KR100707515B1 - Detection apparatus of polymerase chain reaction fragments using screen printed electrode and the detecting method thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 내부에 전도성 고분자로 표면이 코팅된 스크린인쇄 탄소전극, 은/염화은 기준전극 및 백금 상대전극이 포함되어 모세관 전기영동에 의해 샘플의 분리, 신호 검출 및 증폭이 이루어지는 측정저장조;와 이 측정저장조로 샘플을 주입하여 주는 샘플저장조;와 이 샘플저장조와 연결되어 샘플을 배출시키는 샘플폐수저장조;와 샘플폐수저장조와 샘플저장조 및 측정저장조를 T자 형태로 연결시켜 샘플이 이동되는 모세관 채널; 및 측정저장조로 유입되는 샘플의 급격한 변동을 방지하기 위한 완충용액을 공급하여 주는 완충저장조를 구비한 스크린인쇄전극을 이용한 PCR 증폭물의 측정장치에 관한 것이다.The present invention includes a screen-printed carbon electrode, a silver / silver chloride reference electrode and a platinum counter electrode coated with a conductive polymer therein, the measurement storage tank for separation of samples, signal detection and amplification by capillary electrophoresis; and the measurement A sample reservoir for injecting the sample into the reservoir; and a sample connected to the sample reservoir for A sample wastewater storage tank for discharging; and a capillary channel through which the sample is moved by connecting the sample wastewater storage tank, the sample storage tank, and the measurement storage tank in a T shape; And it relates to a measuring device for PCR amplification using a screen printed electrode having a buffer storage tank for supplying a buffer solution for preventing a sudden change of the sample flowing into the measurement reservoir.
PCR, 전기영동, 모세관, 스크린인쇄전극, 전도성 고분자 PCR, electrophoresis, capillary, screen printed electrode, conductive polymer
Description
도 1은 본 발명의 일 실시 예에 따른 스크린인쇄 탄소전극을 제조방법을 나타낸 도면이고,1 is a view showing a method of manufacturing a screen printed carbon electrode according to an embodiment of the present invention,
도 2는 본 발명의 다른 실시 예에 따른 PCR 증폭물의 측정장치를 개략적으로 나타낸 도면이고,2 is a view schematically showing an apparatus for measuring a PCR amplification product according to another embodiment of the present invention,
도 3은 본 발명의 일 예에 따른 PCR 증폭물의 전압전류곡선을 나타낸 도면((■)는 전도성 고분자가 코팅된 스크린인쇄 탄소전극, (●)는 스크린인쇄 탄소전극)이고,Figure 3 is a diagram showing the voltage and current curve of the PCR amplification product according to an embodiment of the present invention ((■) is a screen-printed carbon electrode coated with a conductive polymer, (●) is a screen-printed carbon electrode),
도 4는 본 발명의 일 예에 따른 PCR 증폭물의 분리 및 측정에 대한 전기영동곡선을 나타낸 도면((A)는 스크린인쇄 탄소전극, (B)는 전도성 고분자가 코팅된 스크린인쇄 탄소전극)이고,4 is a diagram showing an electrophoretic curve for the separation and measurement of PCR amplification products according to an embodiment of the present invention ((A) is a screen-printed carbon electrode, (B) is a screen-printed carbon electrode coated with a conductive polymer),
도 5는 본 발명의 일 예에 따른 PCR 증폭물의 분리 및 측정에 미치는 전기장의 세기의 효과를 나타낸 도면이고,5 is a view showing the effect of the strength of the electric field on the separation and measurement of PCR amplification product according to an embodiment of the present invention,
도 6a는 본 발명의 일 예에 따른 PCR 증폭물의 분리 및 측정에 미치는 모세 관 채널의 아웃렛과 작업면의 이격거리의 관계를 나타낸 도면이고,Figure 6a is a view showing the relationship between the separation distance of the work surface and the outlet of the capillary channel on the separation and measurement of PCR amplification product according to an embodiment of the present invention,
도 6b는 본 발명의 일 예에 따른 PCR 증폭물의 전류측정 반응과 시료 주입 시간과의 관계를 나타낸 도면이고,6B is a view showing a relationship between a current measurement reaction of a PCR amplification product and a sample injection time according to an embodiment of the present invention,
도 7a는 본 발명의 일 예에 따른 샘플의 5,10,20,30 싸이클 이후의 PCR 증폭물의 연속적인 전기영동곡선을 나타낸 도면이고,Figure 7a is a diagram showing a continuous electrophoresis curve of the PCR amplification after 5, 10, 20, 30 cycles of a sample according to an embodiment of the present invention,
도 7b는 본 발명의 일 예에 따른 증폭 싸이클 횟수와 피크 면적과의 관계를 나타낸 도면이다.7B is a diagram illustrating a relationship between the number of amplification cycles and a peak area according to an embodiment of the present invention.
본 발명은 PCR 증폭물의 측정장치 및 방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 미세유체 시스템에 있어서 PCR 증폭물을 간편하게 측정할 수 있는 스크린인쇄 탄소전극을 이용한 PCR 증폭물의 측정장치 및 측정방법에 관한 것이다.The present invention relates to an apparatus and method for measuring PCR amplification products, and more particularly, to an apparatus and method for measuring PCR amplification products using a screen-printed carbon electrode capable of easily measuring PCR amplification products in a microfluidic system. .
일반적으로 PCR(Polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄반응)은 DNA의 이중가닥을 주형(Template)으로 하여 동시에 Primer annealing site의 특정 염기서열을 증폭하는 방법으로, 구체적으로 PCR은 특정 DNA부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관 내에서 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로 아주 적은 양의 DNA를 이용하여 많은 양의 DNA합성이 가능하기 때문에 분자생물학적으로 제한효소의 발견만큼 획기적인 것이라고 할 수 있다.In general, PCR (Polymerase chain reaction) is a method of amplifying a specific sequence of a primer annealing site by using a double strand of DNA as a template, and in particular, PCR specifically targets a specific DNA region. By repeat synthesis and amplification of the desired DNA molecule in vitro, it is possible to synthesize a large amount of DNA using a very small amount of DNA, so it can be said that the molecular biology is as revolutionary as the discovery of restriction enzymes.
이와 같은 PCR을 통하여 in vitro 상에서 특정 부위의 DNA를 105~108배까지 수시간 내에 증폭시킬 수 있으며, 이렇게 증폭된 DNA를 여러 가지 실험에 이용할 수 있다. 특히, PCR의 응용분야는 분자생물학실험을 비롯한 유전병 진단, 암 유전자의 조기 진단, 바이러스 유전자의 조기 진단, 인체 게놈 연구, 유전공학 연구 및 법의학적 연구 등에 널리 이용되고 있으며, 점차 그 적용범위가 확대되고 있는 실정이다.Such PCR can amplify DNA in a specific region up to 10 5 to 10 8 times in a few hours in vitro , and the amplified DNA can be used in various experiments. In particular, the application fields of PCR are widely used in the diagnosis of genetic diseases, including molecular biology experiments, early diagnosis of cancer genes, early diagnosis of viral genes, human genome research, genetic engineering research, and forensic research. It's happening.
한편, 모세관 전기영동(Capillary electrophoresis; 이하 'CE'라 명명하기로 한다)은 통상적인 DNA분석을 위한 미세유체(Microfluidic) 시스템에 있어서 강력한 분석 도구로써 이용되고 있다.Capillary electrophoresis (hereinafter referred to as CE) has been used as a powerful analytical tool in microfluidic systems for conventional DNA analysis.
또한, 이와 같은 CE 장치의 소형화는 비용의 절감, 빠른 열 및 물질 전달, 분석 시간과 분석 원료의 소비의 단축 등의 효과를 가져 올 수 있다.In addition, the miniaturization of such a CE device may result in cost reduction, fast heat and mass transfer, analysis time and consumption of analyte.
종래 CE 장치는 레이저 유도 형광(Laser induced fluorescene) 측정 방법에 이루어져 오고 있는 실정이다. 이러한 기술은 마이크로시스템에 있어서 높은 감도(Sensitivity)와 호환성(Compatibility)를 제공할 수 있는 장점이 있으나, 부피가 크고 복잡한 부가적인 계측장비를 필요로 하는 문제점이 있다.Conventional CE devices have been made in a method of measuring laser induced fluorescene. This technique has the advantage of providing high sensitivity and compatibility in a microsystem, but has a problem of requiring bulky and complicated additional measurement equipment.
또한, 레이저 유도 형광 측정방법은 발광을 내는 물질 또는 유도체에 한정되어 사용될 수 밖에 없는 문제점이 있으며, 더욱이 생물학적으로 관심의 대상이 되는 물질은 이와 같은 레이저 유도 형광 측정방법을 사용하여 측정시 효율이 떨어지는 문제점이 있게 된다.In addition, the laser-induced fluorescence measurement method has a problem that can be limited to the light emitting material or derivative, and furthermore, the material of biological interest is less efficient when measuring using such laser-induced fluorescence measurement method. There is a problem.
따라서, 이와 같은 문제점을 해결하고자 최근에는 전기화학적 측정법을 이용한 CE가 관심의 대상이 되고 있다.Therefore, in order to solve such a problem, CE using an electrochemical measurement method has recently been of interest.
전기화학적 측정법을 이용한 CE는 분석 성능의 감소 없이 미세유체 측정 시스템을 소형화시킬 수 있는 장점을 지니고 있기 때문이다.This is because CE using electrochemical measurement has the advantage of miniaturizing microfluidic measurement systems without sacrificing analytical performance.
그러나, 현재까지 전기화학적인 방법으로 미세 유체 칩을 이용한 PCR분석은 거의 기술발전이 이뤄지지 못하고 있는 실정이다.However, until now, the PCR analysis using the microfluidic chip by the electrochemical method has been hardly achieved.
