KR100720052B1 - Microsphere or microbead coated with nanoparticle containing growth factor for regenerating cartilaginous tissue - Google Patents

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정형민
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Abstract

본 발명은 마이크로스피어 또는 마이크로비드에 코팅된 성장인자에 의한 신경의 재생에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 카르복실기가 밖으로 나와있는 마이크로스피어 또는 마이크로비드에 양이온으로 구성된 폴리에틸렌이민으로 정전기적 결합을 시켜 양이온이 바깥쪽에 나와 있게 하여, 바깥 쪽 폴리에틸렌이민에 성장인자를 함유한 고분자전해질 복합체를 정전기적 반응에 의하여 코팅을 시켜, 줄기세포의 분화유도를 유발하여 연골조직재건을 위한 마이크로스피어 또는 마이크로비드는 주사형 마이크로제작 스캐폴드로 이용될 수 있다. The invention was a thing, more specifically, a carboxyl group is listed electrostatically coupled to the polyethyleneimine consisting of a cation in microspheres or microbeads that are out on the reproduction of the nerve by the growth factors coated on the microspheres or microbeads are cationic by allowing out on the outside, the outside by a polyelectrolyte complex comprising a growth factor in the polyethyleneimine to the electrostatic reactions to the coating, to induce the differentiation induction of stem cell microspheres or microbeads for cartilage tissue reconstruction is a scanning It can be used as the microfabrication scaffold.
마이크로스피어, 마이크로비드, 성장인자, 나노입자, 체내주입형물질 Microspheres, microbeads, growth factors, nanoparticles, body injection-type material

Description

성장인자를 함유한 나노입자가 코팅된 연골 조직 재건 및 재생을 위한 마이크로스피어 또는 마이크로비드 {Microsphere or microbead coated with nanoparticle containing growth factor for regenerating cartilaginous tissue} Microspheres or microbeads for which the nanoparticles containing a growth factor coating cartilage rebuilding and reproducing {Microsphere or microbead coated with nanoparticle containing growth factor for regenerating cartilaginous tissue}

도 1은 TGF-b3가 함유된 나노입자들이 코팅되어 있는 마이크로스피어의 표면을 관찰한 도이고, 1 is a diagram observing the surface of the microspheres that are coated to a nanoparticle containing a TGF-b3,

도 2는 TGF-b3가 함유된 나노입자가 함유된 마이크로스피어 표면의 세포 점착을 관찰한 도이며, 2 is a diagram observing a cell adhesive surface of the microspheres containing the nanoparticles containing the TGF-b3,

도 3은 TGF-b3가 1㎍/㎖의 농도로 함유된 나노입자가 코팅된 마이크로스피어에서 간엽줄기세포의 연골화를 콜라젠타입 II의 발현으로 관찰한 도이고, 3 is a diagram observing a cartilage Chemistry of mesenchymal stem cells in microspheres of TGF-b3 is coated with nanoparticles containing a concentration of 1㎍ / ㎖ the expression of collagen type II,

도 4는 TGF-b3가 1㎍/㎖의 농도로 함유된 나노입자가 코팅된 마이크로스피어에서 간엽줄기세포의 연골화를 면역조직학적 검사를 통해서 살펴본 도이다. Figure 4 is a screen examining the cartilage of the mesenchymal stem cells by the immunohistochemical test in the microspheres of the nano-particles contained in a concentration of TGF-b3 1㎍ / ㎖ coating.

조직공학기술은 인공장기, 의료용구 및 바이오 인공장기 개발 기술로써 국민보건 향상 및 삶의 질 향상이라는 측면과 함께 기술개발, 경제적 측면에서도 매우 중요하다. Tissue engineering technology is crucial in technological development, together with economic aspects of public health and improve quality of life by artificial organs, medical devices, and bio-artificial organ development. 관절 연골은 특이하게 혈관, 신경 및 임파 조직이 없으므로 손상 후 스스로의 재생이 불가능한 조직이다. Articular cartilage is a tissue that can not be reproduced because of themselves after injury to blood vessels, nerves and lymphatic tissue specific. 현재의 의학적 방법으로는 관절 연골을 정상적으로 재생할 수 있는 방법이 매우 제한적이다.(Willers C et al, Tissue Engineering , 11(7-8), p.1065, 2005; Okamoto T et al, Nippon With current medical methods is a way to play the articular cartilage is normally very limited (Willers C et al, Tissue Engineering , 11 (7-8), p.1065, 2005;. Okamoto T et al, Nippon Rinsho Rinsho Mar , 61(3) , pp.432-438, 2003) Mar, 61 (3), pp.432-438 , 2003)

자가 연골세포 이식법에 의한 연골조직의 재생이 최근 시도되어 임상적으로 매우 효과적인 수술법으로 알려지고 있으나 연골의 광범위한 손상 부위에는 사용할 수 없다는 것, 관절 연골의 손상 위치, 환자의 나이 등에 따라 제한점을 가지고 있다. It has limitations due to self cartilage cell regeneration of cartilage tissue by yisikbeop been tried recently to be known as a highly effective surgical procedure clinically, but will not be available for a wide range of damaged cartilage, damaged the position of the articular cartilage, the patient's age . 이와 같은 문제점을 해결하고 보다 예측 가능하고, 보다 안전한 수술 방법을 개발하고자 하는 노력이 바로 연골의 조직공학적 재생이다.(kang et al. Tissue Engineering, 11(3-4) , pp.438-447, 2005) In solving these problems, and more predictable, and the right tissue-engineered cartilage regeneration in an effort to develop safer surgical method. (Kang et al. Tissue Engineering , 11 (3-4), pp.438-447, 2005).

인공연골의 제작에 관한 연구가 이미 외국에서 활발하게 수행 중이며, 유럽에서는 이미 연골세포운반체와 함께 연골세포의 이식하는 치료법이 사용되고 있는 실정이다. In a study on the production of artificial cartilage already in actively carried out in a foreign country, a situation that is already being used in Europe for the treatment of chondrocytes with chondrocyte transplantation carrier. (Meyer U et al, Eur (Meyer U et al, Eur Cell Cell Mater , Apr 26(9) , pp.39-49, 2005) 조직공학적으로 제작이 시도되고 있는 장기 중 관절 연골은 인공피부와 함께 실현 가능성이 가장 높고, 실용화가 빠른 장기 중의 하나로 인식되고 있다 Mater, Apr 26 (9), pp.39-49, 2005) , which is produced by the joint of the long-term tissue-engineered cartilage has been attempted most highly feasible with artificial skin, and is recognized as one of the fastest practical long-term

인체에서 관절 연골의 특징은 관절 연골의 인체 조직 중 체중의 부하가 가장 큰 조직으로 마모로 인한 손상에 쉽게 노출된다. Features of the articular cartilage in the human body is susceptible to damage due to wear the biggest load of weight the tissues of the body tissue of the articular cartilage. 관절 연골은 유리 연골(hyaline cartilage)로서 연골세포와 풍부한 세포외기질로 이루어져 있다. Articular cartilage is composed of a glass cartilage (hyaline cartilage) into chondrocytes and rich extracellular matrix. 연골세포는 연골 총 부피의 10% 미만을 차지하고 있으며, 세포외기질을 합성, 분비하므로 관절 연골 의 유지에 중요한 역할을 한다. Cartilage cells accounted for less than 10% of the total volume of the cartilage, and other stromal cells synthesize, secrete, so play an important role in the maintenance of joint cartilage. 노화에 따른 연골세포 수 및 연골세포 대사작용의 감소는 유병률이 높은 노인성 질환인 골관절염의 병인 중의 하나로 생각되고 있다.( Bobacz K et al, Ann Number of chondrocytes and cartilage due to aging decrease in metabolism is thought as one of the etiology of osteoarthritis is higher prevalence of senile diseases. (K Bobacz et al, Ann Rheum Rheum Dis , Dec, 63(12) , pp.1618-1622, 2004) Dis, Dec, 63 (12) , pp.1618-1622, 2004)

