KR100725303B1 - 덴드리머에 페로센 유도체 부착기술개발 및 간편한확인방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단백질 단분자층의 분자인식 확인기술 개발에 관한 것으로, 전기적으로 측정이 가능한 페로센 (ferrocene) 유도체를 덴드리머 (dendrimer)에 정량적으로 도입시키는 방법의 개발 및 확인방법을 포함하는 것을 특징으로 한다.

페로센, 덴드리머, 분자인식

Description

덴드리머에 페로센 유도체 부착기술개발 및 간편한 확인방법{DEVELOPMENT OF FERROCINYLATION OF DENDRIMER AND THEIR CONVENIENT IDENTIFICATION METHOD}

덴드리머의 말단기 아민이 64개인 G4-dendrimer에 전기화학적 신호를 증폭시켜줄 수 있는 페로센화합물을 32%정도인 20개정도의 아민에 결합시키는 방법과 확인하는 방법을 페로센 알데히드와 페로센-N-히드록시석신이미드를 이용하여 확립하였다.

본 발명은 단백질 단분자층의 분자인식 확인기술 개발을 위해 덴드리머에 페로센 유도체를 부착하는 기술의 개발 및 간편한 확인방법에 관한 것이다.

단백질 단분자층을 분자인식 할 수 있는 단백질 칩의 제조를 위해 캘릭스크라운 화합물의 고리에 암모늄기가 분자 인식되는 캘릭스크라운 자기조립 단분자층에 관한 연구가 미래의 주요 바이오산업 과제로서 활발하게 진행되고 있다. 그러나 자기조립 단분자층의 제조 확인기술과 분자인식을 간편한 방법으로 확인하는 방법의 개발이 단백질칩의 실용화를 위해서는 매우 중요하다. 이를 위해 전기적인 측정 및 형광증백을 이용하는 방법들에 관한 연구가 이루어지고 있다.

다음의 반응식 1은 상기 반응을 도식적으로 표시한 것이다.

덴드리머에는 여러 가지 종류가 있으나 64개의 아민 말단기를 가진 G4 polyamidoamine (PAMAM) 덴드리머 (화학식 1)에 페로센 유도체들을 결합시킨다. 여기서 페로센 유도체는 작용기로 알데히드 (화학식 2) 또는 N-hydrosuccinimide (화학식 3)를 갖는 화합물을 이용하며 이것들은 redox 분자 역할을 한다. 제조되는 덴드리머-페로센 결합체는 반응에 이용할 페로센 유도체의 농도를 낮은 농도에서 높은 농도로 바꾸어 가며 64개의 아민 말단기를 가진 덴드리머의 아민그룹의 일부 혹은 전부를 페로센 유도체로 변환하는 합성법을 개발한다. 아민과 알데히드 또는 N-hydrosuccinimide와의 반응은 일반적인 화학반응을 응용한다 [J. Kwak, Anal. Chem. 2003, 75, 5665].

따라서, 본 발명의 목적은 전기적으로 측정이 가능한 페로센 유도체를 덴드리머에 정량적으로 도입하는 방법의 개발 및 그 확인방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 페로센 유도체를 덴드리머에 정량적으로 도입하는 방법의 개발 및 그 확인방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 출발물질로 사용되는 G4 PAMAM dendrimer는 하기 화학식 1로 표시된다:

상기 식에서, 덴드리머의 core 물질은 ethylenediamine이며 ethyleneamine의 구조가 중심에서부터 나뭇가지모양으로 반복적으로 뻗어나온 고분자로서 말단에 아민기가 64개 존재하는 G4 PAMAM dendrimer이다. 상기 화학식 1의 화합물은 10%(w/w) 용액으로 사용한다.

또한, 본 발명에서 페로센 유도체로 사용되는 페로센 알데히드의 유도체이고, 바람직하게는 하기 화학식 2의 ferrocenemonocarboxaldehyde 유도체이다:

상기 식에서 알데히드기는 페로센과 dichloromethyl methyl ether를 tin(IV) chloride 촉매하에 반응시켜 거의 정량적으로 얻을 수 있다.

또한, 본 발명에서 페로센 유도체로 사용되는 페로센 N-hydroxysuccinimide의 유도체이고, 바람직하게는 하기 화학식 3의 ferrocenemono-N-hydroxysuccinimide 에스테르 유도체이다:

상기식에서 N-hydroxysuccinimide기는 ferrocenecarboxylic acid와 N-hydroxy succinimide와의 DCC coupling 반응으로 얻어진다.

