KR100707516B1 - 인산 이온 측정용 바이오 센서 - Google Patents

인산 이온 측정용 바이오 센서 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전해용액에서 공급되는 전위를 인산 이온 측정효소에 전달하는 마이크로 크기의 백금전극 또는 유리탄소전극; 상기 전극의 표면에 전해중합반응을 통하여 결합되고, 인산 이온 측정효소를 고정화시키는 나노 크기의 전도성 고분자; 및 상기 전도성 고분자와 공유결합되어 고정화되고, 인산 이온과 선택적으로 반응하는 인산 이온 측정효소를 포함하여 구성되는 인산 이온 측정용 바이오 센서 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
전도성 고분자, 공유결합, 고정화, 나노, 바이오 센서, 인산

Description

인산 이온 측정용 바이오 센서{Biosensor for detecting phosphate ion and preparation method thereof}
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 인산 이온 측정용 바이오 센서의 구조를 개략적으로 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 인산 이온 측정용 바이오 센서의 제조방법을 나타낸 흐름도이고,
도 3은 본 발명에 따른 나노-전도성고분자층의 표면을 나타내는 SEM 사진이고(a: 0.1 V/s, b: 0.5 V/s, c: 1.0 V/s, d: 1.0 V/s의 주사속도에서 자란 나노-전도성고분자층의 두께),
도 4는 1.0 V/s의 주사속도에서 자란 본 발명에 따른 나노-전도성고분자층에 대한 C1s 및 O1s 피크의 ESCA 스펙트럼을 나타낸 것이고,
도 5는 인산이온의 농도에 따른 본 발명의 바이오 센서의 순환전압전류를 나타낸다(점선: 인산이온 부재, 파선: 0.1 mM 인산이온, 실선: 0.5 mM 인산이온)
<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>
10... 바이오 센서 1... 마이크로-백금 또는 유리탄소 전극
2... 나노-전도성고분자층 3... 인산이온 측정효소
본 발명은 인산 이온 측정용 바이오 센서에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 전류측정법에 의한 무기 인산 이온의 양을 측정하기 위한 인산 이온 측정용 바이오 센서 및 그 제조방법에 관한 것이다.
일반적으로, 무기 인산 이온의 측정은 환경, 임상, 식품 분석 등의 분야에 있어서 그 중요성이 매우 높다. 무기 인산은 주요한 환경 오염물질의 하나로써, 환경 보호에 관한 관심이 증가함에 따라 이러한 오염 물질의 레벨 측정은 일상 생활의 폐수 처리에 있어서 가장 중요시 되고 있다. 강이나 바다에서 부영양화(eutrophication) 현상에 따른 수질의 오염은 인산의 농도가 증가함에 기인한다는 것은 널리 알려진 사실이다. 또한, 수중에서 인산의 농도 증가는 용존 산소(Dissolved oxygen)의 농도를 낮추고, 질식으로 인한 수중 생물의 죽음을 야기하기도 한다.
그리고, 식품에 있어서 인산의 과도한 섭취에 따른 영향 및 부갑상선기능항진증(Hyperparathyroidism), 비타민D 결핍증, 판코니 증후군(Fanconi syndrome) 등의 진단에 있어서 인산의 인체내에 미치는 영향 등은 널리 알려져 있는 사실이다.
게다가, 많은 생물학적 반응은 ATP 가수분해와 결합되어 있고, 특정 세포간의 반응과 신호의 메카니즘(Mechanism)을 좀 더 명확히 이해하기 위해서 방출되어 있는 인산 이온을 모니터링하는 것에 대한 필요성이 증대되고 있다.
한편, 종래의 수질 중에 포함된 인산 이온을 측정하기 위한 방법으로는 색도측정법(Colorimetric method)이나 전위차측정법(Potentiometric method)이 널리 사용되어 오고 있다.
그러나, 상기 색도측정법은 시료의 산성화에 따라 인산 이온의 수치가 변하게 되는 문제점이 있는데, 이는 다른 인산기를 포함하는 화합물의 가수분해와 부유물로부터의 인산의 탈착에 의하여 발생하게 된다. 게다가, 이러한 색도측정법은 측정방법이 복잡하고, 측정하는데 있어서 오랜 시간이 소요되는 문제점이 있다. 또한, 전위차측정법은 음료수에 포함된 미량의 인산 이온을 측정하기에 충분한 감도를 갖추지 못하는 문제점이 있다.
