KR100737230B1 - Biosensor for Detection of ?-estradiol Having Anti-?-estradiol Antiserum and Detecting Process of ?-estradiol - Google Patents

Biosensor for Detection of ?-estradiol Having Anti-?-estradiol Antiserum and Detecting Process of ?-estradiol Download PDF

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Abstract

본 발명은 천연 여성호르몬 중의 하나인 베타에스트라디올(β-estradiol)을 검출하기 위한 항-베타에스트라디올 항혈청(anti-β-estradiol antiserum)을 포함하는 베타에스트라디올 검출용 바이오센서 및 베타에스트라디올 검출방법에 관한 것으로, 베타에스트라디올과 단백질의 결합체로 면역반응시킨 마우스로부터 분리된 항-베타에스트라디올 항혈청을 포함하는 베타에스트라디올 검출용 바이오센서 및 베타에스트라디올과 단백질의 결합체를 제조하는 단계; 상기 결합체를 마우스에 주사하여 면역반응시켜 항-베타에스트라디올 항혈청을 제조하는 단계; 그리고 상기 항-베타에스트라디올 항혈청과 베타에스트라디올이 포함된 해양유기오염물질을 항원 항체 반응시키는 단계를 포함하는 베타에스트라디올 검출 방법에 의하는 경우, 고가의 장비를 필요로 하는 해양유기오염물질의 화학적인 분석에 있어서 베타에스트라디올과 같은 천연 여성호르몬이 포함되어 있는지 여부를 정확하고 간단하게 확인할 수 있는 효과가 있다. The present invention is a biosensor for detecting beta estradiol and beta estradiol including anti-beta-estradiol antiserum for detecting beta estradiol, which is one of natural female hormones. A method comprising: preparing a biosensor for detecting betaestradiol and a combination of betaestradiol and a protein comprising an anti-betaestradiol antiserum isolated from a mouse immunized with a conjugate of betaestradiol and a protein; Preparing an anti-betaestradiol antiserum by injecting the conjugate into a mouse and immunoreacting it; And when the beta estradiol detection method comprising the step of antigen-antibody reaction of the anti-beta estradiol anti-serum and marine organic pollutants containing beta estradiol, the marine organic pollutants requiring expensive equipment In chemical analysis, it is possible to accurately and simply determine whether natural female hormones such as beta estradiol are included.

베타에스트라디올, 바이오센서, 항원 항체 반응 Betaestradiol, biosensor, antigen antibody response

Description

항-베타에스트라디올 항혈청을 포함하는 베타에스트라디올 검출용 바이오센서 및 베타에스트라디올 검출방법{Biosensor for Detection of β-estradiol Having Anti-β-estradiol Antiserum and Detecting Process of β-estradiol}Biosensor for detection of β-estradiol Having Anti-β-estradiol Antiserum and Detecting Process of β-estradiol for detecting beta estradiol containing anti-beta estradiol antiserum

도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)를 이용하여 항-베타에스트라디올 항혈청(anti-β-estradiol antiserum)의 역가 변화를 측정한 그래프이고,1 is a graph measuring the titer change of anti-beta-estradiol antiserum using an Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) according to a preferred embodiment of the present invention.

도 2는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 ELISA를 이용하여 항-베타에스트라디올 항혈청의 발색도를 측정한 결과도이다.Figure 2 is a result of measuring the color development of anti-beta estradiol antiserum using an ELISA according to an embodiment of the present invention.

본 발명은 베타에스트라디올(β-estradiol)을 검출하기 위한 바이오센서에 관한 것으로 특히, 항-베타에스트라디올 항혈청(Anti-β-estradiol Antiserum)을 포함하는 베타에스트라디올 검출용 바이오센서 및 베타에스트라디올 검출방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 베타에스트라디올과 단백질의 결합체로 면역반응시킨 마우스로부터 분리된 항-베타에스트라디올 항혈청을 항원 항체반응을 이용하여 베타에스트라디올을 검출하는 것이다. The present invention relates to a biosensor for detecting beta estradiol, and in particular, a biosensor and beta estradiol for detecting beta estradiol, including anti-beta-estradiol antiserum. It relates to a detection method. More specifically, anti-beta estradiol antisera isolated from mice immunized with a combination of beta estradiol and protein is used to detect beta estradiol using an antigen antibody response.

오늘날 해양수계는 가정과 산업체로부터 배출되는 인공합성 화학물질과 오폐수로 인해 수중 생태계 그 존재 자체가 위협받고 있다. 이에 세계 각국에서는 수중 환경에 존재하는 환경오염물질의 현황과 이를 관리하기 위한 다양한 기술적 방법과 제도적 장치를 마련하고 있다. In today's oceans, the presence of aquatic ecosystems is threatened by synthetic synthetic chemicals and wastewater from households and industries. Accordingly, countries around the world are preparing the present situation of environmental pollutants in the aquatic environment and various technical methods and institutional devices for managing them.