관절 연골의 조직공학적인 재생에 줄기세포가 효과적인 이유는 줄기세포 그 자체가 무한한 증식능력과 다양한 분화능력으로 인하여 연골뿐만 아니라 모든 장기의 재생에 이상적인 세포로 인식되고 있다. The reason the regeneration of cartilage tissue engineering the stem cells effectively has been recognized as the ideal cells for stem cell itself is infinite proliferative capacity and differentiate the various organs as well as the ability to play all of the cartilage due. 특히 골수 줄기세포는 주위 환경에 따라 골 및 연골조직으로의 분화가 매우 용이하므로 연골조직의 공학적 제작에 유리하며, 직접적인 줄기세포의 이식은 골-연골 손상을 동시에 치유할 수 있을 것으로 생각되고 있다. In particular, the bone marrow stem cells, because it is very easy to differentiate into bone and cartilage tissue depending on the surrounding environment, the glass in the engineering production of cartilage tissue, transplantation of direct stem cells is bone - it is thought to be able to heal cartilage damage at the same time. (Spagnoli A et al. Endocr (A Spagnoli et al. Endocr Dev , 9, pp.17-30, 2005; Dev, 9, pp.17-30, 2005; Song L et al, cytotherapy Song L et al, cytotherapy 6(6) , pp.596-601, 2004) 6 (6), pp.596-601, 2004 )

성체 줄기세포에서 연골세포로의 분화를 조절하는 마스터 유전자(master gene)에 관하여서는 자세히 밝혀져 있지 않다. Documentation about the master genes (master gene) that controls the differentiation into cartilage cells from adult stem cells is not more known. 골수 줄기세포를 포함하여 성체 조직에 존재하고 있는 줄기세포는 그 분화 정도를 볼 때 매우 다양한 세포들의 복합체라고 할 수 있으며, 이들 세포군들이 가지는 연골세포로의 분화능력이 동일하지 않을 것이므로, 단일화된 세포들로 분리하는 방법이 개발된다면 보다 효과적인 조직재생이 이루어질 수 있을 것이다. Because stem cells are present in adult tissues including bone marrow stem cells may be referred to as complexes of a wide variety of cells when viewing the differentiation, these cell populations are differentiated ability of cartilage cells is not the same thing, unified cell If this method of separation will be achieved by developing a more effective tissue regeneration.

관절 연골의 성공적인 조직공학적인 제작에 있어 필수적으로 고려되어야 할 부분으로는 생체조직공학적 제작이 시도되고 있는 장기 중 연골은 실현 가능성이 가장 높고, 실용화가 빠른 장기 중의 하나로 인식되고 있다. Part should be considered as essential for successful tissue engineering of articular cartilage production is recognized as one of the living tissue engineering of the production is being attempted is high and the long-term cartilage is feasible, a quick long-term practical applications.

줄기세포에서 분화된 연골세포의 조직공학적 관절연골 제작은 중심 요인들인 연골세포화된 줄기세포, 생분해성 지지체가 필수적이고 연골 세포화된 줄기세포는 골수로부터 단일핵 세포를 분리 후 배양하면서 연골세포로 분화를 유도한다. While tissue-engineered articular cartilage production of cartilage cells differentiated from stem cells is the main factor, which are cartilage cells stylized stem cells, biodegradable stem cell support is essential and chondrocytes Tuesday after the separation of a single nuclear cells from bone marrow cultured chondrocytes induce differentiation. 이상적인 연골세포는 증식능력이 좋아야 하며, 연골세포의 특이 표현형인 콜라젠 타입(collagen type) II를 유지하는 세포이다. Ideal chondrocyte is a cell to be good, and the proliferative capacity, maintain a specific phenotype of the chondrocyte collagen types (collagen type) II. 생분해성 지지체로서 합성고분자재료로는 PLA, PGA, PLGA 등이며 생분해 속도 조절이 가능한 장점이 있다. A synthetic high molecular material is used as a biodegradable support such as a PLA, PGA, PLGA has a possible advantage biodegradation rate control. 천연고분자재료로는 콜라젠(collagen), 젤라틴(gelatin), 케라틴(keratin), 피브로넥틴(fibronectin) 등의 단백질과 셀룰로오스(cellurose), 덱스트란(dextran), 키틴(kitin), GAG와 같은 다당류 등이 있다. Natural polymeric materials are the polysaccharides such as collagen (collagen), gelatin (gelatin), keratin (keratin), fibronectin (fibronectin) protein and cellulose (cellurose), such as, dextran (dextran), chitin (kitin), GAG have. 이들은 세포접착성이 높다는 장점을 가지지만 낮은 기계적 물성이 단점이다. They only have the advantage of high cell adhesiveness is low mechanical property is a disadvantage.

이에 본 발명자들은 생리활성물질인 TGF-b3를 마이크로스피어의 표면에 도입을 통해서 줄기세포를 원활히 점착시키고 배양액 존재 하에서 마이크로스피어의 표면에서 줄기세포를 연골세포로의 분화유도를 통하여 연골재생을 유도할 수 있음을 알아내어 본 발명을 완성하였다. The present inventors to induce cartilage through the differentiation induction of the under physiologically active substance of the adhesive the TGF-b3 stem cells smoothly through the introduction on the surface of the microspheres and the culture medium present on the surface of the microspheres with the stem cell chondrocytes taking out the can, thereby completing the present invention.

본 발명의 목적은 성장인자를 함유한 고분자전해질 복합체를 표면에 부착시킨 마이크로스피어를 이용하여 줄기세포를 점착시켜 연골세포로의 분화유도를 통한 연골조직재건 및 재생을 원활히 제공하는 것이다. An object of the present invention is to provide, using the microspheres was adhered to a polyelectrolyte complex comprising a growth factor on the surface by the adhesive stem cells facilitate the reconstruction and regeneration of cartilage tissue through the induction of differentiation into chondrocytes.

본 발명은 성장인자를 함유한 고분자전해질 복합체로 구성된 나노입자를 표면에 부착시킨 연골조직재건 및 재생을 위한 마이크로스피어 또는 마이크로비드를 제공한다. The present invention provides a microsphere or microbead for which cartilage tissue reconstruction and reproduction adhered nanoparticles consisting of a polyelectrolyte complex comprising a growth factor on a surface.

본원에서 정의되는 성장인자로는 TGF-b1, TGF-b2, TGF-b3, TGF-α, TGF-β, IGF-1, NGF 등을 포함하며 상기 성장인자의 농도가 0.01~1 ㎍/㎖임을 특징으로 하는 마이크로스피어 또는 마이크로비드를 포함한다. A growth factor as defined herein, that TGF-b1, TGF-b2, TGF-b3, TGF-α, TGF-β, IGF-1, including NGF, etc., and the concentration of the growth factor 0.01 ~ 1 ㎍ / ㎖ and a microsphere or microbead, characterized.

본원에서 정의되는 고분자전해질 복합체는 헤파린/폴리엘라이신인 마이크로스피어 또는 마이크로비드를 포함한다. Polyelectrolyte complex as defined herein, comprises a heparin / poly Ella, who is a microsphere or microbead.

본원에서 정의되는 마이크로스피어 또는 마이크로비드는 덱사메타손(dexamethasone) 또는 DHEA(Dehydroepiandrosterone)를 추가적으로 포함할 수 있다. Microspheres or microbeads as defined herein may comprise the further dexamethasone (dexamethasone) or DHEA (Dehydroepiandrosterone).

또한, 본 발명은 성장인자를 함유한 고분자전해질 복합체로 구성된 나노입자를 표면에 부착시킨 마이크로스피어 또는 마이크로비드 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 연골조직재건 및 재생을 위한 약학조성물을 제공한다. The present invention also provides a pharmaceutical composition for the cartilage tissue reconstruction and regeneration, including acceptable excipients as that microspheres or microbeads and a pharmaceutically attach the nanoparticles consisting of a polyelectrolyte complex on the surface containing growth factor.