한편, 이와 같은 문제점을 극복하기 위한 대안으로서 바이오 센서의 일 예로써 효소 센서가 등장하게 되었다. 상기의 효소 센서는 종래 통상적으로 사용되는 인산 이온 측정법에 비해 감도(Selectivity)가 뛰어나고, 사용이 간편하다는 장점이 있다.
이와 같은 효소 센서에 있어서, 한정된 공간 속에 효소의 이동성이 제한되어야 하는데 이를 효소 고정화(enzyme immobilization)라 한다. 효소 고정화의 방법으로는 크게 가두기(Entrapment)와 표면 고정화로 분류된다.
먼저, 가두기 방법(포괄법)은 효소를 작은 공간 속에 물리적으로 밀봉하는 방법으로써 다양한 막 물질을 사용할 수 있다는 장점이 있으나, 용액으로의 효소의 유출, 심각한 확산저항, 효소의 활성과 안정도의 감소, 미세환경 조절의 결여와 같 은 문제점이 있기 때문에 잘 사용되어지지 않는다.
다음으로, 표면 고정화 방법은 효소가 지지물질(Matrix)의 표면에 고정화되는 것으로써 주요한 형태로는 흡착(Adsorption)과 공유결합(Covalent binding)이 있다. 흡착이란 효소가 반데르발스 힘 또는 분산력과 같은 약한 물리적 힘에 의하여 지지입자의 표면에 부착되는 것을 의미하며, 흡착된 부위는 활성부위가 전혀 영향을 받지 않아서 흡착이 되더라도 거의 모든 활성이 유지된다는 장점이 있다. 그러나, 흡착에 의한 결합력은 약하기 때문에 특히 강한 유체역학적 힘이 존재할 때 효소가 탈착되는 문제점이 발생하게 되고, 더욱이 지지물질의 농도가 증가하게 되면 효소의 활성화가 저하되며 인산 이온의 측정시 감도(Sensitivity)가 떨어지게 되는 문제점이 야기된다.
한편, 인산 이온 측정에 대해 상기와 같은 문제점으로 인하여 지지물질과 효소와의 공유결합에 대한 많은 연구가 진행되고 있으나, 적절한 지지물질에 대한 개발이 이루어지지 못하고 있는 실정이고, 또한 효소와 공유결합되는 지지물질의 사이즈가 크기 때문에 소형화를 이루지 못하는 문제점이 있다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위하여 창출된 것으로서, 인산 이온 측정 효소와 공유결합하여 효소를 고정화시킬 수 있는 전도성 고분자를 이용하여 효소의 탈착을 방지하고, 많은 양의 효소를 수용할 수 있는 인산 이온 측정 바이오 센서를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은, 나노 크기의 전도성 고분자를 마이크로 크기의 백금전극 또는 유리탄소전극에 전해중합시킴으로써 바이오 센서의 크기를 소형화 시킬 수 있는 인산 이온 측정용 바이오 센서를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 전해용액에서 공급되는 전위를 인산 이온 측정효소에 전달하는 마이크로 크기의 백금전극 또는 유리탄소전극; 상기 전극의 표면에 전해중합반응을 통하여 결합되고, 상기 인산 이온 측정효소를 고정화시키는 나노 크기의 전도성 고분자; 및 상기 전도성 고분자와 공유결합되어 고정화되고, 인산 이온과 선택적으로 반응하는 인산 이온 측정효소를 포함하여 구성되는 인산 이온 측정용 바이오 센서를 제공한다.
여기서, 상기 백금전극 또는 유리탄소전극은 10 내지 100 ㎛의 크기를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 전도성 고분자는 카르복시기를 지닌 폴리티오펜 화합물이며, 바람직하게는 폴리-5,2':5',2"-터티오펜-3'-카르복시산(poly-5,2':5',2"-terthiophene-3'-carboxylic acid), 3'-브로모-2,2':5',2"-터티오펜(3'-bromo-2,2':5',2"-terthiophene), 3',4'-디아미노-2,2':5',2"-터티오펜(3',4'-diamino-2,2':5',2"-terthiophene), 3'-살리실알데히드-2,2':5',2"-터티오펜(3'-salicylaldehyde-2,2':5',2"-terthiophene) 및 3'-보론-디히드록시-2,2':5',2"-터 티오펜(3'-boron-dihydroxy-2,2':5',2"-terthiophene)으로 이루어진 군에서 선택된다. 이때, 상기 전도성 고분자의 크기는 5 nm 내지 40 nm인 것이 바람직하다.