다만, 최근에 삽입물질(Intercalator)에 근간을 두거나 면역자기 비드(Immunomagnetic beads)에 근간을 둔 PCR증폭의 전기화학적 측정방법이 개시되고 있으며, 이와 같은 방법은 장치의 소형화를 이룰 수 있도록 반응/분리 채널을 갖춘 집적 전기화학적 측정기를 제공할 수 있는 장점이 있으나, 간접적인 방법으로 그 적용에 있어서 측정 효율의 저하 및 측정 데이터가 부정확하다는 문제점을 내포하고 있다.Recently, however, electrochemical measurement methods of PCR amplification based on intercalators or based on immunomagnetic beads have been disclosed, and such methods can be used for reaction / separation in order to achieve miniaturization of the device. Although there is an advantage in providing an integrated electrochemical measuring device with a channel, there is a problem of inferior measurement efficiency and inaccurate measurement data in its application in an indirect manner.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위하여 창출된 것으로서, 감도가 높으며 안정성이 우수하고, 소형화가 가능하고, 분리 효율이 뛰어난 스크린인쇄전극을 이용한 PCR 증폭물의 측정장치를 제공하고자 하는 것이다.The present invention has been made to solve the above problems, and to provide a measuring device for PCR amplification using a screen printing electrode having high sensitivity, excellent stability, miniaturization, and excellent separation efficiency.
본 발명의 또 다른 목적은, 반복적인 샘플의 측정시에도 오차를 줄일 수 있고, 재사용이 가능하며, 부가적인 복잡한 계측기기가 없이도 정확하게 데이터의 측정이 가능한 PCR 증폭물의 측정방법을 제공하고자 하는 것이다. Still another object of the present invention is to provide a method for measuring PCR amplification products, which can reduce errors even when measuring repeated samples, is reusable, and can accurately measure data without additional complicated measuring devices.
상기 목적을 달성하기 위하여, In order to achieve the above object,
본 발명은 내부에 전도성 고분자로 표면이 코팅된 스크린인쇄 탄소전극, 은/염화은 기준전극 및 백금 상대전극이 포함되어 모세관 전기영동에 의해 샘플의 분리, 신호 검출 및 증폭이 이루어지는 측정저장조;와 상기 측정저장조로 샘플을 주입하여 주는 샘플저장조;와 상기 샘플저장조와 연결되어 샘플을 배출시키는 샘플폐수저장조;와 상기 샘플폐수저장조와 상기 샘플저장조 및 상기 측정저장조를 T자 형태로 연결시켜 샘플이 이동되는 모세관 채널; 및 상기 측정저장조로 유입되는 샘플의 급격한 변동을 방지하기 위한 완충용액을 공급하여 주는 완충저장조를 구비한, 스크린인쇄전극을 이용한 PCR 증폭물의 측정장치를 제공한다.The present invention includes a screen-printed carbon electrode, a silver / silver chloride reference electrode and a platinum counter electrode coated with a conductive polymer therein, a measurement storage tank for separating samples, detecting signals, and amplifying by capillary electrophoresis; A sample storage tank for injecting a sample into a storage tank; and a sample wastewater storage tank connected with the sample storage tank to discharge the sample; and a capillary tube in which the sample is moved by connecting the sample wastewater storage tank with the sample storage tank and the measurement storage tank in a T-shape; channel; And it provides a measuring device for PCR amplification using a screen printing electrode having a buffer storage tank for supplying a buffer solution for preventing a sudden change of the sample flowing into the measurement reservoir.
여기서, 상기 전도성 고분자는 카르복시기를 지닌 폴리티오펜 화합물이며, 바람직하게는 폴리-5,2':5',2"-터티오펜-3'-카르복시산(poly-5,2':5',2"-terthiophene-3'-carboxylic acid), 폴리-3'-브로모-2,2':5',2"-터티오펜(poly-3'-bromo-2,2':5',2"-terthiophene), 폴리-3',4'-디아미노-2,2':5',2"-터티오펜(poly-3',4'-diamino-2,2':5',2"-terthiophene), 폴리-3'-살리실알데히드-2,2':5',2"-터티오펜(poly-3'-salicylaldehyde-2,2':5',2"-terthiophene) 및 폴리-3'-보론-디히드록시-2,2':5',2"-터티오펜(poly-3'-boron-dihydroxy-2,2':5',2"-terthiophene)으로 이루어진 군에서 선택된다. Here, the conductive polymer is a polythiophene compound having a carboxyl group, preferably poly-5,2 ': 5', 2 "-terthiophene-3'-carboxylic acid (poly-5,2 ': 5', 2). "-terthiophene-3'-carboxylic acid), poly-3'-bromo-2,2 ': 5', 2" -terthiophene (poly-3'-bromo-2,2 ': 5', 2 " -terthiophene), poly-3 ', 4'-diamino-2,2': 5 ', 2 "-terthiophene (poly-3', 4'-diamino-2,2 ': 5', 2"- terthiophene), poly-3'-salicyaldehyde-2,2 ': 5', 2 "-terthiophene (poly-3'-salicylaldehyde-2,2 ': 5', 2" -terthiophene) and poly-3 '-Boron-dihydroxy-2,2': 5 ', 2 "-terthiophene (poly-3'-boron-dihydroxy-2,2': 5 ', 2" -terthiophene) .
또한, 상기 모세관 채널은 샘플의 흡착을 방지하기 위하여 상기 모세관 채널 내부면에 도포되는 물질로써 선형 폴리아크릴아마이드를 더 포함하는 것이 바람직하다.In addition, the capillary channel preferably further includes linear polyacrylamide as a material applied to the inner surface of the capillary channel to prevent adsorption of the sample.
또한, 상기 스크린인쇄 탄소전극은 상기 모세관 채널의 아웃렛과 20∼50㎛로 이격시키는 폴리머 스페이서를 더 구비하는 것이 바람직하다.The screen-printed carbon electrode may further include a polymer spacer spaced apart from the outlet of the capillary channel by 20 to 50 μm.
또한, 상기 전도성 고분자로 표면이 코팅된 스크린인쇄 탄소전극은 폴리에틸렌 베이스 필름상에 은 전도성 층이 인쇄되는 제1단계; 상기 제1단계를 거친 후에 스크린 인쇄기로 카본 잉크를 인쇄하는 제 2단계; 작업면과 은 전도성 층 사이의 접합부분을 커버할 수 있는 절연층이 인쇄되는 제3단계; 모세관 채널의 아웃렛과 스크린인쇄 탄소전극 사이의 간격을 유지시키기 위하여 폴리머 스페이서를 적층시키는 제4단계; 및 상기 제4단계를 거친 스크린인쇄 탄소전극을 카르복시기를 지닌 폴리티오펜 단량체 용액에 침전시켜 중합반응을 통해 코팅시키는 제5단계를 포함하여 제조되는 것이 바람직하다. In addition, the screen-printed carbon electrode coated with a surface of the conductive polymer is a first step of printing a silver conductive layer on a polyethylene base film; A second step of printing carbon ink using a screen printing machine after the first step; A third step of printing an insulating layer which can cover a junction between the working surface and the silver conductive layer; Stacking polymer spacers to maintain a gap between the outlet of the capillary channel and the screen printed carbon electrode; And a fifth step of depositing the screen-printed carbon electrode subjected to the fourth step in a polythiophene monomer solution having a carboxyl group and coating the same through a polymerization reaction.
이때, 상기 카르복시기를 지닌 폴리티오펜 단량체는 5,2':5',2"-터티오펜-3'-카르복시산, 3'-브로모-2,2':5',2"-터티오펜, 3',4'-디아미노-2,2':5',2"-터티오펜, 3'-살리실알데히드-2,2':5',2"-터티오펜 및 3'-보론-디히드록시-2,2':5',2"-터티오펜을 사용한다.In this case, the polythiophene monomer having a carboxyl group is 5,2 ': 5', 2 "-terthiophene-3'-carboxylic acid, 3'-bromo-2,2 ': 5', 2" -terthiophene, 3 ', 4'-diamino-2,2': 5 ', 2 "-terthiophene, 3'-salicylaldehyde-2,2': 5 ', 2" -terthiophene and 3'-boron-di Hydroxy-2,2 ': 5', 2 "-terthiophene is used.
또한, 상기 모세관 채널은 세척 후 건조시키는 제1단계; 메톡시실란 수용액으로 채널 내부를 피복시키는 제2단계; 및 아크릴아마이드 수용액으로부터 중합반응을 통해 상기 모세관 채널의 내부 표면을 코팅시키는 제3단계를 포함하여 코팅되는 것이 바람직하다.In addition, the capillary channel is a first step of drying after washing; A second step of covering the inside of the channel with an aqueous solution of methoxysilane; And a third step of coating the inner surface of the capillary channel through a polymerization reaction from an acrylamide aqueous solution.
이때, 상기 메톡시실란 화합물은 3-메타크릴옥시프로필트리메톡시실란(3-methacryloxypropyltrimethoxysilane), 비닐트리아세톡시실란(Vinyltriacetoxysilane), 비닐트리(메톡시-에톡시)실란(Vinyltri(β-methoxy-ethoxy)silane), 비닐트리클로로실란(Vinyltrichlorosilane) 또는 메틸비닐디클로로실란(Methylvinyldichlorosilane)을 사용한다.In this case, the methoxysilane compound is 3-methacryloxypropyltrimethoxysilane, vinyltriacetoxysilane, vinyltri (methoxy-ethoxy) silane (Vinyltri (β-methoxy-) ethoxy) silane, vinyltrichlorosilane or methylvinyldichlorosilane.
여기서, 상기 제3단계의 아크릴아미이드 수용액은 중합전에 필터를 통해 필터링되고, 초음파처리에 의해 산소가 제거되는 것이 바람직하다.Here, it is preferable that the acrylamide aqueous solution of the third step is filtered through a filter before polymerization and oxygen is removed by ultrasonication.