상기 약학조성물은 주사제 형태인 것을 포함한다. The pharmaceutical compositions may include those in the form of injections.

이하, 마이크로스피어 또는 마이크로비드를 수득하는 방법을 상세히 설명한다. It describes a method to obtain the following, microspheres or microbeads in detail.

생분해성 폴리머인 PLGA(poly lactic-co-glycolic acid)를 5 내지 20배, 바람직하게는 10배의 분량의 유기용매에 용해시키고, 이 용액을 폴리비닐 알코올(polyvinyl alchol)(Mw 13,000~23,000) 3% 수용액 50내지 300 ml, 바람직하게는 200 ml에 한 방울씩 가하고 바이오믹서(biomixer)를 사용하여 500 내지 20000 rpm, 바람직하게는 1,000 rpm에서 30초 이상, 바람직하게는 5분 동안 유화시켰다. Biodegradable 5 to 20 times the polymer is PLGA (poly lactic-co-glycolic acid), and preferably in an organic solvent in a 10-fold amount, to the solution of polyvinyl alcohol (polyvinyl alchol) (Mw 13,000 ~ 23,000) 3% of the aqueous solution of from 50 to 300 ml, preferably added dropwise to 200 ml bio-mixer 500 to 20000 rpm by using (biomixer), preferably, was emulsified while at 1,000 rpm for more than 30 seconds, preferably 5 minutes. 그 후 용매 증발을 위해 실온에서 30분 내지 24시간, 바람직하게는 3 시간 동안 일정속도로 기계적 교반기를 사용하여 교반시켰다. After solvent evaporation at room temperature for 30 minutes to 24 hours, and then stirred preferably using a mechanical stirrer at a constant rate for 3 hours. 현탁액은 500 내지 2000 rpm, 바람직하게는 1,000 rpm에서 30초 내지 30분, 바람직하게는 5분 동안 원심분리하고 남아 있는 계면활성제를 제거하기 위해 증류수를 10 내지 200 ml, 바람직하게는 100 ml를 1회 이상, 바람직하게는 3회로 나누어 세척한 후 동결 건조하여, 카르복실기를 갖는 마이크로스피어를 수득할 수 있다. The suspension is from 500 to 2000 rpm, preferably at 1,000 rpm 30 seconds to 30 minutes, preferably to about 200 ml 10 with distilled water to remove the surface active agent that remains is centrifuged for 5 minutes, and preferably a 100 ml 1 times or more, preferably washed three dividing circuit can be freeze-dried, to give a microsphere having a carboxyl group.

상기 유기용매는 아세트산, 락트산, 포름산, 아세톤, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, 디메틸술폭사이드, 디옥산, N-메틸피롤리돈 및 이들을 함유하는 수용액으로 이루어진 그룹으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 한다. The organic solvent is selected from one or more of acetic acid, lactic acid, formic acid, acetone, acetonitrile, dimethylformamide, dimethylacetamide, dimethylsulfoxide, dioxane, N- methylpyrrolidone and the group consisting of an aqueous solution containing them and it characterized.

또한, DCM(dichloromethane)에 다양한 농도로 녹여진 PLGA(분산상, dispersion phase)를 주사기에 넣은 후, 중력을 이용하여 평편한 주사바늘(blunt needle; 27G)을 통해 용액을 방출함으로써 다양한 농도의 폴리비닐 알코올이 녹여진 증류수(연속상, continuous phase) 속에서 대략 지름 0.5~1 mm 정도인 방울(drop)을 만들고, 마그네틱 바(magnetic bar)를 이용하여 기계적으로 저어줌으로써 분쇄 시킨 다음, 상온에서 6 시간 동안 방치하여 DCM을 제거하고 동결건조 하여 마이크로비드를 수득할 수 있다. Further, after the PLGA (disperse phase, dispersion phase) binary dissolved in various concentrations in DCM (dichloromethane) into the syringe, a flat needle by gravity (blunt needle; 27G) to various concentrations of polyvinyl by discharging the solution through in which the alcohol is created and the melt binary distilled water, the drops of approximately diameter 0.5 ~ 1 mm approximately in the (continuous phase, continuous phase) (drop), pulverized by giving stirred mechanically with a magnetic bar (magnetic bar), and then for 6 hours at room temperature allowed to stand to remove the DCM for and can be lyophilized to obtain a microbead.

본 발명의 마이크로스피어 또는 마이크로비드를 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. A pharmaceutical composition comprising the microspheres, or microbeads of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients, and diluents normally used for the manufacture of a pharmaceutical composition.

본 발명의 마이크로스피어 또는 마이크로비드의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. Microspheres or pharmaceutical dosage forms of the microbeads of the invention can also be used in the form of salts thereof as possible, pharmaceutically acceptable, and may be used alone or in combination with other pharmaceutically active compounds, as well as suitable set.

산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. Powders, granules, may be used in tablets, capsules, formulated with, suspensions, emulsions, syrups, oral dosage forms, external preparations, suppositories, and in the form of sterile injectable solutions, such as aerosolization. 목초액을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. A carrier that can be included in a composition comprising a wood vinegar, excipients, and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate , it may be mentioned cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methyl hydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. When formulated, the are prepared by using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surface active agents. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc. These solid formulations are sucrose (sucrose, for at least one or more excipients, for example, in the extract, starch, calcium carbonate (calcium carbonate), ) or lactose (lactose), the preparation is mixed with gelatin. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. It is also used as magnesium stearate, talc as a lubricant in addition to simple excipients. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. Liquid formulations for oral administration may include suspensions, solutions, emulsions, syrups, etc. The appropriate there is in addition to water and liquid paraffin simple diluents commonly used, for various excipients, such as wetting agents, sweeteners, aromatics and preservatives, etc. . 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. Parenteral formulations are sterilized aqueous solution for administration, include a non-aqueous water-insoluble excipients, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories. 비수 성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. Nonaqueous solvent, a suspending agent and the like injectable esters such as vegetable oils, ethyl oleate, such as propylene glycol (propylene glycol), polyethylene glycol and olive oil may be used. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. Group zero of the above suppository may tepsol (witepsol), Macrogol, Tween (tween), such as 61, cacao butter, laurin, glycero- Rosetta Latin be used.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. The preferred dosage of the present composition may vary depending on the condition and body weight, degree, drug form, route of administration, and duration of the disease of the patient, it may be suitably selected by those skilled in the art. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. However, for the desired effect, the composition of the present invention 0.0001 to 100 mg / kg 1 day, preferably, administration of 0.001 to 100 mg / kg. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. Dose may be administered once a day and may be administered by dividing several times. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. The dosages in any surfaces not intended to limit the scope of the invention.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. The compositions of the invention may be administered by various routes to mammals such as rats, mice, livestock, human beings. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. Any method of administration may be expected, for example, can be administered by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine epidural or a brain vascular (intracerebroventricular) injection.

본 발명은 각각의 농도의 성장인자를 헤파린과 결합시키는 제 1단계; The present invention is a first step of combining growth factors of various concentrations of heparin; 헤파린 결합 후 교반시키면서 폴리엘라이신을 떨어트리는 제 2단계; A second step after the heparin binding stirring tree fallen poly who Ella; 생성된 나노입자를 폴리에틸렌이민으로 코팅된 마이크로스피어 또는 마이크로비드에 결합시키는 3단계를 포함하는 성장인자를 함유한 나노입자를 마이크로스피어 또는 마이크로비드에 코팅하는 방법을 제공한다. It provides a method of coating a nanoparticle containing a growth factor comprising the step 3 for bonding to the microspheres or microbeads coated with polyethylene imine and the resulting nanoparticles to microspheres or microbeads.

또한, 본 발명은 성장인자를 함유한 고분자전해질 복합체를 표면에 부착시킨 마이 크로스피어 또는 마이크로비드에 줄기세포를 점착시킨 후 배양액 존재 하에서 연골세포 분화를 유도하는 연골세포 배양방법을 제공한다. The present invention also provides a cartilage cell culture method of inducing cartilage cell differentiation under culture there was adhesion of stem cells in my cross-peer or microbeads adhered to a polyelectrolyte complex comprising a growth factor on a surface.