또한, 상기 인산 이온 측정효소는 피루베이트 산화효소인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 마이크로 크기의 백금전극 또는 유리탄소전극을 알루미나 슬러리로 연마하고, 증류수로 세척시키는 전처리단계; 카르복시기를 지닌 티오펜 단량체를 순환적으로 전위를 변화시켜 나노 크기의 전도성 고분자로 중합시키고, 중합된 상기 전도성 고분자가 상기 전극 표면에 코팅되는 전해중합단계; 코팅된 상기 전도성 고분자를 완충용액에 침전시켜 상기 전도성 고분자의 카르복시기를 활성시키는 활성화단계; 및 상기 활성화단계를 거친 후에, 완충용액에 피루베이트 산화효소를 배양시켜 상기 전도성 고분자의 카르복시기와 공유결합시켜 상기 피루베이트 산화효소를 고정시키는 고정화단계를 포함하여 이루어지는 인산 이온 측정용 바이오 센서의 제조방법을 제공한다.
여기서, 상기 전해중합단계는 상기 티오펜 단량체를 이용하여 Ag/AgCl 기준전위를 통해 1 V/s의 주사속도로 0 V에서 1.6 V까지 전위를 주사하는 것을 3회 반복하여 5 nm 내지 40 nm 크기의 상기 전도성 고분자가 중합된다.
또한, 상기 활성화단계의 완충용액은 N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid, 이하 'HEPES'라 약칭함), 트리스(히드록시메칠)아미노메탄(Tris (hydroxymethyl)aminomethane), 이하 'Tis'라 약칭함), N,N-비스((2-히드록시에칠)-2-아미노에탄설포닉산(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, 이하 'BES'라 약칭함), 및 3-N-모르폴 리노 프로판설포닉산(3-N-Morpholino propansulfonic acid, 이하 'MOPS'라 약칭함) 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 완충용액은 1-에틸-3-(3-(디메틸아미노)-프로필) 카르보디이미드(1-ethyl-3(3-(dimethylamino)-propyl carbodiimide), 및 N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, 이하 'NHS'라 약칭함)로 이루어진 군에서 선택된 활성화제를 포함함으로써 전도성 고분자의 카르복시기를 활성화한다.
본 발명을 첨부된 도면으로 보다 상세하게 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 인산 이온 측정용 바이오 센서의 구조를 개략적으로 나타낸다.
먼저, 도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 인산 이용 측정용 바이오 센서(10)는 마이크로 크기의 백금전극(1), 전도성 고분자(Conducting polymer) 및 인산 이온 측정 효소를 포함하여 구성된다.
이때, 인산 이온 측정 효소로 피루베이트 산화효소(pyruvate oxidase, 3)를 이용하여 본 발명의 바이오 센서로 인산 이온이 함유된 용액에서 반응하면 하기 반응식 1과 같이 인산 이온을 측정할 수 있다.
[반응식 1]
Figure 112005051780785-pat00001
하기 반응식 2와 같이, 반응식 1에서 얻어진 과산화수소(Hydrogen peroxide; H2O2)의 산화 전류(Oxidation current)를 측정하여 인산 이온을 측정할 수 있다.
[반응식 2]
Figure 112005051780785-pat00002
본 발명에서 사용된 마이크로 크기의 백금전극 또는 유리탄소전극에서 선택된 전극(1)은 인산 이온 측정효소가 시료 중에 존재하는 인산 이온과 반응하여 발생된 과산화수소의 산화 전류를 측정하며, 그 재질은 이온 분석에 통상적으로 사용되는 것이 사용될 수 있다.
상기 전도성 고분자는 상기 전극(1)의 표면에 전해중합반응을 통하여 결합되며 인산 이온과 반응하는 인산 이온 측정효소와 공유결합하여 상기 인산 이온 측정효소를 고정화시킨다.
이를 보다 자세히 설명하면, 상기 전도성 고분자는 상기 인산 이온 측정효소를 고정화시키는 지지물질로서 상기 전도성 고분자의 카르복시기(-COOH-)와 상기 인산 이온 측정효소의 아미노기(-NH2-)가 공유결합되어진다. 상기 전도성 고분자는 예를들어 나노 크기의 폴리-5,2';5',2"-터티오펜-3'-카르복시산(poly-5,2';5',2"-terthiophene-3'-carboxylic acid, 이하 "나노-CP"라 약칭함)가 사용되는 것이 바람직하다. 이때, 상기 나노-CP(2)는 크기가 5 nm 내지 40 nm인 것이 바람직하다. 상기 나노-CP(2)의 크기가 작아질수록 인산 이온 측정용 칩(Chip)에 장착되는 바이오 센서의 크기를 소형화할 수 있는 잇점이 있게 된다.