화학식 1의 G4 PAMAM 덴드리머를 화학식 2의 페로센알데히드와 염산촉매하에서 반응시키면 덴드리머의 말단 아민기 64개중 알데히드와의 축합반응을 통해 이민이 형성되는데 화학식 1과 화학식 2화합물의 몰 비가 정량적 반응을 조절하는데 매우 중요하다. 덴드리머를 자기조립 단분자층에 도입시켜 단백질의 분자인식을 통한 단백질 칩으로 이용하고자 할 때 덴드리머의 말단 아민 64개중 32% 정도의 아민이 페로센으로 치환된 것이 가장 효율적이라는 연구결과가 보고되었다 [H.-S. Kim, Anal. Chem. 2000, 72, 4420]. 따라서 이에 근접한 결과를 얻기 위한 최적의 조건으로 화학식 1과 화학식 2의 몰 비가 1:0.33 이 되도록 하고 메탄올에 용해시켜 상온에서 반응시킨다. 산촉매로 1N HCl 한방울을 넣어주면 엷은 주황색에서 자주빛으로 변하 는데 반응진행은 얇은막크로마토그래피(TLC)로 남아있는 페로센알데히드를 통해 확인한다. 염산의 양이 적으면 반응이 느려지니 반응진행에 따라 한방울을 더 첨가해 준다. 반응시간은 3시간 내지 4시간 정도가 적당하다. 반응 후 마무리단계는 반응 생성물을 젤투과크로마토그래피 (Sephadex LH-20, Pharmacia)로 정제하여 목적 화합물 4를 얻었다.

화학식 4는 건조시킨 상태로 놓아두면 다시는 메탄올에 녹지 않는 물성의 변화가 일어나므로 메탄올에 용액상태로 보관한다.

화학식 4의 페로세닐 치환정도를 확인하기 위해 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 4의 수소핵자기공명 분광스펙트럼을 하기 그림 1과 같이 비교분석하였다.

(그림 1)

상기 그림 1에서 보여주는 3개의 스펙트럼은 위에서부터 화학식 2, 화학식 1 화학식 4의 수소핵자기공명 분광스펙트럼이다. 그림을 통해 제일 아래그림의 화학식 4의 스펙트럼에서 화학적 이동값 (chemical shift) 2.69ppm (parts per million)은 128개의 덴드리머의 말단가지 메틸렌 수소들을 나타내고 있고 4.25ppm은 페로세닐그룹의 아로마틱 수소 들을 나타낸다. 따라서 인테그레이션을 비교 계산하면 페로세닐그룹이 전체 64개 말단 아민중 몇 개에 치환되어 있는지 계산할 수 있다. 자세한 계산법은 하기 그림 2에서 보여준다.

(그림 2)

그림 2에서는 상기 화학식 4의 덴드리머 메틸렌 수소 128개에 해당하는 화학적 이동값 2.69ppm 과 4.25ppm의 면적비가 0.89:0.79이므로 페로센의 C₅H₅의 수소수는 약 113.6개에 해당함을 알 수 있고 이것은 페로센 22.7개에 해당함을 알 수 있다. 따라서, 덴드리머의 말단 아민 64개중 22.7개가 페로센으로 치환되어 있으므로 35%의 치환율을 확인할 수 있다.

반응식 3도 반응식 2와 유사하게 화학식 1과 화학식 3의 화합물의 몰 비가 1:0.58인 상태에서 메탄올 용매와 상온에서 3시간 교반한 후 반응 생성물을 젤투과크로마토그래피 (Sephadex LH-20, Pharmacia)로 정제하여 목적 화합물 5를 얻었다. 화학식 5 화합물도 메탄올에 용해하여 보관한다.

화학식 5의 페로세노일화 정도도 하기 그림 3과 그림 4에서 보여주는 것처럼 수소핵자기공명 분광스펙트럼으로 확인하였다.

하기 그림 3에서 보여주는 3개의 스펙트럼은 위에서부터 화학식 3, 화학식 1 화학식 5의 수소핵자기공명 분광스펙트럼이다.