국내에서 환경오염물질을 검출할 수 있는 바이오센서의 개발은 수질 모니터링, 토양독성 모니터링, 가스독성 모니터링 등을 위해 연구되고 있다. 특히 생물학적인 바이오센서로는 물벼룩, 해조류, 어류 등을 이용하는 방법과, 대장균, 바실러스, 슈도모나스, 살모넬라 등의 미생물에서 비롯된 유전자 재조합 미생물을 이용하는 방법 등이 주를 이루고 있다. 이중에서 물벼룩, 해조류, 어류 등을 이용하는 방법은 생물체의 유지, 보관 등의 문제로 인하여 일회용 탐지기능만을 제공할 수밖에 없다는 단점이 있다. 한편, 유전자 재조합 미생물을 이용하는 방법에 있어서는 현재까지 생물학적 빛(bioluminescence)와 녹색형광(green fluorescence)을 표지유전자로 사용하는 연구가 활발히 진행 중에 있다. 그리고, 최근에는 DNA 칩을 이용한 마이크로어레이(microarray) 기법도 적용되고 있다.The development of biosensors that can detect environmental pollutants in Korea is being studied for water quality monitoring, soil toxicity monitoring, and gas toxicity monitoring. In particular, biological biosensors include water fleas, seaweeds, fish, and the like, and methods using recombinant microorganisms derived from microorganisms such as Escherichia coli, Bacillus, Pseudomonas, and Salmonella. Among them, the method of using water fleas, algae, fish, etc. has a disadvantage in that it can only provide a single detection function due to problems such as maintenance and storage of living organisms. On the other hand, in the method of using a recombinant microorganism, studies using biological light (bioluminescence) and green fluorescence (green fluorescence) as marker genes are actively underway. Recently, microarray techniques using DNA chips have also been applied.

그러나, 해양유기오염물질 연구를 위한 박테리아 DNA 칩(bacterial DNA chip)의 개 발과 이러한 박테리아 유전자와 형광 또는 발광 유전자를 이용한 바이오센서 개발 연구가 최근에 이루어지고 있다고는 하지만, 실질적으로 현장에서 ng 또는 pg 수준으로 해양유기오염물질를 검출할 수 있는 바이오센서는 아직까지 개발되지 않고 있는 실정이다. 또한, 지금까지의 해양유기오염물질에 관한 연구는 담수를 중심으로하는 유기오염물질의 생태위해성 평가기법 및 이에 대한 모니터링만이 주로 이루어지고 있으며, 해양을 대상으로 하는 연구는 거의 이루어지지 않고 있는 실정이다. However, although the development of bacterial DNA chips for marine organic pollutants and the development of biosensors using these bacterial genes and fluorescence or luminescence genes have been recently conducted, practically in situ ng or Biosensors capable of detecting marine organic pollutants at pg levels have not yet been developed. In addition, the research on marine organic pollutants until now is mainly conducted on the ecological risk assessment technique and monitoring of organic pollutants centered on fresh water, and the research on marine organic pollutants is rarely conducted. to be.

이와 같은 종래의 해양유기오염물질의 연구는 복잡한 시료 전처리 외에도 HPLC, FPLC 또는 GC-MS 등의 분석방법이 이용되었으나 고가의 장비와 인력, 그리고 많은 분석비 요구가 단점으로 지적되어 왔다. 따라서 해양유기오염물질을 손쉽고 빠르게 검출할 수 있는 바이오센서의 개발은 반정량적으로 대량의 시료를 스크리닝할 수 있어, 화학적인 분석의 비용을 절감하고 처리 시료를 늘릴 수 있는 중요한 기술로 인식되고 있다.The conventional marine organic contaminants have been analyzed by HPLC, FPLC, or GC-MS in addition to complex sample preparation. However, it has been pointed out that expensive equipment, manpower, and a lot of analysis costs are required. Therefore, the development of biosensors that can detect marine organic pollutants easily and quickly is recognized as an important technology to reduce the cost of chemical analysis and increase the number of processed samples because it can screen large quantities of samples semi-quantitatively.

현재, 해양유기오염물질 검출에 관한 일부 분자생물학적 연구가 시작되었으나 면역학적 정성 정량에 대한 연구가 부분적으로만 이루어지고 있을 뿐이며(Szekacs, et.al., 1999; Dickert, et.al., 2000; Kim, et.al., 2001; Scharnweber, et.al., 2001; Lee, et. al., 2002), 이것들도 주로 ELISA에 의한 분석 및 Molecular imprints, 단클론 항체 개발 등의 연구에 관한 것이 전부이다. SDI(Newark, DE)나 Biosense Co. 등의 회사에 의해 일부가 상품화되기도 했지만, 이들에 의해 시판되 고 있는 키트는 주로 모든 종류의 광범위한 유기오염물질에 동시에 작용하는 것으로, 이를 사용해서는 유기오염물질 중에 구체적으로 어떤 성분이 들어있는지를 정확히 알 수 없다는 문제점이 있다. Currently, some molecular biological studies on marine organic pollutants have been initiated, but only a few studies on immunological qualitative quantification (Szekacs, et.al., 1999; Dickert, et.al., 2000; Kim, et.al., 2001; Scharnweber, et.al., 2001; Lee, et. Al., 2002), and these are mainly related to the analysis by ELISA, the study of Molecular imprints, and the development of monoclonal antibodies. . SDI (Newark, DE) or Biosense Co. Although some have been commercialized by other companies, such kits are commercially available and work on a wide range of organic pollutants at the same time. There is a problem that unknown.