본 발명의 다른 측면에 따른 PCR증폭물의 측정방법은 모세관 채널을 분리 매개체로 충전시키는 제1단계; 샘플폐수저장조를 완충용액으로 충전시키는 제2단계; 측정저장조를 전기영동 완충용액으로 충전시키는 제3단계; 상기 모세관 채널을 -200V/cm의 전기장의 세기로 1차 전기영동시키는 제4단계; 샘플을 샘플저장조에 투입시키는 제5단계; -200V/cm의 전기장의 세기를 인가하여 전기영동을 개시하고, 상기 샘플폐수저장조는 기저상태로 되고, 상기 측정저장조 및 상기 샘플저장조는 여기상태가 되는 제6단계; 및 상기 제6단계를 거친 후에 상기 샘플저장조는 기저상태로 되고, 상기 측정저장조 및 상기 샘플폐수저장조는 여기상태가 되어 분리되는 제7단계를 포함하여 이루어진다.According to another aspect of the present invention, a method for measuring PCR amplification includes: a first step of filling a capillary channel with a separation medium; A second step of filling the sample wastewater storage tank with a buffer solution; A third step of filling the measurement reservoir with an electrophoretic buffer solution; Performing a fourth electrophoresis on the capillary channel with an intensity of an electric field of -200 V / cm; A fifth step of introducing the sample into the sample reservoir; A sixth step of starting electrophoresis by applying an intensity of an electric field of -200 V / cm, wherein the sample wastewater storage tank is in a ground state, and the measurement storage tank and the sample storage tank are in an excited state; And a seventh step after the sixth step, the sample storage tank is in a ground state, and the measurement storage tank and the sample wastewater storage tank are in an excited state.
여기서, 상기 제1단계의 분리 매개체는 하이드록시에틸셀룰로오스, 폴리에틸렌옥시드(Poly(ethylene oxide)), 폴리-N,N-디메틸아크릴아미드(Poly-N,N-dimethylacrylamide), 폴리비닐 피롤리돈(Polyvinyl pyrrolidone), 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol with fluorocarbon tails), 또는 폴리-N-아크릴로일아미 노프로파놀(Poly-N-acryloylaminopropanol)을 포함하며, 0.75 (w/v)%의 하이드록시에틸셀룰로오스를 포함하는 것이 바람직하다.Here, the separation medium of the first step is hydroxyethyl cellulose, polyethylene oxide (Poly (ethylene oxide)), poly -N, N- dimethyl acrylamide, (Poly- N, N -dimethylacrylamide), polyvinylpyrrolidone (Polyvinyl pyrrolidone), polyethylene glycol comprising a (polyethylene glycol with fluorocarbon tails), or poly-propanol (Poly- N -acryloylaminopropanol) a -N- acryloyl amino Smirnoff, 0.75 (w / v)% of hydroxyethyl cellulose It is preferable to include.
이하 첨부된 도면을 참조로 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. Hereinafter, exemplary embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 스크린인쇄 탄소전극을 제조방법을 나타낸 도면이고, 도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 PCR 증폭물의 측정장치를 개략적으로 나타낸 도면이고, 도 3은 본 발명의 일 예에 따른 PCR 증폭물의 전압전류곡선을 나타낸 도면((■)는 전도성 고분자가 코팅된 스크린인쇄 탄소전극, (●)는 전도성 고분자가 코팅되지 않은 스크린인쇄 탄소전극)이고, 도 4는 본 발명의 일 예에 따른 PCR 증폭물의 분리 및 측정에 대한 전기영동곡선을 나타낸 도면((A)는 전도성 고분자가 코팅되지 않은 스크린인쇄 탄소전극, (B)는 전도성 고분자가 코팅된 스크린인쇄 탄소전극)이고, 도 5는 본 발명의 일 예에 따른 PCR 증폭물의 분리 및 측정에 미치는 전기장의 세기의 효과를 나타낸 도면이고, 도 6a는 본 발명의 일 예에 따른 PCR 증폭물의 분리 및 측정에 미치는 모세관 채널의 아웃렛과 작업면의 이격거리의 관계를 나타낸 도면이고, 도 6b는 본 발명의 일 예에 따른 PCR 증폭물의 전류측정 반응과 샘플 주입 시간과의 관계를 나타낸 도면이고, 도 7a는 본 발명의 일 예에 따른 샘플의 5,10,20,30 싸이클 이후의 PCR 증폭물의 연속적인 전기영동곡선을 나타낸 도면이고, 도 7b는 본 발명의 일 예에 따른 증폭 싸이클 횟수와 피크 면적과의 관계를 나타낸 도면이다. 1 is a view showing a method for manufacturing a screen printed carbon electrode according to an embodiment of the present invention, Figure 2 is a schematic view showing a measuring device of a PCR amplification product according to another embodiment of the present invention, Figure 3 ((■) is a screen-printed carbon electrode coated with a conductive polymer, (●) is a screen-printed carbon electrode without a conductive polymer), and FIG. 4 shows a voltage-current curve of a PCR amplification product according to an embodiment of the present invention. Figure showing the electrophoresis curve for the separation and measurement of the PCR amplification product according to an embodiment of the present invention ((A) is a screen-printed carbon electrode not coated with a conductive polymer, (B) is a screen-printed carbon electrode coated with a conductive polymer) 5 is a view showing the effect of the electric field intensity on the separation and measurement of PCR amplification product according to an embodiment of the present invention, Figure 6a is a separation and PCR amplification product according to an embodiment of the present invention FIG. 6B is a view illustrating a relationship between a separation distance between an outlet of a capillary channel and a working surface and a measurement time of a PCR amplification product according to an example of the present invention, and a sample injection time. FIG. 7A Is a diagram showing a continuous electrophoretic curve of the PCR amplification after 5, 10, 20, 30 cycles of the sample according to an embodiment of the present invention, Figure 7b is amplification cycle number and peak area according to an embodiment of the present invention Is a diagram showing the relationship between.
먼저, 도 2를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 증폭물의 측정장치 는 측정저장조(Detection reservoir; DR)와 샘플저장조(Sample reservoir; SR)와 샘플폐수저장조(Sample waste reservoir; SWR)와 모세관 채널(Capillary channel)과 완충저장조(Buffer reservoir; BR)을 포함하여 구성된다.First, referring to FIG. 2, an apparatus for measuring PCR amplification products according to an embodiment of the present invention includes a measurement reservoir (DR), a sample reservoir (SR), and a sample waste reservoir (SWR). And a capillary channel and a buffer reservoir (BR).
상기 측정저장조는 내부에 전도성 고분자로 표면이 코팅된 스크린인쇄 탄소전극과 은/염화은(Ag/AgCl) 기준전극과 백금 상대전극(Pt-wire counter electrode)을 구비한다.The measurement reservoir includes a screen-printed carbon electrode, a silver / silver chloride (Ag / AgCl) reference electrode, and a platinum counter electrode (Pt-wire counter electrode) coated with a conductive polymer therein.
여기서, 상기 전도성 고분자는 카르복시기를 지닌 폴리티오펜 화합물일 수 있고, 폴리-5,2':5',2"-터티오펜-3'-카르복시산(poly-5,2':5',2"-terthiophene-3'-carboxylic acid), 폴리-3'-브로모-2,2':5',2"-터티오펜(poly-3'-bromo-2,2':5',2"-terthiophene), 폴리-3',4'-디아미노-2,2':5',2"-터티오펜(poly-3',4'-diamino-2,2':5',2"-terthiophene), 폴리-3'-살리실알데히드-2,2':5',2"-터티오펜 (poly-3'-salicylaldehyde-2,2':5',2"-terthiophene) 및 폴리-3'-보론-디히드록시-2,2':5',2"-터티오펜(poly-3'-boron-dihydroxy-2,2':5',2"-terthiophene)으로 이루어진 군에서 선택된다. Herein, the conductive polymer may be a polythiophene compound having a carboxyl group, and poly-5,2 ': 5', 2 "-terthiophene-3'-carboxylic acid (poly-5,2 ': 5', 2" -terthiophene-3'-carboxylic acid, poly-3'-bromo-2,2 ': 5', 2 "-terthiophene (poly-3'-bromo-2,2 ': 5', 2"- terthiophene), poly-3 ', 4'-diamino-2,2': 5 ', 2 "-terthiophene (poly-3', 4'-diamino-2,2 ': 5', 2" -terthiophene ), Poly-3'-salicyaldehyde-2,2 ': 5', 2 "-terthiophene (poly-3'-salicylaldehyde-2,2 ': 5', 2" -terthiophene) and poly-3 ' -Boron-dihydroxy-2,2 ': 5', 2 "-terthiophene (poly-3'-boron-dihydroxy-2,2 ': 5', 2" -terthiophene).
또한, 상기 스크린인쇄 탄소전극은 상기 모세관 채널의 아웃렛(Outlet)과 20∼50㎛ 정도 이격시키는 폴리머 스페이서(Polymer spacer)를 더 구비하는 것이 바람직하며, 이에 대해서는 후술할 전도성 고분자로 표면이 코팅된 스크린인쇄 탄소전극의 제조방법에서 자세히 설명하도록 한다.In addition, the screen-printed carbon electrode may further include a polymer spacer spaced apart from the outlet of the capillary channel by about 20 to 50 μm, which is a screen coated with a conductive polymer, which will be described later. It will be described in detail in the manufacturing method of the printed carbon electrode.
상기 샘플저장조는 상기 측정저장조로 샘플을 주입하여 주고, 상기 샘플폐수저장조는 상기 샘플저장조와 연결되어 시료를 배출하고, 후술할 전기영동시 샘플의 이동(Migration)이 가능하게 된다.The sample storage tank injects a sample into the measurement storage tank, and the sample wastewater storage tank is connected to the sample storage tank to discharge the sample, and the movement of the sample during electrophoresis to be described later is possible.
상기 완충저장조는 상기 측정저장조로 유입되는 샘플의 급격한 변동을 방지하기 위한 완충용액을 공급하여 준다. The buffer storage tank supplies a buffer solution for preventing rapid fluctuation of the sample introduced into the measurement storage tank.