상기 인산 이온 측정효소는 상기 전도성 고분자와 공유결합되어 고정화된다. 여기서, 상기 인산 이온 측정효소는 피루베이트 산화효소(3)가 사용되는 것이 바람직하며, 상기 인산 이온 측정효소는 수중에 존재하는 인산 이온과 반응하여 상기 반응식 1 및 반응식 2를 통해 살펴본 바와 같이 과산화수소의 산화전류를 측정하여 인산 이온의 양을 측정하게 되는 것이다.
또, 도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 인산 이온 측정용 바이오 센서의 제조방법을 나타낸 흐름도이다.
먼저, 도 2를 참조하면, 준비된 마이크로 크기의 백금전극 또는 유리탄소전극에서 선택된 전극을 알루미나 슬러리로 연마하고, 증류수로 세척시켜 표면처리한다(S1). 상기 전극은 그 표면 위에 티오펜 단량체가 전해중합된 전도성 고분자가 코팅되기 때문에, 상기 전도성 고분자와의 접촉 효율을 높이기 위하여 표면처리된다.
다음으로, 티오펜 단량체를 순환적으로 전위를 변화시켜 나노 크기의 전도성 고분자로 중합시키고, 중합된 상기 전도성 고분자는 상기 전극에 코팅된다(S2). 구체적으로, 상기 전극 표면에 상기 티오펜 단량체를 디클로로 메탄과 같은 비수용매에 지지전해질인 테트라부틸 암모니움퍼크로레이트와 함께 녹인 다음 전류-전압 주사법(potential cycling), 일정전위 인가법(potential step) 또는 일정전류법 (Gavanostatic method) 등의 전기화학적 중합법을 사용하여 나노 크기의 입자로 구성된 전기전도성 고분자막을 만든다. 나노 입자의 크기 조정을 위해 전압주사 속도 및 전압 인가 시간을 여러 가지로 변화시켜 전기화학적으로 막을 형성시킨다.
이때, 상기 티오펜 단량체는 Ag/AgCl 기준전위를 통해 1 V/s의 주사속도로 0 V에서 1.6 V까지 전위를 주사하는 것을 3회 반복하여 나노 크기의 상기 전도성 고분자로 전해중합되는 것이 바람직하다.
다음으로, 코팅된 상기 전도성 고분자를 완충용액에 침전시켜 상기 전도성 고분자의 카르복시기를 활성시킨다(S3).
이때, 상기 완충용액은 N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid, 이하'HEPES'라 약칭함), 트리스(히드록시메칠)아미노메탄(Tris (hydroxymethyl)aminomethane), 이하 'Tis'라 약칭함), N,N-비스((2-히드록시에칠)-2-아미노에탄설포닉산(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, 이하 'BES'라 약칭함), 및 3-N-모르폴리노 프로판설포닉산(3-N-Morpholino propansulfonic acid, 이하 'MOPS'라 약칭함)으로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 완충용액은 1-에틸-3-(3-(디메틸아미노)-프로필) 카르보디이미드(1-ethyl-3(3-(dimethylamino)-propyl) carbodiimide, 이하 'EDC'라 약칭함), 및 N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, 이하 'NHS'라 약칭함)로 이루어진 군에서 선택된 활성화제를 포함함으로써 전도성 고분자의 카르복시기를 활성화한다.
예를들어, 코팅된 상기 전도성 고분자를 EDC가 포함된 HEPES 완충용액에 2시간 내지 24시간 정도 침전시켜 상기 전도성 고분자의 카르복시기를 활성화시킨다.
마지막으로, 활성화단계를 거친 후, 완충용액에 인산이온 측정효소를 배양시켜 상기 전도성 고분자의 카르복시기와 공유결합함으로써 상기 효소를 고정시킨다(S4).