현재 독소를 비롯한 각종 유해물질의 신속한 검출 방법으로 가장 많이 사용하고 있는 것이 항원-항체 이용법이지만, 이러한 유해물질의 경우 항체를 생산하기가 쉽지 않아, 아직까지 초기단계의 연구만이 이루어져 있는 실정이다. 따라서, 이제는 해양유기오염물질에 들어있는 유해 물질 성분을 구체적으로 특정하여 정확히 검출할 수 있는 기술이 필요하고, 이를 위해서 해양유기오염물질에 들어있는 각 성분에 대한 항체 개발이 요구되고 있는 시점이다. Currently, the antigen-antibody method is most frequently used as a rapid detection method of toxins and other harmful substances. However, these harmful substances are not easy to produce antibodies, and thus only the early stages of research have been made. Therefore, there is a need for a technology that can specifically detect harmful substances contained in marine organic pollutants and accurately detect them, and for this purpose, it is time to develop antibodies for each component of marine organic pollutants.

본 발명은 상술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 항-베타에스트라디올 항혈청(Anti-β-estradiol Antiserum)을 포함하는 베타에스트라디올 검출용 바이오센서 및 베타에스트라디올 검출방법을 제공하기 위한 것이다. 이를 통하여, 고가의 장비를 필요로 하는 해양유기오염물질의 화학적인 분석에 있어서 베타에스트라디올과 같은 천연 여성호르몬이 포함되어 있는지 여부를 정확하고 간단하게 확인하는 것을 본 발명의 목적으로 한다. The present invention has been made to solve the above problems, to provide a biosensor for detecting beta estradiol and anti-beta estradiol detection method comprising an anti-beta- estradiol Antiserum will be. Through this, it is an object of the present invention to accurately and simply determine whether natural female hormones such as beta estradiol are included in the chemical analysis of marine organic pollutants requiring expensive equipment.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 베타에스트라디올(β-estradiol) 검출용 바이오센서는, 베타에스트라디올과 단백질의 결합체로 면역반응시킨 마우스로부터 분리된 항-베타에스트라디올 항혈청(Anti-β-estradiol Antiserum)을 포함하는 것을 특징으로 한다. 여기서, 상기 단백질은 오브알부민(ovalbumin; OVA) 또는 양이온화된 보바인 혈청알부민(cationized bovine serum albumin; cBSA)인 것이 바람직하다. The biosensor for detecting beta estradiol of the present invention for achieving the above object is an anti-beta estradiol antiserum (Anti-β-) isolated from a mouse immunized with a combination of beta estradiol and protein. estradiol Antiserum). Herein, the protein is preferably ovalbumin (OVA) or cationized bovine serum albumin (cBSA).

상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 베타에스트라디올 검출 방법은, 베타에스트라디올과 단백질의 결합체를 제조하는 단계; 상기 결합체를 마우스에 주사하여 면역반응시켜 항-베타에스트라디올 항혈청을 제조하는 단계; 및 상기 항-베타에스트라디올 항혈청과 베타에스트라디올이 포함된 해양유기오염물질을 항원 항체 반응시키는 단계;를 포함한다. 그리고, 여기서 상기 항원 항체 반응시키는 단계는 마이크로 플레이트를 이용한 간접 효소면역측정법(ELISA)이나 상기 간접 효소면역측정법에 의한 발색도를 측정하는 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 베타에스트라디올 검출 방법일 수 있다.Beta estradiol detection method according to the present invention for achieving the above another object, comprising the steps of preparing a conjugate of beta estradiol and protein; Preparing an anti-betaestradiol antiserum by injecting the conjugate into a mouse and immunoreacting it; And antigen-antibody reaction of the marine organic pollutant including the anti-betaestradiol antiserum and betaestradiol. In this case, the step of reacting the antigen antibody may be a beta estradiol detection method using a method of measuring the color development by the indirect enzyme immunoassay (ELISA) using the microplate or the indirect enzyme immunoassay.

이러한 본 발명은 천연 여성호르몬 중의 하나인 베타에스트라디올(β-estradiol)을 검출할 수 있는 바이오센서 및 이를 이용한 해양유기오염물질 검출 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 베타에스트라디올과 같은 해양유기오염물질을 쥐에 주사하여 혈청으로부터 항체를 생산하고, 생산된 항체와 해양유기오염물질 의 반응에 의해 발색되는 정도를 측정함으로써 베타에스트라디올을 검출하는 방법이다.The present invention relates to a biosensor capable of detecting beta estradiol, which is one of natural female hormones, and a method for detecting marine organic pollutants using the same, and more particularly, to marine organic pollution such as beta estradiol. It is a method of detecting beta estradiol by injecting a substance into the mouse to produce an antibody from the serum, and measuring the degree of color development by the reaction of the produced antibody and marine organic pollutants.