각각의 농도의 성장인자를 헤파린과 결합시키는 제 1단계; A first step of combining the respective concentrations of the growth factor and heparin; 헤파린 결합 후 교반시키면서 폴리엘라이신을 떨어트리는 제 2단계; A second step after the heparin binding stirring tree fallen poly who Ella; 생성된 나노입자를 폴리에틸렌이민으로 코팅된 마이크로스피어 또는 마이크로비드에 결합시키는 3단계; Combining the microspheres or microbeads coated with polyethylene imine and the resulting nanoparticles third step; 성장인자를 함유한 마이크로스피어 또는 마이크로비드를 플레이트(plates)에 깔고 줄기세포를 점착시키는 4단계; Laying a microsphere or microbead containing a growth factor to the plate (plates) 4 steps of pressure-sensitive adhesive of stem cells; 점착시킨 세포들을 2-3일 안정화 시킨 후 배양액 하에서 배양하는 5단계를 포함한다. The cells in which the adhesive was 2 to 3 and a stabilization step of 5 cultured in the culture medium.

상기 배양의 조건은 알파(alpha) MEM 배지(media)에서 안티(anti) 1% , FBS 10% 등의 용액을 이용하여 3~7일 배양하는 것을 포함한다. Conditions for the incubation involves culturing 3 to 7 using a solution such as anti (anti) 1%, FBS 10% in the alpha (alpha) MEM medium (media).

상기 줄기세포 배양은 성장인자를 0.01~1 ㎍/㎖의 농도로 나노입자에 함유되어 8주 까지 수행하는 것이 바람직하며, TGF-b3가 0.01 ㎍/㎖미만으로 나노입자에 함유되면, 성장인자의 자극이 약하여 줄기세포의 배양에 영향을 미치지 못하며, 1 ㎍/㎖ 이상이면 1 ㎍/㎖의 농도와 비교할 때 세포가 받는 자극의 변화를 살펴볼 수 없어 바람직하지 않은 농도이다. If the stem cell culture is preferably carried out is contained in nanoparticles, the growth factor at a concentration of 0.01 ~ 1 ㎍ / ㎖ to 8 weeks, and, TGF-b3 is contained in the nanoparticles is less than 0.01 ㎍ / ㎖, of growth factors this stimulation is weak mothamyeo affect the culture of stem cells, the cell density is undesired can not look at the change of the receiving stimulation compared to the concentration of 1 ㎍ / ㎖ is 1 ㎍ / ㎖ above.

본 발명에서 성장인자가 함유된 나노입자가 코팅된 마이크로스피어 또는 마이크로비드 표면에 줄기세포를 점착시킨 후 배양액 존재 하에서 코팅된 나노입자와 결합된 성장인자의 자극에 의한 간엽줄기세포의 분화 유도 및 연골조직재생을 관찰하였다. Inducing differentiation of the mesenchymal stem cells by the stimulation of the growth factor binding then the present invention adhesion of stem cells to the microspheres, or microbeads surface of the growth factor-containing nanoparticles coated in the coated nanoparticles under the culture medium in the presence and cartilage the tissue was observed. 구체적으로 성장인자의 자극에 의하여 간엽줄기세포로부터 연골세포로의 전환을 관찰할 수 있었으며, 형성된 연골세포들의 연골조직화를 면역조직염색법을 통하여 관찰 할 수 있었다. Specifically, by the stimulation of the growth factor was observed in the conversion of chondrocytes from mesenchymal stem cells, were observed by immunohistochemical staining for cartilage organization of chondrocytes is formed. 상기한 바와 같이, 상기 줄기세포 배양방법은 일반 주사기를 통한 주입이 가능하며, 이러한 주입형 마이크로스피어 또는 마이크로비드는 손상된 조직의 재생을 이루는 마이크로화된 스캐폴드로서 이용이 가능하다. The stem cell culture method as described above, and can be injected through a common injector, such injection type microspheres or microbeads can be used as the micro-screen scaffolds form a reproduction of the damaged tissue.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. It will be described in detail below by the present invention in embodiments.

단, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. However, the following examples are not to be intended as the scope of the present invention illustrating the details of the invention limited by the following examples.

실시예 1. 카르복실기를 갖는 마이크로스피어 제조 방법 Example 1. The method of producing microspheres having a carboxyl group

먼저, 생분해성 폴리머인 PLGA(poly lactic-co-glycolic acid)를 500 mg을 유기용매 5 ml에 용해시키고, 이 용액을 폴리비닐 알코올(polyvinyl alchol)(Mw 13,000~23,000) 3% 수용액 200 ml에 한방울씩 가하고 바이오믹서(biomixer)를 사용하여 1,000 rpm에서 5분 동안 유화시켰다. First, the 500 mg of the biodegradable polymer is PLGA (poly lactic-co-glycolic acid) was dissolved in 5 ml of organic solvent, the solution of polyvinyl alcohol (polyvinyl alchol) (Mw 13,000 ~ 23,000) in 200 ml 3% aqueous solution was added dropwise using a bio-mixer (biomixer) was emulsified at 1,000 rpm for 5 minutes. 그 후 용매 증발을 위해 실온에서 3 시간 동안 일정속도로 기계적 교반기를 사용하여 교반시켰다. Then the mixture was stirred using a mechanical stirrer at a constant speed at room temperature for 3 hours to evaporate the solvent. 현탁액은 1,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 남아 있는 계면활성제를 제거하기 위해 증류수를 100ml를 3회로 나누어 세척한 후 동결 건조하여, 카르복실기를 갖는 마이크로스피어를 제조하였다. The suspension is then centrifuged for 5 minutes at 1,000 rpm, washed with distilled water to remove the surface active agent remaining 100ml dividing circuit 3 and lyophilized, to prepare a microsphere having a carboxyl group.

실시예 2. 마이크로비드 제조 방법 Example 2. Preparation method microbeads

DCM(dichloromethane)에 다양한 농도로 녹여진 PLGA(poly lactic-co-glycolic acid, 분산상, dispersion phase)를 주사기에 넣은 후, 중력을 이용하여 평편한 주사바늘(blunt needle; 27G)을 통해 용액을 방출함으로써 다양한 농도의 폴리비닐 알코올이 녹여진 증류수(연속상, continuous phase) 속에서 대략 지름 0.5~1 mm 정도인 방울(drop)을 만들고, 마그네틱 바(magnetic bar)를 이용하여 기계적으로 저어줌으로써 분쇄시킨 다음, 상온에서 6 시간 동안 방치하여 DCM을 제거하고 동결건조 하여 마이크로비드를 수득하였다. After the PLGA (poly lactic-co-glycolic acid, disperse phase, dispersion phase) binary dissolved in various concentrations in DCM (dichloromethane) into the syringe, a flat needle by gravity (blunt needle; 27G) to release a solution through creating a substantially diameter of 0.5 ~ 1 mm around the drops (drop) in the melt the polyvinyl alcohol with various concentrations of binary distilled water (the continuous phase, continuous phase), was pulverized by giving stirred mechanically with a magnetic bar (magnetic bar) by and then it was allowed to stand at room temperature for 6 hours to remove the DCM and the resulting microbeads and lyophilized.

실시예 3. 섬유아세포성장인자가 함유된 나노입자 코팅 Example 3: fibroblast growth factor-containing coated nanoparticles

각각의 농도(0.01, 0.1, 1 ㎍/ml)의 섬유아세포성장인자를 헤파린과 결합시킨 후 교반시키면서 폴리엘라이신을 떨어트린다. Stirring after combining the fibroblast growth factor for each concentration (0.01, 0.1, 1 ㎍ / ml) and heparin The trim off the poly who Ella. 이렇게 생성된 나노입자를 폴리에틸렌이민으로 코팅된 마이크로스피어(1 g)과 결합시킨다. Couples and thus coating the resulting nanoparticles with a polyethyleneimine microspheres (1 g).