이때, 인산이온 측정효소를 투입한 후 0∼4℃의 온도에서 6시간 내지 24시간 동안 배양시킨다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 바이오 센서 제작
1) 전처리 및 전해중합 단계
10 ㎛의 백금전극을 0.5 ㎛ 알루미나 슬러리 현탁용액에서 연마천(Polishing cloth)으로 깨끗이 닦아낸 후, 증류수로 세척시켜 표면처리하였다. 그 후, 0.1 M TBAP(tetrabutylammonium perchlorate, electrochemical grade; Fluka)/CH2Cl2(99.8%, anhydrous, sealed under N2 gas; Sigma)용액에 용해된 0.1 mM의 5,2':5',2"-터티오펜-3'-카르복실산 단량체를 이미 알려진 방법으로 1000 mV/s에서 세차례에 걸쳐 0 내지 1.6 V 사이로 순환적으로 전위변화를 일으켜 백금전극 위에 나노-전도성 고분자층(나노-CP층)을 만들었다(Rahman et al., Biosens.Bioelectron., 19, 1565-71, 2004; Rahman et al., Biosens.Bioelectron., 21, 257-65, 2005). 과량 사용된 단량체를 CH2Cl2으로 세척하여 제거하였다. 이때, 사용된 5,2':5',2"-터티오펜-3'-카르복실산 단량체는 이미 알려진 방법에 의해 제조되었다(Lee at al., Synth.Met., 126, 105-110, 2002).
2) 활성화 및 고정화 단계
나노-CP층으로 코팅된 백금전극(나노-CP/PtE)은 나노-CP층의 카르복시기의 활성화를 위하여 6시간 동안 10.0 mM의 1-에틸-3-(3-(디메틸아미노)-프로필) 카르보디이미드(1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl) carbodiimide, EDC; Sigma)를 함유한 20 mM의 N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid, HEPES; Sigma) 완충용액(pH 7.0)에 담궜다. 그 후, EDC로 처리된 나노-CP/PtE를 HEPES 완충용액으로 세척한 후, 4℃에서 12시간 동안 20 mM HEPES 완충용액(pH 7.0)에서 피루베이트 산화효소(EC. 1.2.3.3, 100 units/mg from aerococcus species, PyO Sigma)과 인큐베이션하여 피루베이트 산화효소와 공유결합한 나노-CP층으로 코팅된 백금전극(PyO/나노-CP/PtE)을 제작하였다.
<실시예 2> 나노-CP층의 평가
1) SEM 사진
실시예 1에서 얻어진 나노-CP층의 주사 속도에 따른 입자크기 변화를 Cambridge Stereoscan 240으로 측정하였다. 그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 주사 속도가 증가할수록 CP의 입자크기는 감소하였고, 1 V/s 이상의 주사속도에서는 CP의 입자크기가 더 이상 변하지 않았다(도 2c 참조). 도 2d에 나타난 바와 같이, 1 V/s의 주사 속도에서 자란 CP의 입자크기는 5 내지 40 nm이며, 3회 싸이클 후 자란 나노-CP층의 두께는 약 200 nm이었다.
2) ESCA 실험
1 V/s의 주사속도에서 자란 나노-CP층에 대한 C1s 및 O1s 스펙트럼을VG Scientific ESCALAB 250 XPS 스펙트로미터를 이용하여 측정한 결과는 도 3과 같다.
3) QCM(quartz crystal microbalance) 실험
SEIKO EG & G model QCA 917과 PAR model 263A potentiostat/galvanostat를 이용하여 측정하였다. 이때, Au 작동전극(면적 0.196 ㎠, 9MHz, AT-cut quartz crystal)을 이용하였다(Rahman et al., Biosens.Bioelectron., 21, 257-65, 2005). 그 결과, 싸이클 횟수가 증가됨에 따라 진동수가 감소되었고, 진동수 변화는 0.96 kHz이었다. 3회 싸이클 후 자란 나노-CP층의 양은 이미 알려진 식(Rahman et al., Anal.Chem., 75, 1123-1129, 2003)으로 계산한 결과, 1.05 ± 0.17 ㎍이었고, 면적당 분자수는 3.6 ± 0.6 X 10-9 mol/㎠이었다.
<실시예 3> 바이오센서의 전기화학적인 평가
1) 순환 전압전류 측정
순환 전압전류곡선(cyclic voltammogram)을 얻기 위한 전기화학 측정 실험을 Potentiostat/Galvanostat(모델: KST-P2, Kosentech)를 이용하여 HEPES 완충용액에서 수행하였다. 이때, 사용한 전기화학 셀은 작동전극으로 실시예 1에서 제작한 백금전극(면적 7㎟), 기준전극으로 Ag/AgCl(in 포화 KCl), 반대전극으로 백금선을 각각 이용하였다. 전기화학 셀에 20 mM의 HEPES 완충용액 9.0 ml를 넣고 샘플(1.0 X 10-5M) 1.0 ml를 첨가하고 pH 6.5, 30℃에서 교반하면서 정상상태의 전류를 측정하였다.