베타에스트라디올(β-estradiol)은 척추동물의 암컷의 난소에서 분비되는 스테로이드 호르몬인 에스트라디올의 한 종류로써, 난소·태반 등에서 추출·결정화되는 여포호르몬의 하나이다. 암컷의 생식선을 발달시켜 2차·3차성징을 나타내는데, 특히 포유류에서 발정을 일으킨다. 또한, 세포핵에 들어가 새로운 단백질의 합성을 촉진하고, 세포의 증식을 일으키는 작용이 있다. 특히, 베타에스트라디올은 여성의 몸 안에서 심하게 변동하는 생식호르몬으로, 카페인과 비슷한 작용, 즉 아데노신이 원래부터 가지고 있는 억제효과를 상쇄함으로써, 여성들이 월경 주기 중 여포기 후기, 곧 배란 직전에 경험한다는 가벼운 흥분을 일으키는 물질로 알려져 있다. 또한, 프로락틴분비를 촉진하는 인자(prolactin releasing factor: PRF)로도 사용되고, 종양을 생성·촉진하는 발암물질이라는 연구도 있다. Beta-estradiol (β-estradiol) is a type of estradiol, a steroid hormone secreted from the ovaries of females of vertebrates, and is one of the follicle hormones extracted and crystallized from the ovary and placenta. Female gonads develop to show secondary and tertiary features, especially in mammals, causing estrus. In addition, there is an action to enter the cell nucleus to promote the synthesis of new proteins, causing cell proliferation. In particular, betaestradiol is a severely altered reproductive hormone in a woman's body that counteracts the caffeine-like action, adenosine's original inhibitory effect, suggesting that women experience the late follicular phase, shortly before ovulation, during the menstrual cycle. It is known to cause a mild excitement. In addition, it is also used as a prolactin releasing factor (PRF) and has been studied as a carcinogen that produces and promotes tumors.

본 발명에 따른 베타에스트라디올 검출용 바이오센서는 다음 과정을 거쳐 제작된다. 먼저, 베타에스트라디올과 전달 단백질(carrier protein)과의 결합체 (conjugate)를 제조한다. 전달 단백질로는 오브알부민(ovalbumin; OVA)이나 양이온화된 보바인 혈청알부민(cagtinized bovine serum albumin; cBSA) 등을 사용할 수 있다. 그리고, 이렇게 제조된 cBSA-베타에스트라디올 결합체를 마우스에 피하 및 근육에 주사하여 면역반응시킨 후 혈액을 채취하여 항-베타에스트라디올 항혈청 (Anti-β-estradiol Antiserum)을 분리한다.The biosensor for detecting beta estradiol according to the present invention is produced through the following process. First, a conjugate of beta estradiol and a carrier protein is prepared. Ovalbumin (OVA) or cationized bovine serum albumin (cBSA) may be used as the delivery protein. Then, cBSA-betaestradiol conjugate prepared as described above is injected into the mouse subcutaneously and intramuscularly to immunize, and blood is collected to separate anti-beta-estradiol antiserum (Anti-β-estradiol Antiserum).

이와 같이 cBSA-β-estradiol로 면역반응시킨 쥐로부터 획득한 상기 항-베타에스트라디올 항혈청의 역가를 알아보기 위해, OVA-β-estradiol을 코팅시킨 마이크로역가 플레이트를 이용하여 간접 ELISA를 실시한 결과, 본 발명에 따른 상기 항-베타에스트라디올 항혈청은 결합체로 사용한 cBSA 단백질 또는 OVA 단백질보다 cBSA-β-estradiol과 특이적으로 반응을 하는 것으로 나타났다. 즉, 본 발명에 따른 상기 항-베타에스트라디올 항혈청은 해양유기오염물질의 하나인 베타에스트라디올과 특이적으로 반응하는 것이다.In order to determine the titer of the anti-betaestradiol antiserum obtained from the mice immunized with cBSA-β-estradiol, indirect ELISA was performed using a microtiter plate coated with OVA-β-estradiol. The anti-beta estradiol antiserum according to the invention was shown to react specifically with cBSA-β-estradiol than the cBSA protein or OVA protein used as a conjugate. That is, the anti-beta estradiol antiserum according to the present invention specifically reacts with beta estradiol, one of marine organic pollutants.

또한, 상기한 간접 ELISA 방법에 따라 베타에스트라디올을 포함하는 해양유기오염물질을 기질로 사용하여 발색도를 측정한 경우, 본 발명에 따른 항-베타에스트라디올 항혈청의 베타에스트라디올에 대한 감도 역시 매우 높은 것으로 나타나, 상기 항-베타에스트라디올 항혈청을 현장에서 적용하였을 때, 베타에스트라디올과 단백질 결합체를 약 0.015 ng의 농도까지 효과적으로 감지할 수 있는 것으로 확인되었다.In addition, when the color development was measured using a marine organic pollutant containing beta estradiol as a substrate according to the indirect ELISA method, the sensitivity of the anti-beta estradiol antiserum to beta estradiol according to the present invention is also very high. When the anti-beta estradiol antiserum was applied in situ, it was confirmed that the beta estradiol and protein conjugate can be effectively detected up to a concentration of about 0.015 ng.