(그림 3)

(그림 4)

그림 4에서는 상기 화학식 5의 덴드리머 메틸렌 수소 128개에 해당하는 화학적 이동값 2.69ppm 과 4.45ppm의 면적비가 5.00:3.97이므로 페로센의 C₅H₅의 수소수는 약 101.6개에 해당함을 알 수 있고 이것은 페로센 20.3개에 해당함을 알 수 있다. 따라서, 덴드리머의 말단 아민 64개중 20.3개가 페로세노일기로 치환되어 있으므로 32%의 치환율을 확인할 수 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1

부분적으로 페로세닐화된 덴드리머 4

페로센카르복시알데히드 3 mg (0.33 당량)을 메탄올 1 ml에 용해시키고, 여기에 10%(w/w) G4 PAMAM 덴드리머용액 100 μl (0.036 mmol)과 1N HCl 용액 두방울을 천천히 적하한 후 4시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응 혼합물에 소디움보로히드리드 2 mg (1.5 당량)을 메탄올 1 ml에 용해하여 천천히 적하한 후 상온에서 2시간 교반하였다. 반응 생성물을 젤투과크로마토그래피 (Sephadex LH-20, Pharmacia)로 정제하여 목적 화합물 4를 얻었다.

수율 : 10 mg, 90%

¹H NMR (CD₃OD): δ 4.39(s, 2H), 4.31(s, 2H), 4.25(s, 5H), 3.35~2.25(dendrimer protons)

실시예 2

부분적으로 페로세노일화된 덴드리머 5

페로센 N-히드록시석신이미드 8 mg (0.58 당량)을 메탄올 1 ml에 용해시키고, 여기에 10%(w/w) G4 PAMAM 덴드리머용액 100 μl (0.036 mmol)을 천천히 적하한 후 3시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응 생성물을 젤투과크로마토그래피 (Sephadex LH-20, Pharmacia)로 정제하여 목적 화합물 5를 얻었다.

수율 : 10 mg, 71%

¹H NMR (CD₃OD): δ 4.65(s, 2H), 4.45(s, 5H), 4.32(s, 2H), 3.35~2.25(dendrimer protons)

화학식 1의 화합물을 화학식 2와 반응시켜 화학식 4의 화합물을 제조하는데 있어 화학식 1의 당량수에 대한 화학식 2화합물의 몰 비가 1:0.33이 될 때 전기증폭 및 단백질 인식에 가장 적절한 35% 페로세닐화된 덴드리머화합물인 화학식 4를 얻을 수 있다. 어려운 반응공정을 거치지 않고 용이하게 고수율로 생성물을 얻을 수 있으며 수소핵자기공명 분광스펙트럼으로 쉽게 치환정도를 확인할 수 있다.

또한, 화학식 1과 화학식 3의 몰 비가 1:0.58이 될 때 32% 치환된 화학식 5를 얻을 수 있고 역시 수소핵자기 공명스펙트럼으로 쉽게 치환정도를 확인할 수 있다.

Claims (4)

1. 화학식 1로 표시되는 덴드리머와 화학식 2의 페로센 알데히드 화합물을 산촉매하에서 반응시켜 화학식 4의 부분적으로 페로세닐화된 덴드리머화합물을 제조하는 방법 중 화학식 1 및 화학식 2 화합물의 몰 비가 1:0.33일때 덴드리머의 64개 말단 아민중 35%가 화학식 4로 표시되는 페로세닐화된 덴드리머가 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.

   화학식 1

   

   화학식 2

   

   화학식 4

   
2. 제 1항에 있어서, 상기 화학식 1 화합물을 하기 화학식 3로 표시되는 페로센-N-히드록시석신이미드 화합물과 반응시켜 화학식 5의 부분적으로 페로세노일화된 덴드리머 화합물을 제조하는 방법 중 화학식 1과 화학식 3로 표시되는 화합물의 몰 비가 1:0.58일때 덴드리머의 64개 말단 아민중 32%가 화학식 5로 표시되는 페로세노일화된 덴드리머가 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.

   화학식 3

   

   화학식 5

   
3. 제 1항에 있어서, 화학식 4로 표시되는 부분적으로 페로세닐화된 덴드리머의 페로세닐화 정도는 수소핵자기공명 분광스펙트럼의 화학적 이동값 2.69ppm과 4.25ppm의 비율을 이용하여 계산하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 2항에 있어서, 화학식 5로 표시되는 부분적으로 페로세노일화된 덴드리머의 페로세노일화 정도는 수소핵자기공명 분광스펙트럼의 화학적 이동값 2.69ppm과 4.45ppm의 비율을 이용하여 계산하는 것을 특징으로 하는 방법.

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