selected from the group consisting.
  5. 제 1항의 방법에 따라 설계된 프로브 세트. The probe set designed in accordance with the method of claim 1.
  6. 제 5항의 프로브 세트가 기판 상에 고정화 되어 있는 것을 특징으로 하는 표적 서열 동정용 마이크로어레이. Article of Claim 5 is the probe set is immobilized on the substrate target microarray for sequence identification, characterized in that.
  7. 제 6항에 있어서, 7. The method of claim 6,
    상기 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L--sine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것을 특징으로 하는 마이크로어레이. Wherein the substrate is an amino-silane (amino-silane), poly -L- lysine (poly-L-sine) and aldehyde microarray, characterized in that the activator is coated is selected from the group consisting of (aldehyde).
  8. 제 6항에 있어서, 7. The method of claim 6,
    상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이. Wherein the substrate is a microarray, wherein is selected from the group consisting of a silicon wafer, glass, quartz, metals and plastics.
  9. 제 1항에 따른 방법을 컴퓨터가 수행할 수 있도록 하는 프로그램을 기록한, ROM, RAM, CD-ROM, 자기 테이프, 플로피 디스크 및 광데이터 저장장치로 이루어진 군으로부터 선택된 컴퓨터 판독가능한 매체. The recording a program that allows the method according to one of the preceding claims, the computer may perform, ROM, RAM, CD-ROM, magnetic tape, computer-readable medium selected from the group consisting of a floppy disk, and optical data storage devices.
  10. 제 5항의 프로브 세트를 이용하여 표적 서열을 동정하는 방법. The method for identifying a target sequence using the probe set of Claim 5.
  11. 제 10항에 있어서, 11. The method of claim 10,
    상기 방법은 The method
    a) 제 6항에 따른 마이크로어레이에 표적 서열을 포함하는 반응 시료를 적용하는 단계; a) a microarray according to claim 6 wherein the step of applying the reaction samples containing the target sequence;
    b) 프로브와 표적 서열을 혼성화시키는 단계; b) step of hybridization of the probe and the target sequence;
    c) 비특이적 반응을 제거하기 위해 세척하는 단계; c) the step of washing to remove non-specific reaction; And
    d) 하이브리드 형성에 의한 형광 시그널을 검출하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. Characterized in that it comprises a; d) detecting the fluorescent signal by the hybrid formation.
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