이하에서는 본 발명의 바람직한 하나의 실시형태를 첨부된 도면을 참고로 하여 구체적으로 설명한다. 본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이고, 첨부된 특허청구 범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. Hereinafter, one preferred embodiment of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. The invention can be better understood by the following examples, which are intended for the purpose of illustration of the invention and are not intended to limit the scope of protection defined by the appended claims.

실시예Example 1: 베타에스트라디올(β-estradiol)-단백질 결합체(conjugate)의 제조 1: Preparation of β-estradiol-protein conjugate

정제된 베타에스트라디올은 Sigma에서 구입하였으며, 단백질과의 결합은 결합 키트(ImjectR　PharmaLinkTM Immunogen kit, Pierce)를 사용하였다. 즉, 전달 단백질(carrier protein)로 사용될 양이온화된 보바인 혈청알부민(cationized bovine serum albumin; cBSA)과 오브알부민(ovalbumin; OVA)을 10 ㎎/㎖의 농도가 되도록 증류수에 녹이고, 베타에스트라디올은 결합 완충액(conjugation buffer; 0.1 M MES, 0.15 M NaCl, pH 4.7)에 0.5 ㎎/㎖의 농도가 되도록 준비하였다. Purified betaestradiol was purchased from Sigma, and binding to protein was performed using a binding kit (Imject).RPharmalinkTM Immunogen kit, Pierce) was used. That is, cationized bovine serum albumin (cBSA) and ovalbumin (OVA), which are to be used as carrier proteins, are dissolved in distilled water to a concentration of 10 mg / ml, and beta estradiol A concentration of 0.5 mg / ml was prepared in conjugation buffer (0.1 M MES, 0.15 M NaCl, pH 4.7).

결합(conjugation)을 위하여 500 ㎕의 베타에스트라디올과 200 ㎕의 전달 단백질 용액을 혼합한 후, 50 ㎕의 커플링 용액을 첨가하여 실온에서 2 시간 동안 결합 반응을 수행하였다. 반응 중에 약간의 침전물이 형성되기는 하였으나 침전물은 원심 분리하여 제거하였다. 반응이 끝난 후 결합이 되지 않은 베타에스트라디올과 전달 단백질 용액에 남아 있는 EDTA는 탈염 컬럼(D-SaltTM desalting column)을 사용하여 제거하였다.500 μl of beta estradiol and 200 μl of the delivery protein solution were mixed for conjugation, and then 50 μl of coupling solution was added to carry out the binding reaction at room temperature for 2 hours. Although some precipitate was formed during the reaction, the precipitate was removed by centrifugation. After the reaction, EDTA remaining in the unbound beta estradiol and the delivery protein solution was removed using a D-SaltTM desalting column.

베타에스트라디올-전달 단백질 결합체는 SDS-PAGE를 통하여 확인하였으며, BCA 단 백질정량 용액(BCA protein assay reagent, Pierce)을 이용한 단백질 정량 후 에세톤 침전법을 사용하여 그 농도가 1 ㎍/㎖이 되도록 맞추어 적정량을 분주하여 20℃에 보관하였다.The beta estradiol-transfer protein conjugate was confirmed by SDS-PAGE, and the concentration of the protein was determined to be 1 μg / ml by ecetone precipitation after protein quantification using BCA protein assay reagent (Pierce). The appropriate amount was dispensed and stored at 20 ° C.

실시예Example 2: 면역반응(Immunization) 2: Immunization

4 주령의 BALB/c 마우스를 사용하여 다클론 항혈청(polyclonal antiserum)을 제조하였다. 면역반응에는 3차 면역까지 보조제로 임젝트 알럼(ImjectR Alum, Pierce)를 사용하였으며 네 번째 면역에서는 보조제를 사용하지 않았다.Polyclonal antiserum was prepared using 4 week old BALB / c mice. In the immune response, Injection R Alum (Pierce) was used as an adjuvant up to tertiary immunity and no adjuvant was used for the fourth immunity.

각 면역반응에는 쥐 한 마리당 100 ㎍의 cBSA-β-estradiol 결합체가 되도록 멸균된 PBS에 희석하여 사용하였으며, 피하 및 근육(Subcutaneous, intradermal injection) 경로로 주사하였다. 면역반응은 10 일에 한 번씩 실시하였다. 총 4 회의 면역반응 후 항체 역가(titer)를 측정하기 위해 채혈한 후, 혈액을 원심 분리하여 상층의 혈청만을 사용하였다.Each immune response was diluted in sterile PBS to 100 μg of cBSA-β-estradiol conjugate per mouse, and injected by subcutaneous and intramuscular (Subcutaneous, intradermal injection) route. The immune response was conducted once every 10 days. After a total of 4 immune reactions, blood was collected to determine antibody titers, and the blood was centrifuged to use only the serum of the upper layer.