상기 모세관 채널은 상기 샘플폐수저장조와 상기 샘플저장조 및 상기 측정저장조를 T자 형태로 연결시켜 샘플이 이동될 수 있도록 하며, 샘플의 흡착을 방지하기 위하여 상기 모세관 채널 내부면에 도포되는 물질로써 선형 폴리아크릴아마이드(Linear poly-acrylamide)를 더 포함하는 것이 바람직하다.The capillary channel connects the sample wastewater reservoir, the sample reservoir and the measurement reservoir in a T-shape to allow the sample to move, and is a material applied to the inner surface of the capillary channel to prevent adsorption of the sample. It is preferable to further include acrylamide (Linear poly-acrylamide).
본 발명의 일 예로써의 상기 모세관 채널은 샘플저장조로부터 샘플이 공급되는 투입 채널(Injection channels)은 9.64 mm 길이를 나타내고, 측정저장조로 이동되는 분리 채널(Separation channels)은 75.5 mm 길이를 나타낸다. As an example of the present invention, the capillary channel has an injection channel through which the sample is supplied from the sample reservoir has a length of 9.64 mm, and the separation channels moved to the measurement reservoir has a length of 75.5 mm.
그리고, 투입 채널과 분리 채널의 폭과 두께는 각각 50㎛ 이하, 20㎛ 이하인 모세관 채널이 사용되었다.In addition, capillary channels having a width and a thickness of 50 µm or less and 20 µm or less, respectively, were used.
한편, 본 발명의 일 예로써의 상기 모세관 채널의 아웃렛은 상기 스크린인쇄 탄소전극과 일정간격을 두고 직각방향으로 배열되어 위치하고, 일정간격은 50㎛ 이하가 되는 것이 바람직하다.On the other hand, as an example of the present invention, the outlet of the capillary channel is arranged in a direction perpendicular to the screen-printed carbon electrode at a predetermined interval, it is preferable that the predetermined interval is 50㎛ or less.
상기 모세관 채널의 아웃렛과 상기 스크린인쇄 탄소전극의 간격이 넓어지면 PCR 증폭물의 측정시에 측정기의 성능을 저하시키는 확산 밴드(Diffusive band)가 필연적으로 넓어진다.As the gap between the outlet of the capillary channel and the screen printed carbon electrode becomes wider, a diffuse band inevitably widens the performance of the measuring instrument when the PCR amplification product is measured.
이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 전도성 고분자로 표면이 코팅된 스크린인쇄 탄소전극의 제조방법에 대해 살펴보도록 한다.Hereinafter, the manufacturing method of the screen-printed carbon electrode coated with the surface of the conductive polymer according to an embodiment of the present invention will be described.
먼저, 도 1을 참조하면, 폴리에틸렌 베이스 필름상에 은 전도성 층(Ag conducting layer)를 인쇄시킨다(S1).First, referring to FIG. 1, an Ag conducting layer is printed on a polyethylene base film (S1).
은 전도성 층이 인쇄된 후, 60℃에서 20분 정도 경화시킨다. After the silver conductive layer is printed, it is cured for about 20 minutes at 60 ° C.
다음으로, 베이스 필름상에 은 전도성 층을 인쇄시킨 후에 스크린 인쇄기로 카본 잉크를 인쇄시킨다(S2).Next, after printing the silver conductive layer on the base film, the carbon ink is printed with a screen printer (S2).
본 발명의 일 예로써의 카본 잉크를 인쇄하는 방법은 스텐실(Patterned stencils) 인쇄기법을 사용하며, 인쇄된 카본 잉크는 두께가 0.5 ∼ 1.25 mm로 은 전도성 층 위에 인쇄된다. 카본 잉크가 인쇄된 후, 60∼70℃에서 20∼30분 정도 경화시킨다. The method of printing carbon ink as an example of the present invention uses a stencil printing technique, and the printed carbon ink is printed on the silver conductive layer with a thickness of 0.5 to 1.25 mm. After the carbon ink is printed, it is cured for about 20 to 30 minutes at 60 to 70 ° C.
다음으로, 작업면(Working area)과 은 전도성 층 사이의 접합부분을 커버할 수 있는 절연층(Insulating ink layer)을 인쇄한다(S3).Next, an insulating layer (Insulating ink layer) that can cover the junction between the working area and the silver conductive layer is printed (S3).
절연층이 인쇄된 후, 60∼70℃에서 20∼30분 정도 경화시킨다. 경화 온도가 70℃를 초과할 때에는 인쇄 기판의 변형을 가져올 수 있기 때문에 70℃ 이하에서 경화가 이루어지는 것이 바람직하다.After the insulating layer is printed, it is cured for about 20 to 30 minutes at 60 to 70 ° C. When the curing temperature exceeds 70 ° C, the deformation of the printed board can be brought about, so that curing is preferably performed at 70 ° C or lower.
다음으로, 상기 모세관 채널의 아웃렛과 상기 스크린인쇄 탄소전극 사이의 간격을 유지시키기 위하여 폴리머 스페이서(Polymer spacer)를 적층시킨다(S4).Next, in order to maintain a gap between the outlet of the capillary channel and the screen printed carbon electrode, a polymer spacer is stacked (S4).
다음으로, 폴리머 스페이서가 적층된 상기 스크린인쇄 탄소전극을 5,2':5',2"-터티오펜-3'-카르복시산(이하, 'TTCA'로 약칭함) 용액에 침전시켜 중합반응을 통해 코팅시켜 전도성 고분자로 표면이 코팅된 스크린인쇄 탄소전극을 제조한다(S5).Next, the screen-printed carbon electrode in which the polymer spacer is stacked is precipitated in a solution of 5,2 ': 5', 2 "-terthiophene-3'-carboxylic acid (hereinafter, abbreviated as 'TTCA') through a polymerization reaction. Coating to produce a screen-printed carbon electrode coated with a conductive polymer (S5).
본 발명의 일 예로써의 전도성 고분자로 표면이 코팅되는 과정을 간략하게 살펴보면 다음과 같다.Looking at the process of the surface is coated with a conductive polymer as an example of the present invention as follows.
디(프로필렌 글리콜)메틸 에테르(di(propylene glycol)methyl ether)와 트리(프로필렌 글리콜)메틸 에테르(tri(propylene glycol)methyl ether)가 1:1의 비율로 혼합된 용매를 포함하는 1 mM TTCA 단량체 용액을 준비하고, 스크린인쇄 탄소전극을 TTCA 단량체 용액에 침전시켜 상기 스크린인쇄 탄소전극의 표면에 중합반응이 일어나 코팅된다.1 mM TTCA monomer containing a solvent in which di (propylene glycol) methyl ether and tri (propylene glycol) methyl ether are mixed in a 1: 1 ratio. The solution was prepared, and the screen-printed carbon electrode was precipitated in a TTCA monomer solution to cause a polymerization reaction to be coated on the surface of the screen-printed carbon electrode.
이때, 10 mM 인산완충용액(pH 7.4)가 사용되고, 100 mV/s의 스캔율(Scan rate)로 0.0 V 에서 1.6 V까지 전위차의 순환을 3회 반복한다.At this time, 10 mM phosphate buffer solution (pH 7.4) is used, and the cycle of the potential difference from 0.0 V to 1.6 V is repeated three times at a scan rate of 100 mV / s.
이하, 본 발명의 다른 실시예에 따른 모세관 채널의 코팅방법을 살펴보기로 한다.Hereinafter, a method of coating a capillary channel according to another embodiment of the present invention will be described.
먼저, 모세관 채널의 내부를 세척한 후 건조시킨다(S1).First, the inside of the capillary channel is washed and dried (S1).
본 발명의 일 예로써의 모세관 채널의 세척과정은 0.1 M 가성소다로 10분, 탈이온수로 10분, 아세톤(Acetone)으로 10분, 그리고 마지막으로 물로 10분간 세척하는 과정으로 이루어진다.The washing process of the capillary channel as an example of the present invention consists of 10 minutes with 0.1 M caustic soda, 10 minutes with deionized water, 10 minutes with acetone, and finally 10 minutes with water.
세척 후 35℃의 온도에서 밤새도록 상기 모세관 채널을 건조시킨다.After washing, the capillary channel is dried overnight at a temperature of 35 ° C.
다음으로, 건조된 모세관 채널 내부를 메톡시실란 수용액으로 피복시킨다(S2). 이때, 상기 메톡시 실란은 3-메타크릴옥시프로필트리메톡시실란(3-methacryloxypropyltrimethoxysilane), 3-메타크릴옥시프로필트리메톡시실란(3-methacryloxypropyltrimethoxysilane), 비닐트리아세톡시실란 (Vinyltriacetoxysilane), 비닐트리(메톡시-에톡시)실란(Vinyltri(β-methoxy-ethoxy)silane), 비닐트리클로로실란 (Vinyltrichlorosilane), 또는 메틸비닐디클로로실란 (Methylvinyldichlorosilane 을 사용할 수 있다.Next, the inside of the dried capillary channel is coated with an aqueous solution of methoxysilane (S2). At this time, the methoxy silane is 3-methacryloxypropyltrimethoxysilane, 3-methacryloxypropyltrimethoxysilane, 3-triacryloxypropyltrimethoxysilane, vinyltriacetoxysilane, vinyltri Vinyltri (β-methoxy-ethoxy) silane, vinyltrichlorosilane, or methylvinyldichlorosilane may be used.
본 발명의 일 예에 따른 모세관 채널의 피복(Derivatization)은 0.4%(w/v) 3-메타크릴옥시프로필트리메톡시실란 수용액으로 1시간 동안 주입시켜 이루어진다. 피복공정 후에 물로 세정한다.Derivatization of the capillary channel according to an embodiment of the present invention is performed by injecting with 0.4% (w / v) 3-methacryloxypropyltrimethoxysilane aqueous solution for 1 hour. Wash with water after coating process.
마지막으로, 아크릴아마이드 수용액으로부터 중합반응을 통해 상기 모세관 채널의 내부 표면을 코팅시킨다(S3).Finally, the inner surface of the capillary channel is coated through a polymerization reaction from acrylamide aqueous solution (S3).