실시예 3. 인간유래간엽줄기세포배양 ( Human Example 3. human-derived mesenchymal stem cells (Human Fetal Fetal Liver Liver Preparation Preparation and and Cell Cell Culture ) Culture)

치료목적의 선택적 유산술(Therapeatic selective abortion)과정에서 채취된 10주 조직으로부터 태아 간 조직을 얻었다. Selective abortion therapeutic purposes liquor (Therapeatic selective abortion) were obtained from 10 weeks fetal liver tissue collected from the tissue process. 선택적 유산술로 채취된 유산조직을 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium; GIBCO)에 10% 소의 태아 혈청(fetal bovine serum) (FBS; Hyclone, USA)이 들어있는 배양액으로 옮겨져 해부현미경(SM 2645; Nikon) 아래에서 예리한 핀셋으로 간 조직만을 골라내었다. 10% fetal calf serum in (fetal bovine serum); optional legacy alcohol with a legacy tissue DMEM (GIBCO Dulbecco's modified Eagle's medium) collected in (FBS; Hyclone, USA) transferred to the culture medium containing the dissecting microscope (SM 2645; Nikon) only it served to choose between the organization as a sharp tweezers down. 채취한 간조직들은 DMEM 배양액에 씻어 혈청, 혈구 성분을 최대한 제거한 후 사용하였다. A liver tissue collected were used after removing the most of the serum, the DMEM culture solution to wash blood cell components. 치료용 목적으로 낙태된 10주의 인간 배아 조직에서 간 조직을 분리하여 수술용 칼로 얇게 세절한 다음 0.25% 트립신(trypsin)-0.5mM EDTA(GIBCO, USA)를 처리한 후 37℃에서 10분간 처리한다. The 10 week abortion in order for the treatment to separate the liver tissue from human embryos appropriate three thin surgical knife and then treated 0.25% trypsin (trypsin) -0.5mM EDTA (GIBCO, USA) were treated for 10 minutes at 37 ℃ . 분리한 세포는 DMEM(GIBCO, USA)에 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum)(Hyclone, USA ), 0.1mM 비필수 아미노산(nonessential amino acid)(GIBCO, USA), 0.053mM 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol)(GIBCO, USA), 1000units/ml 페니실린(penicillin)(GIBCO, USA), 1000μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)(GIBCO, USA)이 첨가된 배양용액으로 5% CO 2 가 공급되는 배양기로 24시간동안 배양하였다. Separated cells with 10% fetal bovine serum (fetal bovine serum) (Hyclone, USA), 0.1mM non-essential amino acids (nonessential amino acid) (GIBCO, USA), 0.053mM 2- mercaptoethanol in (GIBCO, USA) DMEM (2-mercaptoethanol) (GIBCO, USA), 1000units / ml penicillin (penicillin) (GIBCO, USA) , 1000μg / ml streptomycin (streptomycin) (GIBCO, USA) is to be 5% CO 2 is supplied to the addition of the culture solution in an incubator and incubated for 24 hours.

하루가 지난 후 비부착 세포(nonadherent cell)를 수집하고 낮은-밀도 분획(low-density fraction)(Ficoll-paque ; Amersham Biosciences, Sweden) 1.077g/㎖ 로 원심분리하여 황갈색 막(buffy coat)층을 분리한다. After the last day collect non-adherent cells (nonadherent cell) and low-density fractions (low-density fraction); a (Ficoll-paque Amersham Biosciences, Sweden) 1.077g / ㎖ centrifugation tan film (buffy coat) layer was It separates. 이를 인산염 완충염(phosphate buffered saline)(PBS; GIBCO, USA)에 약 2회 정도 수세하면서 원심분리하여 세포층을 수집한다. This phosphate buffered saline (phosphate buffered saline); to the centrifuge while washing with water about two times (PBS GIBCO, USA) a cell layer is collected.

피콜(Ficoll)로 분리한 세포를 DMEM-LG (Dulbecco's modified Eagle's medium 1g/L low glucose; GIBCO) 와 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum) (FBS; Hyclone, USA), 100U/㎖ 페니실린(penicillin), 100㎍/ml 스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가하여 37℃, 5% CO 2 Ficoll (Ficoll) the removed cells DMEM-LG in (Dulbecco's modified Eagle's medium 1g / L low glucose; GIBCO) with 10% fetal bovine serum (fetal bovine serum) (FBS; Hyclone, USA), 100U / ㎖ penicillin (penicillin ), 100㎍ / ml streptomycin (streptomycin) to 37 ℃, 5% CO 2 was added 헬라 세포(Helacell)로 5일간 배양한다. And 5 days incubation with HeLa cells (Helacell). 이때 배양기 바닥에 붙지 않고 떠있는 세포들은 모두 제거한다. The cells floating in the culture medium does not stick to the bottom are removed. 동시에 배양된 배양기 중이 일부는 알칼린 포스파제(Alkaline phosphase)(Sigma; USA) 염색을 위하여 3.7% 포름알데히드(formaldehyde)로 고정한다. The culture medium being part of the culture at the same time alkaline phosphazenium (Alkaline phosphase); fixed with 3.7% formaldehyde (formaldehyde) to the (Sigma USA) staining.

실시예 4. 간엽줄기로부터 Example 4 from mesenchymal stem 중간엽줄기세포의 분리 및 확장 Isolation and expansion of mesenchymal stem cells

중간엽줄기세포(MSC)는 증식을 멈추면 분화를 시작하기 때문에 융합전에 계대배양를 하면서 유지하여 주어야 한다. Mesenchymal stem cells (MSC) should give to sustain and passaged baeyangreul before fusion, because the start differentiation ceases proliferation. Ca 2 + 및 Fe 2 + 이 첨가되지 않은 PBS로 약 3회 배양기 바닥을 씻어준 후 0.25% 트립신(Trypsin-EDTA; GIBCO, USA)용액으로 처치하여 배양기 바닥에서 세포가 떨어지기 시작하면 10% FBS로 트립신(trypsin) 작용을 억제시키고 15 ml 튜브에 옮긴 뒤 원심분리한다. Ca 2 + and Fe 2 + is washed with approximately three times the incubator bottom with no added PBS 0.25% trypsin; by treatment with (Trypsin-EDTA GIBCO, USA) solution when starting to get the cells off the incubator bottom 10% FBS to inhibit trypsin (trypsin) action were separated after centrifugation transferred to a 15 ml tube. 얻어진 세포들은 헤모사이토미터(hemocytometer)로 수를 세고 다시 배양기에 넣어 배양을 시작하는데 2차 배양(subculture)에 적합한 세포의 농도는 약 5X10 4 /cm 2 가 적당하다. The resulting cells are hemo to count the number in cytometer (hemocytometer) again put in culture incubator start concentration of cells suitable for subculture (subculture) is suitable from about 5X10 4 / cm 2.

실험예 1. 배양된 세포의 면역형질 ( Immunophenotyping Experimental Example 1. Immune transfected in cultured cells (Immunophenotyping of of Cultured Cultured Cells ) Cells)

증식된 세포의 특성을 형광-활성 세포 분류기(Fluorescence-activated cell sorter)(FACS Vantage SE; Becton Dickinson)를 이용하여 특이적인 표면 항원 발현자를 발색하여 보았다. The characteristics of the proliferating cells fluorescence-activated cell sorter (Fluorescence-activated cell sorter); using the (FACS Vantage SE Becton Dickinson) seen by coloring those specific for surface antigen expression.