실시예Example 3: 효소면역진단법(ELISA) 3: enzyme immunoassay (ELISA)

① OVA-β-estradiol 결합체의 고정화① Immobilization of OVA-β-estradiol Conjugates

OVA-β-estradiol 결합체의 고정화는 코팅 완충용액(0.2 M 탄산염 완충액, pH 9.4)으로 0.5 ㎍/㎖이 되도록 희석한 OVA-β-estradiol 결합체를 96-웰 마이트 로역가 플레이트에 200 ㎕씩 분주한 후 37 ℃에서 2시간 반응시켜 실시하였다. 반응 후, 블로킹(blocking)을 위하여 PBST에 1 %(w/v)의 non fat dry skim milk 용액을 만들고, 각 웰에 100 ㎕ 씩 분주하여 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 블로킹 후 마이크로 플레이트는 PBST로 3 회 세척하였다.Immobilization of the OVA-β-estradiol conjugate was performed by diluting 200 μl of the OVA-β-estradiol conjugate diluted in a coating buffer (0.2 M carbonate buffer, pH 9.4) to a 96-well mite titer plate. After reacting at 37 ℃ for 2 hours. After the reaction, a 1% (w / v) non fat dry skim milk solution was prepared in PBST for blocking, and 100 μl of each well was dispensed at 37 ° C. for 1 hour. After blocking the microplates were washed three times with PBST.

② OVA-β-estradiol 결합체를 이용한 간접 ELISA② Indirect ELISA using OVA-β-estradiol conjugate

항혈청 역가측정은 OVA-β-estradiol 결합체가 코팅된 웰의 대조구로 OVA (1 ㎍/웰)와 cBSA (1 ㎍/웰)을 사용하였다. 일차 항체 결합을 위하여 cBSA-β-estradiol로 면역 반응시킨 쥐에서 채취한 항혈청을, 0.1 %(w/v) skim milk/PBST를 이용해서 1/500부터 1/500000까지 serial 희석하여 100 ㎕씩 분주한 후 37 ℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 각 항원에 대하여 2 회씩 실시하였으며, 항혈청을 넣지 않는 웰을 반대 대조구로 사용하였다. 반응이 끝난 후, PBST로 3 회 세척하였다.Antisera titer was measured using OVA (1 μg / well) and cBSA (1 μg / well) as a control of wells coated with OVA-β-estradiol conjugate. Antiserum taken from mice immunized with cBSA-β-estradiol for primary antibody binding was serially diluted from 1/500 to 1/500000 using 0.1% (w / v) skim milk / PBST, and 100 μl were dispensed. After reacting at 37 ° C for 2 hours. Two antigens were performed for each antigen, and the wells containing no antiserum were used as counter controls. After the reaction was completed, washed three times with PBST.

이차 항체로는 염소 항-마우스 IgG-HRP 결합체(goat anti-mouse HRP conjugate, Sigma)를 0.1 %(w/v) skim milk/PBST로 1000 배 희석하여 사용하였다. 각 웰에 100 ㎕씩 분주하여 37 ℃에서 2 시간 동안 반응시킨 후 PBST로 세척하고, 이어서 50 ㎕의 기질(4 mg OPD and 5 ㎕ hydrogen peroxide in citrate-phosphate buffer)을 각 웰에 넣고 10분후에 발색반응을 관찰한 후, 100 ㎕의 반응중지 용액 (1N의 H2SO4)을 사용하여 발색반응을 중지시켰다. 마이크로플레이트 판독기(Microplate reader)를 이용하여 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.As a secondary antibody, goat anti-mouse IgG-HRP conjugate (goat anti-mouse HRP conjugate, Sigma) was used by diluting 1000 times with 0.1% (w / v) skim milk / PBST. 100 μl of each well was reacted at 37 ° C. for 2 hours, washed with PBST, and then 50 μl of substrate (4 mg OPD and 5 μl hydrogen peroxide in citrate-phosphate buffer) was added to each well for 10 minutes. After the color reaction was observed, the color reaction was stopped by using 100 µl of the suspension solution (1 N H 2 SO 4 ). Absorbance was measured at 490 nm using a Microplate reader.

위에서 실시한 실험을 통하여 다음과 같은 결과를 얻었다.Through the experiment conducted above, the following results were obtained.

결과예Result example 1: 항-베타에스트라디올 항혈청(Anti-β-estradiol Antiserum)의  1: Anti-Betaestradiol Antiserum (Anti-β-estradiol Antiserum) 역가Titer 측정 Measure

cBSA-β-estradiol로 면역 반응시킨 쥐로부터 획득한 항혈청의 역가를 알아보기 위해, OVA-β-estradiol, cBSA 및 OVA를 코팅시킨 마이크로역가 플레이트를 이용하여 간접 ELISA를 실시하였다. 도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)를 이용하여 항-베타에스트라디올 항혈청(anti-β-estradiol antiserum)의 역가 변화를 측정한 그래프이다. In order to determine the titer of antiserum obtained from mice immunized with cBSA-β-estradiol, indirect ELISA was performed using microtiter plates coated with OVA-β-estradiol, cBSA and OVA. 1 is a graph measuring the titer change of anti-beta-estradiol antiserum using an Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) according to a preferred embodiment of the present invention.