본 발명의 일 예에 따른 모세관 채널 내부 코팅은 4%(w/v) 아크릴아마이드 수용액을 5분 동안 주입시켜 중합반응을 통해 이루어진다.The coating inside the capillary channel according to one embodiment of the present invention is made through a polymerization reaction by injecting an aqueous 4% (w / v) acrylamide solution for 5 minutes.
한편, 아크릴아마이드 수용액으로 코팅하기 전에, 본 발명의 일 예에 따른 상기 아크릴아마이드 수용액은 0.2㎛의 필터를 통해 필터링되고, 초음파처리에 의해 진공하에서 산소가 제거되는 것이 바람직하다.On the other hand, before coating with an acrylamide aqueous solution, the aqueous acrylamide solution according to an embodiment of the present invention is filtered through a 0.2 ㎛ filter, it is preferable that the oxygen is removed under vacuum by ultrasonic treatment.
이하, 본 발명의 다른 실시예에 따른 PCR 증폭물의 측정방법에 대해 살펴보도록 한다.Hereinafter, a method of measuring PCR amplification products according to another embodiment of the present invention will be described.
먼저, 모세관 채널을 분리 매개체로 충전시킨다(S1).First, the capillary channel is filled with a separation medium (S1).
상기 분리 매개체(Separation medium)는 0.75%(w/v)의 하이드록시에틸셀룰로오스(Hydroxyethylcellulose; 이하 'HEC'라 명명하기로 한다)가 포함되어 사용되는 것이 바람직하며, 본 발명의 일 예로써의 상기 분리 매개체는 0.75%(w/v) HEC, 40 mM 트리스, 40 mM 아세테이트, 1 mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), 1 mM 염산을 포함하여 이루어진다.The separation medium (Separation medium) is preferably used containing 0.75% (w / v) of hydroxyethyl cellulose (hereinafter referred to as 'HEC'), as an example of the present invention The separation medium comprises 0.75% (w / v) HEC, 40 mM Tris, 40 mM acetate, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 1 mM hydrochloric acid.
여기서, 상기 HEC는 상기 분리 매개체에 첨가되고 상온에서 교반된다. 분석을 반복하기 위해서는, 상기 분리 매개체는 각각의 측정시마다 교체되는 것이 바람직하다.Here, the HEC is added to the separation medium and stirred at room temperature. In order to repeat the assay, the separation media is preferably replaced at each measurement.
상기 분리 매개체는 주사기(Syringe)를 통해 완충저장조를 경유하여 상기 모세관 채널 내부에 충전된다.The separation medium is filled into the capillary channel via a buffer reservoir via a syringe (Syringe).
다음으로, 샘플폐수저장조를 완충용액으로 충전시킨다(S2).Next, the sample wastewater storage tank is filled with a buffer solution (S2).
본 발명의 일 예에 따른 상기 샘플폐수저장조에 충전되는 완충용액은 pH 8.3의 5 ㎕ TAE(Tris-acetate-EDTA buffer)이 사용된다.As a buffer solution filled in the sample wastewater storage tank according to an embodiment of the present invention, 5 μl of TAE (Tris-acetate-EDTA buffer) of pH 8.3 is used.
다음으로, 측정저장조를 전기영동 완충용액으로 충전시킨다(S3).Next, the measurement reservoir is filled with an electrophoretic buffer solution (S3).
본 발명의 일 예에 따른 상기 전기영동 완충용액은 pH 8.3의 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA가 사용된다.The electrophoretic buffer solution according to an embodiment of the present invention is 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA of pH 8.3 is used.
다음으로, 상기 모세관 채널을 -200V/cm의 전기장의 세기로 1차 전기영동시킨다(S4).Next, the capillary channel is first electrophoresed at an intensity of an electric field of -200 V / cm (S4).
1차 전기영동 후에 전기영동 완충용액으로 세정한다.After primary electrophoresis, wash with electrophoretic buffer.
다음으로, 샘플을 샘플저장조에 투입시킨다(S5).Next, the sample is put into the sample reservoir (S5).
본 발명의 일 예에 따른 샘플 투입 방법은 잘 알려진 플러그 인젝션(Plug injection)방법(Woolley, A. T., Mathies, R. A., Proc. Natl. Acad. Sci. 1994, 91, 11348-11352)에 의해 이루어지며, 샘플은 T자 형상의 모세관 채널을 채우면서 샘플저장조로부터 샘플폐수저장조로 이주(Migration)된다.Sample injection method according to an embodiment of the present invention is made by a well-known Plug injection method (Woolley, AT, Mathies, RA, Proc. Natl. Acad. Sci. 1994, 91 , 11348-11352), The sample migrates from the sample reservoir to the sample wastewater reservoir while filling the T-shaped capillary channel.
다음으로, 샘플저장조와 샘플폐수저장조 사이에 전기장을 인가하여 전기영동을 개시하여 상기 샘플폐수저장조는 기저(Grounded)상태로 되고, 상기 측정저장조 및 상기 샘플저장조는 여기(Floated)상태로 된다(S6).Next, the electrophoresis is started by applying an electric field between the sample reservoir and the sample wastewater reservoir, and the sample wastewater reservoir is grounded, and the measurement reservoir and the sample reservoir are in the excited state (S6). ).
작동 모드로 스위치를 전환시키면 분석물질인 샘플은 분리 채널의 역할을 하는 모세관 채널 내부로 유입되고, 전기영동 분리는 개시된다.Switching to the operating mode causes the analyte sample to enter into the capillary channel, which acts as a separation channel, and electrophoretic separation is initiated.
마지막으로, 완충저장조와 측정저장조 사이에 제6단계와 동일한 세기의 전기장을 인가하여 상기 측정저장조는 기저상태로 되고, 상기 샘플저장조 및 상기 샘플폐수저장조는 여기상태가 되어 PCR 증폭물의 분리가 개시된다(S7).Finally, by applying an electric field of the same intensity as the sixth step between the buffer reservoir and the measurement reservoir, the measurement reservoir is in a ground state, and the sample reservoir and the sample wastewater reservoir are in an excited state, and separation of the PCR amplification product is started. (S7).
한편, 상기 제6단계와 상기 제7단계 사이에는 상호 오염(Cross-contamination)을 최소화하기 위하여 상기 모세관 채널을 -200∼220 V/cm의 전기장의 세기로 3분 동안 전기영동시키는 것이 바람직하다. Meanwhile, in order to minimize cross-contamination between the sixth step and the seventh step, the capillary channel is electrophoresed for 3 minutes at an electric field intensity of -200 to 220 V / cm.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited by the examples.
<실시예 1> HSF1의 PCR 증폭물 제조<Example 1> PCR amplification of HSF1
본 발명의 일 예로써의 DNA 주형은 50 ng/㎕의 인간열충격인자1(human Heat Shock Transcription Factor 1 이하, 'HSF1'으로 명명하기로 한다)이 사용되었으며, HSF1(1.5 kbp)유전자는 pGET-4T 벡터(4.9 kbp, Amershan Pharmecia, USA)에 의해 복제되었다. 즉, HSF1 주형은 pGET-4T 벡터의 5'-EcoRI/KpnI-3' 부위에서 라이게이션하였다. PCR용으로 사용되는 반응혼합물은 1 μL의 50 ng HSF1 주형(최종농 도 1 ng/μL), 1 μL의 125 ng 프라이머 #1 HSF1 c103s-F ([5'-C CAG CAC CCA TCC TTC CTG CGT GGC C-3']), 1 μL의 125 ng 프라이머 #2 HSF1 c103s-R ([5'-G GCC ACG CAG GAA GGA TGG GTG CTG G-3']), 1 μL의 dNTP 혼합물(2.5 mM), 1 μL의 Pfu Turbo DNA 중합효소(2.5 U/μL), 및 5 μL의 10X 반응완충액(200 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4, 1% triton X-100, 1 mg/mL acetylated Bovine Serum Albumin (BSA), pH 8.4)으로 구성되며, 최종부피는 50 μL이었다.As an example of the present invention, 50 ng / μl of human heat shock factor 1 (hereinafter referred to as 'HSF1') was used as the DNA template, and HSF1 (1.5 kbp) gene was used as pGET-. 4T vector (4.9 kbp, Amershan Pharmecia, USA). That is, the HSF1 template was ligated at the 5'-EcoRI / KpnI-3 'site of the pGET-4T vector. The reaction mixture used for PCR was 1 μL of 50 ng HSF1 template (
DNA 증폭을 위해서, 온도 프로그램은 표적 DNA를 완전히 변성시키기 위해 95℃에서 30초동안 개시되고, 순환 온도 스텝(Cycling temperature step)은 95℃에서 30초, 55℃에서 1분, 68℃에서 3분을 수회 반복하였다. 순환 온도 스텝이 종료된 후에 증폭을 종결시키기 위해 68℃에서 12분으로 온도를 유지시켰다. 열적 순환후에, PCR 증폭물(∼6.4 kbp)은 전기영동장치에 의해 모여지고 분리되었다.For DNA amplification, the temperature program is initiated for 30 seconds at 95 ° C. to completely denature the target DNA, and the cycling temperature step is 30 seconds at 95 ° C., 1 minute at 55 ° C., 3 minutes at 68 ° C. Was repeated several times. The temperature was held at 68 ° C. for 12 minutes after the cycle temperature step was completed to terminate the amplification. After thermal cycling, PCR amplifications (˜6.4 kbp) were collected and separated by electrophoresis.
<실시예 2> PCR 증폭물 측정장치 제작<Example 2> PCR amplification measuring device manufacturing
1) 모세관 채널 준비1) Capillary Channel Preparation
본 발명에서 사용하는 모세관 채널은 샘플저장조로부터 샘플이 공급되는 투입 채널(Injection channels)의 길이가 9.64 mm, 측정저장조로 이동되는 분리 채널(Separation channels)의 길이가 75.5 mm이며, 투입 채널과 분리 채널의 폭과 두께는 각각 50㎛, 20㎛인 모세관 채널을 사용하였다.The capillary channel used in the present invention has a length of 9.64 mm of injection channels supplied with a sample from a sample reservoir, a length of separation channels of 75.5 mm that is moved to a measurement reservoir, and an input channel and a separation channel. The width and thickness of the capillary channel was 50㎛, 20㎛ respectively.