세포의 염색은 4℃에서 30분간 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate)(FITC) 또는 파이코에리스린(phycoerythrin; PE) 또는 항-표지 복합의 시-크롬 (cy-chrome conjugated anti-marker mAbs)(적정 농도에서) 발현시켰다. Staining of the cell is the isothiocyanate in 4 ℃ 30 bungan fluorescein (fluorescein isothiocyanate) (FITC) or pie nose EPO Lin (phycoerythrin; PE) or anti-during the labeling compound - chrome (cy-chrome conjugated anti-marker mAbs) were expressed (at an appropriate concentration). 조혈제 계통 표지(Hematopoietic lineage markers)(CD13, CD14, CD34, HLA-ABC, HLA-DR), 세포간질 수용기(matrix receptors)(CD44), CD106(관 세포 점착 분자(vascular cell adhesion molecule)), CD73, c-Kit, CDw90(Thy-1), 그리고 MSC 표지(SH-2, SH-3)를 인산염 완화 염(phosphate buffered saline)(PBS) 에 2% FBS가 첨가된 용액에 위와 같은 항체를 발현하였다. Johyeolje grid cover (Hematopoietic lineage markers) (CD13, CD14, CD34, HLA-ABC, HLA-DR), cellular interstitial receptor (matrix receptors) (CD44), CD106 (tube cell adhesion molecules (vascular cell adhesion molecule)), CD73 , c-Kit, CDw90 (Thy-1), and the MSC cover (SH-2, SH-3) a phosphate relief salts (phosphate buffered saline) (PBS) 2% FBS that express the antibody as above for the addition of the solution to It was.

증식 조사(proliferation study)와 세포 주기(cell cycle)를 보기 위해서 PI(propidium iodine; Pharmingen, USA) 10㎍으로 발색하며, RNAse A(sigma, USA)을 처리하여 분석하였다. Proliferation irradiation PI to see the (study proliferation) and cell cycle (cell cycle); coloring with (propidium iodine Pharmingen, USA) 10㎍ and was analyzed by treatment with RNAse A (sigma, USA).

실험예 2. 인공연골의 조직학적 검사 Experimental Example 2. Histologic examination of the artificial cartilage

조직 채취 후 바로 조직 구성 성분 및 구조의 변성을 방지하기 위하여 10% 포름알데히드(formaldehyde)에 담가 12~24시간 동안 고정하였다. After harvesting tissue soaked in 10% formaldehyde (formaldehyde) in order to directly prevent the denaturation of the tissue composition and structure it was fixed for 12 to 24 hours. 10%의 포름알데히드 고정 후 고정액을 제거하기 위해서 신선하게 계속 흐르는 물에 약 12~24시간 수세하고, 자동 침투기(autotechnicon)를 사용하여 탈수, 투명, 파라핀(paraffin) 침투 과정을 12단계의 과정을 거쳐 14~15 시간 동안 수행하였다. Of 10% formaldehyde and then fixed dewatering using an automatic penetration group (autotechnicon), and freshly continue flowing about 12-24 hours washing in water to remove the fixative, transparent, paraffin (paraffin) infiltration process to the process of Step 12 the via was carried out for 14 to 15 hours. 파라핀 침투가 끝난 조직은 박절기로 얇게 박절하기 위해 파라핀 블록(paraffin block)으로 제작하는 포매(embedding) 작업을 수행하였다. Organization after the paraffin infiltration was performed for embedding (embedding) work to build a block of paraffin (paraffin block) to a thin bakjeol bakjeolgi. 포매되어 만들어진 파라핀 블록은 회전형 박절기(rotary microtome)를 사용하여 4 ㎛의 두께로 박절(section)하여 부유 항온 수조에 띄워 박절 시 위축된 조직을 편 후 슬라이드에 부착시킨 후 물기를 제거하기 위해 45° 경사로 세워 2~3분 방치하여 수분을 완전 제거하였다. Paraffin block made is embedded is rotatable bakjeolgi (rotary microtome) 45 to remove excess water and then was deposited on the slide by bakjeol (section) in the 4 ㎛ thickness of space from the floating water bath bakjeol hour after Part cost atrophy tissue using ° ramp built to stand 2-3 minutes to remove water completely. 이렇게 건조된 슬라이드는 60°C 정도의 신전기(slide warmer)에 30~60분간 올려놓고, 파라핀을 녹이면서 조직을 슬라이드 글라스에 단단히 접착시킨다. Thus drying the slides are thereby firmly adhere the tissue 30 to place for 60 minutes while melting the paraffin to an electrical (slide warmer) of about 60 ° C to the new slide glass. 위 과정을 다 거친 슬라이드의 상태를 관찰 한 후 H&E, 사프라닌-O, AB-PAS염색을 실시하였다. After observing the state of the above process is a rough slide was subjected to H & E, four plastic non -O, AB-PAS staining.

실험예 3. 면역조직화학적 검사 ( Immuno - histochemistry ) Experimental Example 3. The immunohistochemical test (Immuno - histochemistry)

포매 되어 만들어진 파라핀 블록을 회전형 박절기 (Rotary microtome)를 사용하여 4 ㎛의 두께로 박절(section)하여 부유 항온 수조에 띄워 박절 시 위축된 조직을 편 후 슬라이드에 부착시킨 다음 슬라이드를 56°C 정도의 신전기(slide warmer)에 4시간 올려놓고 파라핀을 녹이면서 조직을 슬라이드 글라스에 단단히 접착 시켰다. To the bakjeol (section) in the 4 ㎛ thickness of space from the floating water bath level was attached to the slide after the pieces have contracted tissue during bakjeol then slides 56 ° C using an embedded is made of a paraffin block rotatable bakjeolgi (Rotary microtome) Shin electric (slide warmer) was firmly adhered to the organization four hours he put on a slide glass melting paraffin. 이렇게 준비된 슬라이드를 자일렌(xylene) 처리하여 조직 내부와 외부에 포매된 파라핀을 제거하고 알코올을 이용하여 탈수과정을 거쳤다. In this way the prepared slide processing xylene (xylene) to remove the paraffin-embedded tissue in the inside and outside, and subjected to dehydration by using an alcohol. 증류수로 10분간 수세한 후 고정액(4% phosphate formaldehyde solution)에 담가 두었다가 3% 과산화수소를 사용하여 내인성 퍼옥시다제(endogenous peroxidase)를 차단시키고 항원 용액이 조직 내부로 잘 흡수되도록 하기 위해 1% 트립신을 사용하여 투고성을 높여 주었다. After 10 minutes in distilled water, washed with water Soak the fixing solution (4% phosphate formaldehyde solution) using a 3% hydrogen peroxide to block endogenous peroxidase (endogenous peroxidase) and a 1% trypsin to ensure that the antigen solution is well absorbed into the tissue It was used to enhance the contribution castle. PBS에 1% BSA가 포함된 용액(blocking solution)으로 실온에서 30분 이상 비특이적 반응을 차단한 후 1차 항체 콜라겐 타입 II(collagen type Ⅱ; Sigma, MA, USA)로 사람의 제 2형 교원질을 사용하여 4°C에서 12시간 처리 한다. A second type of the person in; (Sigma, MA, USA collagen type Ⅱ) collagen 1% BSA solutions that contain (blocking solution) into After blocking for 30 minutes or more non-specific reaction at room temperature for the primary antibody collagen type II in PBS used in processes for 12 hours at 4 ° C. 바이오틴(Biotin)이 부착된 2차 항체 (biotinylated secondary antibody)를 사용하여 1차 항체를 인식시키고, ABC 용액(avidin and biotinylated horseradish peroxidase macromolecular complex)을 처리하여 반응 부위를 증폭시킨다. Biotin (Biotin) thereby attached a secondary antibody using the (biotinylated secondary antibody) recognizing the primary antibody and, amplifying the reactive site by treating the solution of ABC (avidin and biotinylated horseradish peroxidase macromolecular complex). 그 다음 2차 항체가 부착되어 있는 효소의 활성(peroxidase activity)으로 AEC 기질을 침착하게 하여 갈색의 염색물을 보이게 함으로써 1차 항원이 위치하는 곳과 발현되는 정도를 관찰한다. Then the secondary antibody to the deposition of the active (peroxidase activity) of the enzyme attached AEC substrate was observed that the degree where the primary antigen by the look of a brown dyeings location and expression.