여기에서 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 항-베타에스트라디올 항혈청은 OVA 또는 cBSA 단백질만이 있는 것에 비하여, 베타에스트라디올이 결합된 OVA-β-estradiol와 특이적으로 반응한다는 것을 알 수 있고, 상기 OVA-β-estradiol는 희석 농도 전반에 걸쳐서 OVA 또는 cBSA 단백질에 비해 본 발명에 따른 항-베타에스트라디올 항혈청과 현저히 강하게 반응하는 것을 확인할 수 있다(도 1 참조). As shown here, it can be seen that the anti-betaestradiol antiserum according to the present invention specifically reacts with OVA-β-estradiol to which betaestradiol is bound, as compared with only OVA or cBSA protein. It can be seen that OVA-β-estradiol reacts strongly with the anti-betaestradiol antiserum according to the present invention over OVA or cBSA protein throughout the dilution concentration (see FIG. 1).

결과예Result example 2: 현장 적용을 위한 항-베타에스트라디올 항혈청(Anti-β-estradiol Antiserum)의 감도 측정 2: Sensitivity measurement of anti-beta-estradiol antiserum for field application

상기한 간접 ELISA 방법에 따라 베타에스트라디올을 포함하는 해양유기오염 물질을 기질로 사용하여 발색도를 측정한 경우, 본 발명에 따른 항-베타에스트라디올 항혈청의 베타에스트라디올에 대한 감도 역시 매우 높은 것으로 나타났다. 도 2는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 ELISA를 이용하여 항-베타에스트라디올 항혈청의 발색도를 측정한 결과도이다.When the color development was measured using the marine organic pollutant containing beta estradiol as a substrate according to the indirect ELISA method described above, the sensitivity of the anti-beta estradiol antiserum to beta estradiol according to the present invention is also very high. appear. Figure 2 is a result of measuring the color development of anti-beta estradiol antiserum using an ELISA according to an embodiment of the present invention.

즉, 상기 항-베타에스트라디올 항혈청을 현장에서 적용하였을 때, 베타에스트라디올과 단백질 결합체를 1/100,0000 희석하는 조건에서도 상당히 높은 흡광도 값(OD490 > 0.1)을 보이는 것으로 보아, 이 혈청은 베타에스트라디올에 대해 높은 감도를 갖는다는 것을 알 수 있다(도 2참조). 다음 표 1은 베타에스트라디올과 단백질 결합체의 희석비율에 따른 항-베타에스트라디올 항혈청의 감도 변화를 측정한 표이다That is, when the anti-beta estradiol antiserum was applied in situ, the serum showed a significantly high absorbance value (OD490> 0.1) even when dilution of beta estradiol and protein conjugate 1 / 100,0000. It can be seen that it has high sensitivity to estradiol (see FIG. 2). Table 1 is a table measuring the sensitivity change of anti-beta estradiol antiserum according to the dilution ratio of beta estradiol and protein conjugate

[표 1: 베타에스트라디올과 단백질 결합체의 희석비율에 따른 항-베타에스트라디올 항혈청의 감도 변화]Table 1: Changes in sensitivity of anti-betaestradiol antiserum with dilution ratios of betaestradiol and protein conjugates

Dilution factor   Dilution factor Blank Blank OVA-β-Estradiol OVA-β-Estradiol cBSA cBSA OVA OVA 100100 0.0370.037 0.2140.214 0.1980.198 0.0360.036 500500 0.0360.036 0.2410.241 0.1760.176 0.0350.035 10001000 0.0340.034 0.2560.256 0.1240.124 0.0360.036 50005000 0.0350.035 0.2430.243 0.0980.098 0.0340.034 1000010000 0.0360.036 0.2290.229 0.0650.065 0.0360.036 5000050000 0.0350.035 0.1850.185 0.0430.043 0.0380.038 100000100000 0.0360.036 0.1450.145 0.0420.042 0.0370.037 500000500000 0.0350.035 0.0660.066 0.0370.037 0.0370.037 00 0.0340.034 0.0390.039 0.0360.036 0.0350.035

이와 같이, 본 발명은 항-베타에스트라디올 항혈청을 현장에서 적용하였을 때에, 별도의 계산식에 의하면 베타에스트라디올과 단백질 결합체를 약 0.015 ng의 농도까지 효과적으로 감지할 수 있는 것으로 확인되었다. 이상의 결과로부터, 본 발명에 따라 제작된 항-베타에스트라디올 항혈청 및 이를 이용한 베타에스트라디올 검출 방법은 베타에스트라디올을 비롯한 해양오염물질의 조기 정밀 검정에 효과적임을 확인할 수 있다.As described above, when the anti-beta estradiol antiserum was applied in situ, it was confirmed that the beta estradiol and the protein conjugate can be effectively detected to a concentration of about 0.015 ng according to a separate equation. From the above results, it can be confirmed that the anti-beta estradiol antiserum prepared according to the present invention and the beta estradiol detection method using the same is effective for the early precision assay of marine pollutants including beta estradiol.