먼저, 모세관 채널의 내부를 0.1 M NaOH 가성소다로 10분, 탈이온수로 10분, 아세톤(Acetone)으로 10분, 그리고 마지막으로 물로 10분간 세척한 후 35℃의 온도에서 밤새도록 건조시켰다. 상기 건조된 모세관 채널 내부를 0.4% (w/v) 3-메타크릴옥시프로필트리메톡시실란(3-methacryloxypropyltrimethoxysilane) 수용액으로 1시간 동안 피복시킨 후 물로 세정하였다. 마지막으로, 4%(w/v) 아크릴아마이드 수용액을 5분 동안 주입시켜 중합반응을 통해 상기 모세관 채널의 내부 표면을 코팅시켰다. 이때, 아크릴아마이드 수용액은 0.2㎛의 필터를 통해 필터링되고, 초음파처리에 의해 진공하에서 산소가 제거된 것을 코팅에 사용하였다.First, the inside of the capillary channel was washed for 10 minutes with 0.1 M NaOH caustic soda, 10 minutes with deionized water, 10 minutes with acetone, and finally with water for 10 minutes, and then dried overnight at a temperature of 35 ° C. The dried capillary channel was coated with an aqueous 0.4% (w / v) 3-methacryloxypropyltrimethoxysilane for 1 hour and then washed with water. Finally, 4% (w / v) acrylamide aqueous solution was injected for 5 minutes to coat the inner surface of the capillary channel through polymerization. At this time, the aqueous solution of acrylamide was filtered through a filter having a 0.2㎛, the oxygen was removed under vacuum by sonication was used for coating.
2) 스크린인쇄 탄소전극 제작2) Screen printed carbon electrode manufacturing
본 발명에서 사용하는 스크린인쇄 탄소전극의 제작 과정은 도 1을 참조하여 설명한다.The manufacturing process of the screen printed carbon electrode used in the present invention will be described with reference to FIG.
먼저, 폴리에틸렌 베이스 필름상에 은 전도성 층(Ag conducting layer)를 인쇄시켰다(S1). 은 전도성 층이 인쇄된 후, 60℃에서 20분 동안 경화시켰다. 그 후, 은 전도성 층을 인쇄시킨 베이스 필름상에 스크린 인쇄기로 카본 잉크를 인쇄시켰다(S2). 이때, 카본 잉크를 인쇄하는 방법은 스텐실(Patterned stencils) 인쇄기법을 사용하였고, 인쇄된 카본 잉크는 직경이 1.25 mm로 은 전도성 층 위에 인쇄되었다. 카본 잉크가 인쇄된 후, 60℃에서 20분 동안 경화시켰다. 그 후, 작업전극의 작업면(Working area)과 은 전도성 층 사이의 접합부분을 커버할 수 있는 절연층(Insulating ink layer)을 인쇄하였다(S3). 절연층이 인쇄된 후, 60℃에서 20분 동안 경화시켰다. 그 후, 절연층이 인쇄된 전극과 모세관 채널의 아웃렛 사이의 간격을 50㎛로 유지시키기 위하여 폴리에틸렌 필름 스페이서(Polymer spacer) 를 적층시켰다(S4). 이때, 상기 전극은 분리 채널과 직각방향으로 배열되어 위치시켰다. 마지막으로, 폴리에티렌 필름의 스페이서가 적층된 상기 전극을 5,2':5',2"-터티오펜-3'-카르복시산(이하, 'TTCA'로 명명하기로 한다) 용액에 침전시켜 중합반응을 통해 코팅시켜 전도성 고분자로 표면이 코팅된 스크린인쇄 탄소전극을 제조하였다(S5).First, an Ag conducting layer was printed on a polyethylene base film (S1). The silver conductive layer was printed and then cured at 60 ° C. for 20 minutes. Thereafter, carbon ink was printed on a base film on which the silver conductive layer was printed (S2). At this time, the method of printing the carbon ink using a patterned stencils printing technique, the printed carbon ink was printed on the silver conductive layer with a diameter of 1.25 mm. After the carbon ink was printed, it was cured at 60 ° C. for 20 minutes. Thereafter, an insulating layer (Insulating ink layer) that can cover the junction between the working area (working area) of the working electrode and the silver conductive layer was printed (S3). After the insulating layer was printed, it was cured at 60 ° C. for 20 minutes. Thereafter, a polyethylene film spacer was laminated in order to maintain the distance between the electrode on which the insulating layer was printed and the outlet of the capillary channel at 50 μm (S4). In this case, the electrodes are arranged in a direction perpendicular to the separation channel. Finally, the electrode in which the spacer of the polystyrene film is laminated is precipitated in a solution of 5,2 ': 5', 2 "-terthiophene-3'-carboxylic acid (hereinafter referred to as 'TTCA') to polymerize. Coating through a reaction to prepare a screen-printed carbon electrode coated with a conductive polymer (S5).
전도성 고분자로 표면이 코팅되는 과정을 살펴보면, 디(프로필렌 글리콜)메틸 에테르(di(propylene glycol)methyl ether)와 트리(프로필렌 글리콜)메틸 에테르(tri(propylene glycol)methyl ether)가 1:1의 비율로 혼합된 용매를 포함하는 1 mM TTCA 단량체 용액을 준비하고, 상기 전극을 TTCA 단량체 용액에 침전시켜 상기 전극의 표면에 중합반응이 일어나 코팅되었다. 이때, 10 mM 인산완충용액(pH 7.4)가 사용되고, 100 mV/s의 스캔율(Scan rate)로 0.0 V 에서 1.6 V까지 전위차의 순환을 3회 반복하였다.Looking at the process of coating the surface with a conductive polymer, the ratio of di (propylene glycol) methyl ether and tri (propylene glycol) methyl ether is 1: 1 To prepare a 1 mM TTCA monomer solution containing a mixed solvent, and the electrode was precipitated in the TTCA monomer solution to cause a polymerization reaction on the surface of the electrode was coated. At this time, a 10 mM phosphate buffer solution (pH 7.4) was used, and the cycle of the potential difference from 0.0 V to 1.6 V was repeated three times at a scan rate of 100 mV / s.
3) PCR 증폭물 측정장치 제작3) Manufacture of PCR amplification measuring device
상기 제작된 스크린인쇄 탄소전극, 은/염화은 기준전극 및 백금 상대전극으로 구성된 측정저장조 상기 준비된 분리채널 및 주입채널로 구성된 모세관 채널 샘플저장조 샘플폐수저장조 완충저장조로 구성되며, 측정저장조 내에 존재하는 스크린인쇄 탄소전극과 50㎛의 간격을 두고 수직으로 분리채널을 설치하였다. 분리채널의 반대편 말단에 완충저장조를 설치하였고, 샘플저장조와 샘플폐수저장조를 일직선으로 연결하는 주입채널의 가운데 지점에 수직으로 상기 분리채널이 관통하였다. The prepared screen printing carbon electrode, a silver / silver chloride reference electrode and a platinum storage electrode consisting of a counter electrode, the prepared capillary channel sample reservoir consisting of a separation channel and an injection channel, and a sample waste water storage buffer buffer reservoir. Separation channels were installed vertically at intervals of 50 μm with the carbon electrode. A buffer reservoir was installed at the opposite end of the separation channel, and the separation channel penetrated perpendicularly to the center point of the injection channel connecting the sample reservoir and the sample wastewater reservoir in a straight line.
<실시예 3> PCR 증폭물의 분리 및 측정Example 3 Isolation and Measurement of PCR Amplifications
0.75%(w/v) HEC(Hydroxyethylcellulose), 40 mM Tris, 40 mM 아세테이트, 1 mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), 1 mM 염산으로 구성된 분리 매개체를 주사기(Syringe)로 완충저장조를 경유하여 실시예 2에서 준비된 모세관 채널 내부에 충전시켰다. 그리고, 샘플폐수저장조를 pH 8.3의 5 ㎕ TAE(Tris-acetate-EDTA buffer) 완충용액으로 충전시켰고, 측정저장조를 pH 8.3의 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA 전기영동 완충용액으로 충전시켰다.In Example 2, a separation medium consisting of 0.75% (w / v) Hydroxyethylcellulose (HEC), 40 mM Tris, 40 mM acetate, 1 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), and 1 mM hydrochloric acid was passed through a buffer reservoir with a syringe (Syringe). It was filled inside the prepared capillary channel. The sample wastewater reservoir was charged with 5 μl Tri-acetate-EDTA buffer (TAE) buffer at pH 8.3, and the measurement reservoir was charged with 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA electrophoresis buffer at pH 8.3.
다음으로, 상기 모세관 채널을 -200V/cm의 전기장의 세기로 1차 전기영동시키고, 전기영동 완충용액으로 세정한 후, 샘플인 실시예 1에서 얻어진 PCR 증폭물 5 μL을 플러그 인젝션(Plug injection)방법(Woolley, A. T., Mathies, R. A., Proc . Natl. Acad. Sci. 1994, 91, 11348-11352)에 의해 샘플저장조에 투입시키며, 샘플은 T자 형상의 모세관 채널을 채우면서 샘플저장조로부터 샘플폐수저장조로 이주(Migration)하였다.Next, the capillary channel was first electrophoresed at an intensity of an electric field of -200 V / cm, washed with an electrophoretic buffer solution, and 5 μL of the PCR amplification product obtained in Example 1, which is a sample, was plug injected. Method (Woolley, AT, Mathies, RA, Proc . Natl. Acad. Sci. 1994, 91 , 11348-11352) is introduced into the sample reservoir, and the sample fills the T-shaped capillary channel while draining the sample wastewater from the sample reservoir. Migration was done to the reservoir.