도 5와 같이, 인산이온이 없는 경우(점선)에는 전류변화가 나타나지 않지만, 0.1 mM의 인산이온을 함유한 경우(파선)에는 +0.41 V를 나타내었고, 인산이온의 농 도가 0.1 mM에서 0.5 mM로 증가된 경우(실선)에는 촉매적 산화전류가 증가되었다.
2) 대시간 전류법(Chronoamperometric method)
대시간 전류법은 상기 실시예 1에서 제작된 백금전극에 +0.4V의 전위차를 적용하여 효소반응으로부터 얻어진 과산화수소를 산화함으로써 수행되었다. 전기화학 셀에 연속적으로 다양한 양의 인산을 첨가하면서 계속되었다.
그 결과, 1.0 내지 100 μM의 인산이온 농도에서 정상전류와 비례적인 상관관계를 나타내었고(상관계수 0.997), 인산이온의 검출한계는 0.3 μM이었다.
<실시예 4> 다른 음이온의 방해 효과
실시예 1에서 제작한 바이오센서에 대한 다른 음이온들 예를들어, Cl-, SO4 2-, NO3 -, ClO4 - 및 TPP의 방해효과를 검토하였다. 이들 방해가 예상되는 이온을 함유하고 있는 시료용액을 각각 또는 전체 방해 이온을 다 함유하고 있는 시료용액을 제조하여 상기와 동일한 효소센서를 사용하여 신호를 측정 하여 실험 후 방해 작용을 검토하였다.
그 결과, 어떠한 음이온도 본 발명의 바이오센서로 인산이온 측정시 방해하지 않았다.
<실시예 5> 장시간 안정성 평가
실시예 1에서 제작한 바이오센서의 인산이온에 대한 반응성을 매 일주일마다 조사하였다. 매 측정은 처음 제작한 동일한 효소센서를 새로이 제조한 시료 용액을 사용하여 매주 신호의 크기를 측정하였다. 매 실험 후, 바이오센서를 20 mM HEPES 완충용액으로 세척하고 4℃에서 보관하였다. 그 결과, 한달까지는 초기민감도의 95%를 유지하였다.
<실시예 6> 인간혈청샘플에의 적용
실시예 1에서 제작된 바이오센서를 이용하여 인간혈청샘플에 존재하는 인산이온 농도를 측정하였다. 인간 혈청 샘플은 매 측정 전, 10배 희석하여 사용하며 시료를 제조하였으며, 전류법으로 3회 실시하였다. 혈청샘플에 존재하는 인산이온 농도는 검정곡선을 작성하여 계산하였다. 그 결과, 총 인산이온 농도는 1.19 ±0.085 mM이었다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 인산 이온 측정용 바이오 센서는 인산 이온 측정 효소와 공유결합하여 효소를 고정화시킬 수 있는 전도성 고분자를 이용함으로써 효소의 탈착을 방지할 수 있고, 많은 양의 효소를 수용할 수 있기 때문에 보다 정확한 인산 이온의 측정이 가능하고, 나노 크기의 전도성 고분자를 마이크로 크기의 백금전극 또는 유리탄소전극에 전해중합시킴으로써 바이오 센서의 크기를 소형화 시킬 수 있을 뿐만 아니라, 간단한 방법에 의하여 바이오 센서를 제조할 수 있어 비용 및 시간을 줄일 수 있는 장점이 있기 때문에 인간혈청샘플 등에 존재하는 인산이온 농도를 평가하는 데에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (8)

  1. 인산 이온 측정효소가 인산 이온과 반응하여 발생한 과산화수소의 산화전류를 측정하는 마이크로 크기의 백금전극 또는 유리탄소전극;
    상기 전극의 표면에 전해중합반응을 통하여 결합되고, 상기 인산 이온 측정효소를 고정화시키는 나노 크기의 전도성 고분자; 및
    상기 전도성 고분자와 공유결합되어 고정화되고, 인산 이온과 선택적으로 반응하는 인산 이온 측정효소를 포함하여 구성되며,
    상기 전도성 고분자가 폴리-5,2':5',2"-터티오펜-3'-카르복시산(poly-5,2':5',2"-terthiophene-3'-carboxylic acid)이고, 상기 인산 이온 측정효소가 피루베이트 산화효소인 것을 특징으로 하는 인산 이온 측정용 바이오 센서.
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