실험예 4. 1 ㎍/ ml 의 농도로 함유된 나노입자가 코팅된 마이크로스피의 주사현미 경관찰 Test Example 4. Observation of the scanning microscope 1 ㎍ / ml concentration of the nanoparticles is coated with the micro-containing RY

상기 실시 예의 줄기세포 배양방법에 의한 간엽줄기세포의 분화를 관찰하기 위하여 성장인자가 함유된 나노입자가 코팅된 마이크로스피어의 표면분석을 주사현미경을 이용하여 관찰하였다. A surface analysis of the embodiment of stem cell with a nanoparticle containing a growth factor coating to observe the differentiation of mesenchymal stem cells according to the culture method microspheres were observed under a scanning electron microscope.

도 1에서 보는 바와 같이, TGF-b3가 함유된 나노입자들이 마이크로스피어의 표면은 약 100~200 nm 정도의 나노입자가 정전기적 반응에 의하여 코팅되어 있는 모습이 관찰되었다. The state that the nanoparticles of about 100 ~ 200 nm is coated by an electrostatic reaction was observed, the surface of nanoparticles with a TGF-b3-containing microspheres were as shown in the first. 대조군인 마이크로스피어(a)에서는 마이크로스피어의 표면이 매끄럽게 나타나 있는 반면에 TGF-b3가 함유된 나노입자가 얹어진 마이크로스피어(c)의 표면은 표면이 매끄럽지 못하고 우둘투둘한 모양을 하고 있다. In the microspheres (a) a control surface of the microspheres (c) Gene TGF-b3 is a nanoparticle containing a topped whereas appeared smooth the surface of the microsphere has a smooth surface not woodultudul shapes. 따라서, 헤파린/폴리엘라이신(poly(L-lysine)) 나노입자가 TGF-b3를 함유하고 있고 함유된 나노입자에서 조절된 TGF-b3가 방출됨으로서 줄기세포의 분화를 조절할 수 있다는 것을 증명하였다. Thus, it demonstrated that heparin / poly Ella who is (poly (L-lysine)) nanoparticles can control the differentiation of stem cells by being containing TGF-b3, and may contain a controlled from nanoparticles TGF-b3 is released.

실험예 5. 성장인자를 함유한 나노입자가 코팅된 마이크로스피어에서 줄기세포의 H & E염색법 관찰 Experimental Example 5 in which the nano-particle containing the growth factor-coated microspheres of stem cell H & E staining observed

5-1. 5-1. H&E 염색 H & E staining

염색을 위해 탈 파라핀과 함수과정을 거친 슬라이드를 헤마톡실린(hematoxylin) 용액 (Gill`s hematoxylin)에 약 10분간 처리하였다가 흐르는 물에 과도의 헤마톡실린 여액을 세척하고 핵 이외의 부분에 염색된 헤마톡실린 용액을 제거하기 위해 0.5% 알콜성 HCl로 탈색한 후 중화과정으로 0.7% 암모니아를 처리한다. For dyeing washing paraffin and hematoxylin a slide subjected to a function process (hematoxylin) solution (hematoxylin Gill`s) transition of the hematoxylin filtrate flowing water is treated for about 10 minutes and the dye in the portions other than the core after the hematoxylin to remove the bleaching solution appeared to 0.5% alcoholic HCl to process the 0.7% ammonia to the neutralization process. 그 다음 에오신(eosin) 용액에서 1분간 염색 후 탈수와 투명 과정을 거친 다음 광학 현미경으로 핵과 세포질의 염색 상태를 관찰한다. That the following eosin (eosin) 1 bungan staining after dehydration and transparent in the process solution passed then observes the state of the nucleus and cytoplasm staining by light microscopy.

5-2. 5-2. 성장인자를 함유한 나노입자가 코팅된 마이크로스피어에서 줄기세포의 H & E염색법 관찰 H & E staining in which the nanoparticles containing the growth factor-coated microspheres stem cells observed

상기 실시 예의 줄기세포 배양방법에 의한 간엽줄기 세포의 분화를 관찰하기 위하여 성장인자가 함유된 나노입자가 코팅된 마이크로스피어에서 세포의 핵염색법을 통하여 세포의 생존을 관찰하였다. The embodiment stem cell culture method for the survival of the cells was observed by staining the nuclei of cells in which the nanoparticles containing the growth factor-coated microspheres in order to observe the differentiation of mesenchymal stem cells by.

도 2에서 보는 바와 같이, TGF-b3가 함유된 나노입자가 함유된 마이크로스피어 표면에 세포의 점착이 많음을 알 수 있다. Also, it can be seen that the adhesion of the cells to the microspheres, plenty surface containing the nanoparticles of the TGF-b3 containing, as shown in FIG. 1 ㎍/ml의 TGF-b3가 함유된 나노입자가 함유된 마이크로스피어에서는 마이크로의 표면에 많은 수의 간엽줄기세포가 부착되어 있음을 관찰하였다. 1 ㎍ / ml of microspheres TGF-b3 that the nanoparticles containing the content of In was observed that the number of mesenchymal stem cells to the surface of the micro is attached.

실험예 6. RT - PCR 법에 의한 연골세포 분화 마커인 콜라겐 타입 II 발현 관찰 Experimental Example 6. RT - PCR method cartilage differentiation marker of type II collagen-expressing cells according to the observed

상기 실시 예에서 수행한 줄기세포의 배양방법에 의한 간엽줄기 세포의 분화를 관찰하기 위하여 성장인자의 자극에 의한 연골세포의 분화마커를 RT-PCR 방법으로 관찰하였다. A differentiation marker of the embodiment of cartilage cells by the stimulation of the growth factor in order to observe the differentiation of mesenchymal stem cells according to the culture method of stem cells carried out in the example was observed by RT-PCR method.

트리졸(Trizol) (Tel-Test Inc.)을 이용하여 세포에서 회수한 RNA 시료로 첫 번째 가닥(1st strand) cDNA 를 얻은 후, 콜라겐 타입 II 와 GAPDH 에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR를 수행하였다. Was performed Trizol (Trizol) PCR using primers specific to (Tel-Test Inc.) the RNA in a sample collected from the cells using the first strand (1st strand) after obtaining the cDNA, collagen type II and GAPDH . 사용한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다. Nucleotide sequence of the primers used are as follows.

토끼를 이용한 콜라겐 타입 II 의 센스프라이머는 5′-GCA CCC ATG GAC ATT GGA GGG-3(서열번호 1), 안티센스 프라이머는 5′-GAC ACG GAG TAG CAC CAT CG-3′(서열번호 2)이며, 토끼를 이용한 GAPDH의 센스 프라이머는 5′-AAC TCA CTG GCA TGG CCT T-3'(서열번호 3)이고, 안티센스 프라이머는 5′-GCT TCA CCA CCT TCT TGA TG-3′(서열번호 4)로서 256bp 의 PCR 산물을 아가로스 겔(agarose gel)에서 확인하였다. Sense primer for type II collagen using rabbit 5'-GCA CCC ATG GAC ATT GGA GGG-3 (SEQ ID NO: 1), antisense primer is 5'-GAC ACG GAG TAG CAC CAT CG-3 '(SEQ ID NO: 2) , the sense primer of GAPDH using rabbit 5'-AAC TCA CTG GCA TGG CCT T-3 '(SEQ ID NO: 3) and antisense primer 5'-GCT TCA CCA CCT TCT TGA TG-3' (SEQ ID NO: 4) the PCR product of 256bp was found in the agarose gel (agarose gel) as.