다음으로, 샘플저장조와 샘플폐수저장조 사이에 -200V/cm의 전기장을 4초동안 인가하여 전기영동을 개시하여 상기 샘플폐수저장조는 기저(Grounded)상태로 되고, 다른 저장조들은 여기(Floated)상태로 되며, 다시 완충저장조와 측정저장조 사이에 상기와 동일한 전기장을 인가하여 상기 측정저장조는 기저상태로 되고, 다른 저장조들은 여기상태가 되어 PCR 증폭물의 분리가 개시되었다. 이때, 상호 오염(Cross-contamination)을 최소화하기 위하여 상기 모세관 채널을 -200V/cm의 전기 장의 세기로 3분 동안 예비전기영동을 하였고, 전기영동은 25℃에서 수행되었다.Next, the electrophoresis is started by applying an electric field of -200 V / cm for 4 seconds between the sample reservoir and the sample wastewater reservoir, and the sample wastewater reservoir is grounded, and the other reservoirs are in the excited state. When the same electric field was applied between the buffer reservoir and the measurement reservoir, the measurement reservoir became the ground state, and the other reservoirs became the excited state, and separation of the PCR amplification product was started. At this time, in order to minimize cross-contamination, the capillary channel was subjected to preelectrophoresis for 3 minutes at an electric field strength of -200 V / cm, and electrophoresis was performed at 25 ° C.
<실시예 4> 전압전류곡선Example 4 Voltage and Current Curve
실시예 2에서 제작된 스크린인쇄 탄소전극과 전도성 고분자로 코팅되지 않은 스크린인쇄 탄소전극을 이용하여 실시예 1에서 30 싸이클을 반복하여 얻어진 PCR 증폭물의 전압전류곡선을 측정하였다. 이때, 전류측정기(Amperometric detection)로는 Kosentech Model KST-P1(South Korea)와 BAS-CV50(USA) Potentiostat/Galvanostat를 사용하였고, 고전압전원공급장치(High voltage power supply; HVPS)로는 Spellman CZE 1000R(NY, USA)을 사용하였으며 0 내지 30 KV의 범위내에서 HV 스위치 박스에 의하여 전압의 조절이 가능하였다.The voltage and current curves of the PCR amplification products obtained by repeating 30 cycles in Example 1 were measured using the screen printed carbon electrode prepared in Example 2 and the screen printed carbon electrode not coated with the conductive polymer. At this time, Kosentech Model KST-P1 (South Korea) and BAS-CV50 (USA) Potentiostat / Galvanostat were used as the amperometric detection, and Spellman CZE 1000R (NY) was used as the high voltage power supply (HVPS). , USA) was used to control the voltage by the HV switch box within the range of 0 to 30 KV.
그 결과, 도 3과 같이 실시예 2의 전도성 고분자가 코팅된 스크린인쇄 탄소전극(■)에서는 PCR 증폭물에 대한 전압전류곡선이 S자형을 띄고, 0.5V 에서 0.8V까지 점진적으로 증가하나, 전도성 고분자가 코팅되지 않은 스크린인쇄 탄소전극(●)는 0.6V에서 0.8V까지 증가하였다. As a result, in the screen-printed carbon electrode (■) coated with the conductive polymer of Example 2 as shown in FIG. 3, the voltage current curve of the PCR amplification product was S-shaped, but gradually increased from 0.5V to 0.8V, but the conductivity was The screen-printed carbon electrode (●) without polymer coating increased from 0.6V to 0.8V.
한편, 전도성 고분자가 코팅된 스크린인쇄 탄소전극에서 PCR 증폭물의 음극 측정 전위(Anodic detection potential)가 100 mV 음의 방향으로 이동하는 것은 dsDNA의 촉매산화에 기인하며, 전도성 고분자가 코팅된 스크린인쇄 탄소전극이 <0.9V에서는 전압전류곡선에서 불규칙한 감소현상이 발생하는데, 이는 높은 측정전위에서 고분자 기질(Matrix)의 퇴화에 기인한다.On the other hand, in the screen-printed carbon electrode coated with conductive polymer, the anodic detection potential of the PCR amplification is shifted in the negative direction of 100 mV due to catalytic oxidation of dsDNA, and the screen-printed carbon electrode coated with conductive polymer At this <0.9V, an irregular decrease occurs in the voltage-current curve, which is due to the degradation of the polymer matrix at high measurement potentials.
또한, 전도성 고분자가 코팅되지 않은 스크린인쇄 탄소전극과 비교하여 볼 때, 전도성 고분자가 코팅된 스크린인쇄 탄소전극은 최소 표면 오염이 관찰되었고, 전류측정(Amperometric) 신호에 있어서도 우수한 민감도를 나타내었다. 가장 최적의 신호 대 노이즈(Signal-to-noise) 특성은 +0.8V(vs. Ag/AgCl)에서 관찰되었다.In addition, when compared with the screen-printed carbon electrode coated with the conductive polymer, the surface-printed carbon electrode coated with the conductive polymer showed minimal surface contamination and showed excellent sensitivity even in the amperometric signal. The most optimal signal-to-noise characteristic was observed at +0.8 V (vs. Ag / AgCl).
<실시예 5> PCR 증폭물의 분리 및 측정에 대한 전기영동곡선Example 5 Electrophoretic Curve for Separation and Measurement of PCR Amplifications
실시예 2에서 제작된 스크린인쇄 탄소전극과 전도성 고분자로 코팅되지 않은 스크린인쇄 탄소전극을 이용하여 실시예 1에서 30 싸이클을 반복하여 얻어진 PCR 증폭물의 전기영동곡선을 상기 PCR 증폭물을 4초 동안 모세관 채널에 주사하여 측정하였다.Using the screen-printed carbon electrode prepared in Example 2 and the screen-printed carbon electrode not coated with a conductive polymer, the electrophoretic curve of the PCR amplification product obtained by repeating 30 cycles in Example 1 was obtained by capillary tube for 4 seconds. Measurement was made by injection into the channel.
그 결과, 도 4와 같이, 전도성 고분자가 코팅된 스크린인쇄 탄소전극(B)는 전도성 고분자가 코팅되지 않은 스크린인쇄 탄소전극(A)보다 높은 촉매 반응(Catalytic response)을 나타내고 있는데, 이는 전도성 고분자의 표면을 통한 강화된 전자 전달에 기인한다.As a result, as shown in FIG. 4, the screen-printed carbon electrode B coated with the conductive polymer exhibits a higher catalytic response than the screen-printed carbon electrode A without the conductive polymer coated. This is due to enhanced electron transfer through the surface.
또한, 전도성 고분자가 코팅된 스크린인쇄 탄소전극은 상대적으로 낮은 평평한 베이스라인과 낮은 노이즈 레벨을 나타내는데, 이는 전도성 고분자가 코팅된 스크린인쇄 탄소전극이 높은 전기장으로부터 효과적으로 차단(Isolation)되는 것을 의미한다. In addition, the screen-printed carbon electrode coated with the conductive polymer has a relatively low flat baseline and low noise level, which means that the screen-printed carbon electrode coated with the conductive polymer is effectively isolated from the high electric field.
<실시예 6> PCR 증폭물의 분리 및 측정에 미치는 전기장 세기효과Example 6 Field Strength Effects on the Separation and Measurement of PCR Amplifications
실시예 1에서 30 싸이클을 반복하여 얻어진 PCR 증폭물의 분리 및 측정에 미 치는 전기장 세기효과를 -133 V/cm에서-400 V/cm(A→E)로 전기장 세기를 증가함에 따른 이주시간(Migration times)으로 측정하였다.Migration time (Migration) by increasing the electric field strength from -133 V / cm to -400 V / cm (A → E) to the separation and measurement of PCR amplification products obtained by repeating 30 cycles in Example 1 measured in times.
그 결과, 도 5와 같이 전기장의 세기가 증가함에 따라 이주시간(Migration times)이 시료 주입으로부터 241.0±0.5초에서 54.6±0.5초로 급격히 줄어들었다.As a result, as the intensity of the electric field increases as shown in FIG. 5, migration times decreased rapidly from 241.0 ± 0.5 seconds to 54.6 ± 0.5 seconds from the sample injection.
또한, 전기장의 세기가 증가하는 유형에 있어서, 이론적 플레이트(Theoretical plates, Ne, plates/cm)의 수는 11638 plates/cm에서 1086 plates/cm로 감소하였다.In addition, in the type of increasing electric field intensity, the number of theoretical plates (N e , plates / cm) decreased from 11638 plates / cm to 1086 plates / cm.
도 5에 삽입된 도면은 이론적 플레이트에 관한 전기장 세기의 효과의 유형을 나타낸 것이다. 높은 전기장 세기에서 이론적 플레이트의 감소는 줄 히팅(Joule heating)과 같은 비이상적인 효과에 기인한다.The figure inserted in FIG. 5 shows the type of effect of electric field strength on the theoretical plate. The reduction of theoretical plates at high electric field strengths is due to non-ideal effects such as Joule heating.
한편, 보다 큰 전류측정 신호와 작은 노이즈 레벨이 -200V/cm의 전기장의 세기에서 관찰되었다.On the other hand, a larger amperometric signal and a smaller noise level were observed at an electric field strength of -200 V / cm.
따라서, 분리 효율을 높이고, 좋은 전류측정 반응을 얻기 위해서 후술되는 실시에 있어서는 모두 -200V/cm의 전기장의 세기로 분리가 수행되었다.Therefore, in order to improve the separation efficiency and to obtain a good amperometric response, the separation was performed with the intensity of the electric field of -200 V / cm in all of the following examples.