상술한 바와 같은 본 발명에 따르면, 베타에스트라디올(β-estradiol)과 단백질의 결합체로 면역반응시킨 마우스로부터 분리된 항-베타에스트라디올 항혈청(Anti-β-estradiol Antiserum)을 포함하는 베타에스트라디올 검출용 바이오센서 및 베타에스트라디올과 단백질의 결합체를 제조하는 단계; 상기 결합체를 마우스에 주사하여 면역반응시켜 항-베타에스트라디올 항혈청을 제조하는 단계; 그리고 상기 항-베타에스트라디올 항혈청과 베타에스트라디올이 포함된 해양유기오염물질을 항원 항체 반응시키는 단계를 포함하는 베타에스트라디올 검출 방법을 제공할 수 있다. According to the present invention as described above, beta estradiol detection including anti-beta estradiol antiserum (Anti-β-estradiol Antiserum) isolated from mice immunized with a combination of beta estradiol and protein Preparing a biosensor and a conjugate of betaestradiol and a protein; Preparing an anti-betaestradiol antiserum by injecting the conjugate into a mouse and immunoreacting it; And it can provide a beta estradiol detection method comprising the step of antigen-antibody reaction of the marine organic pollutant containing the anti-beta estradiol antiserum and beta estradiol.

이와 같은 본 발명에 따른 베타에스트라디올 검출용 바이오센서 및 이를 이용한 베타에스트라디올 검정법은 아직까지 전세계에서 체계적으로 시도되거나 개발되지 않은 새로운 기술로서, 고가의 장비를 필요로 하는 해양유기오염물질의 화학적인 분석에 있어서 베타에스트라디올과 같은 내분비계장애물질이 포함되어 있는지 여부를 정확하고 간단하게 확인할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명에 따른 항원 항체 반응을 이용한 독성 물질 검출 방법은 반정량적으로 대량의 시료를 스크리닝할 수 있기 때문에, 다른 유해독소의 조기 정밀 진단에도 적용 가능하여 그 활용 가능성은 매우 높은 것이다.The beta estradiol detection biosensor according to the present invention and the beta estradiol assay using the same is a new technology that has not yet been systematically attempted or developed in the world, the chemicals of marine organic pollutants requiring expensive equipment In the analysis, it is possible to accurately and simply determine whether an endocrine disruptor such as beta estradiol is included. In addition, the method for detecting toxic substances using the antigen-antibody reaction according to the present invention is capable of screening a large amount of samples semi-quantitatively, so that it is also applicable to the early precise diagnosis of other harmful toxins, and its use is very high.

Claims (4)

삭제delete 삭제delete 전달 단백질(carrier protein)로 사용될 양이온화된 보바인 혈청알부민(cationized bovine serum albumin; cBSA)이나 오브알부민(ovalbumin; OVA)을 10 ㎎/㎖의 농도가 되도록 증류수에 녹이고, 베타에스트라디올은 결합 완충액(conjugation buffer)에 0.5 ㎎/㎖의 농도가 되도록 준비하며, 상기 베타에스트라디올 500 ㎕과 상기 전달 단백질 200 ㎕을 혼합한 후, 50 ㎕의 커플링 용액을 첨가하여 실온에서 2 시간 동안 결합 반응을 수행한 다음, 그 농도가 1 ㎍/㎖이 되도록 맞추어서 베타에스트라디올과 단백질의 결합체를 제조하는 단계;Dissolve cationized bovine serum albumin (cBSA) or ovalbumin (OVA) in distilled water to a concentration of 10 mg / ml to be used as a carrier protein, and betaestradiol in a binding buffer Prepare a concentration of 0.5 mg / ml in a conjugation buffer, mix 500 μl of the beta estradiol and 200 μl of the delivery protein, and add 50 μl of coupling solution to perform a binding reaction at room temperature for 2 hours. Preparing a conjugate of beta estradiol and protein at a concentration of 1 μg / ml; 상기 결합체를 마우스에 주사하여 면역반응시킨 후, 혈액을 채취한 다음, 상기 혈액을 원심분리하여 항-베타에스트라디올 항혈청을 제조하는 단계; Preparing an anti-betaestradiol antiserum by injecting the conjugate into the mouse to perform an immune reaction, collecting blood, and then centrifuging the blood; 상기 항-베타에스트라디올 항혈청을 0.1%(w/v) skim milk/PBST를 이용해서 100,000배로 희석시키는 단계; Diluting the anti-betaestradiol antiserum 100,000-fold with 0.1% (w / v) skim milk / PBST; 상기 희석된 항-베타에스트라디올 항혈청 100 ㎕과 비스페놀이 포함된 해양유기오염물질 50 ㎕을 항원 항체 반응시키는 단계; 및Antigen antibody reaction of the diluted anti-beta estradiol antiserum with 50 μl of marine organic pollutant containing bisphenol; And 상기 반응에 의한 발색반응을 마이크로플레이트 판독기(Microplate reader)를 이용하여 490 ㎚에서 흡광도 측정하는 단계를 포함하는 베타에스트라디올 검출 방법.A method for detecting beta estradiol, comprising measuring absorbance at 490 nm using a microplate reader. 삭제delete
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