도 3에서 보는 바와 같이, TGF-b3가 1 ㎍/㎖의 농도로 함유된 나노입자가 코팅된 마이크로스피어에서 간엽줄기세포의 연골화를 연골세포의 분화 마커인 콜라겐 타입 II의 발현으로 관찰하였지만, TGF-b3가 1 ㎍/㎖의 농도로 함유된 나노입자가 코팅된 마이크로스피어에서 간엽줄기세포에서는 콜라겐 타입 II의 발현을 관찰하지 못했다. Such as, but observed with TGF-b3 is 1 ㎍ / ㎖ level expression of the nanoparticles, the microspheres in the differentiation marker of the bone Chemistry of mesenchymal stem cells, chondrocytes coating collagen type II contained in the shown in Figure 3, in the TGF-b3 is a nanoparticle containing a 1 ㎍ / ㎖ concentration of coated microspheres in the mesenchymal stem cells was not observed the expression of collagen type II. 상기의 실험에서 보여주듯이 성장인자가 없는 마이크로스피어에서는 연골세포의 분화가 진행되지 않는 것을 확인하였다. As shown in the above experiment, the microspheres do not have growth factor was confirmed that the differentiation of cartilage cells that do not progress.

실험예 7. 주사현미경사진 관찰 Experimental Example 7. The SEM observation picture

상기 실시 5에서 수행한 신경세포의 배양방법에 의한 PC12 세포의 분화를 관찰하기 위하여 PC12 세포의 분화를 주사현미경으로 관찰하였다. To examine the differentiation of PC12 according to the culture method of neuronal cells was done in the embodiment 5, the differentiation of PC12 cells observed in the scanning microscope. 성장인자가 함유되지 않은 마이크로스피어에 점착된 PC12 세포를 비교 예로 하였다. The PC12 cells adhered to the microspheres containing growth factors that are not compared as an example.

도4에서 보는 바와 같이, TGF-b3가 1 ㎍/ml의 농도로 함유된 나노입자가 코 팅된 마이크로스피어에서 간엽줄기세포의 연골화를 면역조직학적 검사를 통해서 살펴본 결과, 거의 모든 세포에서 연골세포의 분화 마커인 콜라겐 타입 II가 관찰되었다. As shown in Figure 4, the result of examining TGF-b3 is 1 ㎍ / nanoparticle containing a concentration of ml is through the nose tingdoen Immunohistochemical examination of cartilage Chemistry of mesenchymal stem cells in microspheres, cartilage cells in almost every cell the differentiation markers of type II collagen were observed.

제제예 1. 주사제제의 제조 Formulation Example 1: Preparation of the injections

실시예 1의 마이크로스피어...........................10㎎ The microspheres of Example 1 ........................... 10㎎

소디움 메타비설파이트..............................3.0㎎ Sodium metabisulfite .............................. 3.0㎎

메틸파라벤.........................................0.8㎎ Methylparaben ......................................... 0.8㎎

프로필파라벤.......................................0.1mg ....................................... 0.1mg Propylparaben

주사용 멸균증류수...................................적량 Injectable sterile distilled water q.s. ...................................

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 2㎖로 한 후, 2㎖ 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조한다. Mixing the above components and then to 2㎖ a conventional method, filled and sterilized in a 2㎖ capacity ampoule to prepare an injection.

제제예 2. 환제의 제조 Preparation Example 2. Preparation of pills

실시예 2의 마이크로비드..............................120㎎ Embodiment microbeads .............................. 120㎎ of Example 2

옥수수 전분..........................................100㎎ Corn starch .......................................... 100㎎

멸균증류수............................................적량 ............................................ sterile distilled water q.s.

상기의 성분을 혼합하고, 통상의 환제 제조방법으로 0.3cm 지름으로 제환하여 환제를 제조한다. Mixing the above components, and in a conventional pill manufacturing methods jehwan to 0.3cm in diameter to prepare the pills.

제제예 3. 정제의 제조 Preparation Example 3. Preparation of tablets

실시예 1의 마이크로스피어............................200 ㎎ Microspheres ............................ 200 ㎎ of Example 1

유당.................................................100 ㎎ Lactose ................................................. 100 ㎎

전분.................................................100 ㎎ Starch ................................................. 100 ㎎

스테아린산 마그네슘....................................적량 Magnesium stearate .................................... q.s.

통상의 정제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 타정하여 정제를 제조한다. In a usual method of mixing the components of the tablets produced and purified to produce an appointed other.

제제예 4. 캡슐제의 제조 Formulation Example 4. Preparation of capsules

실시예 2의 마이크로비드 .............................100 ㎎ Embodiment microbeads of Example 2 ............................. 100 ㎎

유당..................................................50 ㎎ Lactose ................................................. .50 ㎎

전분..................................................50 ㎎ Starch ................................................. .50 ㎎

탈크...................................................2 ㎎ Talc ................................................. ..2 ㎎

스테아린산마그네슘.....................................적량 Magnesium stearate ..................................... q.s.

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다. According to a conventional capsule production method of mixing the components above and filled in a gelatin capsule to prepare a capsule.

제제예 5. 액제의 제조 Preparation Example 5. Preparation of solutions

실시예 1의 마이크로스피어.............................1000 ㎎ The microspheres of Example 1 ............................. 1000 ㎎

설탕....................................................20 g Sugar................................................. ... 20 g

이성화당................................................20 g Isomerization per ................................................ 20 g

레몬향 .................................................적량 Lemon zest ................................................ . q.s.

정제수를 가하여 전체 1000㎖로 맞추었다. Ml of purified water was adjusted to a total 1000㎖. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다. A mixture of components of the according to the conventional method for preparing liquid, and then, was charged in a brown bottle and sterilized to prepare a liquid preparation.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다. The composition is also relatively mubang but suitable components for beverages to the preferred embodiment of mixing the composition, according to regional and national symbols such demand layer, a demand country, use purpose modified the mixing ratio optionally performed.

상기와 같이, 본 발명은 성장인자를 함유한 고분자전해질복합체로 구성된 나노입자를 정전기적 반응에 의하여 코팅을 시켜, 연골조직재건 및 재생을 위한 마이크로스피어 또는 마이크로비드에 관한 것으로 주사형 마이크로제작 스캐폴드로 이용될 수 있다. As described above, the present invention is a polymer electrolyte by a composite nanoparticle composed of the electrostatic reactions to the coating, as a scanning microfabrication scaffold on the microspheres or microbeads for cartilage tissue reconstruction and regeneration containing the growth factor It can be used as.

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Claims (7)

  1. 성장인자 TGF-b3을 0.01 내지 1㎍/㎖의 농도로 함유한 헤파린/폴리엘라이신(poly(L-lysine)) 복합체로 구성된 나노입자를 표면에 부착시킨 연골조직재건 및 재생을 위한 마이크로스피어 또는 마이크로비드. Growth factors, TGF-b3, or the microspheres for a heparin / poly Ella who is (poly (L-lysine)) complex in which cartilage tissue reconstruction and reproduction adhered to the surface of nanoparticles consisting of a concentration of 0.01 to 1㎍ / ㎖ microbeads.
  2. 삭제 delete
  3. 삭제 delete
  4. 제 1항에 있어서, 덱사메타손(dexamethasone) 또는 DHEA(Dehydroepiandro sterone)를 추가적으로 포함함을 특징으로 하는 마이크로스피어 또는 마이크로비드. The method of claim 1 wherein the dexamethasone (dexamethasone) or DHEA microspheres or microbeads, characterized in that the further comprises (Dehydroepiandro sterone).
  5. 삭제 delete
  6. 농도가 0.01 내지 1㎍/㎖인 성장인자 TGF-b3를 함유한 헤파린/폴리엘라이신(poly(L-lysine)) 복합체로 구성된 나노입자를 표면에 부착시킨 마이크로스피어 또는 마이크로비드 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 연골조직재건 및 재생을 위한 주사용 약학조성물. A concentration of 0.01 to 1㎍ / ㎖ the growth factor TGF-b3 heparin / poly Ella who is (poly (L-lysine)) allowed the composite nanoparticles in which microspheres or microbeads and a pharmaceutically attached to a surface consisting of injectable pharmaceutical composition for the cartilage tissue reconstruction and regeneration containing the excipients.
  7. 삭제 delete
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