<실시예 7> PCR 증폭물의 분리 및 측정에 미치는 모세관 채널의 아웃렛과 작동전극의 이격거리의 관계<Example 7> Relationship between the separation distance between the outlet of the capillary channel and the working electrode on the separation and measurement of PCR amplification products
실시예 1에서 20 싸이클을 반복하여 얻어진 PCR 증폭물의 분리 및 측정에 미치는 모세관 채널의 아웃렛과 작동전극의 이격거리의 관계를 이격거리의 변화에 따 른 배경(Background) 노이즈와 전류측정 반응으로 관찰하였다.The relationship between the separation distance between the outlet of the capillary channel and the working electrode on the separation and measurement of the PCR amplification product obtained by repeating 20 cycles in Example 1 was observed by the background noise and the amperometric response according to the change of the separation distance. .
그 결과, 도 6a에 나타난 바와 같이 모세관 채널의 아웃렛과 스크린인쇄 탄소전극의 이격거리가 멀어짐에 따라 높은 배경(Background) 노이즈와 왜곡된 전류측정 반응이 관찰되었다. 전류측정 피크 면적은 채널의 아웃렛과 스크린인쇄 탄소전극의 이격거리가 50㎛에서 200㎛로 증가할 경우 1.73 nAmin에서 0.53 nAmin로 줄어들었다.As a result, as shown in FIG. 6A, as the distance between the outlet of the capillary channel and the screen-printed carbon electrode increases, high background noise and distorted amperometric response were observed. The current measurement peak area decreased from 1.73 nAmin to 0.53 nAmin as the separation distance between the channel outlet and the screen printed carbon electrode increased from 50 μm to 200 μm.
한편, 이러한 이격거리는 이론적 플레이트뿐만 아니라 이주시간에도 영향을 끼친다. 이론적 플레이트 8778 plates/cm에서 1231 plates/cm로 감소하고, 이주시간은 205초에서 208초로 증가하였다.On the other hand, this separation affects the migration time as well as the theoretical plate. The theoretical plate decreased from 8778 plates / cm to 1231 plates / cm and migration time increased from 205 seconds to 208 seconds.
이와 같은 결과는 모세관 채널의 아웃렛과 스크린인쇄 탄소전극의 작업면(Working area) 사이에서 발생하는 확산(Diffusion)에 기인한다.This result is due to diffusion occurring between the outlet of the capillary channel and the working area of the screen-printed carbon electrode.
따라서, 효율적인 유체역학의 물질 전달을 위해서는 모세관 채널의 아웃렛과 스크린인쇄 탄소전극의 이격거리는 50㎛ 이하인 것이 바람직하다.Therefore, the distance between the outlet of the capillary channel and the screen-printed carbon electrode is preferably 50 μm or less for efficient fluid dynamic mass transfer.
<실시예 8> PCR 증폭물의 전류측정 반응과 샘플 주입시간과의 관계<Example 8> Relationship between amperometric reaction of PCR amplification product and sample injection time
실시예 1에서 20 싸이클을 반복하여 얻어진 PCR 증폭물의 전류측정반응에 미치는 PCR 증폭물 주입시간의 상관관계를 샘플 주입시간을 변화하면서 관찰하였다.The correlation of PCR amplification injection time on the current measurement reaction of the PCR amplification product obtained by repeating 20 cycles in Example 1 was observed while changing the sample injection time.
그 결과, 도 6b에 나타난 바와 같이 분리시 샘플의 주입시간(Injection time)이 1초에서 10초로 증가함에 따라 하프 피크 폭(Half peak widths)은 4.0(1s)에서 12.5(10s) 증가하였다.As a result, as shown in FIG. 6B, as the injection time of the sample increased from 1 second to 10 seconds, the half peak widths increased from 4.0 (1s) to 12.5 (10s).
4초의 샘플 주입시간일 때, 전류측정 반응은 다른 주입시간에서 얻어진 값보다 높게 나타났고, 한편 주입시간이 4초 이상일 경우에는 전류측정 신호의 감소와 노이즈 레벨의 상승이 관찰되었다.At the sample injection time of 4 seconds, the amperometric response was higher than that obtained at the other injection times, while for more than 4 seconds, a decrease in the current measurement signal and an increase in the noise level were observed.
따라서, 보다 나은 분리 효율을 얻기 위해서는, 모세관 채널의 아웃렛과 스크린인쇄 탄소전극의 이격거리는 50㎛이하이고, 주입시간은 4초가 되는 것이 바람직하다.Therefore, in order to obtain better separation efficiency, the separation distance between the outlet of the capillary channel and the screen-printed carbon electrode is 50 µm or less, and the injection time is preferably 4 seconds.
<실시예 9> 스크린인쇄 탄소전극의 재현성Example 9 Reproducibility of Screen Printed Carbon Electrode
본 발명에 따른 PCR 증폭물 측정용 스크린인쇄 탄소전극의 재현성(Reproducibility)을 평가하기 위하여, 실시예 2에서 제작된 스크린인쇄 탄소전극과 전도성 고분자로 코팅되지 않은 스크린인쇄 탄소전극을 이용하여 실시예 1에서 30 싸이클을 통해 얻어진 PCR 증폭물을 여덟차례에 걸쳐 반복적으로 주입하여 상대표준편차(Relative standard deviations; 이하 'RSD'라 약칭함)를 구하였다.In order to evaluate the reproducibility of the screen-printed carbon electrode for PCR amplification product measurement according to the present invention, Example 1 using the screen-printed carbon electrode prepared in Example 2 and the screen-printed carbon electrode not coated with a conductive polymer Relative standard deviations (hereinafter, abbreviated as 'RSD') were obtained by repeatedly injecting PCR amplification products obtained through 30 cycles at 8 times.
PCR 증폭물에 대한 피크 면적과 이주시간에 대한 재현성을 하기 표 1에 나타내었다.The reproducibility of the peak area and migration time for the PCR amplification is shown in Table 1 below.
<표 1>TABLE 1
그 결과, 전도성 고분자로 표면이 코팅된 스크린인쇄 탄소전극의 이주시간과 피크 면적은 재현가능한 범위 내에 해당되지만, 전도성 고분자로 코팅되지 않은 스크린인쇄 탄소전극의 이주시간과 피크면적은 상대표준편차가 너무 커서 재현가능성이 없었다.As a result, the migration time and peak area of the screen-printed carbon electrode coated with the conductive polymer are within the reproducible range, but the relative standard deviation of the migration time and the peak area of the screen-printed carbon electrode not coated with the conductive polymer is too high. There was no cursor reproducibility.
<실시예 10> 다양한 싸이클 후에 얻어진 PCR 증폭물의 연속적인 전기영동곡선Example 10 Continuous Electrophoresis Curves of PCR Amplifications Obtained After Various Cycles
5회, 10회, 20회 및 30회로 다양한 싸이클을 통해 실시예 1과 같은 방법으로 얻어진 PCR 증폭물들의 전기영동곡선을 실시예 3과 같은 방법으로 측정하였다.The electrophoretic curves of the PCR amplification products obtained in the same manner as in Example 1 through 5, 10, 20 and 30 cycles were measured in the same manner as in Example 3.
그 결과, 5 싸이클을 통해 증폭된 PCR 증폭물의 경우에는 표적 피크(Target peak; 도 7a상에는 'b'로 표시됨)가 프라이머-다이머(Primer-dimer) 피크(도 7a상에는 'a'로 표시됨)보다 다소 작게 나타났고, 싸이클의 횟수가 증가함에 따라 표적 피크가 나타내는 값은 더욱 커짐을 알 수 있다.As a result, in the case of PCR amplification products amplified through 5 cycles, the target peak (marked with 'b' on FIG. 7A) is higher than the primer-dimer peak (marked with 'a' on FIG. 7A). It appeared somewhat smaller, and it can be seen that as the number of cycles increases, the value indicated by the target peak becomes larger.
한편, 도 7b를 참조하면, 점선은 이상적인 PCR 증폭을 나타내는 것으로써 싸이클 회수가 낮을 때에는 그 결과가 거의 일치함을 알 수 있다. On the other hand, referring to Figure 7b, the dotted line represents the ideal PCR amplification, it can be seen that the results are almost the same when the cycle number is low.
도 7b에 삽입된 도면은 싸이클 횟수와 PCR 증폭물의 대수 피크 면적의 관계를 나타낸 것으로써, 싸이클 횟수가 증가함에 따라 지수영역(Exponential region), 준선형상(Quasilinear phase)을 지나 고원영역(Plateau region)에 도달하였다.The diagram inserted in FIG. 7B shows the relationship between the number of cycles and the logarithmic peak area of the PCR amplification product. Reached.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 스크린인쇄전극을 이용한 PCR 증폭물의 측정장치는 감도가 높으며 안정성이 우수하고, 소형화가 가능하고, 분리 효율이 높은 장점을 나타낸다. 또한, PCR 증폭물의 측정방법은 반복적인 샘플의 측정시에도 오차를 줄일 수 있고, 재사용이 가능하며, 부가적인 복잡한 계측기기가 없이도 정확하게 데이터의 측정이 가능하다는 장점을 나타낸다.As described above, the apparatus for measuring PCR amplification products using the screen printing electrode according to the present invention has high sensitivity, excellent stability, miniaturization, and high separation efficiency. In addition, the method of measuring PCR amplification products has the advantage of reducing the error even when measuring repeated samples, reusable, and accurate data measurement without the need for additional complex measuring instruments.
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| US6436259B1 (en) | 1998-08-31 | 2002-08-20 | Boise State University | Mercury selective electrode |
| US20050064415A1 (en) | 2001-09-12 | 2005-03-24 | Yoon-Bo Shim | Novel terthiophene-3-carboxylic acid compound and fabricating method thereof, functionalized conductive terthiophene polymer with the compound as a monomer, process for dna hybridizatioon detection using the polymer, and fabricating method of probe dna |
-
2005
- 2005-09-15 KR KR1020050086480A patent/KR100707515B1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US6436259B1 (en) | 1998-08-31 | 2002-08-20 | Boise State University | Mercury selective electrode |
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| CN103529199A (en) * | 2013-10-31 | 2014-01-22 | 南京祥中生物科技有限公司 | Method for detecting clenbuterol content in animal derived sample quickly in site |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20070031730A (en) | 2007-03-20 |
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